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A) CENTRIFUGACIN
Consiste en la separacin de los componentes de una mezcla en funcin de las diferencias entre las velocidades que presentan al someterlos a elevadas aceleraciones (g). Esto se consigue haciendo girar la mezcla en un rotor a un gran nmero de vueltas por minuto. Los aparatos empleados con este fin se denominan ultracentrfugas.
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B) CROMATOGRAFA
Se fundamenta en la separacin de los componentes de una mezcla por sus diferencias de absorcin. stas diferencias van a ser debidas a las fuerzas de Van der Wals que se establecen entre los componentes de la mezcla y una sustancia que acta de fase estacionaria. Segn la naturaleza de la fase estacionaria, tendremos los siguientes tipos de cromatografa:
1) CROMATOGRAFA SOBRE PAPEL Se emplea para la separacin de sustancias qumicas que presenten propiedades muy parecidas.
Se opera de la siguiente manera. Una pequea cantidad de la mezcla a separar se deposita sobre un fragmento de papel poroso en el que quedar embebida. A continuacin se introduce el borde del papel en una sustancia en la que sean solubles los componentes de la mezcla que queremos separar. El disolvente se desplazar por capilaridad y los ir arrastrando. Los componentes de la mezcla viajarn ms o menos rpido segn establezcan fuerzas ms o menos grandes con las molculas del papel. Para observar los componentes ya separados se emplean reacciones coloreadas especficas.
2) CROMATOGRAFA DE GASES
El aparato consiste en un serpentn largo y delgado cuyas paredes estn impregnadas de un lquido (fase estacionaria). La mezcla a separar se vaporiza y atraviesa el serpentn transportada por un gas. La fase estacionaria retiene ms o menos los diferentes componentes de la mezcla. stos se detectan cuando al atravesar una llama entran en combustin, lo que aumenta la conductividad elctrica del detector.
Este mtodo tiene la ventaja de necesitar pequesimas cantidades (0,05 mg) y es capaz de separar sustancias muy parecidas qumicamente; por ejemplo: cidos grasos,azcares u hormonas.
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C) ELECTROFORESIS
En este mtodo, la mezcla a separar se deposita en una cubeta (ver imagen) sobre un soporte de tipo poroso (acetato de celulosa o tambin gel de almidn). A continuacin se establece una diferencia de potencial entre los extremos del soporte.
Las sustancias que componen la mezcla se desplazarn en funcin de su carga elctrica. Naturalmente este mtodo se emplear con sustancias que presenten cargas elctricas (protenas y cidos nuclicos)
D) CULTIVOS IN VITRO
Estos mtodos nos van a permitir mantener lneas celulares en el exterior de un organismo en condiciones favorables a su multiplicacin. La gran ventaja va a ser la facilidad para el tratamiento del material biolgico y su estandarizacin.
Las clulas extradas deben mantenerse para su cultivo en un medio con las condiciones fsicas y qumicas adecuadas y suministrarles aquellas sustancias que ellas no son capaces de sintetizar. En la actualidad se venden medios de cultivo concretos para cada tipo celular y que permiten mantener los cultivos durante largos perodos de tiempo.
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1) CLASES DE MICROSCOPIOS
ocular
A.1) FUNDAMENTO Funciona de la siguiente manera: Una fuente luminosa enva rayos de luz a una primera lente, llamada condensador, que concentra los rayos de luz sobre el objeto a observar. Estos rayos atraviesan el objeto y una lente denominada objetivo da una imagen aumentada de ste. Una segunda lente, el ocular, vuelve a aumentar la imagen dada por el objetivo. Esta ltima imagen es la que ser recibida por el observador.
A.2) PREPARACIN DEL MATERIAL En el microscopio ptico la luz atraviesa el objeto a observar. Si ste es muy grueso, la luz no lo atravesar y el objeto aparecer demasiado oscuro; adems se superpondrn los diferentes planos dando una imagen borrosa. Si el objeto es demasiado delgado o muy transparente, no se observarn sus estructuras. En cualquier caso, deberemos realizar una preparacin.
En general, una preparacin requiere las siguientes etapas 1- CORTE. Los objetos demasiado gruesos son cortados mediante aparatos denominados microtomos. stos permiten realizar cortes de apenas unas micras de grosor, corrientemente entre 3 y 20 . El tejido destinado al corte debe congelarse o incluirse en parafina para darle una mayor consistencia y que se pueda cortar con facilidad. 2- FIJACIN. Su fin es matar a las clulas con la menor alteracin de las estructuras posible, para evitar las modificaciones que pudiesen producirse posteriormente por el metabolismo celular o por la descomposicin. Como fijadores se emplean determinadas sustancias qumicas (por ejemplo: formaldehdo y tetrxido de osmio). 3- DESHIDRATACIN. La extraccin del agua del interior de las clulas permitir tambin una mejor conservacin y la penetracin de los colorantes. Para deshidratar el material a observar se le sumerge en alcoholes de cada vez mayor graduacin que por dilucin irn extrayendo el agua. 4- TINCIN. Es la coloracin de las clulas o de partes de stas para que resalten y posibilitar as su observacin. Algunos colorantes son selectivos pues tien partes concretas de la clula. Existen dos clases de colorantes: a) Los colorantes vitales. Que tien las estructuras celulares pero sin matar a las clulas (por ejemplo: el verde jano, el rojo neutro, el azul tripn, el azul de metileno). b) Los colorantes no vitales. Que matan a las clulas (eosina, hematoxilina). 5- MONTAJE. Una vez realizadas las anteriores operaciones el material se coloca entre un portaobjetos y un cubre-objetos. Para un montaje no definitivo, se coloca entre "porta" y "cubre" una gota de glicerina. Este tipo de preparaciones tiene una duracin limitada y slo sirven para la observacin momentnea o a lo sumo de unos das. Si se desea una mayor duracin debe realizarse el montaje en gelatina-glicerina o en euparal.
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B) EL MICROSCOPIO ELECTRNICO
Existen dos clases de microscopios electrnicos: B.1) Microscopio electrnico de trasmisin (MET). B.2) Microscopio electrnico de barrido (MEB).
B.1) EL MICROSCOPIO ELECTRNICO DE TRANSMISIN (MET)
B.1.1) FUNDAMENTO El microscopio electrnico fue puesto a punto en 1931 a partir de los trabajos tericos de De Broglie. Los electrones pueden comportarse como ondas o como partculas. Como ondas pueden llegar a tener una longitud 100.000 veces menor que la luz visible. Al ser partculas negativas pueden ser desviadas por campos magnticos o elctricos que actan como lentes. En esencia su funcionamiento es similar al del microscopio ptico. Un ctodo emite un haz de electrones que son acelerados por la aplicacin de una diferencia de potencial entre el ctodo y el nodo. El flujo de electrones es concentrado sobre el objeto por una primera lente magntica que hace las veces de condensador. Los electrones atraviesan la muestra. Una segunda lente magntica, el objetivo, da una imagen aumentada del objeto. Una tercera lente, el ocular, aumenta de nuevo la imagen dada por la anterior. La imagen final es proyectada sobre una pantalla o fotografiada. Los microscopios electrnicos permiten aumentos tiles que van de 2000 a 100.000 pudiendo llegar hasta 600.000. Los microscopios electrnicos son aparatos de hasta 2 m de alto y llegan a pesar 500 kg.
B.1.2) PREPARACIN del MATERIAL Los electrones necesitan desplazarse en el vaco, esta es la razn por la que no es posible la observacin de clulas vivas al microscopio electrnico. 1) FIJACIN. Las clulas son fijadas mediante fijadores no coagulantes. Los ms corrientes son el tetrxido de osmio (OsO4), el formaldehdo (HCHO) y el permanganato potsico (MnO4K). Los metales pesados que algunos contienen se fijan selectivamente a las diferentes estructuras celulares. Aquellas que retengan ms los metales aparecern ms oscuras. Es por esto que la imagen depende mucho del tipo de fijador utilizado. 2) DESHIDRATACIN e INCLUSIN. La pieza es deshidratada e infiltrada mediante una resina o plstico para darle una mayor consistencia y facilitar su corte. 3) CORTE. Los cortes se realizan mediante ultramicrotomos de cuchilla de vidrio o de diamante. Los cortes ms finos (0,03 ) son depositados sobre un tamiz y dispuestos para su observacin al microscopio.
B.2) MICROSCOPIO ELECTRNICO DE BARRIDO (MEB) Este tipo de microscopio permite obtener imgenes tridimensionales del objeto a estudiar. Primero se efecta un sombreado metlico de la superficie de la muestra, y la rplica obtenida es barrida por un haz de electrones. Los electrones secundarios que se forman son captados y convertidos en imgenes sobre una pantalla de televisin. Estos microscopio son muy tiles para revelar estructuras anatmicas submicroscpicas, sin embargo su aumento no suele pasar de 20.000.
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EL EXPERIMENTO MILLER
En 1952 H.C. Urey volvi a expresar la tesis de Oparin-Haldane en su libro "Los planetas". Tanto l como S.L. Miller iniciaron en la Universidad de Chicago una serie de experiencias para averiguar si era posible que las fuentes de energa que haba en un principio en la Tierra, hubiesen podido generar compuestos orgnicos a partir de los componentes que se encontraban en la atmsfera del planeta.
Para ello montaron un dispositivo consistente en un baln de vidrio de 5 l conectado a otro ms pequeo de 0,5 l. En el primero introdujeron una mezcla formada por H2, NH3, CH4 y H2O. En el matraz mayor situaron unos electrodos y sometieron la mezcla a una serie de descargas elctricas. La mezcla de gases era posteriormente introducida en el matraz pequeo que contena agua hirviendo. Las sustancias que se formaban en el matraz grande se disolvan en el agua del pequeo, y los gases que an no haban reaccionado se volvan al matraz grande por medio de un circuito cerrado. Al cabo de unos das Miller analiz el contenido del agua del recipiente menor y encontr una gran variedad de compuestos orgnicos y entre ellos descubri los 20 aminocidos que forman las protenas (en la tabla siguiente se relacionan los compuestos obtenidos por Miller en su experiencia).
Electrodos
Entrada de gases
Gases
C ondensador
Tom a de m uestras
Esta experiencia permiti dar una base experimental a la hiptesis de Oparin-Haldane sobre el origen de la vida.
Calor
1 La evolucin qumica. Los primeros organismos. 2 La evolucin de los organismos procariticos. 3 Origen de las clulas eucariotas 4 Orgenes de la clula vegetal y animal. 5 Origen y evolucin de los organismos pluricelulares. 6 La evolucin en los vegetales. 7 La evolucin en los animales.
"protobiontes" diferentes qumicamente del medio que les rodeaba y con una identidad propias. 4 Desarrollo de algn tipo de maquinaria reproductora que permitiese a las "clulas hijas" adquirir las caractersticas de las "clulas paternas".
1.1 Sntesis y concentracin de los monmeros biolgicos. La experiencia de Miller nos ha permitido demostrar que es posible la formacin al azar de los monmeros bsicos que constituyen los compuestos de los seres vivos a partir de las sustancias existentes en la Tierra primitiva. La energa necesaria pudo muy bien provenir de las radiaciones o de los rayos producidos por las tormentas. No obstante, las cantidades que se obtienen son muy pequeas y adems enseguida quedaran diluidas en las grandes masas de agua de los mares y lagos. De alguna manera debieron de existir mecanismos que permitieron su concentracin. Se han propuesto algunos muy sencillos como la concentracin por evaporacin o por congelacin del agua de los lagos. Otros son ms complejos; as, por ejemplo, se ha propuesto que las sustancias pudieron concentrarse al ser absorbidas selectivamente por ciertos minerales. 1.2 Polimerizacin de los monmeros. Es de destacar que las reacciones de polimerizacin se encuentran desplazadas normalmente en el sentido de los monmeros. En los seres vivos, la formacin de polmeros es posible al encontrarse catalizada por enzimas. Pero las enzimas son tambin polmeros. Cmo pudieron formarse entonces los polmeros constituyentes de los seres vivos?. Se ha observado que cuando los adenilaminocidos quedan absorbidos por ciertos minerales arcillosos, se polimerizan espontneamente formando cadenas peptdicas de 50 o ms elementos. Tambin se ha observado en mezclas secas de aminocidos una cierta tasa de polimerizacin espontnea a o o temperaturas entre los 60 C y los 130 C. En ciertas condiciones los polmeros as formados pueden llegar a tener hasta 200 aminocidos. Muy probablemente se produjo uno de estos mecanismos u otro similar. Los polmeros, una vez formados, pudieron difundirse hacia las disoluciones acuosas e irse concentrando a lo largo de millones de aos por un mecanismo similar a los estudiados en el punto anterior. 1.3 Formacin de los coacervatos Las clulas se caracterizan por mantener un medio interno qumicamente diferente del medio externo. Esto se consigue por la presencia de una membrana limitante entre ambos medios. Esta membrana impide que los componentes de la clula se diluyan y desaparezcan. Oparin estudi durante muchos aos la tendencia a aislarse de las disoluciones acuosas de polmeros para formar coacervatos: pequeas gotitas ricas en polmeros y separadas del medio acuoso por una membrana. Existen varias combinaciones de polmeros que dan lugar a la formacin de coacervatos. Por ejemplo: las de protena-hidratos de carbono, las de protena solas y las de protena-cido nuclico. Las gotitas de coacervatos son no obstante inestables. Tienen tendencia a descender hacia el fondo de la disolucin donde forman una capa no acuosa. Oparin descubri que si dotaba a los coacervatos de molculas que les permitiesen llevar un cierto metabolismo celular, se hacan ms estables. As, al aadir al medio la enzima fosforilasa, sta se concentraba en el interior de las gotitas. Si posteriormente se aada glucosa-1-fosfato, sta se difunda haca el interior y la enzima la polimerizaba formando almidn. El almidn se va aadiendo a la membrana de la gotita con lo que aumenta de tamao. Cuando el coacervato es excesivamente grande se divide espontneamente dando lugar a varias gotitas "hijas". La energa necesaria proviene del enlace rico en energa de la glucosa-1-fosfato. Si se le aaden al medio otras enzimas, los coacervatos se van transformando en estructuras con un metabolismo y una individualidad qumica que realizan intercambios de materiales y energa. Los coacervatos no son seres vivos pero poco les falta para serlo. Podramos pensar que en el origen de la vida pudo pasar un proceso parecido y que poco a poco las "gotitas de vida" que tuviesen un metabolismo ms adecuado "sobreviviran" ms tiempo y pudieron aumentar en tamao y nmero. 1.4 Adquisicin de la maquinaria gentica. Se trata de algo para lo que no disponemos de modelos de laboratorio. Adems, la complejidad del material gentico y su gran diversidad no nos dan muchas pistas acerca de como pudo suceder el proceso. Es posible que los primeros coacervatos estuviesen constituidos por ADN u otros polinucletidos que fuesen capaces de autoduplicarse y de traducirse a protenas. Aunque la secuencia primaria de sta fuese al azar, pudieron formar una membrana protectora que envolviese al ADN. Se pudo establecer as una relacin mutua: el ADN se traduca a protenas y stas protegan al ADN formando una membrana a
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2) LA EVOLUCIN DE LOS ORGANISMOS PROCARITICOS Los distintos pasos descritos hasta ahora debieron de dar lugar a los primeros seres vivos. Posiblemente se trat de organismos similares a las bacterias fermentadoras, como las actuales del gnero Clostridium, aunque naturalmente su maquinaria bioqumica sera mucho ms simple. Estos organismos debieron de sobrevivir a base de fermentar los componentes orgnicos que se haban formado a lo largo de millones de aos de evolucin qumica. La disminucin de la cantidad de materia orgnica, como consecuencia de los propios procesos de fermentacin, debi de estimular el desarrollo de los primeros organismos fotosintticos. Parece ser que la fotosntesis basada en el SH2 como fuente de hidrgeno y electrones, como lo hacen en la actualidad las bacterias del azufre, es anterior a la fotosntesis basada en el H2O. Esta hiptesis se fundamenta en el hecho de que la atmsfera primitiva de la Tierra era rica en SH2. Adems, la maquinaria bioqumica que se necesita para la fotosntesis basada en el SH2 es menos compleja que la fotosntesis basada en la fotolisis del H2O. No obstante, la abundancia de H2O trajo este tipo de fotosntesis. Los primeros organismos en dar este gran paso debieron ser similares a las cianobacterias, llamadas tambin algas verde-azuladas. Las cianobacterias actuales, como las del gnero nostoc, son organismos procariotas que forman colonias multicelulares de aspecto filamentoso. Durante los 2000 millones de aos siguientes (hasta hace 1500 millones de aos) estos organismos revolucionaron la composicin qumica de la atmsfera. La produccin de oxgeno transform la atmsfera reductora en una atmsfera oxidante y se form adems una capa de ozono (O3) que filtr considerablemente los rayos ultravioleta. El oxgeno comenz a concentrarse en la atmsfera en un porcentaje superior al 1% hace unos 2000 millones de aos. Esto se sabe porque los granos del mineral de uranio llamado uraninita se oxidan rpidamente si la concentracin de oxgeno es superior al 1%. El xido de uranio as formado se disuelve en el agua y es arrastrado hacia los mares donde se mantiene en disolucin. Efectivamente, slo encontramos depsitos de uraninita en sedimentos que tiene una antigedad superior a los 2000 millones de aos y no se encuentran cuando los estratos son ms jvenes. Un resultado similar lo proporcionan los estudios basados en la formacin de los depsitos de xido de hierro.
La reproduccin sexual fue lo que permiti la diversificacin de los seres vivos, la aparicin de los organismos megascpicos y que estos alcanzasen la gran complejidad que tiene en la actualidad. Segn la Teora de la Simbiognesis (Lynn Margulis. Chicago 1938) las clulas eucariotas seran el resultado de la simbiosis de diferentes organismos procariotas. Esto se basa en el hecho de que muchos orgnulos y estructuras celulares (mitocondrias y plastos,) poseen su propio ADN, e incluso sus propios ribosomas, ambos de tipo bacteriano.
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