Microbiologa I

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1.2. MICROBIOLOGA: Definicin. Relacin con otras ciencias. Bacterias, rickettsias, virus, y hongos: su naturaleza. Distribucin y funcin. Clasificacin de la microbiologa. Bacteriologa divisin. La microbiologa es la rama de la biologa que se encarga del estudio de los microorganismos; organismos procariotas o eucariotas simples, que slo son visibles a travs del microscopio. Se relaciona con ciencias como la veterinaria, no slo por el dao que los microorganismos producen en la salud de los animales, sino tambin por las enfermedades que stos pueden transmitirle al hombre. Pero no todos los microorganismos son patgenos, la mayora, de hecho, son apatgenos y muchos son utilizados en la industria alimenticia (quesos, vino, yogurt), en la fabricacin de medicamentos (ATB), en curtiembres y en ecologa para la degradacin de distintos compuestos. La microbiologa estudia 4 tipos de microorganismos: bacterias, virus, levaduras y mohos. Y se divide en 4 ramas: parasitologa, micologa, bacteriologa y virologa. A su vez, se puede clasificar en microbiologa: general, industrial, ecolgica, sistemtica, agrcola y mdico/sanitaria. Los microorganismos se encuentran distribuidos en el suelo, aire, y agua, y algunos en los organismos vivos (piel, mucosas, intestino) formando parte de la flora normal y son denominados microorganismo nativos. Bacteriologa, divisin: las bacterias son procariotas que se dividen en 4 categoras principales. Eubacterias Gram- que tienen pared celular: poseen una pared completa (membrana externa y una fina capa de peptidoglicano que contiene cido murmico). Pueden ser esfricas, ovales, bacilos rectos o curvos, helicoidales o filamentosos. Se reproducen por fisin binaria principalmente.

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Eubacterias Gram+ que tienen pared celular: procariontes que tiene un perfil de pared de G+, aunque no siempre tien como tal. Pueden ser esfricas, bacilos o filamentos, pero muchas muestran verdaderas ramas. Se reproducen por fisin binaria, algunas producen esporas y formas de descanso (endosporas o esporas en hifas). Eubacterias que carecen de pared celular: procariontes que han perdido su pared celular, llamados Mycoplasmas e incluyen las clases Millicutes (que no sintetizan los precursores de peptidoglicanos). Estn encerrados en la membrana plasmtica. Son altamente pleomorfos, aunque las formas filamentosas con proyecciones en forma de ramas son comunes. Se reproducen por divisin por gemacin, as las clulas permanecen unidas entre s por medio de hifas. Las clulas se tien como Gram, usualmente no son mviles, las colonias tiene aspecto de huevo frito. Los organismos recuerdan a las formas L-bacterianas, aunque se diferencian de stas ya que no revierten a las forma primaria. Archeobacterias: microbios terrestres y acuticos, que ocurren en ambientes anaerobios, hipersalados, en ambientes geotermales y como simbiontes en el intestino animal. Algunas especies crecen por encima de los 100C. poseen lpidos de glicerol isopranil ter. La prdida de murena en las clulas hace a las Archeobacterias insensibles a los Antibioticos b-lactmicos. Con la coloracin de Gram pueden aparecer como positivos (con pseudomurena) o negativos. Cada una de ellas se divide en clases, rdenes, familias o grupos morfolgicos (si no hay familia.), gnero y especie. 1.3. ESTERILIZACIN: Asepsia y antisepsia: definiciones. Esterilizacin por calor y por filtracin. Agentes qumicos. Valoracin de la accin desinfectante. Coeficiente fenol. Bioseguridad en el laboratorio. La esterilidad indica la ausencia total de formas viables de microorganismos. No existen grados de esterilidad y es por lo tanto un trmino absoluto . Asepsia (sin sepsis) que consisten en evitar la sepsis mediante procedimientos que intentan impedir la introduccin de microorganismos y reducir el nmero de los que estn presentes

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Antisepsia (contra la sepsis) que es el proceso que se aplica al tejido vivo con el objeto de prevenir la multiplicacin de las formas vegetativas de los grmenes y provocar la sepsis. Desinfeccin consiste en la destruccin de los microorganismos patgenos en estado vegetativo que se encuentran sobre elementos inertes. Control del crecimiento microbiano: puede hacerse de dos maneras; matando al microorganismo o inhibiendo su crecimiento. El control del crecimiento generalmente involucra el uso de agentes fsicos o qumicos que matan o previenen dicho crecimiento. Los agentes que matan las clulas se denominan con la terminacin cida o biocida, mientras que los agentes que inhiben el crecimiento de las clulas (sin matarlas) son llamados agentes estticos. Por ej.: fungicida, bacteriosttico.

Agentes Fsicos CALOR Es el mtodo ms confiable para la esterilizacin. El tiempo de esterilizacin est relacionado con el tiempo de exposicin. Tres parmetros pueden ser usados para indicar el grado de resistencia al calor que tiene los microorganismos. El punto trmico letal: que es la temperatura ms baja en la cual muere una poblacin bacteriana en determinado tiempo (10min.)

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El tiempo trmico letal: que es el menos tiempo necesario para matar el 100% de una poblacin a determinada temperatura bajo condiciones especficas del medio La reduccin decimal del tiempo: es el tiempo en minutos necesario para matar el 90% de la poblacin. Es una modificacin del tiempo trmico letal. CALOR SECO Puede clasificarse en calor directo (o incineracin), como la llama del mechero de Bunsen. Pasar los objetos por la llama es til para esterilizar tijeras y pinzas, que se sumergen previamente en alcohol y se dejan flamear fuera de la llama del mechero para evitar que se destemplen, pero no es el mtodo de eleccin para esterilizar el material de ciruga. Tambin se emplea para esterilizar el asa del mango de Kolle, antes y despus de efectuar la siembra. El mismo mtodo se usa para destrus animales de laboratorio infectados, esqueletos y otros materiales de en hornos crematorios. El calor seco puede aplicarse en forma indirecta mediante el uso de hornos de esterilizacin de aire caliente. (160C durante 2hrs. 170C durante 1 hr.), se recomienda para elementos de vidrio (placas de Petri, pipetas, Erlenmeyer) o de metal. Pero no se emplea para material de caucho, papel o telas porque se queman, ni tampoco para medios de cultivo. En el caso de los elementos de vidrio hay que tener en cuenta que, en el proceso trmico, puede variar su tamao hasta un 5%, por lo que no es recomendable para material de mediciones volumtricas. Tiene la ventaja de eliminar los pirgenos de las bacterias G-. Dentro de un horno NO VENTILADOR se produce una estratificacin del calor, donde las temperaturas ms altas se registran en la bandeja inferior y las ms bajas en la superior, lo que debe tenerse en cuenta cuando se acopian grandes cantidades de material. Con un sistema de ventilacin forzada se logra unificar las temperaturas y solucionar as ste problema. CALOR HMEDO Con presin: autoclave Cuando a un lquido cualquiera se le aplica calor, se calienta hasta cambiar su estado y pasar a su forma gaseosa. La temperatura que alcanza un lquido para pasar a al estado gaseoso se llama punto de ebullicin (ste punto no se altera por mucho calor que se le aplique). Mientras el lquido est recibiendo calor, aumenta su temperatura, pero llegando al punto de ebullicin, se necesita calor extra, el cual es usado para vencer la presin que ejerce la atmsfera sobre la superficie del lquido y convertirse en vapor; esta cantidad extra de calor se denomina calor de vaporizacin. Este fenmeno se produce exactamente en direcciones opuestas; si el vapor es enfriado, llega a convertirse en lquido, y en ese cambio de estado emite exactamente

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el mismo calor que recibi para convertirse en vapor. Este fenmeno se denomina condensacin. El agua con presin atmosfrica, al pasar al estado de vapor, aumenta considerablemente su volumen. Este aumento es contenido por las paredes del autoclave, las que, al no poder aumentar su volumen, incrementen la presin interna. Este aumento de presin hace que el agua cese de bullir y que, por el momento, se establezca un equilibrio, el que no es ms que un punto de ebullicin del agua a esa presin. Se necesita otra vez cierta cantidad de vapor para producir ms vapor y, como consecuencia, aumentar la presin. Esta situacin se repetira hasta que la presin destruira las paredes del autoclave, lo cual se evita con una vlvula de seguridad que a cierta presin deja escapar el vapor. El calor sensible es la cantidad de calor necesaria para llevar 1 litro de agua a ebullicin, el calor latente es el necesario para llevar 1 litro de agua hirviendo a vapor. En el autoclave debe existir, por lo tanto, una relacin constante entre presin y temperatura, en la cual el volumen no vara. Esta relacin se produce slo si el gas que se encuentra en su interior es vapor de agua saturado, si no hay condensaciones bruscas y hay buena circulacin del vapor. El autoclave: dentro de los autoclaves usados en laboratorios se encuentras los de tipo Chamberland. Este es uno de los ms sencillos, existen modelos verticales, horizontales y de diferentes tamaos, pero todos con el mismo principio. Estn constituidos por la caldera de cobre batido y estaado interiormente, sostenido por una cmara metlica. En su parte inferior lleva una fuente calrica, a gas o elctrica (o calderas en industrias). En la parte superior lleva una tapa que debe poseer los siguientes elementos: a) Un termmetro indicador de temperatura (100C 200C) b) Un nanmetro, indicador de presin. (libras/pulgadas, kg/cm en atmsferas) c) Una espita, que sirve para liberar el aire durante el calentamiento (purga). d) Una vlvula de seguridad que permite el escape del vapor a presin que hay en el interior, cuando excede la adecuada. En el interior del autoclave se encuentra un enrejado y una lmina cribada, sobre la cual se apoya el material a esterilizar. Ciclo de esterilizacin por autoclave: 1. Tiempo de calentamiento del autoclave, aprox. 20 min desde 20C (temperatura ambiente) a 121C.

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2. Tiempo de penetracin: tiempo que tarda el calor en llegar a todo el objeto (121C). (El calor debe penetrar el contenedor, el recipiente y el volumen de lo que se desea esterilizar hasta llegar a su centro). 3. Tiempo de alojamiento: es el tiempo que va a estar el objeto a la temperatura de 121C. contempla el tiempo de muerte ms el de seguridad. 4. Tiempo de enfriamiento: desde 121C hasta 60C. Controles de esterilizacin: Mtodo qumico: consiste en introducir papeles en forma de cintas adhesivas que contienen sustancias que, a determinada temperatura, cambian de color (generalmente 120C y, por ej., de gris a negro). Peor no indican tiempo de exposicin. Mtodo biolgico: es el ms seguro, consiste en introducir entre los elementos a esterilizar un tubo con trozos de papel de filtro embebidos en un cultivo de un microorganismo esporulados, resistente a altas temperaturas, apatgenos y fciles de cultivar. Luego de realizada la esterilizacin se lleva el papel a un medio de cultivo y se incuba durante 24 hrs. A 56C. la falta de desarrollo indicar que la esterilizacin a sido correcta. Este mismo papel viene encerrado en una ampolla que tiene un indicador prpura de bromocresol, que vira a amarillo si el microorganismo es capaz de crecer. Mtodo fsico, de termocuplas: consiste en un electrodo ubicado en el interior del autoclave que va conectado por fuera a una aguja inscriptora que registra en un grfico la temperatura en funcin del tiempo de esterilizacin. Cualquier variacin de temperatura por debajo de la necesaria se debe agregar como tiempo extra de esterilizacin. Sin presin: Ebullicin: el agua en ebullicin alcanza una temperatura de 100C a nivel del mar, la cual destruye en unos 10 min. las formas vegetativas de la mayora de las bacterias y muchos virus, pero no tiene efecto sobre las esporas y ciertos virus como la hepatitis humana y la anemia infecciosa equina. Es un mtodo til para higienizar o disminuir la carga bacteriana en forma rpida y con un equipo sencillo. Se utiliza para ciertos elementos como; jeringas, utensilios varios y an instrumental de ciruga en casos extremos. Tindalizacin: este proceso de conoce tambin como esterilizacin fraccionada. Consiste en 3 calentamientos de 60-80C durante 30 minutos, separados por 2 incubaciones de 37C durante 24horas. Con el primer calentamiento se destruyen las formas vegetativas. Con la incubacin, las esporas presentas pasan a formas vegetativas que se destruyen con el segundo calentamiento. Este se repite para asegurar la esterilizacin. Se emplea sobre elementos en los

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cuales la alta temperatura pueda alterar sus propiedades, como por ej.; hidratos de carbono y leche. Es poco usado en laboratorios. Pasteurizacin: no es una tcnica de esterilizacin, ya que se eliminan solamente las formas vegetativas de los microorganismos. Se aplica a sustancias que no toleran la temperatura de esterilizacin sin perder sus caractersticas organolpticas. Para establecer la temperatura y el tiempo adecuados, se tiene en cuanta la resistencia de los patgenos que con mayor frecuencia se encuentran el producto. xido de etileno: es un agente qumico, pero se lo tiene en cuenta porque es esterilizante. Es un gas muy soluble en agua y explosivo. Al igual que el formol, acta como agente alquilante, sustituyendo los tomos de H en radicales NH, OH, COOH y HS de las protenas, combinndose de forma irreversible y desnaturalizndolas. Es muy eficaz tanto en formas vegetativas como en formas esporuladas. Constituye un excelente medio de esterilizacin para superficies secas, pero es ms lento que el vapor y ms costoso. Por otro lado resulta peligroso por ser explosivo y puede dejar residuos txicos, no se descarta una posible actividad mutagnica y carcinognica. Se utiliza para esterilizar objetos sensibles al calor como materiales plsticos, sondas, jeringas, cnulas, guantes, instrumental de ciruga y equipos quirrgicos. Se puede utilizar con o sin autoclave. En el primer caso, se colocan los elementos a esterilizar dentro de una bolsa de polietileno de no ms de 100um de espesor, se hace vaco y luego se llena el autoclave con el gas que viene en garrafa. En el segundo caso se coloca el material dentro de una bolsa y esta, a su vez, dentro de otra bolsa que contiene una ampolla de xido de etileno, se cierra la ampolla y se rompe la ampolla. Luego de 24 hrs. el material est estril, pero de deben esperar otras 24 horas para utilizar su contenido por los residuos txicos. FRO Las temperaturas inferiores a la ptima para el desarrollo disminuyen la actividad microbiana y, si son bastante bajas, sta cesa, al igual que el metabolismo. Las bajas temperaturas son tiles para preservar cultivos, los cuales pueden almacenarse durante largos perodos a temperaturas de refrigeracin (4-7C). Muchas bacterias, y sobre todos muchos virus, se mantiene con xito congelados a temperaturas de -20 a -70C. en estos procedimientos, el enfriado inicial mata a cierta parte de la poblacin, pero los sobrevivientes permanecen viables durante largo tiempo. A esto se debe que las bajas temperaturas, an excesivas (-196C del N lquido), no se puedan emplear como mtodo de esterilizacin. Los microorganismos mantenidos a baja temperatura se consideran en latencia, ya que no desarrollan actividad metablica detectable.

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Los procesos de congelamiento y descongelamiento repetidos producen un efecto destructivo sobre los microorganismos. Este efecto parece depender de dos fenmenos: uno menor, que consiste en la formacin de cristales de hielo que ocasionan lesiones sobre las membranas. Y otro ms importante, que es la formacin de cristales de hielo extracelulares, que causan la salida de agua desde el interior de la clula, y da como resultado el aumento de la concentracin intracelular de electrolitos y la desnaturalizacin de las protenas. Con la lesin de la membrana se produce la salida de compuestos intracelulares y por ende la muerte celular. FILTRACIN Se entiende por filtracin al pasaje de un fluido (lquido o gas) a travs de una sustancia porosa que retiene a los microorganismos contenidos en l. Este medio es un material fibroso o poroso que contiene perforaciones o poros interconectados entre s de manera tal que permita el paso del fluido. Mecanismos que interactan en la retencin de partculas: los slidos suspendidos en un fluido son retenidos por medio de 3 mecanismos. 1) Intercepcin directa o tamiz: en un medio filtrante se pueden observar un conjunto de fibras que definen poros o ranuras a travs de las cuales para un fluido. Si las partculas en el fluido son mayores que los poros, sern retenidas. An las partculas ms chicas son muy irregulares en su forma, y producen un efecto puente sobre las aberturas el filtro. 2) Mecanismo de inercia: las partculas en un fluido en movimiento tienen masa y velocidad, y por lo tanto una cantidad de movimiento asociada a ella; a medida que el lquido y las partculas pasan a travs del medio filtrante, la vena fluida sigue la trayectoria de menor resistencia al flujo y se desva alrededor de la fibra. Una partcula impulsada por la vena fluida, debido a su masa y velocidad, no sigue el trayecto de sta, e impacta con la fibra y queda retenida. 3) Intercepcin por difusin: es un mecanismo inverso al de la inercia, para partculas extremadamente pequeas, submicrnicas. En este proceso las partculas se encuentran en choque permanente con las molculas del fluido. Estos choques frecuentes hacen que las partculas suspendidas se muevan con movimientos desordenados alrededor de las lneas de la vena fluida. estos movimientos que pueden observarse con el microscopio, se denominan movimientos brownianos . La difusin browniana es la causa de que las partculas pequeas se desven de la lnea de flujo, con lo cual aumenta la posibilidad de que impacten la superficie de las fibras y sean all retenidas. Clasificacin de los filtros: Filtros de poros deformables: dependen de los mecanismos de separacin por inercia o difusin browniana.

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Filtros de poros fijos o indeformables: depende de los mecanismos de intercepcin directa o tamiz, aunque a veces pueden actuar mecanismos de impacto inercial o intercepcin por difusin. Sistemas de filtracin: Filtracin por presin positiva: Se realiza introduciendo el lquido a filtrar en un contenedor de cierre hermtico, que posee una vlvula de entrada de agua a presin mediante un compresor. El conductor de salida del lquido a filtrar es inferior, y el lquido es transportado mediante gomas hasta el soporte del filtro. Este consta generalmente de dos partes, una superior y otra inferior, y el elemento filtrante se coloca entre ambas. El lquido atraviesa el filtro y de la pared del soporte saldr el lquido filtrado, que es conducido mediante gomas al elemento receptor final. Todos los elementos deben haber sido autoclavados antes de la filtracin. Este sistema puede ser utilizado en filtros de jeringas: consiste en colocar el lquido a filtrar en una jeringa (de vidrio y a rosca), el elemento filtrante en su extremo y hacer presin (+) en el mbolo, de esta forma el lquido atraviesa el filtro y luego es recogido en algn recipiente estril. Filtracin con presin negativa: En necesario contar con una bomba de alto vaco conectada a un frasco Kitasato mediante mangueras de goma rgida para evitar que colapsen. El soporte del filtro es colocado sobre el Kitasato, y el lquido a filtrar sobre un receptor superior. El vaco producido por la bomba har que el lquido atraviese el filtro y sea recibido en el frasco Kitasato. Aplicacin: Los filtros sirven para tratar fluidos. Como este proceso no produce elevacin de la temperatura, es til para esterilizar lquidos como medios de cultivo que no resisten el tratamiento trmico, sueros u otras sustancias que contienen protenas que se desnaturalizaran con el calor. Tienen como inconveniente que el proceso suele ser algo tedioso, ya que es necesario filtrar sucesivas veces un mismo elemento para lograr su esterilizacin. Otra aplicacin son los filtros absolutos, tambin llamados HEPA (High Efficiency Particulate Air) destinados a la filtracin de aire en un flujo laminar. El HEPA, por definicin, es un filtro con una eficiencia mnima de 99.97% en la partcula ms difcil de filtrar, que es la de 0.03um de dimetro. Consta de una sola hoja de papel de celulosa, amianto y fibra de vidrio de dimetro inferiores al micrmetro, ste papel es

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doblado en muchsimos pliegues que se mantienen separados por entre s por medio de separadores metlicos o de cartulina corrugada. El flujo laminar: las reas estriles son ambientes cerrados y pasteurizados con una sobrepresin de aire donde ste entra al rea a travs de filtros de muy alta eficiencia (HEPA). Pueden observarse dos tiempos de flujo laminar: 1) Destinado a la preparacin de medio, y trabajo con sustancias no peligrosas. (el flujo de aire estril llega al operador, se protege el producto) 2) Destinado al uso de sustancias peligrosas, la corriente de aire circula dentro de la campana impidiendo la salida de aire hacia el operador. (se protege al operador).

ULTRAPRESON Tanto la alta como la baja presin, no parecen producir la muerte de las bacterias, sin embargo los microorganismos no sobreviven a los cambios bruscos de presin. El fraccionador de Ribi produce la ruptura de la clula primero creando alta presin y despus expulsndolas a travs de un pequeo orificio que est sujeto a presin atmosfrica normal. Este proceso depende de la formacin de burbujas de gas intracelulares para su efecto. ULTRASONIDO Mediante osciladores snicos se puede lograr vibraciones con una frecuencia que puede llegar a 20.000Hz., lo que produce un fraccionamiento celular. Pero no suele utilizarse como mtodo de esterilizacin ya que quedan muchas clulas vivas El fundamento radica en que, al pasar el sonido a travs de un lquido, provoca cambios de presin, los cuales generan cavidades en el lquido, las cuales aumentan su tamao hasta que colapsan violentamente produciendo altas velocidades y presiones que desintegran a las clulas. RADIACIONES La energa se transmite a travs del espacio en una gran variedad de formas, una de ellas es la radiacin. Dentro de stas se encuentran las ionizantes o electromagnticas de alta energa, y las no ionizantes o de baja energa. Radiaciones ionizantes: comprende los rayos alfa, beta, gamma y X, los cuales poseen suficiente energa para empujar los electrones fuera de las molculas y ionizarlos, mediante una reaccin en cadena. Cuando las radiaciones pasan a travs de las clulas se producen H libres, radicales HO y algunos perxidos que ocasionan diferentes tipos de dao intracelular. Como el dao recae en una gran variedad de constituyentes celulares, la radiaciones ionizantes son poco especficas en sus efectos, pero tiene alto poder de penetracin.

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Radiaciones no ionizantes: comprende la radiaciones ultravioletas (UV) e infrarrojas (IR). La luz UV es absorbida por muchos materiales celulares, peor es en los c. nucleicos donde causa mayor dao. Esta absorcin se efecta sobre todo en sus bases pirimdicas, donde puede formar un dmero entre dos bases vecinas que, al menos que sea desdoblado por enzimas intracelulares especficas, inhiben la replicacin del ADN. Las radiaciones IR son inicuas a las sustancias qumicas y, por lo tanto, a los microorganismos. nicamente causan un alargamiento y desdoblamiento molecular y algo de rotacin, de manera que no les da la energa suficiente para reaccionar.

Agentes Qumicos
Los antimicrobianos son agente qumicos que matan o inhiben el crecimiento de los microbios. stos incluyen preservantes qumicos y antispticos, adems de frmacos usados en el tratamiento de enfermedades infecciosas de las plantas y los animales. Los agentes antimicrobianos pueden ser de origen natural o sinttico, y pueden tener un efecto biocida o bioesttico.
Alcoholes Iodo Antispticos Agentes catinicos, aninicos y anfteros rgano Mercuriales Colorantes Cloro y Compuestos clorados Aldehdos Desinfectantes y/o Esterilizantes Oxido de Etileno Compuestos Fenlicos cidos y lcalis

Tipos de agentes antimicrobianos: - Antispticos: agentes microbicidas poco txicos que pueden ser aplicados sobre la piel o membranas mucosas; no deben ser ingeridos. Por ej.: alcoholes, detergentes, soluciones de yodo. - Desinfectantes: agentes que matan a los microorganismos pero no necesariamente a sus esporas; no son seguros para su uso en tejidos vivos. Se utilizan sobre objetos inanimados como pisos, mesadas, utensilios. Por ej.: cloro, hipoclorito, compuestos de amonio cuaternario, sulfato de cobre. Los desinfectantes y los antispticos se definen sobre la base de seguridad de uso sobre las membranas mucosas por ello, en algunos casos, un mismo compuesto,

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dependiendo de su concentracin, puede ser un desinfectante o un antisptico. Por ej.: hipoclorito de sodio. Conservantes o preservativos: son agentes estticos usados para inhibir el crecimiento de microorganismos, utilizados con frecuencia en alimentos. Obviamente, si son ingeridos, no deben ser txicos. Por ej.: propionato de Ca, benzoato de Na, nitrato, etc. Coeficiente Fenol. Es un valor experimental que se realiza a las sustancias que tienen propiedades biocida, tomando como referencia la capacidad biocida del fenol. El mtodo estandarizado para obtener el valor del coeficiente fenlico, es una modificacin de la tcnica de dilucin en tubo, en la cual se prepara una serie de tubos conteniendo cada uno 5 ml de diferentes diluciones del desinfectante. A la vez se prepara una segunda serie de tubos que contengan diferentes diluciones de fenol. Cada tubo de las dos series se inocula con 0,5 ml de un cultivo de 24 horas del microorganismo utilizado como prueba (cepas especficas de Salmonella typhi o Staphylococcus aureus). A los 5, 10 y 15 minutos se recoge una cantidad alcuota de cada tubo que se inocula en otro tubo que contenga medio de cultivo estril. Estos tubos inoculados se incuban durante 24 a 48 horas y se observa el crecimiento del microorganismo (aparicin de turbidez). La mayor dilucin del desinfectante que mate a los microorganismos en 10 minutos pero no los mate en 5 minutos se divide por la dilucin mayor de fenol que d los mismos resultados. El nmero obtenido es el coeficiente fenlico de ese desinfectante. Bioseguridad en el laboratorio. El laboratorio biolgico representa un riesgo potencial de exposicin a la enfermedad especializado y auxiliar al trabajar con material infeccioso. Por lo tanto, se deben administrar todas las medidas necesarias para que el ambiente institucional est exento de microorganismos hasta el lmite de lo posible. Toda actividad conlleva un riesgo, pero su conocimiento anticipado puede prevenirlo o controlarlo. Los riesgos potenciales del laboratorio pueden referirse a; materiales infecciosos, qumicos o radioactivos y a las instalaciones fsicas. Los objetivos de la bioseguridad consisten en proteger al laboratorio, a la comunidad y al medio ambiente de agentes potencialmente peligrosos. Los factores aplicables al agente incluyen: virulencia, dosis infecciosa, vas de infeccin y toxigenicidad.

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En cuanto al hospedador, las variables que influyen en el riesgo son: edad, sexo, raza, embarazo, presencia y nivel de anticuerpos o inmunidad celular y disponibilidad y uso de vacunas, compuestos teraputicos especficos o medicamentos. Finalmente el tiempo de actividad: diagnostico, produccin, investigacin) pueden afectar notablemente el riesgo del personal debido al tipo, la cantidad y la concentracin de agentes manejados y manipulaciones utilizadas en la tarea.pos de riesgo.

Segn el riesgo relativo que entraan los microorganismos infectantes, se pueden clasificar 4 grupos de riesgo. Escaso riesgo individual y comunitario. Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades humanas o enfermedades de importancia veterinaria en los animales. Riesgo individual moderado, riesgo comunitario limitado. Agente patgeno que puede provocar enfermedades humanas o en animales, pero que tiene un riesgo grave para el personal del laboratorio, la comunidad, el ganado o el medio ambiente. La exposicin en el laboratorio puede provocar una infeccin grave, pero se dispone de medios de tratamiento y de prevencin y el riesgo de propagacin es limitado. Riesgo individual elevado, riesgo comunitario escaso. El agente patgeno suele provocar enfermedades humanas graves, pero de ordinario no se propaga de una persona infectada a otra. Elevado riesgo individual y comunitario. Agente patgeno que suele provocar enfermedades graves en las personas o animales y que puede propagarse fcilmente de un individuo a otro directa o indirectamente.

Grupo de riesgo I

Grupo de riesgo II

Grupo de riesgo III

Grupo de riesgo IV

En cuanto al los laboratorios, se clasifican segn sus caractersticas de diseo, construccin y medios de contencin en 3 tipos: laboratorios bsicos, laboratorios de contencin y laboratorios de contencin mxima. Normas de bioseguridad: Los errores humanos y las prcticas incorrectas de laboratorio pueden contrarrestar la eficacia de las medidas y los aparatos que se utilicen para proteger a las personas. Por sta razn el elemento clave para prevenir accidentes e infecciones es un personal preocupado por la seguridad y bien informado sobre la manera de reconocer y combatir los riesgos presentes en el laboratorio: Inhalacin: formacin de aerosoles) siembra de placas, pipeteo, centrifugacin, esterilizacin a la llama de de asas de platino, apertura de recipientes de cultivo. Ingesta: manipulacin de muestras, frotis y cultivos. Eliminacin de material infeccioso.

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Eliminacin de materiales: La descontaminacin (desinfeccin o esterilizacin) y eliminacin de desechos son operaciones ntimamente relacionadas. Los mtodos y las instalaciones para efectuar la evacuacin comprenden desde lo ms simple, hasta lo ms complejo. Los desechos de laboratorio no pueden ser desechados de la misma forma que los desechos de una casa. Por lo tanto hay que establecer categoras: Desechos no contaminados que pueden eliminarse con la basura: evitar su acumulacin para prevenir que alberguen microorganismos que puedan propagarse a otra rea del laboratorio. Objetos aguzados y cortantes: se colocan en recipientes que no puedan ser fcilmente perforados, cuando se llenaron, se colocan dentro de otro recipiente para ser incinerados (aunque hayan sido esterilizados en autoclave) Material contaminado para tratamiento en autoclave y reutilizacin: se colocan en el autoclave junto con desinfectantes. Material contaminado para eliminacin; autoclave e incinerador. *En la incineracin se destruye el contenido y el continente. Pautas complementarias de la bioseguridad en el laboratorio: La experiencia ha demostrado que la inocuidad del trabajo de investigacin con microorganismos peligrosos depende de: las buenas prcticas de laboratorio, la disponibilidad y el uso de equipos de contencin y el diseo y funcionamiento del local. Hbitos y prcticas de higiene personal: Muchas prcticas de higiene personal en el laboratorio estn destinadas a prevenir lesiones o enfermedades directamente relacionadas con el trabajo. Las precauciones y prcticas recomendadas son; Lavado de manos: las manos nunca estn libres de grmenes, estos pueden ser transitorios (recogido por contacto con material contaminado, no sobreviven indefinidamente pero pueden ser transmitidos al paciente) o residentes (no provocan infeccin al menos que entren en contacto con heridas abiertas). Para efectuar un buen avado existen 3 factores esenciales: agua corriente, jabn y friccin. Ropa y equipos de proteccin: se emplean ropas y equipos especiales para proteger al personal del laboratorio en contacto con agentes infecciosos, txicos, corrosivos, calor excesivo, fuego, para evitar la contaminacin de los materiales de experimento, etc. La clase ropa y equipos ser acorde a la naturaleza de la investigacin y los peligros que sta conlleve, y debern ser utilizados correctamente para beneficiarse de la protecciones que proporciona. La ropa suele ser de algodn o polister, o una mezcla de los dos. Los microorganismos permanecen viables en tejidos de algodn o lana y pueden propagarse fcilmente a travs de stos, por sta razn es necesario usar una prende protectora como guardapolvo o delantal (que no deben salir del laboratorio sin ser desinfectados).

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Otra prenda importante del equipo son los guantes de seguridad. Deben ser cmodos y lo suficientemente largo como para evitar la exposicin de la mueca. Segn el uso que se pretenda darles, los guantes deben ser de una composicin y un modelo que proporcione agilidad, fuerza, baja permeabilidad y resistencia a la penetracin de objetos puntiagudos y proteccin contra fro y calor. No se puede esperar que una clase sea satisfactoria para todos los usos. Limpieza del laboratorio: compete al supervisor del laboratorio determinar con qu frecuencia se har de efectuar la limpieza, individual y colectiva, suministrar los planes respectivos y realizar inspecciones a menudo para cerciorarse de su cumplimiento. Cuidado del piso: se debe evitar barrer y limpiar el polvo en seco para disminuir la formacin de aerosoles ambientales no especficos. Se recomienda limpiar con agua o con una aspiradora equipada con filtro HEPA. o Si no hay derrames peligrosos visibles, la tarea de limpieza consistir en aspirar y luego limpiar con un trapeador humedecido con una solucin descontaminante que contenga detergentes. Barrida en seco: no es un mtodo recomendado, pero de ser preciso su uso, se deben evitar la formacin de aerosoles de polvo Seleccin de una solucin de limpieza: la seleccin de una mezcla de desinfectantes y detergentes para la limpieza se basar en las exigencias de rea que tenga la mayor posibilidad de contaminacin con el ms amplio espectro de microorganismos (detergentes + fenoles). Lavado con agua con el mtodo de los dos baldes: se emplea un dispositivo que consta de dos baldes, uno celeste y otro rojo. El primero contiene una solucin limpia de detergente y desinfectante que se aplica en el piso con un trapeador, y el segundo (vaco) recoge la solucin que se saca del trapeador el retorcerlo dentro del mismo. Si la limpieza se efecta despus de un derrame de material infeccioso, la solucin usada para desinfectar debe esterilizarse en autoclave o tratarse con cloro (dejar en contacto por 15) antes de ser desechada por la alcantarilla sanitaria. Plan de emergencia: Los laboratorios que trabajan con agentes infecciosos deben contar con planes de emergencia para anticiparse al tipo de accidentes ms probables dentro de las instalaciones. Es responsabilidad del supervisor del laboratorio: Valorar la probabilidad de accidentes y emergencias en las tareas operativas del laboratorio. Preparar un plan de emergencia. Instruir al personal en los procedimientos aplicables. Ensayar la aplicabilidad de dichos procedimientos.

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1.4. MORFOLOGA MICROBIANA: I.Bacterias: forma, tamao y agrupacin. II.Rickettsias: forma, tamao y disposicin. III.Virus de animales, de plantas y de bacterias: Forma, tamao. IV.Hongos: Mohos y levaduras. Micelio, forma y tamao. Estructura de los cuerpos o formaciones fructferas. Reproduccin asexuada y sexuada. Su importancia en taxonoma. Bacterias: Las bacterias o eubacterias son microorganismos unicelulares que pertenecen al dominio Bacteria. Los miembros de este dominio tienen diferencias con aquellos pertenecientes a los otros dos dominios, Archaea y Eukarya. En la Tierra, existen slo dos tipos bsicos de clulas que son estructuralmente muy diferentes: las procariontes y las eucariontes. Las bacterias son clulas procariontes. Estas clulas poseen un nico cromosoma desnudo, es decir, que este cromosoma no se halla envuelto por una membrana nuclear sino que se halla en el citoplasma. Algunos investigadores se refieren a este cromosoma desnudo como nucleoide o ncleo primitivo. Otra de las caractersticas principales de las clulas procariontes es que no poseen organelas rodeadas por membranas como retculos endoplsmicos, mitocondrias, aparato de Golgi o lisosomas. Las clulas bacterianas son muy pequeas, de menos de una micra hasta 10 micras de longitud y de 0.2 a 1 micra de anchura. Casi todas las especies bacterianas son unicelulares pero las hay filamentosas o bajo forma de clulas con cierto grado de unin. En vista de su pequeo tamao y semejanza estructural suelen clasificarse por sus estructuras fisiolgicas o bioqumicas y no exclusivamente morfolgicas. Las bacterias tienen una estructura menos compleja que la de las clulas de los organismos superiores: son clulas procariotas (su ncleo est formado por un nico cromosoma y carecen de membrana nuclear). Igualmente son muy diferentes a los virus, que no pueden desarrollarse ms dentro de las clulas y que slo contienen un cido nucleico. Las eubacterias poseen las siguientes caractersticas:
Presentan una pared celular, con excepcin de los Mycoplasmas, por fuera de la clula

que otorga rigidez y proteccin en medios osmticamente inadecuados. La membrana citoplasmtica posee una estructura trilaminar tpica y est formada por lpidos, protenas y pequeas cantidades de hidratos de carbono. Se reproducen por fisin binaria o divisin simple. No poseen un ncleo verdadero sino un cromosoma de DNA que se encuentra, ms o menos libre, en el citoplasma. No poseen organelas rodeadas por membranas. Sus ribosomas son 70s formados por las subunidades 30s y 50s. Poseen grnulos citoplasmticos que son acumulaciones de materiales de reserva como polisacridos, lpidos y polifosfatos.

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Las bacterias pueden clasificarse, atendiendo a su forma, en cocos (esfricas), bacilos (bastones rectos) y espirilos (bastones curvos). Otra forma de clasificar las bacterias es aerobia, las que necesitan aire para vivir, anaerobia, que no pueden vivir en presencia de aire y por ltimo, aquella que indiferentemente pueden vivir con aire o sin ste. Dentro de las eubacterias existen tres grupos de bacterias que pueden ser diferenciados en relacin a la estructura de la pared celular. Para poder diferenciar a estos grupos no es necesario utilizar complejos sistemas de identificacin, y basta con un microscopio ptico y unas cuantas soluciones de colorantes. La forma ms sencilla de iniciar una identificacin del microorganismo que se desea estudiar es realizar una coloracin o tincin de Gram. La tincin de Gram es una tincin diferencial porque no todas las clulas se tien de la misma manera y permite discriminar entre dos grandes grupos de eubacterias, las eubacterias Gram positivas y Gram negativas. Los microorganismos Gram positivos, como el Staphylococcus aureus, adquieren un color violeta despus de la coloracin de Gram debido a que contienen una pared celular estructuralmente muy diferente a la de los microorganismos Gram negativos, como la Escherichia coli, que adquieren un color rosado. El tercer grupo de eubacterias es el de los Acido-Alcohol Resistentes (BAAR) que pueden ser diferenciados utilizando la coloracin de Ziehl-Neelsen. La diferencia en la coloracin no se debe a reacciones qumicas con ciertos componentes de la pared sino a la estructura fsica de la misma.

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Gram positivos: Ests clulas poseen una membrana citoplasmtica con fosfolpidos y protenas. Por fuera de la membrana citoplasmtica se encuentra la pared celular que est compuesta por una ancha capa de peptidoglicano. Este peptidoglicano es una macromolcula gigante formada por cadenas de un dmero compuesto por Nacetilglucosamina y N-acetilmurmico. A su vez, estas cadenas se encuentran unidas entre s mediante pptidos, que son pequeas cadenas de aminocidos que se entrecruzan. Estos puentes peptdicos son caractersticos de las distintas bacterias y presentan mayor rigidez cuanto ms completo sea el entrecruzamiento. El peptidoglicano es una malla porosa que otorga forma y rigidez a la clula, y evita que la clula estalle en medios hipotnicos. Al ser porosa permite el paso de nutrientes desde el exterior y el movimiento de enzimas catalticas y productos de secrecin hacia el exterior de la clula. La pared celular Gram positiva tambin contiene cidos teicoicos y cidos lipoteicoicos. Los cidos teicoicos son cadenas de ribitol o glicerol unidas por fosfodisteres, y estn unidos covalentemente al peptidoglicano por medio de grupos fosfodister en el oxidrilo del C6 del N-acetilmurmico. Los cidos lipoteicoicos son polmeros de glicerofosfato se encuentran anclados en la membrana citoplasmtica y no estn unidos al peptidoglicano. La funcin de estos compuestos sera estructural, pero existen evidencias que indican que tambin participaran en la regulacin de las enzimas hidrolticas que renuevan la pared celular (autolisisnas) y que seran sitios de fijacin de fagos. Gram Negativos: Las clulas se encuentran envueltas por una membrana citoplasmtica formada por una bicapa fosfolipdica y protenas. Por encima de esta membrana se encuentra una fina capa de peptidoglicano que se halla unida covalentemente a unas lipoprotenas de anclaje que fijan la membrana externa por medio de porciones lipoflicas. Entre la membrana citoplasmtica y la membrana externa queda delimitado el espacio periplsmico. Este espacio es ocupado por el periplasma que es una matriz isotnica respecto al citoplasma, isotonicidad que es

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mantenida mediante los oligosacridos derivados de membrana (MDO), y en la que se hallan componentes catalticos de suma importancia para la viabilidad celular. La membrana externa tiene una estructura de bicapa asimtrica en donde la cara externa est compuesta por el lipopolisacarido (LPS) y la cara interna por fosfolpidos. Adems, esta membrana es rica en protenas, algunas de las cuales se denominan porinas. La membrana externa funciona como una barrera de permeabilidad para ciertas sustancias como antimicrobianas y enlentece el pasaje de otros que son inactivados en el periplasma. El LPS est formado por tres regiones: el polisacrido O (Antgeno O), el polisacrido del centro (KDO) y el lpido A (Endotoxina). La presencia del LPS en la membrana externa le confiere a la clula una efectiva proteccin contra enzimas digestivas y detergentes como las sales biliares, y dota a la superficie bacteriana con una fuerte hidrofilicidad que le permite a la clula evadir la fagocitosis, tener cierta resistencia al complemento, evitar la respuesta inmune especfica por alteracin de la superficie antignica y adherirse a ciertas clulas del hospedador. Las porinas son poros o canales proteicos no especficos que pueden ser atravesados por pequeas molculas hidroflicas. En la membrana externa se encuentran otras protenas que funcionan como canales de difusin especficos y facilitan el paso de di, tri y oligosacridos. RICKETTSIAS Bacilos Gram-negativo Aerobios Pertenecientes a la familia Rickettsiaceae, junto con Ehrlichia, estos dos gneros se subdividieron en dos gneros, gracias al anlisis de secuencias de ADN. El gnero Rickettsia se subdivide en dos gneros: Rickettsia y Orientia Anteriormente se consideraban virus por su diminuto tamao: 0.3 x 1 a 2 m; pero poseen caractersticas tpicas de las bacterias Intracelulares obligados; crecimiento restringido al citoplasma de las clulas eucariotas. Tincin escasa mtodo de Gram con el. Algunos animales son reservorios y los artrpodos son reservorios y vectores Las infecciones en el hombre son accidentales. Se subdividen en dos grupos: Fiebre maculosa Tifus Las enfermedades rickettsiales, exceptuando a la fiebre Q, presentan tpicamente la siguiente sintomatologa: Fiebre Exantemas Vasculitis Todas las Rickettsias son transmitidas por artrpodos

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MORFOLOGIA Y FISIOLOGIA Pleomorfas Pueden aparecer como bacilos cortos, o como cocos; ya sea aislados, en pares, en cadenas cortas o en filamentos Fciles de teir; con el colorante Giemsa se tien de rojo en marcado contraste con el citoplasma, teido de azul, en cuyo seno aparecen Crecen rpidamente en embrin de pollo, en el que el saco vitelino es el tejido ms infectado Su pared celular est constituida por peptidoglucanos, que contienen: Acido murmico y diaminopimelico y esta se parece a la de las bacterias Gram negativas Su cultivo tarda de 8 a 10 horas y se realiza a una temperatura de 34C Oxidan metabolitos intermediarios similares a los cidos pirvico, succnico y glutmico; pueden transformar el cido glutmico en acido asprtico Pierden su actividad biolgica a 0C y a 36C por la prdida progresiva de NAD, esto se puede revertir con una incubacin subsecuente con NAD Se desarrollan en diferentes partes de la clula: o Tifus: generalmente en el citoplasma o Fiebre manchada: en el ncleo Su desarrollo se intensifica cuando la actividad metablica del husped es baja as como la presencia de sulfonamidas; por el contrario, las tetraciclinas o el cloranfenicol inhiben el desarrollo Se destruyen por el calor, desecacin y agentes qumicos bactericida VIRULENCIA Las rickettsias se multiplican en las clulas endoteliales de los vasos sanguneos pequeos, produciendo vasculitis Dichas clulas se hinchan y posteriormente se necrosan, teniendo como consecuencia trombosis del vaso y despus su rotura, siguiendo la necrosis de este La vasculitis es la base de los trastornos hemostticos El corazn presenta lesiones similares a las de los vasos sanguneos Coagulacin intravascular diseminada y oclusin vascular Las lesiones vasculares son prominentes en piel, pero tambin hay vasculitis en mltiples rganos Las rickettsias se replican intracelularmente en el macrfago que las haya fagocitado, aun con presencia de anticuerpos En el encfalo se forman los ndulos del tifus: linfocitos, macrfagos y leucocitos polimorfonucleares unidos con los vasos sanguneos de la materia gris VIRUS Los virus son microorganismos de una gran simplicidad estructural y funcional, por lo que se encuentran en la frontera entre lo vivo y lo inerte: no se nutren, no se relacionan, carecen de metabolismo propio; slo son capaces de reproducirse, pero slo pueden hacerlo en el interior de una clula viva, utilizando su maquinaria

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metablica. Por ello los virus son parsitos celulares obligados, tanto de las bacterias como de las clulas animales y vegetales. Un hecho a destacar es que cada tipo de virus slo infecta a un determinado tipo de clulas: a aquellas que tienen en su superficie protenas receptoras para el virus. Dentro de la clula hospedadora, la reproduccin del virus acaba provocando la muerte celular. Las repercusiones para el organismo de las infecciones vricas dependen de la importancia de las clulas lesionadas. As, el virus de la rabia destruye neuronas y su infeccin es mortal si alcanza los centros vitales del encfalo; el virus del SIDA destruye el sistema inmunitario, por lo que el organismo queda sin defensas frente a todo tipo de infecciones que acaban causando la muerte. Caractersticas morfolgicas de los virus - Tamao. Aunque ya se tenan pruebas de su existencia, sta no fue comprobada hasta que se descubri el microscopio electrnico, pues debido a su tamao no se ven con el microscopio ptico. Su dimetro oscila entre los 10 nanmetros (como en el virus de la poliomelitis) hasta los 300 nm en los virus ms grandes (virus de la viruela, virus TMV, etc). Estructura: Un virus est formado por: ADN o ARN, nunca los dos juntos; el ADN puede ser bicatenario (p.e., en el fago T4),o monocatenario (en el fago i-X-174); el ARN tambin puede ser bicatenario (en los reovirus) o monocatenario ( en los retrovirus). Una cpsula proteica o cpside que se halla constituida por el ensamblaje de varias subunidades peptdicas llamadas capsmeros. En su interior se halla contenida la molcula de c. nucleico y, en algunos casos, tambin contiene enzimas vricas que facilitan la entrada y salida de los virus en las clulas que parasitan, o que son necesarias para la replicacin del cido nucleico. Una envoltura membranosa: rodea exteriormente a la cpside y no existe en todos los virus. Esta presenta unas glucoprotenas, a modo de espculas, que constituyen el sistema de anclaje del virus a la clula que van a infectar. Como veremos, esta envoltura se trata en realidad de un fragmento modificado de la membrana plasmtica de la clula en la que se ha originado el virus. Clasificacin: Atendiendo al tipo de clula que parasitan, podemos distinguir entre los virus que infectan a las clulas eucariticas (virus animales y vegetales), y los virus que infectan a las clulas procariticas (bacterifagos o fagos) Los virus animales y vegetales, atendiendo a la forma geomtrica de su cpside, se clasifican en:

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VIRUS HELICOIDALES. Los capsmeros se disponen helicoidalmente delimitando un cilindro hueco. El c. nucleico no ocupa el interior de este cilindro sino que est inserto entre los capsmeros. Un ejemplo es el VTM (virus del mosaico del tabaco), llamado as por ser responsable de una enfermedad en las plantas de tabaco que se manifiesta por la aparicin de manchas amarillas en las hojas; el virus de la gripe sera otro ejemplo, pero, en este caso, el cpside se encuentra flexionado dentro de una envoltura. VIRUS ICOSAEDRICOS. La cpside tiene la forma de un icosaedro regular (poliedro de 20 caras tringulares). Como en el caso anterior, pueden ser desnudos (p.e., adenovirus) o con envoltura ( p.e., los herpesvirus)

Los BACTERIFAGOS o FAGOS presentan una combinacin de las dos formas anteriores, ya que presentan una regin icosadrica, (la llamada cabeza), en cuyo interior se encuentra el cido nucleico, y una regin helicoidal (vaina), que est rodeando a un eje tubular hueco; el conjunto formado por este eje y la vaina que lo rodea constituye la cola. La cola termina en una placa provista de unos filamentos (las fibras caudales) y unas espculas (las espinas caudales). La placa caudal, con las espinas y fibras, representa el mecanismo de anclaje del virus a la bacteria. Debido a su forma, estos virus se denominan tambin VIRUS COMPLEJOS HONGOS: Los hongos son clulas eucariticas (con ncleo y dems orgnelos membranosos: aparato de Golgi, mitocondrias, retculo endoplasmtico, etc.), carecen de clorofila (son acloroflicos, no realizan la fotosntesis, por lo que son hetertrofos y necesitan un aporte de carbono y nitrgeno fijado orgnicamente), tienen una pared celular rgida bien definida de quitina; normalmente son inmviles, no presentan tallos, ni races, ni hojas, ni vasos conductores como presentan las plantas. Pueden ser unicelulares o

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multicelulares y microscpicas o macroscpicas. Se reproducen asexual o sexualmente. Al carecer de clorofila, deben nutrirse a expensas de materia orgnica. En la industria farmacutica cada vez tienen ms importancia, ya que a partir de los hongos se fabrican antibiticos, drogas, tonificantes, etc. Son responsables de la desintegracin de la materia orgnica, y en simbiosis con determinados rboles producen un mayor crecimiento de estos. Tambin son causantes de determinadas enfermedades en las plantas, (con deterioro de cosechas), en animales y humanos. Por consiguiente, los hongos estn ntimamente relacionados con el ser humano, resultando benefactores y perjudiciales para la vida. Los hongos se nutren de materia vegetal viva o muerta. Segn sea el substrato en el que se encuentren se dividen en: Micorrzicos, Parsitos y Saprfitos. Hongos Micorricicos: Define una relacin simbitica entre las hifas de ciertos hongos y las races de las plantas. Hongos Saprfitos: Viven sobre materia orgnica en descomposicin, es decir sobre materia muerta, (restos orgnicos de la de plantas y animales que contiene el suelo, partes muertas de la madera de un rbol o excrementos de animales.) Hongos Parsitos: Se alojan sobre algn ser vivo que los hospede, viviendo a expensas de ste sin ofrecerle ningn beneficio a cambio. Los hongos tienen habitats muy diversos , algunos son acuticos viviendo principalmente en agua dulce , pero tambin se conocen unos cuantos marinos ; la mayora son terrestres y habitan en el suelo , sobre materia orgnica muerta (saprofitos ) desempeando una actividad crucial en la mineralizacin del carbono orgnico , otros muchos son parsitos de vegetales , ocasionando la mayora de las enfermedades significativas econmicamente de plantas cultivadas , algunos son parasito de animales incluyendo el hombre. Al cuerpo de los hongos se les denomina talo y este puede ser unicelular , de forma amiboideo u ovoide , ejemplo , las levaduras , o bien pueden ser pluricelulares con aspecto filamentoso , esponjoso o carnoso , a los filamentos se les conoce como mohos como ejemplo de los carnosos se tiene a las setas y championes. Algunos hongos presentan dimorfismo, es decir bajo ciertas circunstancias ambientales se desarrollan como levaduras, en tanto que cuando se cambia la temperatura o la concentracin o tipo de algn nutriente, se desarrollan en forma filamentosa. En las levaduras el talo unicelular desempea las funciones vegetativas reproductivas, estas se reproducen asexualmente por biparticin o por gemacin y en la reproduccin sexual dos clulas levaduriformes se unen y como resultado forman

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ascosporas en algunas levaduras la gema o brote formado queda adherido a la clula madre, los brotes sucesivos dan lugar a la formacin de un talo de transicin ( nipluricelular ) denominado pseudomicelio. La mayora de los hongos tienen aspecto filamentoso, a los filamentosos individuales se les denomina fas y al conjunto de hifas micelio, este por su posicin puede ser profundo y areo, el primero se encuentra sumergido en el sustrato desempeando las funciones de absorcin y sostn , tambin se le conoce como micelio vegetativo . el micelio areo emerge del sustrato donde se desarrolla , siendo este el que da lugar a las hifas o cuerpos fructferos formadoras de esporas por lo que tambin se le conoce como micelio reproductivo en cada especie de hongo las hifas vegetativas , crecen , se ramifican y entretejen en forma ms o menos constante, lo que determina la formacin de colonias con caractersticas tpicas de la especie , por otra parte algunos hongos rizoides , haustorios , estolones y apresorios , en algunos otros hongos la hifas se agrupan y retuercen formando fibras gruesas ( funculos y rizomorfos ) o un micelio compacto y apretado ( plectenquima ) las hifas reproductivas pueden permanecer diferenciadas ( esporiangoforos , conidioforos ) , al igual que las hifas vegetativas las reproductivas se pueden agrupar en una estructura especializada llamada cuerpo fructfero : en estos , la agrupacin de hifas puede quedar directamente expuesta al medio ( coremio ) o protegida dentro de un receptculo o contenedor ( picnidos , esporodoquios ) o formar parte de un cuerpo altamente diferenciado ( ascocarpos y basidiocarpos ). Cuando se compara a los hongos con las bacterias , en general estos tienen requerimientos nutricionales muy simples, pero su desarrollo es ms lento , por lo que requieren mayor tiempo de incubacin para su cultivo , la diversidad ms notable la presentan en sus propiedades morfolgicas y en sus ciclos sexuales siendo estas caractersticas los criterios que se emplean en la identificacin y clasificacin de este grupo las caractersticas estructurales incluyen : tipo de talo , morfologa microscpica del micelio tanto areo como profundo . tipo de hifas diferenciacin y disposicin o agrupacin de las mismas tipo de hifas reproductivas asexuales , estructura y modo de formacin del cuerpo fructfero sexual , tipo de espora ( forma , tamao , aspecto externo , agrupacin , tabicacion , color , movilidad , tipo y numero de flagelos ); compocision de la pared celular , adems , evaluar otras caractersticas fisiolgicas y reacciones metablicas especialmente sobre azucares , de este modo , el estudio de los hongos implica el examen microscpico , la observacin del aspecto macroscopico de sus colonias y la determinacin de sus propiedades fisiolgicas , especialmente su actividad frente a sus diferentes azucares .

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1.5. CITOLOGA BACTERIANA: Cpsula, pared celular, membrana citoplasmtica, mesosomas, citoplasma, inclusiones y vacuolas. Flagelos, pili-fimbrias. Esporas. Formas L. Las bacterias pueden considerarse como los microorganismos de menor tamao (1um aprox.) que contiene la maquinaria necesaria para crecer y autorreplicarse a expensas de los alimentos. Son morfolgicamente ms simples que las clulas de los organismos superiores, pero analizando su superficie, resulta que stas son ms complejas. Las bacterias carecen de ncleo organizado (por lo tanto, son procariontes). Carecen de: Mitocondrias y cloroplastos Sistema mittico Membrana nuclear REL RER Material Nuclear:
Posee:

Material nuclear Inclusiones Ribosomas Membrana clulas Pared celular

El material nuclear procarionte est constituido por ADN bacteriano pero carece de membrana nuclear y sistema mittico, aunque si se puede observar una regin de concentracin de cido nucleico. El ADN bacteriano se encuentra naturalmente muy enrollado y puede extraerse como una molcula continua, tiene un PM de 3 x 10 y mide aprox. 1mm de longitud, por lo tanto puede considerarse como un nico cromosoma. El ADN aparece super enrollado en un centro de ARN que sirve para mantener al ADN en su forma compacta. Tiene una estructura como de cuentas de collar, semejante al del eucariota pero sin histonas bsicas. Se encuentra insertado en una invaginacin de la membrana celular denominado mesosoma que forma tabique durante la divisin celular y colabora en la separacin de los cromosomas homlogos despus se la autorreplicacin. [El citoplasma bacteriano contiene ARN densamente agregado, por lo que, cuando se utilizan colorantes, ste resulta ser basfilo como el ncleo]. Estructuras Citoplasmticas: Inclusiones: Las bacterias almacenan materiales de reserva en forma de grnulos citoplasmticos insolubles (osmticamente inertes) que constituyen la fuente de C para la sntesis de protenas y cidos nucleicos. Tambin, muchas bacterias, acumulan fosfato inorgnico en forma de grnulos metacromticos, denominados grnulos de volutina. Ribosomas: El citoplasma bacteriano contiene numerosos ribosomas. Cada ribosoma compuestos de 2 subunidades (50S y 30S), que en el proceso de sntesis proteica se agrupan en cadenas formando polisomas.

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Estructuras Externas: Las bacterias se pueden dividir en dos grupos de acuerdo a si retiene o no un colorante (GRAM): las bacterias capaces de retener el colorante cristal violeta se denominan Gram + y aquellas que no, Gram -. GRAM Presenta tres capas principales; - Una interna, la membrana citoplasmtica - Una capa delgada, correspondiente a la pared celular - Una capa externa, que recibe el nombre de membrana externa o capa L GRAM +

Presenta dos capas; - Membrana citoplasmtica - Pared celular (gruesa)

Membrana Celular: Es una membrana unitaria tpica, de fosfolpidos y protenas. Se diferencia de la de eucarionte por la ausencia de esteroles, (excepto Mycoplasma, que los incorpora en su membrana si crece en medios que los contengan). El contenido de protenas varia de un 60-70%, y aparentan ser cataltica o de transporte, y no estructurales. sta membrana tambin contiene enzimas con diferentes funciones, entre las ms importantes se destacan: - Transporte de electrones - Fosforilacin oxidativa en las especies aerobias - Sntesis lipdica - Biosntesis de la pared - Replicacin del ADN Mesosoma: es una invaginacin de la membrana plasmtica (puede haber una o ms), presente generalmente en G+, irregular y de gran tamao. Pueden ser de tipo laminar o vesicular. Los mesosomas laminares (de tabique) forman paredes transversas durante la divisin celular, el cromosoma est fijado al mesosoma. Los mesosomas vesiculares (laterales) intervienen en la funcin de secrecin. Pared Celular: Se encuentra rodeando externamente a la membrana plasmtica, gruesa en G+ y fina en G-. La presin osmtica de la mayora de las bacterias es de 5 a 20 atmsferas, suficiente presin para hacer explotar la clula si no fuese por la presencia de la pared celular. Su fuerza se debe que est compuesta de murena y peptidoglucano.

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Componentes especiales de la pared celular: Gram +: contienen abundantes cantidades de cido teicoico y polisacridos. Gram -: contiene polmeros que se encuentran fuera de la envoltura del peptidoglucano: lipoprotena, membrana exterior y lipopolisacrido. - Bacterias cido- alcohol resistentes: con respecto a su coloracin; son cido alcohol resistentes. Poseen envolturas mucho ms complejas. El cido miclico (c. graso de cadena larga) se une covalentemente por medio de un polisacrido al peptidoglucano, puede, adems, contener otros compuestos y complejos lipdicos formando una fina membrana cerosa por fuera de la pared del peptidoglucano. En ste grupo se encuentran las micobacterias, nocardias y corinebacterias. Protoplastos, esferoplastos y formas L: Puede lograrse el crecimiento de cepas bacterianas carentes de pared celular mediante hidrlisis con lisozima. Es necesario que crezcan en medio osmticos protectores, lo que hace que liberen protoplastos de las clulas G+ y esferoplastos (que contiene la membrana exterior) de las clulas G-. Si las clulas con capaces de crecer y dividirse, se las denomina formas L (Lister institute). Cpsula: Es un limo excretado, generalmente de polisacridos. Las mutaciones celulares afectan su produccin y las clulas afectadas forman colonias lisas o mucoides, mientras que las clulas no encapsuladas producen colonias rugosas. La cpsula protege al patgeno de la fagocitosis de los fagocitos de la sangre o protozoos y de los virus que deben fijarse a la pared celular, y por esto su papel es crucial en la determinacin de la virulencia de un germen. Las capsulas verdaderas, en general, estn compuestas por polisacridos con mucina. Son estructuras organizadas, firmemente ancladas a la pared celular, por lo que suele ser difcil su eliminacin completa mediante lavados in vitro, a diferencia de los slime que se unen laxamente. - Slime: trama densa de H. de C. complejos secretados por los microorganismos. Es capaz de incluir a una comunidad de microorganismos dentro de s, constituyendo un biofilm - Biofilm: estructura multilaminar compuesta de protenas del hospedador, plaquetas, agregados bacterianos y polisacridos EC. No contribuyen a la adherencia de las bacterias, pero favorecen su permanencia. Los microorganismos contenidos dentro de un biofilm constituyen un foco de resistencia a tratamientos ATB y al sistema inmunitario. *Glicocalix: es el material dentro del biofilm que contiene polisacridos y agregados bacterianos. Membrana externa de G -: Bicapa lipdica intercalada con protenas. La cara interna est formada por fosfolpidos y la cara externa puede contener fosfolpidos, pero principalmente est compuesta por una molcula anfiptica compuesta de LPS. Las protenas de la membrana externa

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generalmente atraviesan la membrana y la fijan a la membrana de peptidoglucano subyacente. La molcula de LPS de la membrana exterior est compuesta por una regin hidrofbica, llamada lpido A, que se une a una regin hidroflica de polisacridos lineales que consisten en el core polisacrido y el polisacrido O-especfico. El componente txico del LPS es el lpido A, y el polisacrido O puede cooperar con la adhesin y ofrecerle algo de resistencia a la fagocitosis. As, aunque el lpido A es el encargado de la toxicidad, el polisacrido le confiere la virulencia. Flagelo:
Estructura: Son apndices filiformes/filamentosos, finos, ondulados y largos (3 a 12um), compuestos en su totalidad por flagelina (protena globular soluble), su dimetro de 12-13nm y no pueden verse con MO a menos que se empleen tcnicas de coloracin. Son los responsables de la locomocin bacteriana y el tipo de ondulacin es exclusiva para cada cepa bacteriana. Se conocen distintos tipos de distribucin: tricos: carecen de flagelo Montricos: un solo flagelo polar Anftricos: un flagelo en cada polo Loftricos: mecha de flagelos en un polo Anfiloftricos: mecha de flagelos en ambos polos Pertricos: flagelos distribuidos en toda la superficie

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La flagelina est compuesta por agregacin de subunidades que originan una estructura cilndrica hueca. Los flagelos bacterianos, al ser mucho ms delgados que los cilios de vertebrados o flagelos de protozoos, no contienen las subfibrillas que se hallan en estas estructuras, sino que se presentan en forma de cadenas ntimamente enrolladas, por lo general como triple hlice. Si se produce la prdida de los flagelos mecnicamente (agitacin por 6 minutos), se sintetiza uno nuevo. El flagelo se inserta en el cuerpo de la clula bacteriana mediante una estructura compleja que consiste en un gancho y un cuerpo basal. El cuerpo basal porta una serie de anillos (1 par en G+, y 2 pares en G-). Motilidad: Los flagelos son rotores helicoidales semirrgidos a los cuales la clula les permite movimientos de giro. Se supone que el anillo S est inserto en la pared celular, y el anillo M en la membrana. La rotacin del anillo S en relacin con el anillo M fijo proporciona el movimiento de rotacin. La rotacin puede producirse como respuesta al estmulo del ambiente. Pili, pelos o fimbrias: Apndices superficiales rgidos presentes en muchas bacterias G- y en algunas G+. Son estructuras ms finas y cortas que los flagelos, compuestas de un solo tipo de protena; pilina. Se originan de los cuerpos basales de la membrana citoplsmica. En una misma clula puede haber pilis de diferente grosor y longitud. Bsicamente se clasifican en pilis sexuales

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(involucrados en la conjugacin bacteriana) y comunes o fimbrias (relacionados con la adherencia). Los estreptococos (bacterias G+), poseen una capa exterior de fimbrias llamada protena M, que es su principal Ag de superficie y es esencial para su establecimiento en el hospedador. Endosporas: Cuando las bacterias se hallan en condiciones desfavorables de nutricin comienzan a morir, pero existe un grupo que en iguales condiciones sobrevive (aunque en estado de latencia), debido a la formacin en su interior de un organismo especial, el esporo. Los esporos o endosporas son clulas muy deshidratadas, resistentes al calor, a situaciones ambientales adversas y a agentes qumicos. Los tres gneros de bacterias son capases de formar endosporas. Dentro de la clula bacteriana, el esporo puede hallarse en un extremo, subterminales o en el centro de la misma. La espora puede modificar el cuerpo de la bacteria, si la bacteria es ms chica que ella z(deformantes o no deformantes). Estos microorganismos sufren un ciclo de diferenciacin en respuesta a condiciones ambientales; bajo causas de deficiencias nutricionales, cada clula forma una nica endospora. La cual se libera cuando la clula progenitora sufre autlisis. Cuando regresan las condiciones favorables y es activada, la espora germina para producir una clula vegetativa. Algo caracterstico de la endosporas es que poseen un enorme contenido de Ca++, el que es acompaado por iguales cantidades de c. dipiclinico, sustancia capaz de quelar el Ca++. La resistencia el calor se debe en parte a su deshidratacin y al dipiclolinato de Ca++. Proceso de esporulacin: El proceso comienza cuando las condiciones nutricionales son desfavorables (N y C especialmente), se activan los genes para la formacin de espora y se desactivan los de las funciones vegetativas. La esporulacin inicia con la migracin de una regin nuclear condensada hacia uno de los extremos de la clula. Comienza a formarse un ncleo terminal mediante el crecimiento invaginante de la membrana celular que produce y una estructura membranosa doble. Las dos membranas de la espora constituirn capas especiales que formarn la envoltura celular, stas son; pared de la espora, corteza y capa o cubierta. El exosporio se encuentra por fuera de las membranas. Estructura de la endospora: Endosporio Centro Envoltura Pared Corteza Capa o cubierta

Exosporio Ncleo: protoplasto de la espora., contiene un cromosoma, el aparato sintetizador de protenas y un sistema generador de energa basado en la degradacin de glucosa.

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Envoltura: - Pared: en la capa ms interna que rodea a la membrana interna de la espora. Contiene murena y es transformada en la pared celular de la clula vegetativa germinante. - Corteza: entre la pared de la espora y la capa o cubierta, se sintetiza la corteza, formada por un tipo especial de peptidoglucano laxo. - Capa o cubierta: est compuesta de una protena semejante a la queratina que contiene muchos enlaces disulfuro. . Debido a su impermeabilidad es responsable de la resistencia a los agentes qumicos y colorantes. - Exosporio: protena de la membrana que contiene algo de glcidos

Proceso de germinacin: consta de tres etapas. - Activacin: an cuando sean colocadas en ambientes ricos, las esporas no germina si no es daan su pared por algn medio (c., calor, abrasin, lesin mecnica o qumica de la corteza, o por accin enzimtica), lo que permite que la clula capte agua y pierda su elevado contenido de dipicolinato de Ca++. - Iniciacin: una vez activada, iniciar la germinacin, si las condiciones ambientales son favorables. Se capta agua, se libera dipicolinato de Ca++ y varios constituyentes de las esporas son degradados por enzimas hidrolticas. - Excrecencia: la degradacin de la corteza y de las capas exteriores resulta en la aparicin de una nueva clula vegetativa que consiste en el protoplasto de la espora con su pared contigua. MORFOLOGA Y AGRUPACIN BACTERIANA: Teniendo en cuenta su morfologa, las bateras pueden agruparse en 4 clases: Cocos: bacterias esfricas que se presentan aisladas o reunidas en diferente disposicin. Pero no todos los cocos son perfectamente esfricos, alguno son ovales, lanceolados y otros presentan escotaduras. Reunidos de a pared son llamados diplococos, si forman cadenas (3 o ms cocos) se denominan estreptococos, si se agrupan irregularmente sobre un mismo plano forman los llamados estafilococos, si forman grupos de 4 elementos se llaman ttradas o tetrgenos y, finalmente, si se agrupan en 4 elementos y lo hacen en 2 planos se denominan sercina. Bacilos: bacterias en forma de bastn, sus extremos pueden ser rectos, redondeados o aguzados. Se presentan de forma aislada, reunidos por sus extremos formando diplobacilos, o en cadenas largas formando estreptobacilos. Cuando se agrupan por sus lados pueden dar una imagen similar a letras chinas.

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Vibriones: bacilos retorcidos en su eje longitudinal. Normalmente no alcanzan a cumplir una vuelta completa alrededor de su eje. Espirilos: son bacilos retorcidos en su eje longitudinal, que cumplen varias vueltas alrededor de su eje. REPRODUCIN: Reproduccin asexual: La mayora de las bacterias se reproducen por un proceso simple de reproduccin asexual denominado fisin binaria, en el que cada clula incremente su tamao y se divide en dos clulas iguales. Durante la reproduccin hay un incremento ordenado de estructuras y componentes celulares, una replicacin y segregacin del ADN, y la formacin de un septo que atraviesa y divide la clula en dos. La divisin est coordinada por la membrana plasmtica. El ADN permanece unido a un punto de la membrana donde es replicado, y donde las dos molculas de ADN permanecern juntas mientras un nuevo material de membrana es sintetizado entre ambos ambas. Cuando la formacin del septo est completa, la clula se separa en dos clulas hijas. El tiempo requerido para que la clula se divida es llamado tiempo de generacin y puede variar desde 15min, a varios das dependiendo de la naturaleza de la bacteria. Reproduccin sexual: Es menos frecuente, tarde de 15-20min. Algunas bacterias tiene un fragmento extra de ADN circular denominado plsmido.

Conclusiones:
Las bacterias tiene miles de veces menos ADN que una clula eucarionte Viven en un medio con una viscosidad igual a la del asfalto Slo se pueden movilizar en dos direcciones, lo hacen a 50km/hr. Y no pueden detenerse. Una bacteria se puede relacionar sexualmente con un macho que posee un aparato sexual para transferir informacin gentica hembras receptivas (sin embargo es difcil que se encuentren a esa velocidad). Cada vez que una bacteria macho se aparean con una hembra, sta se vuelve macho. Tambin, con mucha frecuencia, mutaciones espontnea causan que las bacterias cambien se sexo. El mal uso de las drogas ha resultado en la seleccin de bacterias resistentes a las mismas.

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1.6.OBSERVACIN DE LOS MICROORGANISMOS: I.-Microscopa en fresco, con fondo oscuro, con luz transmitida, y con luz ultravioleta. Microscopa electrnica. II.-La preparacin microscpica: materiales. Tcnicas: extensin, secado, fijacin y coloracin. Coloracin principal, mordiente, diferenciador, coloracin por contraste. Mtodos de coloracin: Gram y Zihl Neelsen. Nociones sobre coloracin de esporas, cilias, cpsulas y corpsculos metacromticos. Coloracin de espiroquetas y de rickettsias. Observacin y coloracin de hongos. Microscopio Simple o Lupa Se llama microscopio simple o lupa a aquel formado por una lente positiva o convergente, que colocada delante de un objeto determina la formacin de una imagen agrandada del mismo. Microscopio Compuesto El microscopio compuesto est formado primordialmente por dos sistemas pticos, objetivo y ocular; ambos lentes positivos que se sitan en los extremos de un tubo con un eje ptico comn. Microscopia en Fresco Permite la observacin de bacterias vivas, su morfologa verdadera, su agrupacin, motilidad y hasta reproduccin segn la tcnica empleada. bacteriana ni su constitucin qumica. Mtodo Simple (entre porta y cubreobjetos) En esta tcnica se coloca una gota de cultivo (o se suspende una fraccin de colonia en una gota de agua destilada) en el portaobjetos y luego se aplica sobre esta un cubreobjetos; este ltimo puede ser fijado al portaobjetos con parafina para evita la rpida evaporacin del liquido y adems evitar el desplazamiento al observar la inmersin Gota Pendiente En esta tcnica, la gota de suspensin bacteriana se coloca en el cubreobjetos; posteriormente, este se coloca en posicin invertida y con un rpido movimiento sobre el portaobjetos, por lo que la gota de liquido queda suspendida del cubreobjetos. Este

No puede determinarse la estructura

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mtodo permite eventualmente observar la reproduccin de bacterias. El portaobjetos aqu utilizado es un portaobjetos de Koch, el cual posee una depresin o excavado central. Clula de Boettcher: la depresin central tiene fondo plano y est rodeada de un canal perifrico ms profundo que impide una posible fuga de lquido. Clula de Ranvier: consta de un cilindro o anillo de vidrio adherido a la superficie del portaobjetos; sobre ella se coloca el cubreobjetos con el material. Negativa Es un mtodo simple y rpido para detectar bacterias encapsuladas y que puede definirse como el FALSO Fondo Oscuro, la muestra se suspende en una gota de colorante (ej. Nigrosina) el cual no llega a teir las bacterias pero si el espacio interbacteriano con lo que los microorganismos se destacan por contraste. La nigrosina puede ser reemplazada por colargol o tinta china. La observacin se debe realizar de inmediato antes de que el material se seque. Fondo Oscuro Este mtodo es utilizado para la observacin de objetos por medio de su iluminacin perifrica, lo cual permite detectar la presencia de elementos de soma (La nocin
tambin sirve para hacer mencin a la estructura corporal total de los organismos vivientes, a excepcin de los gametos.) muy delgado y con un ndice de refraccin muy cercano al del

agua, tal como sucede con algunas espiroquetas. El fundamento de este mtodo se basa en el principio Tyndall que consiste en el empleo de condensadores especiales, los cuales solo permiten el paso de de los rayos de luz perifricos, los cuales refractan o reflejan en la superficie espejada interior del condensador e inciden de manera oblicua en el objeto. Tras chocar con el soma bacteriano, el rayo luminoso se desva de su curso original y penetra en la lente objetivo, permitiendo de esta manera la visualizacin de las distintas morfologas como partculas brillantes en su periferia sobre un fondo totalmente oscuro. Microscopia de Fluorescencia Los microscopios de fluorescencia utilizan la propiedad que poseen ciertas sustancias de emitir bajo la accin de radiaciones de longitudes de onda corta, otras de longitudes de onda ms larga. Los primeros microscopios utilizaban un arco voltaico de carbn p, como emisor de luz ultravioleta, esta una vez filtrada para seleccionar los rayos de luz requeridos pasaba a travs de un condensador de campo oscuro; as sobre un fondo oscuro, la parte fluorescente de la muestra se observaba brillante. Existen dos tipos bsicos de equipos de fluorescencia: de luz transmitida y de luz incidente, se diferencian en la manera en la cual los rayos de luz inciden en la muestra.

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Microscopia Electrnica Un microscopio electrnico, como el de la imagen, funciona con un haz de electrones generados por un can electrnico, acelerados por un alto voltaje y focalizados por medio de lentes magnticas (todo ello al alto vaco ya que los electrones son absorbidos por el aire). Un rayo de electrones atraviesa la muestra (debidamente deshidratada y en algunos casos recubierta de una fina capa metlica para resaltar su textura) y la amplificacin se produce por un conjunto de lentes magnticas que forman una imagen sobre una placa fotogrfica o sobre una pantalla sensible al impacto de los electrones que transfiere la imagen formada a la pantalla de un ordenador. Los microscopios electrnicos producen imgenes sin ninguna clase de informacin de color, puesto que este es una propiedad de la luz y no hay una forma posible de reproducir este fenmeno mediante los electrones; sin embargo, es posible colorizar las imgenes posteriormente, aplicando tcnicas de retoque digital a travs del ordenador. Las tcnicas utilizadas pueden ser por Barrido o Transmicin.
Coloracin Simple Simple: es una tcnica que emplea un solo colorante, de manera que todos los elementos incluidos en la muestra toman el mismo color. Directa: en este caso, solamente el colorante acta sobre la muestra. Progresiva: cuanto ms tiempo se aplica el colorante sobre la muestra, ms la tie.

Coloracin Compuesta Compuesta: esta tcnica se denomina as por emplear dos colorantes. Indirecta: incluye el uso de un mordiente que incrementa la fijacin del colorante principal al material (ej. lugol, cido fnico, calor). Regresiva: se aplican decolorantes para eliminar el colorante principal. As se diferencian las bacterias positivas y negativas. Ejemplos de decolorantes son: alcohol, alcohol acetona, alcohol cido, etc.

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Pasos previos a la tincin 1. Extendido: este paso implica la colocacin de la muestra sobre el portaobjetos, siguiendo todas las reglas de esterilidad y bioseguridad correspondientes. 2. Secado: se lo aplica para eliminar el exceso de lquido de la muestra pero esto no produce la muerte de las bacterias en ella contenidas. Debe recordarse que una bacteria deshidratada no es una bacteria muerta. 3. Fijado: en este paso s se produce la muerte bacteriana por degradacin de sus protenas somticas por accin de agentes qumicos o del calor, segn el mtodo utilizado. De todas formas hay que considerar el tipo de muestra a fijar debido a que en ciertas oportunidades el vehculo en que se hallan las bacterias permiten su sobrevida an despus de la fijacin (ej. Mycobacterium tuberculosis en esputo). Coloracin Colorante: Toda sustancia que es capaz de transmitir color a otro elemento. Componentes: A. Grupo Cromforo: Transmite el color. B. Grupo Auxcromo: Poder de combinarse. Colorantes Bsicos: Tien la parte cida de la bacteria como su ADN, ARN. Por ejemplo Azul de metileno, violeta de metilo, fucsina bsica, verde de malaquita, cristal violeta, safranina. Colorantes cidos: Tien la parte bsica como su citoplasma. Por ejemplo la eosina o el rojo Congo. Son de carga neta negativa y se usan para teir protenas de carga positiva. Tipos de Coloracin Coloracin simple: Un solo colorante (azul de metileno) todo se tie igual. Coloracin compuesta: Dos colorantes: Primario o Colorante Principal y Secundario o Colorante de Contraste. Coloracin diferencial: Coloraciones especiales que colorean una estructura en particular de la bacteria: Esporos Flagelos

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Cpsula Corpsculos Metacromticos Colorante principal: Solucin hidroalcohlica de Violeta de Genciana Mordiente: Es cualquier sustancia que forme compuestos insolubles con colorantes y determine su fijacin a las bacterias. Se usa Solucin de Lugol Decolorante: Alcohol Acetona Colorante de contraste: Solucin madre de Safranina Tcnica de Coloracin de Gram 1. Violeta de Genciana: 1 min. 2. Lavado con agua 3. Lugol: 1 min. 4. Lavado con agua 5. Alcohol acetona: 10 seg. 6. Lavado con agua 7. Safranina: 45 seg a 1 min. 8. Lavado con agua, secado y observacin Interpretacin: Positivos: VIOLETA Negativos: ROJO Fundamentos de la Coloracin de Gram Las GRAM+, al poseer una pared celular ms resistente y con mayor proporcin de peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin del solvente orgnico, sino que ste acta deshidratando los poros y cerrndolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloracin azul-violcea. En cambio, en la decoloracin, la membrana externa de las GRAM- se disuelve, porque la capa de peptidoglucano que posee es muy delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se form previamente, Por esto, al colocar el colorante Secundario, toman su color. Se tien con la tcnica de Gram, todos los microorganismos que poseen pared celular Coloracin Compuesta de Zhiel Neelsen (Bacilo Acido Alcohol Resistente BAAR) Colorante principal: Fucsina fenicada de Ziehl Decolorante: Alcohol cido (solucin de Alchohol Etilco 96, con Acetona en una proporcin de 1:1) Colorante de contraste: Solucin acuosa de Azul de Metileno.

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Tcnica de la Coloracin 1. Fucsina fenicada de Ziehl (en caliente) 5 min 2. Lavado con agua 3. Alcohol cido 2 min 4. Lavado con agua 5. Azul de metileno 1 min 6. Lavado con agua, secado y observacin. Interpretacin: Positivos: Rojo Negativos: Azul Fundamento de la Coloracion de Ziehl Neelsen Las Mycobacterias contienen cidos miclicos que les confieren la propiedad de resistir la decoloracin con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos, por esto se denominan cido-alcohol resistentes El calentamiento permite que el colorante atraviese la pared bacteriana, ya que aumenta la energa cintica de sus molculas facilitndo su entrada a las bacterias. Luego, al enfriar con agua, se provoca una solidificacin de los cidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Se tien con la tcnica de Ziehl Neelsen por ejemplos parsitos Coccideos como el Cryptosporidium, microbacterias tales como la microbacteria de la tuberculosis

1.9. METABOLISMO: I.Nutricin: tipos. Elementos energticos y morfognicos. Factores accesorios. Mecanismo metablico. Enzimas. Metabolismo gaseoso. Fermentacin. Putrefaccin. II.Actividad bioqumica sobre los glcidos, lpidos y prtidos. Formacin de cidos y gases. Hidrgeno sulfurado, indol, acetil-metil-carbinol. Reduccin de nitratos a nitritos. Catalasa, peroxidasa y ureasa. Metabolismo Bacteriano Conjunto de reacciones bioqumicas catablicas y anablicas, que transforman las sustancias nutritivas para obtener energa. Anabolismo: reacciones de sntesis. Catabolismo: degradacin de compuestos orgnicos. Reacciones Endergonicas. Consumen Energa Reacciones Exergnicas. Liberacin de Energa Fases del metabolismo y produccin de la Energa La transformacin de la energa, generacin de ATP, puede ser mediante 3 vas principales: 1. La respiracin, que tiene lugar en presencia de O2 y da como resultado CO2 y H2O, es un proceso de oxidacin. 2. La fermentacin: en condiciones sin oxigeno. 3. La fotosntesis: que obtiene la energa por absorcin de luz visible a travs de la clorofila.

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Fuente de Energia Puede ser la luz solar o artificial, o sustancias inorgnicas como el azufre, el CO, el amonio o sustancias provenientes de la materia organica, como por ejemplo los hidratos de carbono, las protenas y los lpidos. Segn los requerimientos energticos las bacterias se dividen en: 1. Fototrofas 2. Litotrofastrofas 3. Heterotrofas 4. Mixotrofas Nutricin microbiana Las clulas estn compuestas de: 1. Macromolculas: polisacridos, lpidos, cidos nucleicos y protenas (Las protenas son las ms abundantes). 2. Agua. El agua es el solvente ideal para los organismos vivos debido a su polaridad y a su cohesin. Los microorganismos requieren para su desarrollo y actividad celular compuestos qumicos: denominados nutrientes. Dependiendo de las cantidades que se requieran se habla de macronutrientes y micronutrientes. Existen diferencias en cuanto a los requerimientos nutricionales de cada microorganismo. Macro Micro Carbono. Cromo Nitrogeno. Cobalto Fosforo. Cobre Azufre Manganeso Potasio Molibdeno Magnesio Niquel Sodio Selenio Calcio Tungsteno Hierro Vanadio y Zinc.
Todas las clulas utilizan oxgeno, gaseoso o encubierto, ya que para un determinado grupo de bacterias puede ser mortal. De acuerdo a los requerimientos de oxgeno, las bacterias se pueden clasificar en; Bacterias aerobias estrictas u obligadas: las que requiere O2 como aceptor terminal de electrones y no proliferan en condiciones de anaerobiosis Bacterias anaerobios estrictas u obligadas: se desarrollan en total ausencia de O2, obtiene su energa de la fermentacin. Bacterias anaerobias facultativas: proliferan mediante procesos oxidativos, utilizando O2 como aceptor terminal de electrones, o en anaerobiosis, empleando la fermentacin para obtener energa. Por lo tanto sobreviven tanto en aerobiosis como en anaerobiosos

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Anaerobios aerotolerantes: pueden crecer en presencia o ausencia de O2, pero obtienen la energa de la fermentacin. Microaerfilos: requieren del O2 como aceptor terminal de electrones, pero en una tensin menor a la requerida por bacterias aerobias. Capnoicos: bacterias que se desarrollan mejor en presencia de anhdrido carbnico.

Tipos Nutricionales
Tipo Fotoautotrofas Fotoheterotrofas Fuente de energa Luz Luz Fuente de carbono CO2 Compuestos orgnicos Ejemplos Algas y cianobacterias Algas y bacterias fotosintticas Pocas bacterias

Quimioautotrofas o Litotrofas Quimioheterotrofas o Heterotrofas

Qumica

Compuesto inorgnicos: H2, NH3, NO2, H2S, CO2 Compuesto orgnicos: glucosa

Qumica

La mayora de bacterias

Factores de Crecimiento Se requieren en muy pocas cantidades y solo por algunas clulas: Vitaminas, Aminocidos, purinas y pirimidinas. La mayora de los microorganismos son capaces de sintetizarlos. Enzimas Catalizadores biolgicos de naturaleza proteica. Su accionar es esencial en el metabolismo bacteriano. Actan de manera especfica a travs de un sitio activo, produciendo un efecto cataltico sobre las molculas del sustrato, convirtindola en un producto especifico. Funcionan en forma secuencial: Lo que significa que el producto de una reaccin enzimtica ser a su vez degradado por la siguiente enzima de la cadena de reacciones de alguna va metablica. Existen sistemas multienzimaticos organizados espacialmente en la membrana celular; esto permite que las reacciones ocurran de una manera organizada.

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1.10. CULTIVO DE BACTERIAS: Marcha bacteriolgica. Medios de cultivo: preparacin. Medios comunes, mejorados, diferenciales y selectivos. Siembras. Desarrollo de las bacterias en los medios de cultivo lquidos y slidos. Colonias: tipos.
Marcha Bacteriologica La expresin marcha bacteriolgica designa la serie ordenada de pasos que se deben seguir para identificar correctamente una bacteria responsable de infeccin. Los pasos habituales de la marcha bacteriolgica son: 1. Decisin de realizar el estudio bacteriolgico 2. Recoleccin de la muestra y transporte 3. Observacin microscpica 4. Observacin en fresco 5. Coloracin 6. Cultivo 7. Tipificacin bioqumica 8. Serotipificacion 9. Estudios complementarios 10. Antibiograma 11. Serodiagnstico Medios de Cultivo Los medios de cultivo pueden tener una composicin qumica definida o no. Antiguamente se utilizaban los extractos de carne o de otros tejidos que constituan una fuente de protenas y azucares. Finalidad de un medio de cultivo: - Aislamiento de microorganismos en colonias puras - Estudio de caractersticas culturales - Estudio de actividad metablica - Preparacin de vacunas y Antgenos - Conservacin de grmenes en coleccin - Obtencin de grandes masas microbianas para estudios fsicos y qumicos - Obtencin de grmenes con fines industriales (preparacin de productos lcteos, vitivincolas, enzimticos y ensilajes) Composicin y propiedades: En la actualidad se utilizan compuestos hidrolizados proteicos llamados PEPTONAS, obtenidos por hidrlisis enzimtica de leche, carne, levaduras, etc., que mantiene sus propiedades en cuanto a aa y vitaminas. El medio posee tambin cloruro de Na que tiene como funcin mantener la presin osmtica. Si el medio a cultivar requiera sangre, sta se hemoliza si no hay presin osmtica adecuada. Un medio de cultivo, debe contener como mnimo; C, N, S, P y sales orgnicas. En muchos casos, adems, hacen falta vitaminas y sustancias inductoras del crecimiento. Tambin los medios pueden tener indicadores de cambios de pH en las reacciones metablicas.

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Para lograr que un medio de cultivo sea slido de le agregan solidificantes. ste puede ser agar slice, gelatina o gel poliacrlico. En la actualidad se usa el agar, que es un polisacrido derivado de algas marinas. La mayora de los microorganismos crecen en un pH cercano a la neutralidad, por eso es importante verificar el pH luego de la esterilizacin. Y antes de ser usados, los medios de cultivos, deben ser controlarse para verificar su esterilidad incubndolos a 37C durante 24 horas (salvo la de agar sangre, porque pierden calidad). Slo algunas placas, representativas de un lote, se incuban durante una semana y el resultado se extrapola al total del lote. Clasificacin de los medios de cultivo: Por sus consistencia: Lquido: tambin denominado caldo; posee elementos nutritivos disueltos en agua destilada. Semislidos: tambin llamado agar blando; es de consistencia leve y gelatinosa, se obtiene agregando agar al caldo. Se fracciona en tubo de hemlisis para siembra en puntura. Slido: llamado agar estra o agar duro o placa; se obtiene esa consistencia agregando mayor cantidad de agar al caldo. Se fracciona en placas de Petri o en tubo de ensayo, los que se dejan solidificar inclinados para obtener agar pico de flauta. Por su finalidad: Medio de transporte: medo lquido o semilquido. Permite el mantenimiento de la muestra clnica sin modificaciones en calidad y cantidad de microorganismos presentes. No posee nutrientes, sino agua, sales y amortiguadores de pH. Medios de enriquecimiento: medio lquido selectivo que permite el crecimiento preferencial de ciertas bacterias patgenas. Se utiliza cuando la muestra clnica tiene muchos microorganismos y slo favorece el crecimiento de las bacterias mejor adaptadas. Medio mnimo: contiene la cantidad mnima de nutrientes que un microorganismos necesita para desarrollarse Comn o simple: es aquel que, reuniendo los elementos mnimos, permite el desarrollo de la mayor parte de bacterias no exigentes. Enriquecido: es un medio siempre con el agregado de sustancias que aumentan su poder nutritivo (sangre, suero, extractos de levaduras, vitaminas). ste medio se usa para bacterias exigentes como estreptococos y mycoplasma) Selectivo: permite seleccionar ciertos microorganismos, frenando el desarrollo de otros. Esto se logra con el agregado de sustancias inhibidoras como los ATB, ciertos colorantes, sales biliares, etc. Tambin la temperatura de incubacin hace selectivo un medio!! Diferencial: es el medio que permite diferenciar bioqumicamente a las bacterias por su actividad metablica. Poseen un sustrato sobre el cual acta o no la bacteria, y esa actividad se revela por la aparicin del pH del medio o por alguna actividad enzimtica que modifica el aspecto del medio de cultivo

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Especial: las sustancias que lo integran cumplen con las exigencias vitales de determinados microorganismos y nicamente ellos pueden desarrollar en forma ptima.

Colonia Las bacterias crecen sobre un medio de cultivo slido, no pueden moverse y al multiplicarse en forma geomtrica, las sucesivas generaciones de bacterias quedan ubicadas unas sobre otras hasta hacerse visibles macroscpicamente. Poblacin Desarrollo bacteriano en medios de cultivo lquidos, en donde no pueden diferenciarse entre s los distintos microorganismos; las caractersticas ms importantes son: turbidez del medio; formacin de velo superficial (su consistencia, espesor y cantidad) y presencia de sedimento (aspecto, cantidad y coloracin).

1.11. CRECIMIENTO REPRODUCCIN Y MUERTE DE LAS BACTERIAS: Estudio cuantitativo del desarrollo: concentracin celular; conteo total y conteo viable. Mtodos. Factores que afectan el desarrollo. Curvas de crecimiento: significado de sus fases. DMM, DL50: fundamentos.

Cultivo de Microorganismos:
Se denomina cultivo al proceso de propagar microorganismos brindndoles las condiciones ambientales adecuadas. Para luego poder realizar un estudio cuantitativo del desarrollo bacteriano. Agar: Es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin de medios de cultivo. Se lica a 97 C Se solidifica a 40 C Con mnimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por ellas. Aislamiento: Proceso o conjunto de mtodos que deben aplicarse para conseguir bacterias en cultivo puro, separando las bacterias que se desea estudiar de los microorganismos contaminantes; se realiza en medios slidos. Mtodos generales de aislamiento: - Diseminacin en una placa: El medio de cultivo elegido se funde a bao mara hirviente, se vuelca en una placa de Petri y se deja solidificar. Para evaporar el exceso de humedad, se coloca la placa en una estufa de cultivo a 37C, boca abajo, por 24 horas. Para realizar el aislamiento se realiza una ansada de la muestra en un punto perifrico de la placa, y con el ansa se traza una estra apretada de poca extensin, luego se debe quemar y enfriar el ansa. Si la muestra es un hisopado, se coloca el hisopo en un punto perifrico y se hisopa apretadamente, luego se contina con el ansa

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Para realizar la primera siembra ciega, la placa se gira en el sentido contrario a las agujas del reloj y se arrastra el material de la estra primaria al medio sin sembrar, en forma perpendicular. Luego quemar y enfriar el ansa. Seguido de una segunda siembra ciega, se gira nuevamente la placa arrastrando material de la segunda estra al medio nuevo en forma perpendicular. Girando finalmente por tercera vez la placa, sin esterilizar el ansa, se traza una estra final de agotamiento en el medio de la siembra y se procede a incubar. Al quemar el ansas el nmero de colonias disminuir de la primera a la ltima estra, esto permite obtener el aislamiento buscado. - Diseminacin en varias placas: Se usan varias placas con medios slidos. Se coloca en un extremo de la placa la muestra clnica y, con esptula de Drigalsky previamente flameada y fra, se disemina la muestra en toda la superficie de la placa. Luego se toma una segunda placa y se repite la diseminacin con la esptula sin flamear. Al repetir la operacin con otras placas, la cantidad de bacterias ir disminuyendo progresivamente, obtenindose al final colonias aisladas. - Dilucin, mtodo empleado para conteo viable o unidades formadoras de colonias: Esta tcnica se utiliza, fundamentalmente, para determinar la calidad higinica de agua y alimentos. Se realizan diluciones de una muestra problema sobre la que se desea averiguar el nmero de bacterias viables. Se efecta la siembra de una alcuota de cada dilucin sobre un medio slido. Luego de incubar cada dilucin, se cuenta el nmero de colonias aisladas y se multiplica por el factor de dilucin, obteniendo el nmero de bacterias por milln de la muestra. Morfologa y aspecto de las colonias y poblaciones bacterianas: Desarrollo del cultivo en medio lquido: - Desarrollo superficial: 1) Formacin de anillo: puede ser de tamao y consistencia variada (pelcula tenue, grumosa, membranosa), puede estar adherido o no a la pared del tubo y ser de aspecto diverso (seco, hmedo). 2) Formacin de velo o pelcula: puede ser de diferente consistencia, gruesa o fina, lisa o rugosa, hmeda o seca, ascendente por el tubo, al agitar el tubo puede mantenerse en la superficie o caer al fondo del tubo. 3) Formacin de precipitado fluctuoso: al agitar el tubo el precipitado desciende formando largos flculos hasta el fondo del tubo (la floculacin es la dispersin de grumos slidos en una solucin coloidal (lquida)). 4) Formacin de pelcula membranosa: se forma una membrana ms gruesa que el velo. 5) Desarrollo superficial ausente: cuando se trata de bacterias microaerfilas anaerobias absolutas no se observa ningn desarrollo superficial, pero s se advierte turbidez del medio en la parte inferior. - Turbidez del medio lquido: muchas bacterias desarrollan produciendo enturbiamiento del medio debido a la abundante suspensin celular. sta turbidez tiene distintos grados y se

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la clasifica segn su mayor o menor intensidad en; leve, moderada y fuerte, y por su duracin en transitoria o persistente. - Formacin de sedimento: muchos cultivos presentan sedimentos de diferentes aspectos. Se clasifican en; fluctuosos (cuando el aspecto es granuloso grueso), granular (cuando es granuloso fino), escamoso y viscoso. A su vez, la cantidad de sedimento puede ser nula, escasa o abundante. Desarrollo del cultivo en medio slido: La morfologa colonial en medio slido es caracterstico de cada tipo bacteriano. Es til su observacin en un cultivo primario para definir si se trata de un cultivo puro o si la muestra est contaminada. Las caractersticas ms importantes son:, forma, dimensiones, elevacin, contorno y superficie. - Pigmentada: depende de la presencia de pigmentos carotenoides. - Superficie: puede ser lisa, rugosa, mucosa, anularconcntrica o con surcos radiales. Las superficies lisas se deben a la presencia de cpsulas o a las cadenas laterales de los polisacridos de la membrana externa de G- (generalmente asociadas a la virulencia de los microorganismos). Las colonias rugosas tienen una superficie seca formada por clulas que carecen de cpsula o que crecen en forma filamentosa. En algunos microorganismos las cepas rugosas no poseen virulencia. Las superficies mucosas se observan en bacterias altamente capsuladas. Las formas son variadas; puntiformes, circular, filamentosa, rizoide o irregular. El borde puede ser; entero, ondulado, lobulado, mellado, filamentoso o festonado. La altura puede ser; elevada, plana, convexa o cncava. Otro rasgo son el olor y caracteres pticos (como; opaco, translcido, opalescente o iridiscente). Conteo Bacteriano El conteo bacteriano seala la magnitud de la poblacin total bacteriana

Conteo de clulas viables La clula viable es aquella capaz de dividirse y formar una colonia en el medio de cultivo. Se basa en que cada colonia surge de una simple clula. Cada colonia contiene una sola especie bacteriana. El nmero de bacterias viables por muestra se expresa en: UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (UFC) Representa cada colonia contada y su nmero total representa el nmero total de bacterias viables en la muestra.

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La determinacin del numero UFC se puede obtener de dos maneras Mtodo de vertido en placa Mtodo de extensin en placa Mtodo de extendido en placa Es el mtodo de eleccin para anaerobios facultativos y cultivo de microaerfilos.

Mtodo de Vertido en placa Esta tcnica se usa generalmente para bacterias aerobias obligatorias.

Dilucin en tubos

til para la tcnica de vertido en placa o extensin en placa. Se siembran volmenes conocidos de cada dilucin Luego se incuba a 35 37 0C durante 24 48 horas. Tcnica de recuento Finalizado el tiempo de incubacin, se realiza el recuento. Se toman en cuenta nicamente aquellas cajas Petri que tengan entre 30 y 300 colonias. Este nmero de colonias es estadsticamente representativo. Aquellas placas que tengan ms de 300 colonias se reportan como INCONTABLES.

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Para realizar el conteo se puede utilizar un cuenta colonias, para realizar el conteo con est: Puede ser contada toda la placa o por cuadrantes. Cuando la carga bacteriana es alta, se toma en cuenta un cuadrante con carga alta, un cuadrante con carga media y un cuadrante con carga baja. Se realiza la sumatoria de los tres cuadrantes y se saca el promedio. Finalmente el promedio se multiplica por 65 No. Colonias = (CA + CM + CB /3) * 65 Obtencin de resultados Terminado el conteo por cualquier mtodo, se debe aplicar la siguiente frmula para obtener el No. de UFC/ ml o UFC/g. UFC/ml UFC/g = No. de colonias por placa X el factor de dilucin * ml de la muestra sembrada *Factor de dilucin: inversa de la dilucin. Curva de crecimiento Las bacterias se multiplican por fisin binaria. Este proceso dura entre 10 min y 24 horas dependiendo del microorganismo, pero la mayora de las bacterias de importancia mdica tiene un tiempo de generacin de entre 20 min y 2 horas. En cada generacin se duplica el nmero de individuos. Partiendo de un nmero inicial de bacterias N0, al cabo de una generacin tendremos 2 x N0, en la siguiente generacin, 2 x 2 x N0 y as sucesivamente la poblacin aumenta con el exponente de 2, por lo que se expresa como crecimiento exponencial. Primera generacin: 2 x N0 Segunda generacin: 2 x 2 x N0 = 22 x N0 Tercera generacin: 2 x 2 x 2 N0 = 23 x N0

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1.16.ACTIVIDAD PATGENA DE LAS BACTERIAS, HONGOS, RICKETTSIAS Y VIRUS: Parasitismo y enfermedad. Relaciones hospedador-parsito. Postulados de Koch. I.Condiciones que posibilitan la enfermedad: 1.Inherente a los microorganismos: patogenicidad y virulencia. Factores de virulencia. a)Bacterias: exo y endotoxinas, hemolisinas, leucocidinas, otras. b)Rickettsias y virus: toxinas y antgenos solubles. c)Hongos: Mecanismo directo, oportunistas y patgenos primitivos. Mecanismo indirecto, micotoxicosis. 2.Inherentes al organismo animal: la especie, raza, edad, estado sanitario, sexo, otras. 3.Otros factores: clima, estacin, alojamiento, otras. Microorganismos nativos (Microbiota normal). Puerta de entrada. Infeccin local y general. Septicemia. Bacteriemia. Viremia, etc. Infecciones latentes.
Relaciones hospedador-parasito Depende del estado inmune del hospedador De la naturaleza de la especie o cepa microbiana Del nmero de microorganismos de la exposicin inicial De las condiciones del ambiente Propiedades que confieren patogenecidad Toxigenicidad capacidad para producir toxinas invasividad (No confundir con invasividad intra celular) se refiere a la facultad para penetrar, establecerse, reproducirse y diseminarse en los tejidos del hospedero Factores que intervienen Penetrabilidad Entrada Adherencia: Mucoplisacridos: Cpsula que sirve para la adhesin Polmeros (glucanos, destranos) que son mucosos y sirven para la adherencia en las caries (Streptococcus mutans) Pilis bacterianos: en mucosas. E.coli enteropatgenos del bovino y cerdo (Plsmido K88 y K89) Multiplicacin No se sabe si la multiplicacin por si sola produce dao. Neutralizacin de defensas Protena A de Staphylococcus aureus que inhibe la quimiotaxis y la fagocitosis El Ag K de E.coli, Vi de Salmonella y Ag O de enterobacterias: con capacidad antifagoctica o resistentes a la accin del Complemento. cido miclico, LPS y cera M. tuberculosis. Cpsula del neumonoco y en Bacillus anthracis. Toxicidad Es la capacidad de un microroganismo de causar dao en determinado tejido por sustancias txicas.

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Endotoxinas (LPS) Lpido A Cadenas laterales especficas Exotoxinas (protenas txicas) Tipo intracitoplasmticas (ej. E.coli) Verdaderas (Diftrica, tetnica, Botulnica) Factores auxiliares de la virulencia Factores enzimticos Hialuronidasa (Streptococcus grupo A, Staphylococcus, Clostridium) Estreptocinasa o fibrinolisina Coagulasa (estafilococo) Proteasas, colagenasas, DNAsas, RNAsas, etc. Factores inmunolgicos Alergia e hipersensibilidad (Candida albicans) Glomrulo nefritis por sensibilizacin a Proteus, E.coli, o protena M del Streptococcus beta hemoltico grupo A Eritema papular por Trichophyton.

Postulado de Koch
1. El micro organismo patgeno sospechoso debe estar presente en todos los caso de enfermedad y ausente en animales sanos. 2. El micro organismo sospechoso debe cultivarse en cultivo axenico 3. La clulas de un cultivo axenico del microorg aislado deben causar enfermedad en animales sanos. 4. El micro organismo debe ser re-aislado y debe ser idntico al original. Patgeno: Es un micro organismo capaz de producir enfermedad Patogenicidad: Es un trmino absoluto. Es o No es patgeno Virulencia: Determina los grados de patogenicidad.

1.18.ACCIN PATGENA EXPERIMENTAL: Animales de laboratorio. Especies ms utilizadas. Estandarizacin animal, aspectos ticos. Clasificacin de los animales de acuerdo con su condicin microbiolgica: convencionales, animales libres de patgenos especficos (SPF), gnotobiotes, animales libres de grmenes (GFA). Rata y ratn: generalidades, sujecin, sexado, identificacin, vas de inoculacin. Toma de muestras. Eutanasia.
La Ciencia de los animales de laboratorio se puede definir como una rama multidisciplinaria que contribuye con la investigacin biomdica permitiendo la obtencin de datos reproducibles, confiables e informativos. Incluye el estudio de la biologa de los animales de laboratorio, su manejo y requerimientos ambientales, los procedimientos de estandarizacin microbiolgica y gentica, la prevencin y tratamiento de enfermedades, la optimizacin de tcnicas experimentales y de las tcnicas de anestesia, analgesia y eutanasia. Esta ciencia tambin incluye el estudio de los aspectos ticos

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de la experimentacin animal junto con la bsqueda de procedimientos alternativos y complementarios. El trmino experimento con animales puede aplicarse a cualquier procedimiento cientfico en el que se utilicen animales, con independencia de que sean vertebrados o invertebrados. El objetivo principal de la ciencia de animales de laboratorio es lograr el equilibrio entre la calidad de la experimentacin animal y el bienestar de los animales. Se define como animal de laboratorio a cualquier tipo de ser vivo, con independencia de su categora filogentica o taxonmica, tanto vertebrados como invertebrados, que se utilice como instrumento de medida con fines cientficos. La ciencia en la que se utilizan fundamentalmente es la biologa (biomedicina), dentro de las siguientes reas: a) Estudios biolgicos b) Desarrollo y control de calidad de productos y aplicaciones para medicina humana y veterinaria, fabricacin de productos farmacuticos o alimenticios y pruebas de eficacia y/o seguridad. c) Diagnstico y prevencin de enfermedades o alteraciones de la salud, prevencin de anomalas o sus efectos, diagnstico y tratamiento de las mismas. d) Valoracin, deteccin, normalizacin o modificacin de las condiciones fisiolgicas en el hombre, los animales vertebrados e invertebrados o las plantas. e. Proteccin del hombre, los animales y el ambiente. e) Educacin y formacin f) Otros El animal de laboratorio se considera como un reactivo biolgico, que lo definimos como aquel animal en experiencia, en funcin al tema en estudio, capaz de dar una respuesta confiable y reproducible. Su pureza debe ser vigilada, controlada y evaluada lo mismo que otro reactivo (qumico o fsico), sin olvidar su posible contaminacin bitica o abitica, que puede producir alteraciones en los resultados esperados u observados en el proceso experimental. El objetivo final es la obtencin de animales biolgicamente uniformes, desde el punto de vista gentico y microbiolgico. Adems se deben estandarizar las variables macro y microambientales del espacio en el cual se encuentran los animales (ventilacin, temperatura, humedad, luz), como as tambin las de ndole etolgico o de comportamiento (territorialidad, agresividad y hacinamiento). Las unidades en donde se producen o mantienen bajo experiencia los animales de laboratorio se denominan bioterios. Tienen como funcin producir animales para ser utilizados como reactivos biolgicos de alta calidad y/o mantener especies o cepas bajo experiencia aplicando metodologas que estn de acuerdo con las recomendaciones internacionales. Bienestar Animal La teora de Russell y Burch tal como se elabor a finales de los aos cincuenta se ha convertido en un tema central de la ciencia de animales de laboratorio. Se trata de cmo instrumentar medidas para disminuir o eliminar los aspectos no humanitarios de la experimentacin animal, para ese fin se introdujo el Concepto de las 3 Rs (refinamiento, reduccin y reemplazo) como base fundamental para el empleo responsable de los animales en los experimentos.

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Refinamiento: Se refiere a las condiciones y calidad de vida que se le otorga al animal en cautiverio. Reduccin: se refiere a una disminucin del nmero de animales que se necesitan para un experimento determinado. Reemplazo: Se refiere a la sustitucin del empleo de animales vivos por tcnicas in vitro, modelos normatizados, videos, etc. Los animales pueden clasificarse por su calidad microbiolgica a) Convencionales: criados y mantenidos en condiciones ambientales no definidas, eventualmente pueden ser portadores de infecciones, latentes o no, pero de ninguna manera zoonosis. b) Libres de patgenos especficos (S.P.F. Specific Pathogen Free): Se obtienen por histerectoma asptica y se cran y mantienen bajo barreras sanitarias. La tcnica de histerectoma se fundamenta en la capacidad que tiene la placenta para filtrar la mayora de los microorganismos, lo cual evita la transmisin vertical. Su microbiota intestinal es normal y se controlan peridicamente. c) Libres de grmenes o axnicos (G.F.A. Germ Free Animals): Son animales en los cuales no se pueden detectar ningn microorganismo, incluyendo los de la microbiota normal por los mtodoshasta ahora conocidos. Son criados y mantenidos en ambientes totalmente estriles como por ejemplo: aisladores. Tambin se obtienen por mtodos de histerectoma. d) Gnotobiotes (Gnotos: conocido, Biote: vida): Son animales axnicos o libres de grmenes que se han puesto en contacto con uno o ms cultivos puros de microorganismos. Es decir que en estos animales conocemos totalmente la carga microbiana presente. Para establecer la categora microbiolgica a la cual pertenecen los animales se controla peridicamente el estado sanitario de las colonias aplicando mtodos y recomendaciones establecidos internacionalmente.

RATON
El ratn es el animal ms utilizado en las pruebas de diagnstico e investigacin. Su pequeo tamao, vida relativamente corta, alta eficiencia reproductiva, adaptacin a la explotacin en grandes colonias, el conocimiento completo de su genoma, su amplia variabilidad gentica y la susceptibilidad a agentes qumicos y microbianos, hacen de este animal un modelo apropiado para investigacin en diversas disciplinas, tales como embriologa, etologa, gentica, gerontologa, microbiologa, oncologa, etc. ORIGEN El ratn domstico (Mus musculus) tiene una amplia distribucin mundial y como su nombre lo indica se encuentra asociado al hbitat humano. Todas las cepas de ratones de laboratorio existentes derivan de una cra selectiva del Mus musculus tipo salvaje. TAXONOMA Clase: Mamfero Orden: Rodentia Familia: Muridae Gnero: Mus Especie: musculus

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BIOLOGA GENERAL El ratn domstico es una especie cosmopolita, comensal del hombre. Se adapta ampliamente a una gran variedad de condiciones ambientales, desde zonas muy fras hasta regiones tropicales. En general las especies prefieren lugares ms secos que hmedos. Es de hbitos nocturnos. Posee un agudo sentido de la audicin, y responde a un amplio rango de secuencias ultrasnicas, por ejemplo cuando la hembra sale del nido sus cras emiten sonidos ultrasnicos que inmediatamente son percibidos por la madre.

RATA
ORIGEN La rata de laboratorio es la variedad domstica de la rata noruega marrn, la cual se encuentra en climas fros, templados y subtropicales de Europa y Norteamrica. En la actualidad es una especie cosmopolita. TAXONOMA Clase: Mamfera Orden: Rodentia Familia: Muridae Gnero: Rattus Especie: norvegicus Biologia General La rata es un animal con una alta adaptabilidad, al igual que el ratn, es capaz de sobrevivir a una amplia variedad de condiciones climticas y de hbitats. Puede ser solitaria o vivir en grandes grupos. En la naturaleza compite con el hombre por el alimento. El hacinamiento combinado con la escasez de alimento puede llevarlas a competir entre ellas sucumbiendo las ms dbiles. En el laboratorio, el canibalismo se evita alimentndolas ad-libitum.

Eutanasia
Bajo dicho trmino entendemos el sacrificio deliberado de un animal, siguiendo una tcnica indolora, rpida, que permita un trnsito tranquilo desde la plena conciencia hasta la muerte. Entre los mtodos ms empleados se encuentra la administracin intraperitoneal, endovenosa, e intracardaca de una sobredosis de un anestsico inyectable. Se calcula una dosis 3 a 4 veces mayor que la normal. Otro mtodo de eutanasia se realiza mediante la dislocacin cervical, slo para un pequeo nmero de animales. Uno de los mtodos ms recomendados es el CO2. Para esto se debe contar con una cmara que debe ser suficientemente grande como para permitir el ingreso de los animales dentro de sus propias cajas, lo que disminuye el estrs. Los animales deben estar expuestos a este gas luego de 3 a 5 min del cese de la respiracin, los neonatos son resistentes por lo tanto se requiere de un mtodo alternativo o exponerlos por ms de 15 min.

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