Soil Bio!. Bioclrem. Vol. 2, pp. 47-53. Pergamon Press 1970.

Printed in Great Britain

FIXATION MICROBIENNE DE L'AZOTE DANS UN SOL SALIN TUNISIEN

THERESA HAUKE-PACEWICZOWA
Zaklad Mikrobiologii I.U.N.G., pulawy, Pologne et

J. BALANDREAU et Y. DOWRGUES
Centre de Pdologie du C.N.R.S., Vandoeuvre-les-Nancy, France
(Accepted 1 1November 1969)
I

RsumXLa fixation d'azote molculaire a t tudie sur un sol salin tunisien, soumis aux quatre traitements suivants: (1) Sol non ensemenc en mas, maintenu la capacit au champ (sol non rhizosphrique non engorg). (2) Sol ensemenc en mas, maintenu la capacit au champ (sol rhizosphrique non engorg). (3) Sol non ensemenc en mas, submerg 10jours aprs la mise en route de l'exprience (sol non rhizosphrique engorg). (4) Sol ensemenc en mas submerg 10jours aprs la mise en route de l'exprience (sol rhizosphrique engorg). La fixation d'azote molculaire, mesure par la mthode de rduction de l'actylne en kthylne, n'apparat que dans le cas du sol rhizosphrique engorg (traitement 4). Les racines de mas ne fixant pas, par elles-mmes,l'azote atmosphrique, ce processus est strictement d'origine microbienne et ne se manifeste qu' proximit des racines de mas. Les microorganismes responsables appartiennent essentiellement au genre Clostridium.L'activit fixatrice d'azote ne devient significative que lorsque la densit des Clostridium dpasse le seuil de lo6 cellules/g de sol. Summary-Nitrogen fixation was studied in a Tunisian saline soil submitted to four treatments : (1) Bare soil, maintained at field capacity (moist non-rhizosphere soil). (2) Soil planted with maize, maintained at field capacity (moist rhizosphere soil). (3) Bare soil, waterlogged 10 days after the beginning of the experiment (waterlogged nonrhizosphere soil). (4) Soil planted with maize, waterlogged 10 days after the beginning of the experiment (waterlogged rhizosphere soil). Nitrogen fixation, measured by the acetylene reduction method, occurred only in the waterlogged rhizosphere soil (treatment 4). The maize plants did not fix atmospheric nitrogen. This process was strictly microbial and it was intense in the vicinity of the maize roots. The predominant microorganisms involved were Clostridium sp. Nitrogen fixation was significant only when the density of Clostridium was more than lo6 cellslg of soil.

INTRODUCTION

Nos connaissances sur l'autcologie des bactries fixatrices d'azote sont actuellement assez dveloppes, tout au moins en ce qui concerne certaines esp6cesou souches, appartenant aux
genres Azotobacter, Beijeriiickia, Clostridium. Par contre on est trs mal renseign sur la syncologie de ces microorganismes, c'est--dire sur leur comportement, et notamment leur activit fixatrice, partir des seuls substrats existant spontanment dans le sol et en prsence des autres dments constitutifs de la microflore tellurique. Le retard dans ce domaine est, en partie, d'origine mthodologique, la seule technique permettant, jusqu' ces dernires annes, d'valuer la fixation brute d'azote dans le sol tant la technique isotopique qui, on le sait, se prte difficilement aux analyses de srie. Mais la dcouverte du
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Q. t'?,.

s**taC&, gti.

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phnomne de rduction de lactylne en thylhe par le complexe enzymatique fixateur dazote (Schollhorn et Burris, 1966; Dilworth, 1966) a ouvert la voie une technique sensible et rapide dapprciation de lactivit fixatrice dazote par des micropopulations complexes (Stewart, Fitzgerald et Burris, 1967; 1968). Cest en faisant appel cette technique que nous avons abord le problhme de lcologie de la fixation dazote dans un sol salin tunisien, dans lequel la densit parfois leve (lo6) dAzotobacter (Dommergues, Combremont, Beck et Ollat, 1969b) suggrait une fixation microbienne active. Nous nous sommes limits ltude de deux facteurs de lenvironnement, le facteur rhizosphre et le facteur engorgement. Limportance de ce dernier facteur a t souligne dans une note rcente (Hauke-Pacewiczowa, Balandreau et Dommergues, 1969).
MATERIEL ET METHODES

Sol Le sol utilis pour lexprimentation provient de la station agronomique de Nakta, Tunisie, station installe en 1962 par le Centre de Recherche pour lutilisation de lEau Sale en Irrigation (C.R.U.E.S.I.) (Van Hoorn, 1966). Cest un sol salin typique form sur alluvions; son pH est de 7,s; sa teneur en argile de lordre de 20 pour cent; sa conductivit lectrique mesure en mmho.cm-l est de lordre de 13. Pour plus de dtails concernant les caractristiques chimiques de ce sol, on se reportera la note publie rcemment (Dommergues et al., 1969b). Le sol est rparti dans des colonnes plates en chlorure de polyvinyle de 50 x 10 mm de section et de 100 mm de hauteur, raison de 150 g par colonne; ces colonnes, fermes la base, souvrent latralement, ce qui permet dextraire facilement les racines et le sol rhizosphrique en fin dexprience. Comme le sol tudi est favorable la prolifration, dans la rhizosphre, de bactries sulfato-rductrices, certaines zones (notamment le bas des colonnes) senrichissent en sulfures ;il a sembl intressant danalyser sparment les chanet les chantillons riches en tillons de sol rhizosphrique pauvres en sulfures (S2-< 1 s sulfures W-> 1 x Prparation du sol rhizosphrique Les graines de mas hybride (varit I.N.R.A. 420) sont strilises 30 min dans une solution 7 pour cent deau oxygne 110 volumes additionne de 2 gouttes de Teepol, puis mises germer en bote de Petri sur une mince couche de glose 3 pour cent, raison dune graine par bote de Petri; les plantules contamines sont limines. Les graines germes sont places dans le sol, raison de 3 par colonne, les graines aflezirant la surface; cette prcaution vite le dprissement des plantules qui se produit souvent, la suite du dveloppement excessif des bactries sulfato-rductrices dans la spermosphre, lorsque les graines sont enfonces trop profondment dans ce sol dont la structure est dfectueuse. On laisse les plantules se dvelopper pendant une dizaine de jours dans le sol maintenu par arrosage quotidien une humidit voisine de la capacit au champ. Lorsque les plants de mas atteignent 10 cm de hauteur environ, une moiti des colonnes de sol est immerge dans leau distille (traitement: sol rhizosphrique engorg) et lautre moiti est maintenue la capacit au champ (traitement: sol rlzizosphriqzce non engorg). Tous les 4 jours on apporte chaque colonne 5 ml de la solution nutritive de Brner et Rodemacher (Dommergues et al., 1969b). Par sol de la rhizosphere PloignPe, nous entendons le sol rcolt avec une fine spatule dans un rayon de 2 3 mm autour des racines. Par sol de la rliizosphre proche, nous entendons

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le sol qui adhre aux racines. Dans le premier cas, l'chantillon est constitu uniquement par du sol; dans le deuxime cas, il est constitu par du sol et des racines. Pendant toute la dure de l'exprience, la temprature est maintenue 26C; l'clairement est obtenu par lumire naturelle (2000 lx, photopriode de 16 h) avec un appoint de lumire artificielle de 1000 l x supplmentaires pendant 8 h par jour.

Prparation du sol non rhizosphrique Le sol non rhizosphrique est extrait de colonnes de sol traitrs de la mme faon que le sol oh est cultiv le mas; d'oh les deux autres traitements: sol non rhizosphrique engorg, sol non rhizosphrique non engorg. Culture hydroponique axnique de mas Paralllement la culture en sol non strile, on cultive du mas strilement conformment la technique dcrite par ailleurs (Dommergues et al., 1969b). Mesure de l'activit fixatrice d'azote Nous adoptons, pour cette mesure, la technique propose par Stewart et al. (1967, 1968) et adapte au sol par Balandreau (en prparation). Sans entrer dans les dtails techniques publis rcemment par ce dernier auteur, rappelons ci-dessous le principe de la mthode et les principales oprations effectues. L'actylne, analogue strique et lectronique de l'azote, est substitu celui-ci dans l'atmosphre fournie l'chantillon tudier: il est hydrogn par la nitrognase comme le serait l'azote dans les mmes conditions et on dose l'thylne form pendant le temps d'exposition l'actylne. N2 6 H + 6e---t2 NH3 C 2 H 2 + 2 H f +2e---tCzH4.

TI se forme thoriquement trois molcules d'thylne l oh une molcule d'azote aurait t k e . L'chantillon de 1 3 g (sol, sol et racines excises ou racines excises seules) est introduit dans un flacon de 12 ml ferm par un disque tanche de caoutchouc; une aiguille hypodermique traversant ce dernier permet de faire un vide pouss dans la fiole, de faon liminer l'azote; on introduit ensuite par cette aiguille un mlange d'hlium et d'actylne, la pression atmosphrique. L'chantillon est incub 28C pendant 24 h. Le dosage de l'thylne form est effectu l'aide d'un chromatographe en phase gazeuse Varian Aerograph 1520. Ethylene et actylne sont spars 50C sur colonne de Porapak R (diamtre 1/4 de pouce; longueur 5 pieds). La dtection se fait par ionisation de flamme d'hydrogne. La forme des pics du chromatogramme est telle que leur hauteur est proportionnelle la quantit d'thylne mesurer. L'incubation simultane des racines excises et du sol adhrant, qui est utilise pour la mesure de la k a t i o n d'azote dans la rhizosphre proche, prsente a priori deux inconvnients: (i) les racines du vgtal pourraient fixer l'azote en dehors de toute intervention microbienne (ii) les racines pourraient, aprs excision, librer des exsudats diffrant qualitativement et quantitativement des exsudats de la plante vivante. La premire objection est rejeter puisque l'on a vrifi que les racines, par elles-mmes, sont dpourvues d'activit fixatrice (cf. fin du paragraphe 'Rsultatsy). La deuxime objection est plus srieuse; mais nous pensons que la dure de l'incubation est assez rduite (24 h) pour que les modifications

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dans la composition des exsudats soient relativement peu importantes. Toutefois, il sagitl dun problme qui nous proccupe et nous avons entrepris une exprience destine dceler des variations ventuelles de lintensit de fixation de lazote atmosphrique, suivant que les racines sont excises ou non.

Numrations bactriennes Les numrations dAzotobacter sont faites sur le milieu glos la mannite dcrit par Pochon et Tardieux (1962), lensemencement tant effectu par des dilutions de suspensions de sol schelonnant entre 10-1 et lo4. Les numrations de Clostridium sont faites sur le milieu dcrit par Pochon et Tardieux (1962), mais modifi par adjonction dextrait de levure Difco h 2pour mille (Dommergues et Villemin, en prparation). Analyse statistique des rsultats Les rsultats des dispositifs exprimentaux adopts, qui sont du type factoriel 2 x 2, ont t analyss suivant la mthode simple prconise par Beck, Dommergues et Van Den Driessche (1969).
RESULTATS

Influence de lengorgement sur lactivit jxatrice dazote et la densit des Clostridium et Azotobacter dans la rhizosphzre proche Lactivit fixatrice dazote-mesure par la rduction de lactylne en thylkne-est nulle dans le sol non rhizosphrique. Lactivit fixatrice dazote dans la rhizosph8re proche M thylBne/h/g de sol sec) lorsque le sol est maintenu la est insignifiante (OJ2 x capacit au champ (sol non engorg)),mais elle est importante (4,61) dans le sol engorg o la sulfato-rduction se manifeste (S2- > 1 x Lanalyse statistique dont les rsultats sont rsums dans le Tableau 1 montre lexistence dune interaction significative (P= 0,Ol) effet rhizosphre proche x engorgement.
TABLEAU 1. INTERACTION EFFET RMZOSPHRE PROCHE X ENEN THYLBNE GORGEMENT SUR LA RDUCTION DE L A C ~ N E (X M TmNE/h/gDE SOL SEC) ( p = 0,Ol)

mg

Sol non engorg Sol non rhizosphrique Sol de la rhizosphre proche

O
0,12

Sol engorg (S2-->1 x 10-61

O
4,61

N.B. Les chiffres de la premire ligne correspondent aux moyennes de 5 rptitions. Les chiffres de la deuxime ligne correspondent aux moyennes de 10 rptitions.

En ce qui concerne la densit des Clostridiirm kateurs dazote, on observe effectivement lexistence dune interaction significative ( P = 0,Ol) du mme type (Tableau 2); mais, alors que lactivit fixatrice est insignifiante dans la rhizosphre non engorge, les CloJtridiiim prolifrent dj de faon importante dans cet habitat; il ne semble pas y avoir un paralllisme Ctroit entre lactivit fixatrice dazote et la densit des Clostridium. Dans le sol utilis pour notre exprience, la densit des Azotobacfer prsente une variabilit si leve quil nest pas possible de mettre en vidence une diffrence significative entre

FIXATION DE LAZOTE DANS UN SOL TUNISIEN TABLEAU 2. INTERACTION EFFET RHIZOSPHRE PROCHE X ENGORGEMENT SUR LA DENSIT DES ClostridiurnFIXATEURSDAZOTE (log,, DU NOMBRE DE BACTRIESlg DE SOL SEC) ( p =: 0,01)
Sol non engorg Sol non rhizosphrique Sol de la rhizosphre proche 4,26 6,27 Sol engorg 4,72 8,95

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N.B. Les chiffres correspondent aux moyennes de 4 rptitions.

les traitements. Aussi indiquons-nous seulement les tendances suivantes qui ressortent des rsultats: dans le sol rhizosphrique, la densit des Azotobacter est de lordre de 102/g de sol sec; dans le sol de la rhizosphre proche, engorg ou non, cette densit est comprise entre lo3 et lo5; quel que soit le traitement, la densit des Azotobacter natteint jamais celle des Clostridium. InJuence de la distance des racines et de la teneur du bol en sulfures sur lactivit fixatrice dazote Le Tableau 3 montre que lactivit fixatrice dazote-mesure par la rduction de lactylne en thylne-est plus importante (i) dans la rhizosphre proche que dans la rhizosphre loigne (ii) dans le sol rhizosphrique dont la teneur en sulfures est suprieure Lanalyse statistique des que dans celui dont la teneur est infrieure 1 x 1x rsultats (Tableau 3) met, en outre, en vidence, lexistence dune interaction significative (P= 0,Ol) distance des racines x teneur du sol en sulfures. En ce qui concerne la relation entre la fixation dazote et la teneur du sol en sulfures, elle nest pas de nature linaire; la fixation prsente un maximum dactivit lorsque la teneur du sol en sulfures est de lordre puis cette activit diminue progressivement au fur et mesure que cette de 20 x teneur augmente.
TABLEAU 3. INTERACTION DISTANCE DES RACINES
X TENEUR DU SOL EN

SULFURESSUR LA RDUCTION DE LACTYLNE EN THYLNE ( X =NE/h/g DE SOL SEC) ( p = 0,01)

le9 M

52-11 x 10-6
~~ ~

s2->1 x 2,29 4,61

l e 6

Sol de la rhizosphre loignk Sol de la rhizosphre proche

0,12
1,29

N.B. Les chiffres correspondent aux moyennes de 10 rptitions.

Activit Jixatrice dazote des racines Ainsi quon la dj signal au paragraphe Matriel et mthodes, les chantillons correspondant la rhizosphre proche sont constitus par les racines et le sol y adhrant; dans ces conditions, on pourrait supposer que la fixation dazote est, non seulement dorigine microbienne, mais aussi dorigine vgtale. Cest pourquoi nous avons compar (i) lactivit fixatrice de racines striles provenant dune culture axnique de mas (ii) lactivit fkatrice de racines non striles provenant de plants de mas cultivs dans le sol salin et laves trs soigneusement aprs leur extraction. Le Tableau 4 montre que les racines striles ne fixent

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pas lazote, contrairement aux racines non striles, qui en fixent des quantits relativement importantes. La fixation dazote dans ce deuxime cas est certainement due aux microorganismes vivant la surface des racines non limins par le lavage.
TABLEAU 4. RDUCTION DE LACTYLNE PAR LES RACINES DE MAS LAVES ST~RILESET NON STRILES ( x IW9 M NE/h/g DE RACINE SCHE A 60C) (P = 0,Ol)
Racines striles provenant dune culture axnique Racines non striles provenant dun sol engorg
~~

0,97

N.B. Le chiffre gauche correspond la moyenne de 4 rptitions, lautre chiffre correspond A la moyenne de 9 rptitions.

CONCLUSION

Dans le sol salin tudi, lazote atmosphrique nest fx par la microflore htrotrophex que dans lhabitat particulier constitu par la rhizosphre proche erigorge; cet habitat est caractris (i) par la prsence de substrats nergtiques en quantit suffisante (ii) par une anarobiose assez stricte, rsultant du blocage de la diffusion de loxygne par lengorgement. La ncessit dune source dnergie pour le processus de fixation microbienne explique parfaitement le fait que ce processus soit localis la rhizosph6re proche. Quant lengorgement, divers auteurs, dont Barrow et Jenkinson (19621, ont signal son effet favorable sur le processus de k a t i o n microbienne. Nos expriences montrent quil nest pas seulement favorable: il est indispensable (Tableau 1); nous avons prcis, en outre, que la fxation est plus intense quand la teneur du sol en sulfures est suprieure 1 x (Tableau 3), cest-dire quand le potentiel doxydo-rduction devient ngatif. Mais, lorsque la teneur en sulfures lactivit fixatrice dcrot. La fixation microbienne exige donc un dpasse 20 x certain niveau danarobiose; mais cette anarobiose ne doit pas tre excessive. Les rsultats obtenus mettent en vidence lexistence dune interaction hautement significative effet rhizosphre proche x humidit, en ce qui concerne lactivit fixatrice dazote; une interaction du mme type a dj t constate par lun de nous, dans le cas de la sulfato-rduction (Dommergues, Jacq et Beck, 1969a). Jusqu prsent, les recherches sur leffet rhizosphre ont t6 conduites en ngligeant lintervention du facteur humidit; les conclusions auxquelles nous parvenons ici montrent, au contraire, quil est indispensable danalyser trs attentivement les interactions de ce type. Contrairement aux hypothses mises par certains auteurs, dont Stevenson (1 9591, Geltser (1965) ou Turchin ef al. cits par Moore (1966), la plante ne peut fixer lazote par elle-mme. La fixation dans la rhizosphre est donc exclusivement dorigine microbienne. Les Clostridiuiii semblent jouer un rle prpondrant pour les deux raisons suivantes: (i) leur densit est beaucoup plus leve que celle des Azotobacter (elle atteint le chiffre considrable de IO8 IO9 unitslg de sol sec) (ii) les Clostridi~m sont mieux adapts que les Azotobacter lhabitat rducteur que constitue la rhizosphre engorge. La possibilit de lintervention des Azotobacter ne doit cependant pas tre totalement limine, car on snit que ces bactries peuvent se dvelopper dans des conditions o les bactries sulfato-rductrices prolifrent (Le Gall. Senez et Pichinoty, 1959). La comparaison des Tableaux 1 et 2 rvle enfin que lactivit fkatrice dazote ne devient significative que lorsque la densit des

* II nest pas question ici de la fixation par les Cyanophyces car elles ne jouent vraisemblablement aucun
rle dans la rhizosphre.

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Clostridium dpasse le seuil de IO6, seuil beaucoup plus lev que le seuil habituellement admis.
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