Agrobiotecnologa

Curso 2011

Transferencia de genes a clulas animales en cultivo

Gerardo C. Glikin

Departamento de Fisiologa, Biologa Molecular y Celular Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Universidad de Buenos Aires

ORGANISMOS TRANSGNICOS - INVOLUCRADOS EN BIOTECNOLOGA BACTERIAS (i.e.: Escherichia coli) HONGOS (i.e.: Saccharomyces cereviseae) CULTIVOS CELULARES (animales o vegetales) PLANTAS ALGAS VASCULARES ANIMALES: PECES AVES MAMFEROS Bovinos Caprinos Ovinos Porcinos HUMANOS: Transgnesis parcial Terapia Gnica

Transferencia de Genes a Clulas Animales en Cultivo

PROPSITOS
Confirmar identidad de genes Caracterizar oncogenes Expresar protenas que necesitan modificaciones posttraduccionales Producir grandes cantidades de protenas que naturalmente se encuentran en cantidades limitadas Estudiar sntesis y transporte intracelular Expresar secuencias genmicas que contienen intrones Estudiar mecanismos de edicin de genes Analizar seales de control de transcripcin y su modulacin por drogas, hormonas, estado de diferenciacin

MODALIDAD
Transitoria: s/ Integracin: Expresin 12-72 horas Permanente: c/ Integracin: Expresin 1-3 semanas

PARMETROS A CONSIDERAR
Tipos celulares disponibles Expresin transitoria o permanente (estable) Elementos de control de expresin adecuados

MARCADORES FENOTPICOS
Crecimiento en agar Crecimiento con bajo suero Cambios morfolgicos Rescate de la muerte de cultivos celulares primarios

MARCADORES BIOQUMICOS
Indicadores Anticuerpos especficos Chloramphenicol acetyltransferase (cat) -galactosidase (-gal) Luciferase Selectores Thymidine kinase (tk) Xantine guanine phosphoribosyl transferase (xgprt) Aminoglicoside phosphotransferase (apht/neor) Dihydrofolate reductase (dhfr) Hygromycin B phosphotransferase (hygr) Indicadores/Selectores Green/Blue/Red fluorescence proteins (gfp/bfp/rfp)

MARCADORES BIOQUMICOS
Indicadores
Anticuerpos especficos
Ag + AbI Ag.AbI Ag.AbI + AbII. Ag.Ab.AbII.
: enzima, grupo fluorescente, grupo radioactivo

Chloramphenicol acetyltransferase (cat)

[14C] Chloramphenicol Ac- [14C] Chloramphenicol (Ac)2-[14C] Chloramphenicol

-galactosidase (-gal, lac Z)

lactosa galactosa + glucosa ONPG o-nitrofenol (amarillo) + galactosa Xgal X (azul) + galactosa

Luciferase
Luciferina + ATP Luciferina + ADP + h (luz)

Indicadores/Selectores
Green/Blue/Red fluorescence proteins (gfp/bfp/rfp) XFP + h1 (luz) XFP + h2 (luz)
1 >2 Selector: FACS

MARCADORES BIOQUMICOS
Selectores
Thymidine kinase (tk):)
dT +ATP dTMP +ADP dUMP dTTP select. cls. tk-: HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina) inhib: aminopterina selectivo p/toda cl.: AAMX (adenosina, aminopterina, ac. Aminofenlico, xantina) ASMP: ac. adenilosuccnico

Xantine-guanine phosphorybosil transferase (xgprt)

Xantina XMP GMP guanina inhib: ac. aminofenlico precursores IMP inhib: aminpoterina ASMP AMP

Aminoglicoside phosphotransferase (apht/neor)

neomicina/kanamicina/geneticina (G418) antibitico fosforilado (inactivo)

Dihydrofolate reductase (dhfr)

DHFTHF selectivo en cls. dhfr-: ausencia de nuclesidos selectivo p/toda cl.: methotrexate (MTX)

Hygromycin B phosphotransferase (hygr)

Hygromicina B (G418) antibitico fosforilado (inactivo)

TRANSFERENCIA GENTICA: METODOLOGIA

Vectores virales Vectores no virales

Direccionamiento de vectores Via de administracin Receptores celulares Promotores especficos de tejido

 Vectores Virales
Virus naturales (silvestres): Crecen en todas las clulas Infectan todas las clulas Son patognicos Virus terapeticos (recombinantes): Slo crecen en clulas empaquetadoras Infectan todas las clulas No son patognicos

VECTORES VIRALES
Tamao mximo del gen terapetico Clulas objetivo

Retrovirus

Adenovirus

Herpes virus

Virus Adeno asociados 4,8 kb En divisin o quizs sin divisin Ex vivo o in situ Posiblemente estable Moderado Posible integracin mutagnica S

8 kb Slo en divisin activa Ex vivo o in situ Estable Moderado Posible integracin mutagnica No

35 kb En divisin activa o sin divisin Ex vivo o in situ Transitoria Elevado Reacciones inflamatorias/ inmunitarias S

30 kb En divisin activa o sin divisin Ex vivo o in situ Transitoria Moderado Posible integracin mutagnica S

Administracin Expresin del gen terapetico Indice de expresin del gen terapetico Riesgos

Inmunidad preexistente en el hospedador Recombinacin con el hospedador Recombinacin con el virus parental

Improbable Imposible

Posible Posible

Posible Posible

Improbable Posible

 Vectores no Virales
Microinyeccin / Perforacin (DNA desnudo) Precipitacin con fosfato de calcio Liposomas aninicos Complejos DNA/lpido catinico: lipoplex Complejos DNA/polycatin: polyplex Conjugados moleculares Dendrmeros: PEI Hydrogel Nanoesferas Biopolmero-DNA Complejos LPD Inyeccin a presin Electroporacin Can gnico Ultrasonido Campo magntico

Microinjection

Transfection

Liposomes

Electroporation

Lpidos catinicos: Citofectinas

Complejo DNA/lpido catinico: Lipoplex

Lipids / Polycations / DNA (LPD) Complexes

LPD-I: Cationic Liposome Entrapped, Polycation Condensed DNA

LPD-II: Anionic Liposome Entrapped, Polycation Condensed DNA

VECTORES NO VIRALES
Capacidad de insercin Eficiencia de transferencia Integracin Generacin virus recombinantes Oncogenicidad Expresin de protenas virales Expresin estable Administracin in vivo Transmisin a cls. quiescentes

Conjugados moleculares Irrestricto Eficiente No No ? No Transitoria ? No

Transfecc. Irrestricto Eficiente No/Rara No ? No Transitoria S S

Liposomas catinicos Irrestricto Eficiente No No ? No Transitoria S S

Vector ideal 1-1000 kb Muy eficiente S/No No No No S/No S S

Co-transfection

Gene amplification

Bioprocess Engineering in Recombinant Protein Production

Transfection Cell culture Purification Formulation/ Filling

+
Drug product (sterile)

Cells and plasmid

Cell line

Drug substance (crude)

Drug substance (pure)

Cell line manufacture Bioreactor process Downstream Medium development development & scale-up purification Analytical characterization

Mammalian system demands on the grow