1.

INTRODUO

TESTE DE DIFUSO EM GEL O teste de difuso em gel vem sendo usado h muito tempo. Serve para pesquisar anticorpos no soro ou para identificar microrganismos, como vrus, bactrias, etc. um mtodo que apresenta pouca sensibilidade, por isso tem sido usado, em menor escala no laboratrio de Anlises Clnicas (FAHHEY e KELVEY, 1965) A tcnica de imunodifuso realizada em meio semi-slido, geralmente o gar ou agarose, que permite uma difuso mais homognea que em meio lquido, mas que tem o inconveniente de demorar entre 18 e 24 horas para que seja observada a precipitao. A difuso dos imunoprecipitados no gel depende do tamanho destes; quando so grandes ficam maiores que o dimetro dos poros, o que impede a sua difuso (MANCINI et Al., 1965). Baseia-se na difuso de antgeno e de anticorpo colocados lado a lado em um suporte de gel (normalmente, agar ou agarose). No ponto de encontro dos dois teremos uma reao Ag-Ac e precipitao. Neste caso temos a dupla difuso . Outra tcnica consiste em adicionar ao agar, ainda fundido (+/- 45C) o antgeno ou o anticorpo, dependendo do que se vai pesquisar. Colocando, por exemplo, o antgeno num orifcio feito no agar, este se espalha e se combina com o anticorpo formando um halo de precipitao. Neste caso temos a difuso radial simples (RUMBAUGH et al., 1979). A imunodifuso dupla pode ser realizada numa lmina de microscpio revestida de gar, contendo orifcios onde so colocadas concentraes de Ag e Ac. Quando o Ag e os anticorpos especficos encontram-se, em concentraes correspondentes zona de equivalncia, so formados complexos precipitantes.

IMUNODIFUSO RADIAL SIMPLES A imunodifuso radial simples, introduzida por Mancini, em 1965, alm de ser uma tcnica de fcil realizao e de baixo custo, quantitativa. realizada em placas ou lminas revestidas de gar, no qual incorporado um anticorpo especfico para a molcula a ser quantificada. A imobilizao de um dos componentes (anticorpo ou antgeno) no meio gel. A mistura ento adicionada a uma placa de petri . Aps a gelificao, orifcios so abertos no gel e adicionase o segundo componente aos orifcios. Ocorrer e difuso simultnea atravs do gel e consequentemente a formao da linha de precipitao na zona de equivalncia (FEITOSA et al., 2001).

Como mostrado na figura 1, na imunodifuso simple possvel ter as fazes de prezona ,onde geralmente se excesso de anticorpo; zona de equivalncia, onde a quantidade de anticorpo e de antgeno e equilibram propocinando a a formao do preciptado mais homogneo; e h tambm a pro-zona, onde existe antgeno em excesso. Tanto a pr-zona quanto a ps zona interfere na ligao antgeno-anticorpo e preojudica a precipitao. (McDonnell e Askari ., 1997)
Figura1: Demonstrao de pr-zona, zona de equivancia e ps zona na imunodifuso radial simples.

2. PRINCPIO DO TESTE

Baseia-se na difuso de antgeno e de anticorpo colocados lado a lado em um suporte de gel (normalmente, agar ou agarose). No ponto de encontro dos dois teremos uma reao Ag-Ac e precipitao. Neste caso temos a dupla difuso (DD). Outra tcnica consiste em adicionar ao agar, ainda fundido (+/- 45C) o antgeno ou o anticorpo, dependendo do que se vai pesquisar. Colocando, por exemplo, o antgeno num orifcio feito no agar, este se espalha e se combina com o anticorpo formando um halo de precipitao. Neste caso temos a difuso radial simples (DRS).

3. MATERIAIS E REAGENTES UTILIZADOS

Placar com Agar Caneta (para fazer o orifcio) Azul de metileno (Para visualizao da difuso no gel) Ponteiras e pipetas

4. PROCEDIMENTO

Retirar a parte a parte superior de uma caneta esfrica, Com a caneta furar o agar da placa com a parte superior da mesma formando um orifcio e com auxilio de uma micropipeta aplicar azul de metileno no orifcio e observar a difuso.

5. RESULTADOS

Cada aluno presente treinou a aplicao de azul de metileno no orifcio de placa com gel resultando em duas placas com vrio orifcio. As referentes placas emcontram-se representadas na figura 2.

Figura 2: Difuso do azul de metileno aps aplicao em placa com gel de agarose

6. DISCURSO

Foi preciso observar a difuso do azul de metileno pelo gel simulando um teste com antgenos e anticorpos, isso foi possvel devido a capacidade de penetrabilidade de substancias atravs do gel. A difulso, alm do tamanho da partcula a dinfundir, tambm dependente do tamanho dos poros formados no gel, assim,a escolha do gel tambm se faz importante.

7. CONCLUSO

A simulao do teste de imunodifuso radial possibilitou a visualizao da difuso do azul de etileno no gel bem como a prtica de aplicao da amostra nos orifcios do gel de agarose.

8. REFERNCIAS

McDonnell, W.M., Askari, F.K., 1997. Immunization. JAMA278(22):2000-2007. http://www.fao.org/docrep/w0049e/w0049e06.htm#agar gel immunodiffusion (agid) (acessado em 12/02/2013) FEITOSA, F.L.F., BIRGEL, E.H., MIRANDOLA, R.M.S., et al. Diagnstico de transferrencia de imunidade passiva em bezerros atravs da determinao de protenas total e suas fraes eletroforticas, imunoglobulinas G eM e da atividade da gama glutamil transferase no soro sanguneo. Ciencia Rural, V.31,n.2, p.251-255, 2001. FAHHEY, J.L.; McKELVEY, E,M. Qualitative determination of srum

imunoglobulins in antibary-agar plates. Jornal of Immunology, v.94, p.84-90, 1965. MANCINI, G.; CARBONARA, A.O; HEREMANS, J.F.; Imunochemical quantitaion of antigens by single radial immunodifusion. Imunochemistry, v.2, n.3 p. 235-254, 1965. RUMBAUGH, G.E.; ARDANS, A.A.; GINNO, D et al. Identification and treatment of colostrum-deficient foals. Journal of American veterinary Medical Association, v.174, n.3, p. 273-276, 1979.