UNIVERSIDAD ALAS PERUANA ESCUELA DE FARMACIA Y BIOQUIMICA BIOQUMICA II FOSFOLIPASA Y PROTEINASA DE ESPECIES DE CANDIDA

La cndida es la cuarta ms comn de infeccin en torrente sanguneo en los pacientes hospitalarios. Para colonizar infectar evaden los mecanismos de defensa del husped la cndida posee un repertorio de atributos de virulencia ,la morfologa celular factores de adhesin ,cambio fenotpico y fuera de la actividad celular lipolitica y proteoltica. Los factores de virulencia expresados en cuanto a la infeccin pueden variar dependiendo del tipo de infeccin ,el sitio de infeccin y la naturaleza de la respuesta del husped.. Las Proteinasas asprtico secretadadas (PAE) son responsables por los daos de adherencia a tejidos y de la invasin sede la respuesta inmune. Su actividad proteoltica se ha asociado con la invasin de los tejidos y de la invasin sede la respuesta inmune. Su actividad proteoltica se ha asociado con la invasin de tejidos la secrecin fosfolipasas extracelulares se considera un atributo clave que ayuda a la acogida de invasin de la mucosa del epitelio. Las fosfolipasas en general catalizan la hidrolisis de los fosfolpidos que son los componentes importantes de todas las membranas celulares. MATERIALES Y METODOS Tomaron muestras de sangre de las unidades de cuidados intensivos (UCI) de las unidades de dilisis y las unidades de

oncologa en los hospitales y asilos de ancianos en los alrededores de Bangalore. Las muestras fueron tomadas de pacientes que no han tenido la exposicin al frmaco anticomotico durante la hospitalizacin. Un total de 114 aislamiento de cndida se recuper de las muestras de sangre. Los aislamientos fueron identificados por la formacin de clamidosporas, fermentacin de azucares y los patrones de asimilacin. El estudio comparativo se realiza con cepas estndar proporcionado por P.G.I.M.E.R.En el anlisis de proteinasa y estimacin de la fosfolipasas los aislamientos se determin para todos. DETECCION DE PROTEINASA La proteinasa en cndida fue detectado por el mtodo Staib ligeramente modificado. Utilizando medio suero de la albumina Bovina (dextrosa al 2%, H2KPO4 0,1% ; 0,05% MgSO4 ; Agar al 2% mezclado a 50 c despus del enfriamiento con bovina al 1% solucin de albumina de suero ).La actividad de la proteinasa se detecto mediante la inoculacin de alcuotas de la suspensin de levaduras (Aproximadamente 108 clulas de levadura/ml) en los pocillos perforados en la superficie del medio. Las placas se incubaron a 37 C durante los das despus de la incubacin ,las placas se fijaron con cido tricloro actico al 20 % y se tieron con 1,25% amidoblack. La decoloraciones se llev a cabo con 15 % de cido actico. La opacidad del agar corresponde a una zona de la protelisis de alrededor de los pozos que no se podran haber teido con amidoblack esto indica la degradacin de la protena.

El dimetro de las zonas alrededor de la mancha tambin se le considera como una medida de la produccion de proteinasa. La actividad de proteinasa (pz) se determin en trminos de la relacin entre el dimetro del poco con el dimetro de la zona proteoltica sin teir cuando el PZ igual a 1 ninguna actividad proteinasa se detect en la cepa. Por lo tanto una baja PZ indica una alta produccion de la enzima. ESTIMACION FOSFOLIPASA: Los aislamientos fueron evaluados por su actividad fosfolipasas por la creciente extracelular en agar, yema de huevo y medir el tamao de la zona de precipitacin por el mtodo de Sama Ramayake ligeramente modificado. En pocas palabras el medio de la yema de huevo consisti en 13 gr de agar sabouraud dextrosa 11,7 gr NaCl, C aCl2 0,111 gr y el 10 % de yema de huevo estril .Se centrifuga 500 gr de la yema del huevo durante 10 minutos a T ambiente y 20ml del sobrenadante se aadi a mediano plazo a la esterilizacin. La actividad fosfolipasas extracelular fue detectada mediante la inoculacin de alcuotas de 10 ml de la suspensin de levadura (aproximadamente 108 clulas de levadura/ml) en los pozos perforados. Sobre la superficie del medio o de yema de huevo. El dimetro de la zona de precipitacin alrededor del pozo se midi despus de la incubacin a 37 C durante 48 horas.La fosfolipasas (valor PZ) fue determinada por la relacin entre el dimetro de la colonia con el dimetro total de precipitacin. Cuando el PZ igual a 1 .Sin actividad fosfolipasas fue detectadas en la cepa as de nuevo un PZ baja indica alta produccion de la enzima.

RESUTADOS Incluido en la cndida 114 las especies aisladas de las muestras de sangre fueron C .Albicans ,C glabatra, C guilliermondi ; C kfir , C Crucy ,C Parapsilosis , y C Tropicales. Todos los aislamientos fueron probados para la proteinasa y fosfolipasas de produccion. La actividad de proteinasa fue detectada en 85 % de los aislamientos y la actividad fosfolipasas se detect en 51 % ; aislamientos. Los aislamientos analizados demostraron diversos grados de actividad de la fosfolipasas (valor pz : 0,23 1,0)con actividad ms significativo la fosfolipasas. El valor de la actividad Proteinasas PZ oscilacin de 0,17 y 1,0 el nivel ms alto de la actividad proteinasa PZ oscilacin de 0,17 y 1,0.El nivel ms alto de la actividad enzimtica fue para comparar la produccin de proteinasa y fosfolipasas en diferentes orgnicas no hubo diferencias significativas entre los organismos. Con respecto a la produccion media de proteinasa y fosfolipasas DISCUSIN Para la levaduras pasados varios aos en el gnero cndida sigue siendo la mas importante etiolgicamente los agentes de infeccin nosocomial. El considerable aumento de la profunda candidiasis es ms comn. Observado en pacientes en UCI ,las personas con catteres permanentes o que reciben tratamiento oncolgica de trasplantes de rganos y otros individuos inmunocomprometidos sometidos a fuertes protocolos teraputico. El aislamiento de no C-Albicans se han citado poco con frecuencia en los ltimas dcadas y los resultados estn de acuerdo con este hallazgo .De los 11437 cepas fueron C-albicans y 77 no fueron Albicans.

Como las fosfolipasas y proteasas de Aspartil C.Albicans se consideran factores importantes de virulencia ,la ausencia o baja expresin de estas enzimas puede indicar la naturaleza menos virulentas de especies de candida ,cuando en comparacin con las especies de Candida con una mayor expresin de estas enzimas 18 de C.Albincans fueron probados productores de fosfolipasa sin embargo algunas cepas de C.Kruce ,C.Tropicalis y C.Glabrata se comporto de la misma manera.Candida Albicans,C.Kefyr,C.Parapsilosis y C.Tropicalis mostro que la actividad proteinasa es casi similar. Nuestro resultado tambin indica que a pesar de que todas las cepas aisladas fueron patgenas ,no todas las cepas de cndida producen proteinsasa y la fosfolipasa como factores de virulencia. La virulencia de especies de cndida se atribuye no aun solo factor sino a una combinacin de varios factores como proteinasa ,fosfolipasa,la produccion de biofilm etc .Los resultados de nuestro estudio coincide con las de Ibrahim demostrando que C.Albicans aislada a partir de las muestra de sangre muestra un significativo extracelular fosfolipasa.El porcentaje de no C.Albicans aislados de la produccion de protena es superior a la de C.Albincans cepas , mientras que C.Albincans son ms altos productores de la fosfolipasas que las no- C.Albincans.