Sunteți pe pagina 1din 33

II.

ANALIZA CROMATOGRAFIC
Analiza chimica cromatografica include mai multe metode de separare si totodata de analiza a componentilor amestecului din proba. Separarea precede analiza si se realizeaza prin repetarea, de un numar mare de ori, a echilibrului de distributie ntre doua faze. Una dintre faze este imobila si poarta denumirea de faza stationara (aflata de regula ntr-un tub numit coloana) iar cealalta -faza mobila - aflata n miscare, se deplaseaza prin golurile primei faze. Separarea se petrece n coloana cromatografica, piesa cheie a ntregii metode. Faza mobila, denumita si eluent -scurgndu-se continuu (deci cu viteza constanta) prin interstitiile fazei stationare, adeseori poroase, poate provoca migrarea, cu viteze diferite, a celor n componenti ai amestecului de separat de-a lungul coloanei. Amestecul supus separarii se introduce sub forma de solutie la nceputul coloanei, folosindu-se un dispozitiv de introducere a probei (de exemplu o microseringa), si se afla initial fixat ntro zona ngusta de la nceputul coloanei. Spalati de eluent, o parte din componentii probei migreaza apoi prin coloana cu viteze diferite. Acest lucru se datoreaza interactiunilor fizice specifice, dintre moleculele probei si faza stationara (desigur, nu orice molecula poate migra pe orice faza stationara). Efectul, este numit retentie si aceasta provoaca o asa-numita migrare diferentiata. Adica moleculele migreaza n grupuri, n fiecare grup existnd doar molecule de acelasi fel. Aceasta face posibila sesizarea componentilor, pe rnd, la parasirea coloanei, de catre un instrument, n grupurile respective - denumite uneori zone. Instrumentul amintit este un analizor fizico-chimic, sensibil la mai multi (n mod ideal la oricare) dintre componenti ce ies din coloana si care este plasat n eluent, imediat dupa iesirea din coloana. Acest analizor, denumit detector este capabil sa dea un semnal proportional cu masa sau cu concentratia solutiei de component n faza mobila. n consecinta, dispozitivul, "marcheaza" trecerea fiecareia din substantele ce formeaza initial proba, similar cu o fotocelula care nregistreaza trecerea concurentilor la sosire n atletism.

Fig. II.1. Elementele unei cromatograme n orice tip de cromatografie detectorul da un semnal proportional, uneori cu concentratia, alteori cu masa componentului aflat n celula de masura, semnal ce poate fi nregistrat n functie de timp. Diagrama semnal, functie de timp sau de volumul de eluent se numeste cromatograma. Pe cromatograma distingem o serie de maxime, numite picuri (peak = vrf n l. engleza), care se produc deasupra liniei de baza sau a portiunii orizontale a curbei, paralela cu axa timpului. Aceasta apare ori de cte ori n detector nu apare nici un component, n afara eluentului evident.

Oricare pic are, n cazul ideal, forma distributiei normale Gauss. Sa consideram cea mai simpla cromatograma posibila: cazul introducerii unui singur component, ntr-un gaz, C, care contine urme de aer - aerul fiind un component inert. Aspectul acestei cromatograme este cel prezentat n figura II.1. Pe axa absciselor s-a considerat timpul (sau volumul) de eluent scurs, cu debit cunoscut, de la introducerea (injectarea) probei, iar pe cea a ordonatelor, semnalul detectorului - n unitati arbitrare. Distingem urmatoarele elemente de baza ale unei cromatograme: 1. Picurile cromatografice. n cazul prezentat n fig. 1, cele doua semnale sau vrfuri sunt denumite picuri. Acestea sunt semnalele valorificabile n analiza calitativa si cantitativa n toate metodele cromatografice. Primul pic, mai mic, corespunde unui component inert (aerul de exemplu n CG) - care nu este retinut de loc - iar cel de-al doilea, notat cu C, corespunde componentului (unic n cazul de fata) al probei considerate si este datorat moleculelor care se distribuie pe parcursul migrarii prin coloana ntre faza mobila si cea stationara si care, n consecinta, ies mai trziu din coloana. 2. Timpul mort, tM - este timpul n care un component, complet neretinut de catre faza stationara, parcurge coloana si tuburile de legatura pna la detector. Acesta nu poate fi zero. n cazul CG timpul mort, de exmplu, este egal cu timpul de retentie al aerului: tM = tR (R = Retentie). Deci, cu alte cuvinte, reprezinta timpul scurs de la injectarea (introducerea) probei n coloana si aparitia maximului de concentratie n detector, pentru componentul neretinut. 3. Timpul de retentie, tR - o marime caracteristica pentru fiecare component al amestecului separat de coloana - reprezinta timpul scurs de la injectarea probei si aparitia maximului de concentratie n detector. De exemplu, n cazul prezentat anterior n fig. 1, acesta este distanta de la axa ordonatelor (nceputul cromatogramei) pna la verticala prin vrful picului C. Acest timp, pentru un component si o coloana (plus conditii experimentale) date este constant, indiferent daca componentul respectiv este singur sau n amestec. 4. Volumul de retentie, VR este volumul de eluent corespunzator timpului de retentie (legat de timpul tR prin intermediul debitului eluentului, Fe): VR = tRFe 5. Timpul de retentie ajustat, tR'- introdus n cromatografie pentru a se putea compara timpii masurati pe coloane diferite, n cazul aceluia si component - este dat de diferenta: tR' = tR - tM 6. VR' = VR VM unde VM este volumul mort; acest volum mort este legat de debitul eluentului coloanei, Fe, prin produsul: VM = tMFe si reprezinta volumul golurilor din coloana plus volumul tuburilor de legatura de la coloana la detector. Corespunzator exista si un volum de retentie ajustat,

II.1. CLASIFICAREA TEHNICILOR CROMATOGRAFICE


S-au realizat numeroase variante ale metodei cromatografice, diferind unele de altele n primul rnd prin natura fazei mobile, dar si a celei stationare. Astfel se distinge: a. cromatografia de lichide (LC) cnd faza mobila este un lichid in cadrul careia se distinge: -cromatografia de lichide pe coloana deschisa; -cromatografia de lichide pe coloana inchisa; b. cromatografia de gaze (GC) cnd faza mobila este un gaz; c. cromatografia cu fluide supracritice la care faza mobila este un lichid aflat peste temperatura critica. A. n cadrul cromatografiei in lichide (LC) se disting mai multe variante, n functie de mecanismele de separare: 1. Cromatografia de adsorbtie utilizata pentru separarea substantelor organice cu molecule de dimensiuni mici si medii pe adsorbanti, ca silicagel si alumina, folosindu-se, ca faze mobile, diferite amestecuri de solventi organici. 2. Cromatografia ionica (de schimb ionic), care se petrece pe o faza stationara solida, poroasa, formata din materiale specifice schimbatorii de ioni - substante cu o retea solida afnata, de natura organica sau anorganica. Cele mai raspndite sunt rasinile schimbatoare de ioni. 3. Cromatografia de excluziune sterica se desfasoara pe faze stationare poroase dar cu porozitatea selectionata astfel nct sa corespunda dimensiunilor moleculelor supuse separarii. O parte dintre molecule intra prin pori, iar altele sunt excluse deplasndu-se practic neretinute odata cu faza mobila. Tehnica se mai ntlneste si sub denumirea de filtrare prin geluri sau permeatie prin geluri n functie de natura apoasa sau organica a fazei mobile. 4. Cromatografia lichid-lichid (LLC), n care faza stationara este o faza lichida, nemiscibila cu cea mobila si imobilizata pe un suport solid, ntr-o coloana. Aici suportul solid este inert fata de componentele din proba. Acesta tehnica este cea mai raspndita devenind aproape sinonima cu cromatografia de lichide. 5. Cromatografia pe coloana deschisa sau cromatografia planara (PC) faza mobila circula printr-un material poros dispus ntr-un plan si formnd un strat relativ subtire, dar de compozitie asemanatoare cu cele mentionate la cromatografia pe coloana. Se disting: Cromatogafia pe hrtie, tehnica n care faza stationara este o hrtie poroasa din celuloza (initial o hrtie de filtru) care este irigata de solvent prin forte capilare. Cromatografia pe strat subtire (TLC), n care faza stationara pulverulenta este fixata de suportul plan (sticla, aluminiu, material plastic) cu un liant, formnd un strat subtire (0.1- 0.5mm) de asemenea irigata prin capilaritate. Cromatografia pe strat subtire de nalta performanta (HPTLC), n care faza stationara are granulatie extrem de fina ridicndu-se astfel eficienta separarilor dar si viteza acestora. B. n mod analog, n cazul cromatografiei de gaze (sau mai pretentios cromatografiei n faza gazoasa), denumita prescurtat GC se disting urmatoarele tehnici: 1. Cromatografia gaz-lichid n care faza stationara este un lichid nevolatil imobilizat pe un suport solid. Aici suportul poate fi unul granular, poros, situat ntr-o

coloana n asa-numita cromatografie de gaze conventionala sau chiar pe peretii coloanei, confectionata de dimensiuni capilare, n cromatografia pe coloana capilara. 2. Cromatografia gaz-solid este analoga cu cromatografia de adsorbtie si la cea de excluziune sterica cu deosebirea ca schimbarea gazului nu modifica selectivitatea. Faza stationara o constituie tot silicagelul sau alumina, respectiv sitele moleculare (niste silicati naturali sau sintetici) respectiv granulele de carbon poros. Metoda este extrem de importanta pentru separarea gazelor permanente (CO, CO2, O2, N2, gaze nobile etc.)

II.2. CROMATOGRAFIA DE GAZE


Prin cromatografie de gaze pot fi anlizate toate amestecurile de lichide gaze sau solide care pot fi trecute sau exist n stare gazoas i care nu se descompun la nclzire n alte specii chimice. Modul cel mai uzual de analiz este acela n care amestecurile supuse analizei snt n stare lichid din care snt aduse n stare gazoas prin evaporare .Singura restrictie pentru folosirea analizei cromatografice gazoase este la substanele la care temperatura de vaporizare este mai mare dect temperatura de descompunere a substantelor de analizat rezultind ali compui dect cei supui analizei. In aceste cazuri nainte de introducerea probei n cromatograf se pot realiza niste derivati (compusi noi), volatili, utiliznd anumite reactii chimice specifice, procedeu denumit derivatizare. Uurinta cu care se pune la punct o analiza noua, sensibilitatea sa, posibilitatea de automatizare precum si largile posibilitati de aplicare sunt avantajele principale ale acestei metode. Printre domeniile n care GC si-a cucerit un loc de prim rang sunt: petrochimia, industria farmaceutica, protectia mediului, analiza aromelor, igiena si criminalistica. La cromatografia cu gaze proba este evaporat la intrarea n coloana cromatografic fie direct la captul acestei fie ntr-un dispozitiv special plasat tot la intrarea n coloan. Separarea de-a lungul coloanei (eluia) are loc cu ajutorul unui gaz purttor care spre deosebire de cromatografia de lichide nu interacioneaz cu faza mobil , singurul lui scop fiind acela de agent de transport a speciilor chimice din amestec prin coloan. nceputurile Cromatografiei de gaze snt legate de coloane cu umplutur n care se transfera amestecul de substane gazoase dup ce n prealabil erau evaporate spontan ntr-un injector nclzit. La ora actual este folosit n exclusivitate numai cromatografia de gaze cu coloane fr umplutur la care se deosebesc dou tipuri: - cromatografia de gaze pe faze staionare solide (cromatografie de absorbie) - cromatografia de gaze pe faze staionare lichide (cromatografie de repartiie) La cromatografia de gaze pe faze staionare solide retenia speciilor de analizat din amestec este realizat pe baz de absorbie fizic pe peretele interior al coloanelor cromatografice ce au diametre interioare de zecimi de milimetrii i lungimi apreciabile de ordinul zecilor de metrii. Din cauza unor absorbii ireversibile, care duc la rndul lor reproductibiliti slabe, aceast tehnic este folosit rar i numai la substane cu puine molecule n structur. Cromatografia de gaze pe faze staionare lichide se bazeaz pe repartiia substanei de analizat ntre faza mobil gazoas i o faza lichid imobilizat pe peretele interior al coloanei cromatografice. Acest tip de cromatografie de gaze este folosit la ora actual aproape n exclusivitate. Relaiile matematice care o descriu snt valabile cu mici modificri i la cromatografia de lichide, aceste modificri snt dictate

de faptul c gazele snt compresibile i ca atare proprietile i comportarea reologic snt influenate de presiune i de temperatur. Din acest motiv la cromatografia de gaze este folosit n locul timpului de retenie tr volumul de retenie Vr care ine cont de debitul mediu Q al fazei mobile exprimat n ml/min, debit ce depinde de presiune i de temperatur : Vr= tr . Q Spre deosebire de cromatografia de lichide viteza fazei mobile are o influen mare asupra lirii de band ( vezi i cap. Cromatografia de lichide) influena difuziei longitudinale fiind important dtorit coeficientului de difuzie mai ridicat cu 3-4 ordine de mrime la gaze fa de cel al lichidelor.

II.2.1. Aparate folosite n gazcromatografia de gaze


Un gazcromatograf respect schema bloc din figura avnd particulariti specifice pentru analiza unei faze gazoase schema lui de principiu arat ca n figura II.2.

Fig.II.2. Schema de principiu a unui gazcromatograf. 1-butelie de gaz purttor, 2-reductor de


presiune, 3 - manometru de nalt presiune, 3- manometru de joas presiune, 5- regulator de presiune i debit, 6- sering de injecie pentru substane de analizat n stare iniial lichid, 7-dispozitiv de evaporare rapid , 8-cuptor termostatat de nclzire, 9- coloan cromatografic tubular, 10- detector, 11- amplificator electronic, 12- sistem electronic de achiziie prelucrare i afiare date, 13 calculator, 14- imprimant

II.2.1.1. Alimentarea cu gaz purttor


Gazul purttor trebuie s fie inert din punct de vedere chimic. Din acest punct de vedere intr n discuie gazele inerte, hidrogenul, azotul i bioxidul de carbon. Natura gazului utilizat depinde de tipul de detector folosit , iar acesta depinde la rndul lui de

mai muli factori dar n principal de clasa de substane analizate. Gazele purttoare de nalt puritate snt preluate de regul din butelii speciale de nalt presiune prevzute cu reductoare de presiune ce asigur presiuni de intrare cuprinse ntre 1,5 i 3 ata, dar pot fi produse i pe loc cu generatoare speciale ( hidrogen, azot). Pe traseul gazului purttor se gsete un debitmetru electronic precum i o sit molecular pentru reinerea vaporilor de ap i a eventualelor impuriti solide de dimensiuni mici.

II.2.1.2. Sistemul de injecie


Caracteristicile sistemului de injecie asigur n mare parte calitatea analizelor cromatografice, fiind responsabile de lirea de band a peak-urilor. Un sistem

Fig.II.3. Fazele de injecie ale amestecului lichid de analizat performant de injecie trebuie s asigure injecia n timp scurt a unor cantiti extrem de mici de subsatan de analizat numai aa snt asigurate peak-uri nguste la baz. Extragerea probei se face dintr-un minirecpient cilindric de sticl aezat pe suportul mobil a autosamplerului prin intermediul unei microseringi speciale acionat automat. Acul seringii perforeaz un dop de cauciuc siliconic sau i absoarbe o cantitate bine definit de prob, figura II.3. , dup care se ridic automat , se deplaseaz i injecteaz proba printr-un semptum prevzut cu un dop de cauciuc siliconic ntr-un dispozitiv de evaporare rapid situat la intrarea n coloan. Este foarte important ca evaporarea s se produc practic instantaneu astfel nct amestecul fazei purttoare cu substana de analizat s se produc chiar la baza coloanei cromatografice. Volumul unei probe analizate pentru coloane analitice normale variaz de la civa l la cca 30 l, la coloane capilare volumul probei este mult mai mic de ctiva nl fiind necesar folosirea unui sistem de splitare ( divizare), figura II.4., a volumului probei , sistem care asigur preluarea pentru analiz numai a unui volum extrem de mic restul fiind purjat n mediu. Aceste sisteme de splitare snt n principiu divizri de debit cu tuburi de tip T, existente att pe traseul gazului purttor ct i pe cel al amestecului gazos, pe ale crori ramuri se creaz rezistene hidraulice bine controlate astfel nct s poat fi purjat cea mai mare parte din substana de analizat, pe coloan ajungnd numai o parte infim de amestec i gaz purttor aa cum de altfel este necesar. Manipularea a unor cantiti

Fig. II.4. Dou procedee de splitatare a volumului probei la cromatograful de gaze


2- tub de evaporare cu dop de vata de sticl sau de cuar , 4 corpul dispozitivului de injecie , 5- ventil cu 3 ci, 6- ventil cu ace cu debit reglabil

mici de prob, aa cum este cazul la gazcromatografie, pe cale manual duce la erori importante motiv pentru care pentru dozare i injecie snt recomandate dispozitive de tip autosampler.

II.2.1.3. Coloane cromatografice


Termenul de coloan cromatografic este oarecum impropriu pentru cromatografia de gaze, el provine inc din timpul n care se foloseau coloane cu umplutur de lungimi rezonabile care ncpeau n gazcromatograf sau care erau montate n poziie vertical lng aparat avnd o termostatare concentric. Diametrul interior al coloanelor cu umplutur pentru gazcromatografie este de 4,6 mm, 3,18 mm sau la aa numitele coloane micro <1mm. Acest tip de coloane este astzi extrem de rar folosit din cauza faptului c au o capacitate de separare redus i o rezoluie slab. Astzi snt folosite cu precdere coloane capilare care se prezint sub forma unor tuburi metalice de cupru , oel inoxidabil sau din sticl cele din urm fiind trase ntr-un film de poliamid sau de aluminiu pentru a le mri rezistena mecanic la incovoiere. Coloanele capilare snt goale, au diametre interioare submilimetrice i lungimi de zeci de metrii putnd depi i o sut de metri. Coloanele capilare au capacitate de separare i rezoluie mare n schimb din cauza cantitilor extrem de mici de substan analizat au au o limit de detecie sczut i un timp de analiz mai ridicat. Din cauza volumului extrem de mic necesar ntr-o coloan capilar , de ordinul l, ale amestecului gazos de analizat nainte de intrarea n coloana cromatografic se folosete splitarea

(divizarea) probei ,prin aceast operaie numai o mic parte a acesteia, la limita dozrii volumice, este admis n colan cealalt parte fiind purjat n atmosfer. Aceast cantitate emic de substan analizat este motivul limitei de detecie mai sczute. Att coloanele cu umplutur ct i cele capilare pot funciona n regim de cromatografie de absorbie (gaz- solid) sau n regim de cromatografie de repartiie (gaz - lichid). La folosirea coloanelor cu umplutur pentru cromatografia de absorbie umplutura este format dintr-un absorbant foarte fin, figura, iar la cromatografia de repartiie umplutura este format dintr-un material poros figura II.5, a crui suprafa este impregnat cu o faz lichid staionar.

Fig.II.5. Tipuri de coloane utilizate n gazcromatografie. a- coloane cu umplutur pentru cromatografia de absorbie, 1-perete coloan, 2-umplutur poroas . b-coloane cu umplutur pentru cromatografia de repartiie, 1-perete coloan, 2faz staionar lichid depus pe umplutur, 3-umplutur. c-coloan capilar cu film lichid subire, 1-perete coloan, 2-film lichid , d-coloan capilar cu strat subire impregnat cu lichid, 1-perete coloan, 2- film lichid, 3-strat granular subire.

La folosirea coloanelor capilare se deosebesc coloane cu film i capilare cu strat. La coloanele capilare cu film, figura, faza staionar ader sub forma unui film subire de peretele interior neted al coloanei capilare iar la coloanele capilare cu strat, figura, faza stationar este aplicat sub forma unui strat subire de diatomee impregnat cu faza lichid staionar. n cadrul cromatografiei de gaze snt valabile tot relaiile stabilite la ceromatografia de lichide cu condiia ca influena temperaturii i a presiunii s fie redus la maxim. n acest scop procesul de sparare n coloan trebuie s fie izoterm iar trecerea amestecului n faz gazoas ct mai rapid posibil. Pentru alegerea corect a unei coloane pentru gazcromatografie este nevoie s se in cont de urmtoarele: - proprietile negative ale unei coloane ( cost, timp de analiz, absorbie rezidual) snt proporionale cu lungimea crescnd deci cu creterea acesteia - singura proprietate pozitiv a coloanei i anume capacitatea ei de separare crete abia cu ptratul lungimii coloanei, acesta fiind i motivul folosirii unor coloane de lungime medie de 20 -30 m n locul unor lungimi ce pot depi 100 m. Afar de aceasta la coloane scurte scade timpul de analiz i absorbia rezidual deoarece ea este proporional cu lungimea drumului parcurs de faza mobil n mediul absorbant

Atunci cnd se solicit o separare avansat se vor folosi coloane de lungime mare cu recomandarea ca drept gaz purttor s se foloseasc hidrogenul deoarece se reduc sensibil timpii de analiz. Trebuie avut n vedere c aici crete timpul de analiz Reducerea timpului analiz prin mrirea presiunii iniiale a gayului purttor duce la reducerea capacitii de separare a coloanei capilare

II.2.1.4. Cuptoare de termostatare


Temperatura coloanei este un parametru esenial pentru gazcromatografie deoarece ea provoac practic gradientul de presiune ce transport gazul prin coloan. Creterea Temperaturii duce la creterea exponenial a presiunii amestecului gazos care la rndul ei duce la creterea vitezei de migrare reducnd sensibil timpul de retenie. n general se consider c o cretere atemperaturii cu cca 30 0C duce la reducerea la jumtate a timpului de retenie. n realitate nu intereseaz viteza absolut de migrare ci viteza relativ de migrare vr ca fiind raportul dintre viteza medie vma liniar a substanei analizate raportat la viteza medie vmg a gazului purttor:

vr =

v ma v mg

valoarea vitezei relative de migrare se situeaz ntre 0 i 1, ceea ce nseamn vc la valoarea zero nu are loc nici o migrare, temperatura fiind prea mic, iar la valoarea 1 nu are loc nici o separare deoarece amestecul de de analizat traverseaz coloana cu aceei vitez cu gazul purttor nefiind reinui difereniat n timp diferiii componeni. Care valoare intermediar ntre zero i 1 este optim depinde n mare parte de dificultatea separrii. Temperatura optim a coloanei depinde de temperatura de fierbere i de gradul de separare. Pentru amestecuri a cror temperatur de evaporare se situeaz ntr-un domeniu destul de apropiat se poate spune cu o apreciere relativ bun c o temperatur egal sau ceva mai mare dect temperatura medie de evaporare a probei duce la un timp de eluie apreciat de cca 4-30 minute ceea ce reprezint valori acceptabile. Dac se folosete acest raionament se apeleaz la regimul de lucru izoterm (temperatura coloanei constant). In cadrul lucrului n regim izoterm valoarea temperaturii trebuie meninut constant n limitele 0,1 0C motiv pentru care coloana se gsete ntr-un cuptor termostatat . n cazul unor probe cu un interval mare de fierbere este de dorit s fie folosit un program de temperatur n cadrul cruia temperatura este crescut fie n mod continuu fie n trepte . La injecie proba se gsete la temperatura cea mai sczut optim pentru componentele volatile dar necorespunztoare pentru componentele cu temperatur de vaporizare mare. n timpul analizei temperatura este crescut progresiv pn cnd se obine n final temperatura corespunztoare componentelor volatile. n cadrul programelor de temperatur nu trebuie depit ns temperatura care duce la valorii mai mari de 1 a vitezei relative de migrare vr

II.2.1.5. Detectoare pentru gazcromatografie


II.2.1.5.1. Caracteristicile detectoarelor
La ieirea din coloana gascromatografice exist condiii optime de msurare pentru multe tipuri de detectoare deoarece aici ies pe rnd substane gazoase pure cu o diluie ideal realizat cu un gaz inert. Pentru identificri calitative este indicat folosirea de spectrometre la ieirea gazcromatografelor. Cele mai utilizate combinaii snt: gazcromatograf- spectrometru de mas ( GC-MS) sau gazcromatograf- spectrometru n infrarou cu transformat Fourier (GC-FTIR). Pentru analiza cantitativ a probelor ( probe a cror compoziie calitativ este deja cunoscut) s-au impus cteva detectoare utilizate la ora actual la scar mare acestea se clasific dup principiul lor fizic n: Detectoare sensibile la variaie de concentraie Detectoare sensibile la variaie de debit masic

La detectoarele sensibile la variaie de concentraie semnalul electric al detectorului este proporional cu concentraia momentan a substanei ( i) din volumul din imediata vecintate a detectorului. La un detector sensibil la variaie de debit masic semnalul electric al detectorului este proporional cu debitul masic ( Mi), adic cu masa de substan ce trece n unitatea de timp prin dreptul detectorului. Detectoare sensibile la variaia de concentraie snt influenate de debitul de gaz purttor motiv pentru care debitul de gaz purttor trebuie reglat automat n vederea meninerii constante a valorii lui. Influena debitului de gaz purttor nu se manifest la detectoarele sensibile la variaie de debit masic. Sensibilitatea S a detectorului reprezint nivelul de conversie a mrimii fizice neelectrice ntr-o mrime electric proporional. La detectoarele sensibile la

Fig.II.6. Componente duntoare ale semnalului electric al detectoarelor variaie de concentraie sensibilitatea detectorului este dat de raportul dintre semnalul electric Ei i concentraia substanei i din gazul purttor, iar la detectoare sensibile la variaie de debit masic sensibilitatea este dat de raportul dintre semnalul electric Ei i debitul masic Mi - mas n unitate de timp). Prin nregistrarea semnalului electric al detectorului (potentialul electric E-mV sau curentul electric I-

mA) n funcie de timp se obine cromatograma. Un detector nu d numai un semnal electric util ci conine i componente duntoare sau parazite precum : abateri, zgomot de fond , drift (plaj de variaie) , figura II.6., care pot duce la erori importante de msurare. Abaterile periodice i au originea n reglrile periodice automate ale temperaturii i debitului gazului pe cnd oscilaii neperiodice trebuie puse mai ales pe seama coloanelor de separare inclzite incomplet sau murdare. Zgomotul de fond are frecven ridicat este specific fiecrui detector i electronicii sale aferente i se manifest mai ales atunci cnd amplificarea electronic a semnalului este mare. Componentele parazite din semnalul electric se determin n felul urmtor: din semnalul nregistrat al detectorului n funcie de timp se alege ntimpltor un interval de 15 minute si se traseaz pe ambele pri ale liniei de baz a semnalului dou linii paralele n aa fel nct aceste linii s ating tangenial intr-un interval de cca 10 minute peak-urile (virfurile) a cele mai mari. Drift-ul , figura , este definit ca fiind nclinaia celor dou linii paralele fa de abscis. Abaterile snt definite ca distana ntre cele dou linii. Pentru stabilirea mrimii zgomotului de fond se alege intervalul de un minut care prezin cel mai mare zgomot. Nivelul zgomotului de fond se determin prin mrimea distanei ntre cele dou linii paralele ce unesc vrfurile semnalului de zgomot. Limita de detectare Ld reprezint o msur a concentraiei mg/l sau a debitului masic g/s celor mai mici a substanelor analizate nc detectabile de un senzor cromatografic: Pentru descrierea capacitii unui senzor folosit n cromatografie se folosete exclusiv limita de detectabilitate i nu sensibilitatea lui. Limita de detectabilitate se determin din raportul dintre nivelul tuturor semnalelor parazite praportat la sensibilitate S: Ld =p/S Numai atunci cnd diferena E ntre valoarea mrimii msurate i valoarea medie a unei analize oarbe este de trei ori mai mare dect abaterea standard (s) a tuturor semnalelor parazite p se poate susine cu o siguran de 99% c c un punct de msurare oarecare P de pe cromatogram reprezint un punct a semnalului util i nu a componentelor parazite ale semnalului. La acest raionament se iau n calcul numai abaterile pozitive ale Peak-urilor de la valoarea medie ( jumtatea semnalului de eroare). Acest concept teoretic , dealtfel perfect valabil, este modificat n practica cromatografic n sensul c se iau n considerare att abaterile pozitive ct i cele negative , msurtorea fcndu-se vrf vrf. Din aceste msurtori ar rezulta prin mprire un factor f , (f = 1,5 (n loc de 3) pentru distana punctului de msurare P de la valoarea median a semnalului de abatere . de regul pentru calculul limitei de detectabilitate Ld se fololosete un factor f =1,2 2: Ld = (1,5...2) semnal de abatere /Si Ld = (5...10) semnal de abatere /Si n conformitate cu alte standarde snt folosite i alte valori pentru factorul f, IUPAC recomand f = 3. de ex

Limita de determinare real L det reclam valori mai mari pentru (f) dect n cadrul limitei de detectare, astfel valoarea acestuia trebuie s fie cuprins ntre 5-10 corespunztor cu sigurana statistic cerut pentru rezultatul msurtorilor. Constanta de timp () , figura II.7. a unui detector cromatografic, inclusiv a electronicii aferente, reprezint timpul care trece din momentul iniierii msurtorii pn n momentul n care este indicat 63,2% a ntregului semnal. Dup (5 ) se obin 99,3 % a ntregului semnal

Fig.II.7. Influena consatantei de timp asupra timpul de rspuns t Selectivitatea unui detector Si,j descrie sensibilitile diferite pentru dou materiale diferite i i j. Selectivitatea Si,j este indicat ca fiind raportul sensibilitii detectorului pentru cele dou substane: Sij= Si/Sj Dac sensibilitatea pentru substana j se apropie de valoarea unu detectorul este specific pentru substana i, (Si = ) Domeniul liniar al unui detector, figuraII.8, reprezint domeniul unde sensibilitatea Si este constant . n partea de jos domeniul liniar este limitat prin limita

Fig.II.8. Domeniul liniar (a) i domeniul dinamic (b) al unui detector folosit n cromatografie

de detectabilitate Ld. n partea de sus prin o abatere tolerat de 5% de la dreapta ideal de liniaritate. Pentru exemplificare grafic a domeniului liniar se reprezint n coordonate dublu logaritmice suprafaa peak-ului Ai sau a semnalului detectorului Ei n funcie de cantitatea m i a probei, concentraia Ci , respectiv fa de debitul masic Qmii, figura II.8.a, Intr-un alt tip de reprezentare folosit se reprezint sensibilitatea Si n funcie de cantitatea de prob folosit mi, n funcie de concentraia Ci sau n funcie de debitul masic Qmii, figura II.8.b. Valoric domeniul liniar se exprim prin raportul dintre limita superioar a domeniului liniar i limita de detectabilitate, este obligatorie i indicarea naturii substanei analizate i. Domeniul dinamic al detectorului este plasat n continuarea domeniului liniar i reprezint domeniul n care o modificare a concentraiei sau a debitului masic mai provoac o modificare sensibil i posibil de calibrat a semnalului detectorului, figura II.8.a,b.

II.2.1.5.2. Detectorul de ionizare cu flacr ( FID)


Detectorul de ionizare cu flacr, figura II.9, este un detector folosit pentru substane organice ( hidrai de carbon) ce are aplicaia de baz la cromatografele de gaze deoarece mbin o sensibilitate ridicat cu robusteea. Un detector de ionizare cu flacr este de cca 1000 ori mai sensibil dect un detector de conductivitate termic. Alte domenii de aplicare ale acestui detector snt la supravegherea apelor privind prezena de hidrocarburi volatile precum i la supravegherea polurii atmosferei i a aerului din spaii interioare cu hidrocarburi gazoase. Principiul detectorului se bazeaz pe msurarea conductivitii electrice unei flcri de hidrogen plasat ntre doi electrozi. Substanele de analizat snt transportate n flacr cu un gaz purttor unde snt ionizate termic datorit aportului de cldur din flacr. n felul acesta n cmpul electric dintre cei doi electrozi apare un curent ionic msurabil care este nregistrat n funcie de timp de ctre nregistrator sub form unor vrfuri (Peak-uri) cu aplicaii n analiza chimic calitativ. Intensitatea semnalului electric al detectorului (nlimea maxim al Peakului) este liniar i proporional cu coninutul de hidrocarbur ntr-un domeniu foarte larg de concentraie , cu aplicaii n analiz cantitativ. Din acest motiv concentraia unei hidrocarburi poate fi determinat direct din semnal fr a se folosi curbe de etalonare. Unele substane organice ( de ex. acidul formic, acetaldehida) au detectabilitate slab . Alte substane precum: gazele nobile, H 2 , N2, NO2 , CO, CO2 , H2O , CS2 , NH3 , 02 , CCl4 sau alte legturi de halogen , halogenuri de siliciu

Fig.II.9. Schema de principiu a detectorului gazcromatografic de tip FID. 1-areztor, 2-flacr de


hidrogen, 3,4- electrozi colectori de electroni, 5 amplificator electronic, 6- sistem electronic de prelucrare i afiare

Sistemul cromatospectrometric prezentat in figura II.10 permite determinarea concomitent a compoziiei calitative i cantitative moleculare precum i a celei calitative i cantitative atomice din amestecuri complexe de gaze. n acest scop este folosit un gazcromatograf echipat cu detector FID dispozitivat cu o structur spectrometric modular format dintr-o sond, compus la rndul ei dintr-o lentil colimatoare, o fibr optic, un spectrometru miniatural compact echipat cu reea de difracie fix , detector Diode- Aray, soft pentru prelucrare informaii spectrale de emisie atomic precum i un sistem de procesare, afiare i tiprire spectre. Sonda se monteaz perpendicular pe direcia de ardere a flcrii de hidrogen i valorific emisia spectral a atomilor elementelor chimice excitate n flacra de hidrogen la cca 3.000 0 C. Informaia spectral ajunge prin lentila colimatoare i fibra optic pe reeaua de difracie a unui spectrometru miniatural, iar dup difracie, pe un detector Diode-Array care mpreun cu microprocesorul spectrometrului furnizeaz spectrograma de emisie atomic a speciilor chimice elementare (elemente chimice) prezente in amestecul de gaze analizat.

Fig.II.10. Sistem combinat cromatospectrometric. 1-gazcromatograf, 2- detector de ionizare, 3sistem de adaptare pentru sonda optic, 4-flacr de hidrogen, 5-lentil colimatoare din sticl de cuar, 6- fibr optic de transmisie, 7-spectrometru cu reea de difracie i detector Diode- Array, 8- sistem de procesare afiare i tiprire spectre

II.2.1.5.3. Detectorul pentru compui de azot i fosfor (NPD)


Detectorul pentru azot i fosfor este un detector modificat de tip FID care conine o surs alcalin de silicat sub forma unei perle din sticl sau ceramic dopat cu elemente alcaline, precum K,Rb,Cs, ce elibereaz uor electroni. Perla alcalin este

fixat pe o srm de platin ntre flacra de hidrogen i electrozii colectori de electroni ai detectorului, figura fiind nclzit att pe cale electric prin srma de platin pus sub tensiune ct i prin flacra de hidrogen, n jurul ei formndu-se un nor termic plasmatic care prin norul de electroni emii are totdeauna sarcina negativ fa de sarcina pozitiv a electrozilor colectori . Detectorul NPD poate fi folosit n dou moduri: - ca detector de fosfor (P) ca detector de azot (NP) n cazul utilizrii lui ca detector de fosfor, figura II.11 a , flacra de hidrogen arde ca la detectorul FID deasupra arztorului cu deosebirea c arztorul este legat la pmnt, figura, deoarece electronii rezultai din arderea unor componente ce conin atomi de carbon , electroni ce constituie semnalul electric la un detector FID , snt respini n acest caz de potenialul negativ al perlei scurgndu-se la mas, n schimb electronii ce iau natere pe suprafaa perlei alcaline , al cror numr este proporional cu concentraia de fosfor, ajung nestingherii la electrozii colectori formnd semnalul electric al detectorului. n ce privete mecanismul propriuzis de reacie trebuie artat c la nceput se formeaz n flacr oxizi de fosfor cu un numr impar de electroni , prin fixarea a electronului impar se formeaz n prima faz anionii diferiilor acizi fosforici care n flacr snt oxidai n flacr cu radicali OH la acizi neutrii de fosfor ,

a)

b)

Fig. II.11. Schema de principiu a detectorului pentru: a- fosfor (P), b- azot i fosfor (N-P).
1-arztor, 2- flacr de hidrogen, 3,4 electrozi colectori de electroni, 5-perl alcalin, 6-plasm, 7- amplificator electronic, 8-sistem electronic de prelucrare i afiare

ocazie cu care electronul fixat este eliberat i se constituie n semnalul electric al detectorului. La folosirea detectorului pentru compui de azot mecanismul este asemntor ca la fosfor deoarece i i azotul are un numr impar de electroni care duce la formarea de oxizi numai c acetia se descompun prea repede i nu reacioneaz cu perla alcalin . Dac n schimb se scade regimul termic de nclzire al perlei se formeaz radicali cian care dau reacie alcalin specific . Pentru a reduce regimul termic se micoreaz debitul de hidrogen la un nivel de cca 1-3 l/min i cel de aer la cca 100 l/min, condiii n care flacra de hidrogen se stinge iar aportul slab de hidrogen existent , ca urmare a reducerii debitului acestuia, duce la aprinderea lui n jurul perlei sub forma unui nor plasmatic slab . Radicalii cian formai prin piroliz termic fixeaz un electron iar anionii CN - formai reacioneaz cu hidrogenul o respectiv cu radicali OH cu formare de compui neutrii de tip CO2, H2O, N2 cu

eliberarea unui electron ce se constituie , aa cum s-a mai artat, n semnalul detectorului . Detectorul azot - fosfor este un detector selectiv putnd fi folosit n principiu pentru toate elementele care au un numr impar de electroni , inclusiv pentru compui volatili de bor i arsen , utilizarea lui de baz este totui cea pentru compui fosfor i azot n regimul de lucru N-P, figura II.11 b. n regimul de lucru numai pentru fosfor (regimul P) detectorul este selectiv pentru compui de fosfor dar are sensibilitatea mai redus ca n regimul de lucru N-P. Un mod de lucru numai pentru azot (regim de lucru de tip N) nu este posibil fiind indicate alturi de compui de azot totdeauna i compui de fosfor , bineneles dac acetia snt prezeni n amestecul de subsatane analizate

II.2.1.5.4. Detectorul de conductivitate termic


Detectorul de conductivitate termic este unul din cele mai vechi detectoare folosite n cromatografie. El se bazeaz pe msurarea continu a conductivitii termice a amestecului de gaze compus dintr-un gaz purttor i amestecul gazos de analizat, figura. Conductivitatea termic este o mrime fizic specific naturii i concentraiei substanelor. Amestecuri de gaze de compoziii i concentraii diferite ce scald cei patru rezistori nclzii ai punii Wheatstone modific proporional cu natura i cu concentraiilor substanelor rezistena acestor rezistori ducnd la apariia unei tensiuni de dezechilibru a punii.

Fig.II.12.

Schema de principiu a unui analizor de gaze bazat pe principiul punii Wheatstone. 1- amplificator electronic, 2- sistem electronic de achiziie , prelucrare i afiare, R1,R2, R3, R4 - rezistori din platin nclzii electric

Detectorul de conductivitate termic , figura II.12, este format dintr-un bloc metalic compact bine termostatat n care se gsesc patru celule de gaz identice prevzute cu filamente de platin sau de wolfram , sub form de srm, legate electric ntr-o punte de tip Wheatstone. n detector se realizeaz o msurare comparativ de compensaie. n acest scop prin dou celule, situate pe dou laturi opuse ale braelor punii, trece gazul purttor pur, iar prin celelalte dou brae ale punii trece gazul purttor n amestec cu gazele pentru analizat. Toate filamentele snt parcurse de un curent electric care provoac nclzirea acestora prin efect JouleLenz. Temperatura srmelor i prin aceasta i rezistena lor electric depinde de

conductivitatea termic a gazelor ce trec prin celule. Modificri ale compoziiei gazelor provoac prin conductivitile lor termice specifice modificri corespunztoare de temperatur i prin aceast modificri ale rezistenei electrice a filamentelor de srm. Diferenele de temperatur a filamentelor n celulele de msurare i n celulele de referin duc la un dezechilibru electric msurabil al punii Wheatstone. Timpul la care se produce acest dezechilibru este proporional cu natura substanei care traverseaz la acel moment dou brae opuse ale punii , iar valoarea dezechilibrului este proporional cu concentraia acelei substane din amestecul de gaze. Detectorul de conductivitate termic este un detector universal, utilizabil la aproape toate substanele, singurele ngrdiri snt la substane puternic corozive care distrug filamentele, dar are o sensibilitate destul de sczut.

II.2.1.5.5. Detectorul cu capcan de electroni (ECD)


Detectorul cu capcan de electroni (ECD engl. Electron Capture Detector), este un detector specific pentru gazcromatografie folosit n analiza substanelor sulfuroase, substanelor cu azot i a substanelor halogenate ( ex. PCB, Lindan, etc). Aplicaiile de baz snt n analiza urmelor i n chimia mediului. Detectorul este format dintr-o camer de ionizare ce conine un catod i un anod i un flux continuu de gaz. Pentru ionizare snt folosite radiaii () emise de o surs radioactiv sub forma unei folii foarte subiri al izotopului Ni63, sursa de radiaii constituie totodat i catodul, figura II.13. Descompunerea radiaiei () duce la emisia de electroni primari care se ciocnesc cu moleculele (N2) ale gazului purttor i ca urmare iau natere ioni N2 ncrcai pozitiv i electroni secundari liberi. Prin aplicarea unei tensiuni ntre cei doi electrozi apare un cmp electric prin care electronii secundari liberi se deplaseaz spre anod unde produc un curent electric de civa nanoamperi numit curent de ionizare de baz. Dac n amestecul de gaze este un gaz cu afinitate mare fa de electroni atunci aceast substan colecteaz o mare parte din electronii liberi ceea ce duce la micorarea curentului de ionizare de baz. Aceast micorare afecteaz proporional curentul de baz i reprezint semnalul util al detectorului. Detectorul cu capcan de electroni reacioneaz la substane cu afinitate de electroni cum snt de exemplu substane halogenate precum i anumite pesticide. Sistemul clasic cu msurarea curentului de ionizare de baz, descris mai sus, are dezavantajul unui domeniu liniar redus, motiv pentru care n aparate moderne se folosete alt sistem de lucru. Astfel se aplic un impuls de tensiune cu frecven variabil . n momentul n care exist semnalul de tensiune (0,5 pn la 1s), electronii care nu au reacionat cu substanele amestecului de gaze din gazul purttor snt colectai de anod. Timpii de pulsare a semnalului electric se aleg aa de scuri pentru ca ionii grei, rezultai ca urmare a absorbiei de electroni, s nu poat ajunge la anod. Frecvena semnalelor electrice aplicate nu este constant ci modificat continuu n sensul asigurrii unei intensiti de curent constante. Dac n detector intr prin amestecul de gaze un numr mare de molecule electrofile pentru compensarea scderii sub limit a curentului (ca urmare a scderii numrului de electroni) se mrete frecvena curentului. La acest mod de lucru semnalul util al detectorului nu-l mai reprezint micorarea curentului de ionizare de baz ci modificarea frecvenei tensiunii aplicate n scopul meninerii constante a intensitii curentului , frecvena semnalului fiind proporional cu concentraia moleculelor captoare de electroni. Prin timpul de pauz ntre semnale se asigur n limite largi un numr de electroni liberi constant , ceea ce nsemn c i la concentraii mari ale substanei de

analizat snt suficieni electroni la dispoziie pentru ionizare. Numrul de electoni se adapteaz concentraiei substanei de analizat prin acesta extinzndu-se sensibil i domeniul liniar.

Fig.II.13. Schema de principiu a detectorului gazcromatografic de tip ECD. 1


Camera de ionizare, 2- folie de izotop Ni 63, 3- amplificator electronic, 4sistem electronic de prelucrare i afiare

Tab.II.1. Sensibilitatea aproximativ pentru diferite clase de compui organici Gruparea chimic
Hidrocarburi eteri, esteri Alcoli alifatici, cetone, amine Aldehide i legturi tri-Cl Legturi mono-J-, di-Br- i legturi nitro Legturi di-J-, tri-Br-, legturi poly-Cl i poly-F

Sensibilitatea relativ
1 10 100 104 105 106

Legturi mono-Cl- i mono-F-, mono-Br-, legturi di-Cl i di-F 1000

Valorile din tabel 1 snt valori aproximative dar corecte din punct de vedere al ierarhizrii. Sensibilitatea variaz destul de mult chiar n cadrul aceleiai grupri chimice deoarece ea depinde de structura legturilor .

II.2.1.5.6. Detectorul de emisie atomica


Detectorul de emisie atomic (AED - Atomic Emission Detector), figura II.14, reprezint o realizare relativ recent fiind legat n principal de evoluia detectorului de tip Diode- Array. Eluatul ce prsete colana cromatografic este introdus ntr-o plasm termic de heliu generat ntr-un cuptor cu microunde . Energia nalt a plasmei atomizeaz toate elementele din prob provocnd emisie atomic specific a

acestora . Prin decompunerea radiaiei rezultate cu o reea de difracie rezult spectrul atomic al probei care este preluat de un detector Diode Array. Marele avantaj al acestui tip de detector este analiza multipl fiind posibil detectarea mai multor elemente n acelai timp. Profitnd de prezena unei plasme de nalt energie deja existent la spectrometrele clasice cu plasm cuplat inductiv (ICP-MS), la ora actual se realizeaz combinaii deosebit de performante ntre cromatografe HPLC i spectrometrele cu plasm cuplate inductiv (HPLC-ICP-MS) i gazcromatografe i spectrometre cu plasm cuplate inductiv (GC -ICP-MS). Aceste combinaii snt avantajoase ca pre de cost deoarece un cromatograf clasic beneficiaz de o plasm termic deosebit de performant generat de un alt aparat , respectic un spectroscop cu plasm cuplat inductiv (ICP) prezent poate chiar n acelai laborator.

Fig.II.14. Schema de principiu a detectorului de emisie atomic. 1-camer cu plasm termic dat de microunde, 2- plasm termic, 3-oglind plan de reflexie, 4- retea de difracie, 5detector Diode-Array, 6-amplificator electronic, 7- sistem electronic de achiziie , prelucrare i afiare

II.2.1.5.7. Detectorul cu fotoionizare


Folosirea detectorului cu fotoionizare, figura II.15, n cromatografia de gaze se datoreaz att selectivitii ct i sensibilitii sale ridicate la detectarea hidrocarburilor

Fig.II.15. Schema de principiu a detectorului cu fotoionizare. 1-camer de ionizare cu radiaii


ultraviolete, 2,3- electrozi, 4- lamp de ultraviolete, 5- amplificator electronic, 6- sistem electronic de prelucrare i afiare

aromatice sau a speciilor organice cu heteroatomi . Acest tip de detector utilizez ionizarea cu radiaii ultraviolete a compuilor ce prsesc coloana cromatografic dup urmtorul model:
R + h R + + e

Doi electrozi colecteaz electronii rezultai ca urmare a ionizrii, electroni ce formeaz de fapt semnalul electric al detectorului. Nivelul acestui semnal este proporional cu gradul de ionizare , iar acesta la rndul lui este proporional cu concentraia specieiei anlizate ce se gsete n acel moment n camera de ionizare.

II.3. CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE INALTA PERFORMANTA (HPLC)


Cromatografia de lichide de nalt performan ( engl. HPLC - High Performance Liquid Chromatography ) cunoscut n literatur i sub denumirea de cromatografie de nalt presiune ( High Pressure Liquid Chromatography) este metoda cromatografic cea performant i este folosit n separarea i identificarea calitativ i cantitativ a substanelor din amestecuri lichide. Separri i analize de substane imposibul de realizat prin alte metode pot fi realizate uor prin HPLC. Pe de alt parte la aceast tehnic pot fi fcute i multe greeli. Acesta este motivul pentru care este nevoie de o experien practic bogat dar i de cunostiine stiinifice fundamentale. Avnd n vedere c att n cromatografia de gaze (GC) ct i in cromatografia de lichide HPLC starea de agregare iniial a probelor este cea lichid trebuie luat decizia asupra metodei cromatografice folosite pentru acel amestec. In acest scop trebuie avute n vedere urmtoarele: - la cromatografia de gaze proba trebuie adus n stare gazoas prin nclzire fr ca aceast operaie s duc la distrugere integritii moleculare a speciei anlizate , in practic numai cca 20 % din speciile moleculare ndeplinesc aceast condiie [LINDSAY - la cromatografia de gaze detectorii au universalitate mai mare i au limite de detecie mai bune dect la cromatografia de lichide - comportarea speciilor moleculare polare sau ionizabile au o comportare cromatografic necorespunztoare n gazcromatografie ca urmare analiza lor trebuie fcut in cromatografie lichid - n cromatografia de gaze exist numai o singur faz staionar care poate interaciona cu moleculele probei , faza solid sau faza lichid, cu aceasta faz poate absorbi proba gazoas n orice raport - n HPLC att faza staionar ct i cea mobil pot interaciona mai selectiv cu proba . Multitudinea acestor interaciuni selective face cromatografia HPLC multilateral fa de cromatografia de gaze cu ea putnt fi rezolvate probleme de separare avansat deosebit de complexe.

n situaiile n care ambele metode pot fi aplicate decizia este pentru gazcromatografie aceste analize au sensibilitate mai mare i snt mai rapide, iar dac este vorba de determinri curente la anumite clase de compui trebuie avut in vdere c un gazcromatograf este sensibil mai ieftin dect un cromatograf pentru HPLC. La cromatografia HPLC faza mobil purttoare denumit "Eluent" mpreun cu substanele lichide de analizat este pompat cu ajutorul unei pompe printr-o coloan cromatografic de separare ce conine faza staionar. n mod obinuit naintea coloanei de separare propriu zise se cupleaz o pre coloan de separare pentru reinerea impuritilor, coloan care este sensibil mai ieftin dect coloana de baz. O coloan de separare ntr-un cromatograf HPLC are lungimea cuprins ntre 5 i 30 cm iar debitul de faz mobil este cuprins ntre 1-5 ml/min. La ora actual exist urmtoarele metode de cromatografie de lichide : cromatografie prin absorbie cromatografie prin repartiie cromatografie prin schimb ionic cromatografie de excludere cromatografie prin gel

La cromatografia schimbtoare de ioni faza stationar este este o rin schimbtoare de ioni iar gradul de separare este dat de intensitatea interaciunilor intre ionii probei i grupele schimbtoare de ioni din rin . In cromatografia de excludere ca faz staionar este folosit un gel cu pori mari care poate separa moleculele dup mrime i form , la acest tip de cromatografie moleculele mari traverseaz cel mai rapid sistemul cromatografic. Cromatografia cu lichide supracritice Dac n timpul separarii cromatografice compoziia substanei de analizat rmne constant tehnica de cromatografic este denumit eluie izocratic. Dac compoziia fazei analizate este schimbat n timpul procesului de separare dup o modalitate prestabilit, tehnica poart denumirea de eluie de gradient .Cea din urm tehnic este folosit atunci cnd domeniul timpilor de retenie a moleculelor din prob este att de mare nct acetes nu pot fi eluate ntr-un timp rezonabil cu un solvent pur sau cu un amestec de solveni. Detectorii folosii n HPLC lnt detectori selectivi, ceea ce nseamn c ei nu rspund la toate moleculele existente nt-un amestec ci numai la anumite molecule sau clase de compui. In cromatografia de lichide nc nu exist un detector universal i de inalt sensibilitate aa cum este de exemplu detectorul de ionizare cu flacr FID din cadrul cromatografiei de lichide, n schimb detectoarele din cromatografia de lichide acoper un numr mult mai mare de substane dect cele din cromatografia de gaze. Unele molecule de probe snt greu de detectat n HPLC i trebuiesc aduse dup prsirea coloanei cromatografice ntr-o form detectabil tehnic denumit derivatizare dup

coloan. Ca i la alte cromatografii n condiii tehnice date pentru analiza calitativ este definitoriu timpul necesar unei molecule din prob pentru a traversa sistemul cromatografic i a ajunge la detector, timp denumit timp de retenie. Dat fiind numrul extrem de mare de substane organice unele substane au timpi de retenie identici situaie n care peak-urile se suprapun putnd da natere la erori importante de interpretare. Pentru nlturarea acestui neajuns cele mai importante detectoare pentru HPLC snt spectrometrele. Tot mai des ieirile din coloanele cromatografice se cupleaz la spectrometre clasice cel mai des folosit fiind spectrometrul de mas (MS) situaia clasic fiind cea LC-MS sau LC-MS-MS. Aceste combinaii de aparate au sisteme de performante de prelucrarea datelor ce permit identificarea automat prin compararea electronic a spectrului oricrei specii moleculare, n momentul sosirii ei din coloana cromatografic la spectrometru, cu spectrele etalon din bibliotec electronic de spectre.

II.3.1. Aparatura folosit n cromatografia HPLC


Cromatografele de lichide de nalt performan snt formate dint-un sistem de vase cu solveni, o pomp de nalt presiune , o coloan cromatografic , unul sau mai muli detectori , i un sistem de prelucrare a datelor , ele mai snt completate cu elemente de reglare automat a debitului , a presiunii i a temperaturii. In figura II.16 este reprezentat schema de principiu a unui cromatograf de lichide.

Fig. II.16. Schema de principiu a unui cromatograf de lichide. 1- butelie, 2-ventil nalt
presiune, 3-manometru nalt presiune, 4-reductor de presiune, 5- manometru de joas presiune, 6- sistem distribuitor i dozare heliu, 7,8- recipiente cu solvent, 9- distribuitor, 10,11-filtru, 12-sistem de injecie prob, 13-purj, 14-pomp de nalt presiune , 15precoloan, 16-filtru, 17-distribuitor, 18-coloana cromatografic, 19-incint de

termostatare coloan, 20-detector, 21- amplificator electronic, 22-sistem de achiziie i prelucrare date, 23-sistem de calcul, 24-imprimant

Trebuie avut n vedere c n HPLC se folosesc solveni organici puternici sau soluii tampon care pot ataca chimic orice component ce se gsete n traseul lor de la recipientele de stocare pin la detector , ca atare toate materialele folosite pe acest traseu trebuie s prezinte o rezisten chimic corespunztoare. O alt recomandare este aceea ca volumul mort , denumit i volum extracolumnar, ntre introducerea probei i traversarea detectorului s fie meninut ct mai mic posibil prin aceasta evitndu-se o lire de band (vezi i cap). Reducerea volumului mort se realizeaz n primul rnd prin msuri constructive ale furnizorului de cromatograf i prin de alegerea corespunztoare a coloanei cromatografice. In continuare vor fi descrise pe rnd elementele componente ale unui cromatograf de tip HPLC
Semnalul este nregistrat fie cu un nregistrator, fie direct n memoria unui calculator. n esenta, un cromatograf analitic HPLC are schema bloc din figura II.17. unde nu s-a mai prezentat colectorul de fractiuni, interesant doar din punct de vedere preparativ. Se poate observa asemanarea cu GC singura deosebire majora constituind-o sursa de eluent pompa.

Solvent Pompa Injector Coloana Detector nregistrator


Fig. II.17. Schema bloc a unui cromatograf HPLC

II. 3.1.1. Detectori utilizati in cromatografia de lichide de nalta performanta (HPLC)


Tehnica HPLC s-a dezvoltat o data cu perfectionarea detectorilor. Detectorii n cromatografie sunt instrumente analitice specializate, situate la iesirea eluentului dintr-o coloana si care pot nregistra continuu substantele separate de catre aceasta. Deci detectorii constituie acea parte a instrumentatiei care permite sa se observe modul cum decurge separarea prin coloana fara a se vedea componentii propriu zisi ci doar semnalul lor. ntruct coloanele de separare performante au capacitati de ncarcare mici, sistemul de detectie trebuie sa fie unul foarte sensibil. Totodata, pentru ca n LC volumul de proba este de ordinul microlitrilor (8-10l), volumul detectorilor trebuie sa fie de volum apropiat pentru a se putea sesiza n mod continuu picul cromatografic. n calitate de instrumente se poate utiliza, n principiu, oricare dispozitiv de analiza chimica cunoscut, pentru probe lichide, precum si orice combinatii de instrumente fizice. De exemplu, n ultimul timp, combinatia dintre un detector refractometric si unul bazat pe difuzia luminii este extrem de eficace n analiza polimerilor n amestec cu monomeri sau oligomeri dintr-un material. Exista chiar

posibilitatea cresterii sensibilitatii detectiei printr-o reactie chimica n urma adaugarii, cu un debit controlat, a unui reactiv potrivit. Tehnica se numeste derivatizare si se poate practica chiar nainte de introducerea probei n coloana, dar si dupa iesirea din coloana a componentelor separate. Metoda a fost utilizata pna n prezent n special legata de metodele spectrofotometrice (colorimetrice) sau fluorimetrice si mai ales pentru analiza unor amestecuri de compusi numerosi avnd aceleasi functiuni reactive (de exemplu aminoacizi). Caracteristicile detectorilor sunt asemanatoare cu ale celorlalte instrumente analitice si oarecum similare cu cele descrise la metoda GC.

II. 2.1.1. Detectori spectrofotometrici n UV-VIS


Acest grup de detectori sunt cei mai folositi detectori pna n prezent, att n LC, ct si n HPLC. Pentru a putea fi utilizati, compusii separati cromatografic trebuie sa fie colorati - adica sa absoarba lumina pe domeniul de lungimi de unda al detectorului. Pe de alta parte, eluentul trebuie sa fie practic transparent pentru acelasi domeniu spectral. Legea fizica pe baza careia functioneaza acesti detectori este legea LambertBeer (A=elC). Deci unitatile vor fi unitati de absorbanta, adimensionale. De aceea limita de detectie sau zgomotul de fond se prezinta n cazul acestor detectori n AUFS (prescurtare de la Absorbance Units Full Scale = unitati de absorbanta raportate la ntreaga scala, l. engl.). Astfel n cadrul instrumentelor actuale sensibilitatea este de 0,001 AUFS cu zgomotul de fond de 1%. Motivul principal al popularitatii acestor detectori este acela ca numeroasele substante organice, anume cele care contin legaturi duble (electroni p), respectiv au grefate functiuni organice cu electroni neparticipanti, absorb lumina n UV-VIS. Este vorba de toate hidrocarburile olefinice si aromatice precum si derivatii tuturor hidrocarburilor cu diferite functiuni organice (=C=O, =C=S, -N-O, -N=N-, -NH 2). ntre acestea se includ si numeroasele combinatii de interes biologic ca enzime, acizi nucleici etc.Un mare avantaj al acestor detectori este faptul ca sunt insensibili la micile variatii de debit si temperatura. Sensibilitatea detectorului este direct proporionala cu coeficientul de extincie si cu lungimea celulei. Pentru a mari sensibilitatea detectorului ar trebui mrita lungimea celulei dar aceasta este restricionata. Sensibilitatea este de ordinul 5x10-8g/ml. Cele mai moderne celule au diametre de 0,5-2mm si lungimi de 1-10mm. Se pot distinge si n cazul acestei clase de detectori mai multe tipuri de detectori. 1. Detectorii monocromatici au fost primii utilizati, fiind mai ieftini deoarece lucreaza doar la o lungime de unda. Modelul cel mai raspndit se compune dintr-o sursa luminoasa cu deuteriu sau cu vapori de mercur, un monocromator care separa un domeniu ngust (de ex. linia 254nm a mercurului) si un detector. Schema bloc a unui astfel de detector este prezentata n figura II.18.

Sursa Monocromator Celula nregistrator


Fig. II.18. Schema bloc a unui detector HPLC spectrofotometric 2. Detectorii policromatici mai frecvent utilizai n cromatografele HPLC moderne permit si selectarea lungimii de unda la care se lucreaz, dar chiar pot nregistra electronic absorbanta celulei la mai multe lungimi de unda simultan. Acest mod de lucru da o mai mare sigurana analizei, n sensul ca permite stabilirea puritii, adic daca picul

constituie un semnal dat de o singura substana sau de un amestec (ceea ce se cunoate sub numele de stabilirea puritii picului). Principiul de functionare al detectotrului Uv este porezentat n figura II.19. Detectorul este format dintr-o celula cilindrica (5) cu capacitate de 1l-10l care este intersectata de coloana cu eluent. Razele UV (1) sunt aranjate astfel incit sa treac prin celula cu proba de analizat (5) si apoi sa cada pe fotoelement (6). Semnalul de la fotoelement ajunge la amplificator (7) (acesta mrete intensitatea semnalului) si apoi la sistemul de achiziie, prelucrare si afiare a datelor obinute (8); rezultatul este o cromatograma (9) ale crui picuri va oferi informaii calitativa si cantitative despre substanele din soluia analizata.
10 2 3 6 7

8 t

Fig. II.19. Principiul de funcionare al detectorului de UV. 1- raze UV, 2- substana ce vine de
la coloana cromatografica,3- substana ce pleac, 4- geam de cuar, 5- tub capilar prin care circula substana de analizat, 6- detector (fotomultiplicator), 7amplificator,8- sistem de achiziie, prelucrare si afiare a datelor, 9cromatograma,10- cuva detectorului

II. 2.1.2. Detectori refractometrici


Detectorii refractometrici, au la baza legile refractiei luminii. Principiul de functionare al acestor detectori are la baza legea lui Fresnel - de transmitere a luminii prin medii transparente avnd un indicele de refractie dat. Astfel, un fascicul luminos (mono sau policomponent) trece printr-o celula cu doua compartimente unul continnd doar eluentul pur iar celalalt faza mobila care paraseste coloana , figura II.20

3 1

8 M 5 6

9
6 C 2 I 10

Fig.II.20. Principiul de functionare al unui detector refractometric. 1- radiatia luminoasa, 2amestec de substante, 3- solvent pur,4- perete sticla, 5- detector refractometric, 6fotoelement, 7- amplificator, 8- surub reglator, 9- sistem nregistrator, 10cromatograma, C- cuva refractometrica, M- sistem ce regleaza detectorul in funcie de unghiul sub care cad razele

Radiatia luminoasa (1) trece prin solventul pur, apoi prin peretele de sticla ce separa cele 2 incinte, prin amestecul de substante. Ajunge sub un anumit unghi pe detector, o parte se reflecta pe fotoelementul 6 iar o parte se refracta pe fotoelementul 6. Semnalul este amplificat. Daca cele doua tensiuni primite de la cei 2 detectori sunt diferite, motorul primete un semnal de corecie, in scopul egalizrii tensiunilor, astfel are loc compensarea modificrii indicilor de refracie. In urma deplasarii urubului 8 , sistemul nregistrator 9 va nregistra datele sub forma unei cromatograme.Diferenta dintre indicii de refractie pentru solutiile aflate n cele doua compartimente vor fi practic nule, atta timp ct din coloana iese doar eluentul pur, dar diferita n momentul n care n eluent mai apare un component separat - antrenat de catre eluent din coloana. n momentul iesirii unui component are loc o deplasare a pozitiei fascicolului emergent din detector - deplasare care este proportionala cu concentratia si sesizata de catre detector. n cazul acestui tip de detector sunt posibile si picuri negative, ceea ce face necesara aducerea liniei de baza la jumatatea scalei lucru care, pe lnga sensibilitatea relativ coborta (10-5molL-1), constituie un dezavantaj. Acest detector este universal, dar nu poate fi utilizat n cromatografia cu gradienti deoarece, n acest caz, compozitia eluentului la intrarea n coloana difera de cea de la iesire si se modifica continuu, neexistnd o linie de baza. De asemenea fenomenul este foarte sensibil la temperatura (0.0001C) fiind necesara termostatarea, att a detectorului ct si a coloanei.

II. 2.1.3. Detectorii electrochimici


Detectori electrochimici sunt folositi cu precadere pentru identificare calitativa si cantitativa la amestecuri de electroliti precum si la substante care se pot oxida respectiv reduce. Intru-cat marea majoritate a substantelor se pot oxida sau reduce si intru-cat detctorii si logistica electronica de interpretare a datelor au devenit foarte performante momentan HPLC cu detectori electrochimici a devenit cea mai importanta metoda analiza si identificare a substantelor.

Exista doua tipuri de detectori electrochimici: - Conductometrici- sunt folositi pentru detectia calitativa si cantitaiva la electoliti - Coulometrici, amperometrici- sunt folositi pentru detectii in regim de oxido-reducere la substantele organice;

II. 2.1.3.1. Detectorii conductometrici


Detectorii conductometrici sunt folositi in special pentru solutiile ionice unde substantele disociaza complet. Acest tip de detectori se utilizeaza cu precadere n cromatografia pe schimbatori de ioni si sunt sensibili la ioni anorganici sau organici inclusiv acizi organici. Sunt asadar detectori specifici. Sunt suficient de sensibili (500pg1ng). Detectorii conductometrici msoar conductivitatea fazei mobile. Este constituit din doi electrozi situai in coloana cu eluent si o rezistenta situata intre cei doi. Rezistenta este msurata cu ajutorul circuitului electric la care este legata. Principiul de functionare al unui detector conductometric este prezentat n figura II.21. Celula conductometrica este etansa, iar cei doi electrozi sunt fixati si dimensionati din fabrica. Substanta de analizat(4) vine de la coloana cromatografica si intra in celula conductometrica(2). Cand se modifica concentratia primei substante (H=kC) se modifica conductivitatea celor doi electrozi (3). Aceasta schimbare este amplificata si prinsa sub forma unui pic in cromatograma (8). Astfel se realizeaza analiza cantitativa probei. A doua substanta va modifica conductivitatea electrolilor dupa un anumit timp cea ce duce la masurarea timpului de retentie (analiza calitativa) si la aparitia unui nou pic in cromaograma. Este necesar un generator de inalta frecventa pentru a nu se instala un transfer de ioni intre cei doi electrozi ceea ce ar duce la denaturarea analizei. Se alimenteaza cu 5kH.

6 1 2

4 3

Fig.II.21. Principiul de functionare al detectorului conductometric. 1- generator de inalta


frecventa, 2- celula conductometrica, 3- electrozi de platina, 4- sustanta de analizat ce vine de la coloana cromatografica, 5- substanta iese din celula conductometrica, 6- amplificator, 7- sistem de achiziie, prelucrare si afiare a datelor, 8cromatograma in coordonate conductivitate si timp

II. 2.1.3.2. Detectorii amperometrici sau coulometrici


Principiul de functionare: celula electrochimica, figura II.22. , este formata din trei electrozi, unul de referinta, unul de lucru si unul auxiliar, aflati int-un tub capilar alimentat cu solutie de la coloana cromatografica. Intre electrodul de lucru si cel de referinta se aplica o tensiune functie de potential ceea ce duce la aparitia pe curba cinetica a curbelor de reducere, care sunt pozitive, si a curbelor de oxidare, care sunt negative , figura II.23. ale elementelor care se gasesc in solutia electrolitica complexa. Din E1 substantele incep sa se reduca, intensitatea de reducere creste cu potentialul. Daca se aplica potential negativ in partea stanga a lui E0, se observa ca E3 reprezinta inceputul oxidarii unui element iar E4 sfarsitul oxidarii acelui element.
i 3 4 7 10

6 2 5

9 8

Fig.II.22.

Principiul de functionare al detectorului electrochimic amperometric. 1- substantele ce vin de la coloana cromatografica, 2- electrodul de lucru, 3- electrodul auxiliar 4celula electrochimica,5- tub capilar prin care circula substana de analizat, 6electrodul de referinta, 7- substanta iese din tubul capilar, 8- amplificator, 9- sistem de achiziie, prelucrare si afiare a datelor,10- cromatograma in coordonate intensitatea cinetica si timp

+i

E6

E5

E4

E3 E0 E1 E2 E(mv)

-i

Fig.II.23. Diagrama curbei cinetice si cromatograma obtinuta

Pentru a se putea efectua masurarile trebuie sa se cunoasca diagrama potentialelor. Picurile pe cromatograma apar sub forma unui potential de semiunda (se duc tangente la curbele de reducere si oxidare iar la mijlocul distantei dintre liniile ce se duc din capatul tangentei pe ordonata cromatogramei se afla varful picului).

II. 2.1.4. Detectorii de fluorescenta


Detectorii de fluorescenta se bazeaz pe msurarea intensitii fluorescentei pentru substanele ce prezint acest fenomen. Fluorescenta este un fenomen care apare la unele substane cnd sunt iradiate cu ultraviolete. Acele substane emit radiaii pe o lungime de unda mai mare dect a radiatei incidente. Daca emisia de radiaii are loc in acelai timp cu emisia de radiaie ultravioleta incidenta fenomenul se numete fluorescenta. Putini compui prezint fluorescenta iar cei ce nu prezint pot fi transformai in derivai ai lor ce au aceasta proprietate. Fluorescenta s-a artat a fi foarte folositoare ca proces de detecie iar cu detectorii bazai pe fluorescenta s-au obinut unele dintre cele mai nalte sensibilitati din cromatografie de lichide. Tehnicile de detecie bazate pe fluorescenta confer o buna sensibilitate probelor concentrate si o sensibilitate mult mai mica atunci cnd se folosesc instrumente de genul senzorilor de temperata, presiune etc..Din aceasta cauza lumina de fluorescenta este msurata pe un fundal ntunecat( sau la zgomot de fond redus). Pentru ca intensitatea fluorescentei sa poat fi msurata instrumental, raportul dintre cantitatea de radiaie remisa si cantitatea de radiaie UV incidenta trebuie sa aib valori cuprinse intre 0.1-1. Sistemul optic al celor mai multi detectori de fluorescenta este aranjat astfel incat lumina fluorescenta sa cada sub un anumit unghi( de 90), figura II.24., pe raza incidenta.Acest lucru micsoreaza cantitatea de lumina incidenta care ar interactiona cu semnalul. In aceste circumstante semnalul este masurat pe un fundal aproape negru (pentru a mai reduce din luminozitatea fundalului se foloseste un filtru). Cel mai simplu detector este format dintr-o sursa de excitare si un senzor ce monitorizeaza semnalul pentru toate lungimile de unda (pentru anumite probe poate fi foarte sensibil si relativ ieftin).
1 2 3 4 I 16 15

t 5 8 13

14 7 9 10 11 12

Fig.II.24.

Principiul de funcionare al detectorului de fluorescenta.1- sursa de radiaie, 2- fanta, 3- filtru, 4- lentila, 5- substana ce vine de la coloana. 6- substana de analizat, 7cuva cu perei de cuar, 8- unghi de 90 grade,9- substana ce iese din cuva, 10lentila, 11- filtru, 12- fanta, 13- detector de fluorescenta, 14- amplificator, 15- sistem de preluare, prelucrare si afiare a datelor, 16- cromatograma.

Principiul de funcionare: Radiaia emisa de sursa (1) dup trecerea prin filtru este focalizata de lentila (4) apoi cade sub un unghi de 90 pe radiaia incidenta. Lumina fluorescenta emisa este focalizata de lentila (10), trece prin filtrul (11) si ajunge la detectorul de fluorescenta care ii msoar intensitatea. Semnalul este apoi amplificat si preluat de sistemul de prelucrare si afiare a datelor(15). Datele obinute sunt afiate sub forma unei cromatograme (16).

II. 2.1.5.Detectoare Diode Array


Detectorul sir de fotodiode poate fi folosit in numeroase situatii, de exemplu determinarea puritatii unei solutii, separarea hidrocarburilor aromatice. Principiul de utilizare. Detectorul este utilizat cu lampa de deuteriu si xenon care emit ultraviolete (1). Lumina de la lampa trece prin proba aflata in tubul capilar (5) iar lumina dispersata trece printr-o retea de difractie (6) apoi cade pe dioda Array (7). Rezolutia detectorului depinde de numarul diodelor si de numarul lungimilor de unda acoperite. Doda Array poate contin sute de diode iar semnalul de la fiecare dioda este preluat si amplificat de catre amplicator (8) ca la sfarsit sa ajunga la sistem de preluare, prelucrare si afiare a datelor (9) care de obicei este un calculator care stocheaza datele pe hard disc. La sfarsitul analizei informatile oferite de fotodiode sunt afisate pe o cromatograma. Sunt oferite intensitatile substantelor din amestec (analiza cantitativa) si timpii lor de retentie (analiza calitativa). Sensitivitatea detectorului sir de fotodiode este de 1x10 -7 g/ml iar domeniu dinamic liniar de 5x103. Schema principiului de functionare este prezentat in figura II.25
2 1 3 6

10 7 t 8 9

Fig.II.25. Principiul de funcionare al detectorului sir de fotodiode. 1- radiaii ultraviolete, 2substana ce vine de la coloana cromatografica,3- substana ce pleac la tratament chimic, 4- fereastr cuart, 5- tub capilar prin care circula substana de analizat, 6reea de difracie, 7- dioda Array, 8- amplificator, 9- sistem de preluare,achiziie si afiare a datelor, 10- cromatograma (in care se preiau concomitent toate lungimile de unda)

II. 2.1.6. Alti detectori


In practica analitica se mai ntlnesc si alti detectori prezentati schematic n tabelul 2. Dintre acestia o mentiune speciala trebuie facuta pentru cei bazati pe spectrometria de masa si FT-IR, care au permis determinari calitative uneori imposibil de realizat prin alte variante de detectie n lipsa etaloanelor cunoscute. Acesti detectori permit ca, pe baza unei baze de date formata din spectre cunoscute, sa se obtina compusii cei mai apropiati (3 dintre acestia), din toate substantele chimice cunoscute, care ar putea fi prezenti n proba. Tab. II.2. Alti detectori utilizati n LC
Detectori LC Fluorimetrici Electrochimici (Amperometrici) Bazati Spectrometria de Masa (MS) FT-IR Difuzia luminii Activitate optica Electrozi ion selectivi Fotoionizare pe Limita de detectie 1-10pg 10pg = 1ng 100pg 1ng 1g 10g 1ng 10ng Caracteristici Este necesara uneori derivatizarea Sensibilitate 10-10M Sensibilitate 10-10M Compusi oxidabili sau reductibili Necesare coloane capilare Necesara pulverizarea Pret de cost ridicat Pret de cost ridicat Adecvati pentru macromolecule Pentru substante optic active Doar pentru ioni sau compusi ionizabili Disponibilitateco merciala Da Da Da

Da Da Nu Nu

1pg- 1ng

Nu

II. 3.2. Electroforeza capilara


Electroforeza este o metoda cromatografica de analiza la care separarea componentilor se face pe baza unui gradient de potential in curent continuu. Electroforeza poate fi: fara medii stabilizante; cu medii stabilizante. Mediile stabilizante pot fi: hartia electroforetica; geluri speciale pe placi de sticla; structuri de pulberi depuse in tuburi. Bazele electroforezei au fost puse de catre Tisellius ce a dezvoltat electroforeza fara medii stabilizante figura II.26. a si b. In fig. II.26. a este reprezentata forma initiala a montajului, inainte de alimentarea cu tensiune, cand substantele sunt amestecate. Cand

sistemul este alimentat cu tensiune electrica componentele se separa in functie de gradientul lor de potential, fig. II.26.b.
+ electrozi Solutie tampon A C A+B B+C B A B+C C _

A+B+C a b

Fig.II.26. Scema de principiu a electroforezei fara medii stabilizante Electroforeza capilara (EC) este folosita pentru separarea speciilor ionice datorita incarcaturii lor electrice si a fortelor de atractie si respingere. Se deosebeste de HPLC doar prin faptul ca separarea pe componenti se face sub inalta tensiune electrica pe cand la HPLC se face cu o pompa de inalta presiune. Exista si combinatii intre electroforeza capilara si HPLC (ce nu se poate detecta cu HPLC intra in sistemul de detectare al eletroforezei capilare).

7 8 9

10

+ I

2 3

1 11 t

Fig.II.27.

Principiul electroforezei capilare.1- anod, 2- solutie tampon, 3- celula electroforetica, 4- catod, 5- fotodetector (in UV, Dioda Array etc), 6- tub capilar, 7-sursa de radiatie, 8-fanta, 9- Amplificator, 10- sistem de preluare,achiziie si afiare a datelor, 11cromatograma electoforetica

Principiul de functionare , figura II.27, este relativ simplu. La aplicarea tensiunii electrice U, ionii substantelor din amestec vor incepe sa migreze prin tubul capilar in functie de potentialele lor specifice. Astfel se realizeaza separarea ompusilor din

amestecul de analizat. Deplasarea lor e bidirectionala (de la stanga la dreapta si de la dreapta la stanga). In deplasarea lor prin tubul capilar, la un moment dat ionii substantei vor fi detectati cu ajutorul unui sistem de detectie ce vor transmite semnalul la un amplificator. Dupa amplificarea semnalul ajunge la sistemul de preluare, achiziie si afiare a datelor care ne va oferi informatiile in ceea ce priveste substantele din amestecul analizat sub forma unei cromatograme electroforetice. Fiecare substanta este caracterizata de timpul propriu de retentie (analiza canlitativa) iar inaltimea picului corespunzator ofera informatii despre cantitatea de substanta existenta. Avantaje ale electroforezei capilare sint: - separarea componentilor dintr-un amestec este mai avansata ca la HPLC i creste cu cit tensiune electrica aplicata este mai mare - pretul este mult mai mic decat cel de achizitie a unui HPLC; - fiabilitate mai buna decit la HPLC