Factores que Influyen la Microbiologa en los Alimentos

Dr. Esther Z. Vega Microbiologa Aplicada

Bosquejo
Mtodos de deteccin y cuantificacin Factores internos y ambientales que controlan el crecimiento bacteriano Cintica de crecimiento bacteriano Fisiologa y metabolismo de microorganismos de origen alimentario

Ecosistemas, homeostasis y tecnologa de defensa

Ecologa the study of the interactions between the chemical, physical, and structural aspects of a niche and the composition of its specific microbial population
Commission on Microbial Specifications for Foods

Ecosistemas, homeostasis y tecnologa de defensa

Los alimentos son ecosistemas
Organismos Ambiente
Factores intrnsecos (pH, Aw, nutrientes) Factores extrnsecos (temperatura, ambiente gaseoso, presencia de otras bacterias) Preservacin por manipulacin de los factores

Los alimentos pueden contener mltiples microambientes

Microbiologa clsica y sus limitaciones

Limitaciones en la deteccin y mtodos de enumeracin
Contaje de placas Medio selectivo, diferencial Mtodo nmero ms probable Tcnicas de enriquecimiento Clulas daadas Viable no cultivable Factores intrnsecos que influyen en el crecimiento microbiano Factores extrnsecos que influyen en el crecimiento microbiano

Homeostasis y tecnologa de defensa Cintica de crecimiento

Limitaciones de contaje de placas

Asume
Cada clula forma una colonia Cada colonia proviene de una sola clula bacterial Algunas colonias puede ser originadas de una agrupamientode bacterias

Se reporta como
- Unidad formadora de colonias (CFU)/gramo ml. - NO como bacterias totales

Limitaciones de contaje de placas

Factores que afectan la formacin de colonias por una clula
Estado fisiolgico de la clula Medio de cultivo utilizado en la enumeracin Temperatura de incubacin

Limitaciones del contaje de placas

Slo se consideran organismos aerbicos No se sabe el tipo de bacteria El medio de cultivo permite el crecimiento de ciertas bacterias Limitaciones visuales/Errores humanos Difcil de distinguir entre partculas de alimentos y bacterias No se debe utilizar en alimentos fermentados Las colonias podran ser muy pequeas para verse

Tipos de muestra
Lquidas Lquidos no viscosos se miden con pipetas Lquidos viscosos se pesan

Slidas
Pesar aspticamente

Hisopo
Tomar muestra pasando un hisopo por un rea definida

Ambientales y de envases
Enjuage el interior del envase Abra una placa para tomar una muestra del aire Placas RODAC

Protocolo para Contaje en Placas

Prepare un homogenado de la muestra
Dilucin 1:10 1 parte de la muestra a 10 partes del volumen total

Mezcle en licuadora o stomacherpor 2 minutos

10 g/ml muestra 90 ml of diluyente

1:10 Dilucin 10-1

Protocolo para contaje en placas

Prepare diluciones seriadas
Diluya hasta que obtenga colonias separadas entre 25-250 en una placa Utilice una pipeta estril entre cada dilucin Ponga la pipeta usada en el rea designada

Mezcle cada botella de dilucin 25 veces en un arco de 90 grados por 7 segundos Use amortiguador de fosfato peptona para diluir

Diluciones
Sample Homogenate Dilution Blanks Containing 90 ml Diluent 10 ml 10 ml 10 ml 10 ml

10-1 (1:10)

10-2 10-3 (1:100) (1:1000)

10-4 (1:10000)

10-5 (1:100000)

Placas
Put 1 ml of Each Dilution into Empty Petri-Dish
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

1 ml 1 ml

1 ml 1 ml

1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml

Protocolo Contaje de placas

Aada 18-20 ml de agar (45-50oF), a la placa petri
El agar no puede estar muy caliente porque mata las bacterias

Mtodo estndar agar de placa (Plate Count Agar) Mueve 10x en cada direccin Deje que solidifique Incube las placas invertidas a 35-37oC por 48 horas.
Atmsfera (aerbico, anaerbico, microaerfilico) Temperatura

Enumeracin
Nmero de colonias promedio por placa
Placas entre 25 y 250 colonias

Contaje de placa aerbica

Provee un estimado general de bacterias aerbicas vivas Evala calidad Predictor de shelf-life Monitoreo ambiental Excluye
Anaerobos obligados Microaeroflicos

Resultados del Contaje de placa aerbica

Evala la sanitacin de una producto Predice la durabilidad (Shelf-life) Indicador de seguridad (Safety) Monitorea el ambiente

Medio microbiolgico
Provee nutrientes para el crecimiento de los microorganismos
Caldo
Usualmente se utiliza para crecer cultivos puros Utilizado para enumeracin a travs de la tcnica de MPN

Medio microbiolgico Agar slido

Agar- agente gelatinizante sin valor nutricional Lquido a 45oC, slido a temperatura ambiente Clulas bacteriales estn atrapadas en el agar tal que puedan ser enumeradas Utilizado para aislar Puede ser no-selectivo, selectivo o diferencial

Medio selectivo y diferencial

Selectivo
Se aade un ingrediente al medio para inhibir el crecimiento de ciertos tipos de organismos y ayudar el crecimiento de otros

Diferencial
Se le aade algo para diferenciar entre organismos diferentes i.e. cambio en color

Mtodos de Nmero ms Probable (MPN)

MPN
Basado en probabilidad estadstica NO es contaje directo Tcnica lquida

Mtodos de Nmero ms Probable (MPN)

Estima nmero de organismos en muestra cuando se encuentran en bajas concentraciones Se utiliza comnmente para E. coli y coliformes Se aaden agentes selectivos Mtodo de 3 5 tubos Lmite ms bajo de sensitividad (3 tubos) <3.0 bacteria/gm

MPN - Continuacin
El objetivo es diluir el organismo Seleccione la muestra ms diluda con todos los tubos positivos y los prximos dos
3,2,1 Nuestra combinacin

Determine el MPN utilizando la tabla de MPN

Tcnicas de enriquecimiento
Cero tolerancia
Salmonella Listeria monocytogenes E. coli O157:H7

No se necesita enumeracin! Deteccin

Medio de pre-enriquecimiento con medio selectivo enriquecido Se pone en placa en medio selectivo Confirmacin bioqumica y gentica

Clulas daadas
Una clula puede ser daada en lugar de matada por niveles sub-letales de calor, radiacin, cidos o agentes sanitizantes. Resultado: Menor resistencia a agentes selectivos o aumento en sus requerimientos nutricionales.

Clulas daadas
Tabla 2.3 Valor D55C- tiempo requerido para eliminar 90% de la poblacin a 55oC. Figura 2.3

Clulas daadas: Causas ambientales

Calor subletal Congelamiento subletal Secado freeze drying Secado Radiacin Qumicos
Tintes Sodium azide Sales Metales pesados Antiboticos Aceites esenciales EDTA Compuestos sanitizantes

Clulas daadas: Factores influyentes

La accin de daar una clula es un proceso complejo, influeciado por: Tiempo Temperatura Concentracin de agente Cepa de organismo Metodologa experimental L. monocytogenes crecida a <28 C expuesta a 52 C reduccin por muerte de 3-4 log.
o o

Crecida a 37 o 42oC, 2-3 logs de dao cuando se exponen a 52oC.

Clulas daadas: Caractersticas de las clulas

Aumento en el tiempo de la fase lag de crecimiento (efecto de reparacin) Aumento en la sensitividad a la variedad de agentes selectivos en el medio de cultivo
Prdida de la habilidad de formar colonias en medio selectivo

Clulas daadas: Efecto de estresores ambientales en las clulas

Membrana celular
Daos en los componentes lpidos

Enzimas de ciclo TCA Otras enzimas

Coagulasa Nucleasa termoestable

Ribosomas
Prdida de Mg+2

DNA RNA

Clulas daadas: Qu significa?

Imposible recuperar la cantidad verdadera de patgenos
Eficiencia del procesamiento del alimento es sobreestimada
E.g. valor D menor

Recuperacin de patgenos daados en alimentos

Problemas de seguridad Problemas de contaminacin

Agentes selectivos pueden ser ingredientes comunes de los alimentos e.g. sal

Clulas daadas: S. aureus

Clulas de S. aureus daadas por cido durante la fermentacin para la produccin de embutidos puede crecer en TSA, pero no en TSA 7.5% NaCl. Estas clulas pueden reparse en el embutido si se mantiene a 35oC (pero no a 5oC), crecer y producir enterotoxina.

Clulas daadas: Deteccin

Pre-enriquecimiento no selectivo seguido de placas con medio selectivos
Agentes que reparan (e.g. piruvato, catalasa, oxirasa)

Placas de medio no-selectivo y medio selectivo

No-selectivo: daadas y no-daadas Selectivo: no-daadas

Organismos viables pero no cultivables (VBNC): caractersticas de las clulas

Organismos que no son cultivables con medio no selectivo Activos metablicamente
Presencia de enzimas metablicas
Sntesis de nuevas protenas Cambios en los lpidos celulares

Nutrient uptake

Cambios morfolgicos
VNBC Campylobacter jejuni

Organismos viables pero no cultivable (VBNC): Deteccin

Metabolismo de nutrientes radioactivos o fluorognicos para viabilidad (acridina anaranjada:DNA:RNA) Sondas de cidos nuclicos
No provee informacin de viabilidad

Contaje directo de clulas viables por microscopa

Organismos viables pero no cultivable (VBNC): Deteccin

Patgenos de origen alimentario pueden convertirse a VBNC cuando el alimento es puesto a temperaturas fras en un medio rico nutritivamente.
Resucitacin de clulas VNC es demostrado por un aumento en cultivilidad pero no en un aumento en el nmero de clulas.

Organismos viables pero no cultivables (VBNC): Teoras

Teora original: parte del ciclo normal de la bacteria Resultados recientes: inducido por estrs
Bajas temperaturas (<15oC) Falta de nutrientes

Reversin a una forma cultivable

Real? Pocas clulas cultivables se multiplican

Organismos viables pero no cultivables (VBNC): Vibrio vulnificus

Figura 2.7

Organismos viables pero no cultivables (VBNC): Significado

Campylobacter jejuni Escherichia coli Vibrio vulnificus Salmonella enteritidis Shigella Vibrio cholerae Un patgeno que no se detecta!

Factores intrnsecos que influyen en el crecimiento microbiano

Factores intrnsecos- caractersticas inherentes al alimento pH Contenido de humedad (Aw) Potencial de oxidacin-reduccin (Eh) Contenido nutricional Constituyentes antimicrobiales Estructuras biolgicas

Rangos de pH ptimos para crecimiento microbiano

pH
Optimum Bacteria Hongos Levaduras 6.5-7.5 4.0-6.8 4.5-6.5 Maximum 9.0 8.0-11.0 8.0-8.5 Minimum 4.5 1.5-3.5 1.5-3.5

pH
El pH de un alimento es la medida de la acidez o alcalinidad de ese producto. La escala del pH abarca valores que oscilan entre 0 y 14. Un pH inferior a 7 es cido, un pH de 7 es neutro y un pH superior a 7 es alcalino o bsico.

H2O

Actividad de agua (Aw )

H2O

Actividad de agua (Aw) proporcin de agua presente en un alimento. Tambin se conoce como la humedad relativa. Rango: 0-1.0 (agua pura)

H2O

H2O

H2O

H2O

Aw
Staphylococcus aureus puede crecer hasta un Aw de 0.86

Aw de alimentos
Frutas y vegetales 0.97-1.00 Carnes 0.95-1.0 Pan 0.95-1.0 Queso 0.68-1.0 Mermeladas- 0.75-0.94 Miel 0.54-0.75

Potencial de oxidacin-reduccin (Eh)

Oxidacin prdida de electrones Reduccin ganancia de electrones Potencial de oxi-reduccin facilidad en que un sustrato en particular gana o pierde electrones (mV) Eh negativo: sistema anaerbico Eh positivo: sistema es aerbico Un producto oxidado es +; uno reducido es -

Potencial oxi-reductor (O-R)

El potencial oxi-reductor de los alimentos est influenciado por: Composicin qumica del alimento Tratamiento que se aplica al procesarlo Condiciones de almacenaje

Eh de algunos alimentos
Origen vegetal: +400 mV Queso: -20 a -200 mV Carnes
Pre-rigor: +250 mV Post-rigor: +10 a -130 mV Carne molida: +300 mV

Cul de las siguientes representa un Eh + ?

Rango de crecimiento microbiano en relacin a Eh

Organismo aerobios Anaerobios facultativos anaerobios Rango de Eh De +500 a +300 mV De +300 a +100 mV De +100 a -250 mV

Nutrientes
Los microorganismos muestran diversidad en sus requisitos nutricionales. Qu necesitan?
Agua Fuente de energa Fuente de nitrgeno Vitaminas Factores de crecimiento Minerales

Factores antimicrobiales naturales

Lisozima en el huevo Aglutinina en la leche Lacteninas en la leche Eugenol en los clavos cido benzoico en los arndanos

Factores extrnsecos que afectan el crecimiento microbiano

Temperatura de almacenamiento Humedad relativa del ambiente Presencia y concentracin de gases en el ambiente Presencia y actividades de otros organismos

Temperatura

Humedad relativa
Muy alta: condensacin, crecimiento Muy baja: prdida de humedad, inhibicin de crecimiento

Presencia y concentracin de gases

Oxgeno o aire Atmsfera anaerbica CO2 Ozono

Presencia y actividades de otros organismos

General
No especfica Inhibicin o destruccin de un organismos por otro Mecanismo
No est claro
Nmero de inhibidores > organismos blanco Variedad de inhibidores Competencia por nutrientes Alteracin no-favorable del ambiente Combinacin de factores

Presencia y actividades de otros organismos

Antagonismo por lactato
Sustancias con actividad antimicrobiana de bacterias productoras de cido lctico
Metabolitos de oxgeno Acidos orgnicos CO2 Diacetil Acetaldehdo Bacteriocinas Antiboticos

Cintica de crecimiento

Fisiologa microbiana y metabolismo

Fermentaciones de alimentos Dao de alimentos Seguridad alimentaria

Fisiologa microbiana y metabolismo

Bacterias aerbicas
GlucosaCO2 (oxidacin) OxgenoH2O (reduccin) 38 ATPs
Fosforilacin oxidativa en el sistema de transporte de electrones Oxgeno es el aceptador final de electrones

Fisiologa microbiana y metabolismo

Bacterias anaerbicas
No tienen sistema de transporte de electrones Reduccin de compuestos a travs de fermentacin 1-2 ATP/mol de hexosa Fosforilacin a nivel de sustrato
P de compuestos orgnicos es transferido a nucletidos de adenina para formar ATP

Gluclisis- Flujo de carbn y fosforilacin a nivel de sustrato

fosfofructocinasa aldolasa

Embden Meyerhof pathway

Ruta EMP
2 ATP/mol glucosa Bidireccional Enzimas claves:
Fosfofructocinasa Aldolasa

Ruta Entner-Doudoroff

Zymomonas y Pseudomonas

1 ATP/mol glucosa 1 3C para biosntesis

Catabolismo heterofermentativo
Leuconostoc, Lactobacillus Basado en catabolismo de pentosas 1 ATP/mol hexosa
Ruta heterofermentativa

Catabolismo homofermentativo
Lactococcus, Pediococcus, algunos Lactobacillus
Bacterias homolcticas utilizan Ruta EMP para producir piruvato

Ciclo TCA
Utilizado por todos los aerbicos Genera NADH2 and FADH como sustrato para fosforilacin oxidativa Genera ATP por medio de fosforilacin a nivel de sustrato Relacionado a biosntesis de amino cidos

Aerbicos: regeneracin de NAD y respiracin

Aerbico
NADH2NAD (oxidacin O2 es el aceptador final de e Azufre y nitrito en respiracin anaerbica

Transporte de egradiente de protonesATP

Anaerobos: regeneracin de NAD y respiracin

Anaerobos
Metabolismo fermentativo
El aceptador final de e- es un compuesto orgnico