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2011

EXTRACCIN Y CUANTIFICACIN DE ADN

Ingeniera Gentica Prof. William Capa Robles E.A.P Biotecnologa- IV ciclo Integrantes: Cedrn Maguia Vania Gonzales Gomez Emely

EXTRACCIN Y CUANTIFICACIN DE ADN I. INTRODUCCIN: 2

El cido desoxirribonucleico, frecuentemente abreviado como ADN (y tambin DNA, del ingls deoxyribonucleic acid), es un tipo de cido nucleico, una macromolcula que forma parte de todas las clulas. Contiene la informacin gentica usada en el desarrollo y el funcionamiento de los organismos vivos conocidos y de algunos virus, y es responsable de su transmisin hereditaria. El conocimiento de la estructura del ADN ha permitido el desarrollo de multitud de herramientas tecnolgicas que explotan sus propiedades fisicoqumicas para analizar su implicacin en problemas concretos: por ejemplo, desde anlisis filogeeticos para detectar similitudes entre diferentes taxones, a la caracterizacin de la variabilidad individual de un paciente en su respuesta a un determinado frmaco, pasando por un enfoque global, a nivel genmico, de cualquier caracterstica especfica en un grupo de individuos de inters. Podemos clasificar las metodologas de anlisis del ADN en aquellas que buscan su multiplicacin, ya in vivo, como la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), ya in vitro, como la clonacin, y aquellas que explotan las propiedades especficas de elementos concretos, o de genomas adecuadamente clonados. Es el caso de la secuenciacin de ADN y de la hibridacin con sondas especficas ("southern blot" y chips de ADN). En PCR, el cido desoxirribonucleico (ADN) es el analito. Por tanto, una buena muestra implica siempre un correcto proceso de obtencin de esta molcula a partir de material biolgico. La extraccin de ADN consta de una etapa de lisis, que consiste en romper las estructuras que confinan el citoplasma y liberar al medio su contenido y otra de purificacin, que implica la retirada de la solucin final de la mayora de elementos que pueden interferir en la PCR. De los tres pasos crticos que componen el anlisis de patgenos por PCR, la extraccin de ADN es quizs el ms desconocido y sobre el que ms control podemos ejercer. Los pasos necesarios para una correcta extraccin y purificacin del ADN mediante un procedimiento qumico son: 1. Lisis de las clulas o virus. Las sales caotrpicas ayudan a romper la estructura tridimensional de macromolculas como las protenas o los cidos nucleicos consiguiendo su desnaturalizacin. La adicin de un detergente como el SDS es
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necesaria a menudo para eliminar las membranas.En esta prctica se utilizara el lauryl sulfato (sarkosyl) un detergente no inico que lisan la membrana plasmtica.(http://webcache.googleusercontent.com/search?q=cache:m9TvyzrdgAJ:w ww.encolombia.com/medicina/enfermeria/enfermeria3300construccion2.htm+deterge nte+de+sarkosyl&cd=1&hl=es&ct=clnk&gl=pe) 2. Degradacin de la fraccin proteica asociada al ADN. Se consigue mediante la adicin de una proteasa. La fraccin proteica puede precipitarse mejor con la ayuda de sales como el acetato de amonio o el acetato sdico. ( http://www.microbial-systems.com) 3. Purificacin. Consta de 3 fases: Precipitacin del ADN. El ADN es insoluble en alcohol, por lo que se puede precipitar etanol fro o isopropanol, y recuperar mediante una centrifugacin. El alcohol del sobrenadante se llevar las sales aadidas previamente. (Zavala E., 2005) Lavado del pellet. Se realiza con alcohol fro volviendo a centrifugarse Recuperacin. El sedimento se puede resuspender en agua o tampn TE (Tris -EDTA) tras ser secado completamente Para evaluar la concentracin y grados de pureza del ADN extrado se utiliza lecturas espectrofotomtricas a 230, 260 y 280nm, sabiendo que 1 unidad de absorbancia a 260nm equivale a 50 ug/ml de ADN de doble cadena.

II.

MATERIALES Y MTODOS:
1. Obtener un aproximado de 1 cm3 de tejido animal (hgado y talo de concha de abanico)

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2. Colocarlo en un mortero, machacar y homogenizar 3. Adicionar TE (TRIS-EDTA) 20:5 (2ml)

4. Homogenizar y dejar reposar por 5 min (se necesita el tejido lavado)

Talo de concha de abanico 5. Se repite dos veces los dos procesos anteriores

Hgado

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6. Adicionar a tubos eppendorf 1 ml de volumen de tejido lavado (dos por cada muestra)

7. Centrifugar por 5 min a 15000 rpm.

8. Al precipitado anterior, adicionar 1/10 (100l) del detergente Sarkosyl (L-lauril sarcosil)

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9. Mezclar e incubar a 60 C x 10 min

10. Sacar y adicionar proteinasa K ( 30g) 11. Mezclar e incubar por 20 minutos, moviendo cada 5. 12. En dos tubos de cada muestra de tejido animal se adiciona 5 ml de cloroformo y 0,2ml de alcohol isoamlico y posteriormente se centrifuga a 15000 rpm.

13. Se extrae el sobrenadante y nuevamente se sigue el proceso con los dos tubos a los que no adicionamos cloroformo. 14. Adicionamos a tubos de ensayo 1,2 ml de cada muestra y 400l de acetato de amonio y mezclar.

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15. Aadir unos 5 ml de etanol absoluto frio y mezclar por inversin

16. Centrifugar por 5 minutos a unos 15000 rpm y se obtiene as el pellet ADN. 17. Se resuspende con TE (1 ml) 18. Se lleva al espectrofotmetro y se lee a 230, 280 y 260 nm.

III. RESULTADOS:
1. Lecturas espectrofotomtricas a 230, 260 y 280nm ABSORBANCIAS MUESTRA 230nm Concha de abanico con cloroformo Concha de abanico Hgado con cloroformo Hgado 3.479 3.538 3.469 3.505 260nm 3.235 3.384 3.195 3.324 280nm 3.041 3.218 3.009 3.133

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2. Determinacin de grado de pureza de ADN obtenido por las relaciones de las absorbancias de 260, 230 y 280nm. RELACIONES MUESTRA 260 / 230nm Concha de abanico con cloroformo Concha de abanico Hgado con cloroformo Hgado 0.92 0.956 0.921 0.948 260/280nm 1.064 1.052 1.062 1.060

IV. DISCUSIN:
La extraccin de ADN es un proceso fundamental para llevar a cabo tcnicas de PCR por lo tanto es necesario la correcta obtencin de esta molcula. Se han descrito diferentes mtodos de extraccin para el aislamiento de ADN; sin embargo todas poseen pasos principales o generales. Para la extraccin de ADN primero se realiza una ruptura o lisis celular triturando el tejido y agregando un buffer como el TE (Tris-EDTA) para lograr la solubilizacin del ADN y protegerla de la degradacin pues el EDTA es un inactivador de las nucleasas sin embargo es necesario que se aada solo en pequeas proporciones pues este es un quelante de cationes divalentes y las enzimas de restriccin requieren de estos iones para su actividad por lo que se recomienda aadir EDTA a una concentracin de 0.05mM para no afectar la actividad de las endonucleasa de restriccin. (Zavala ,2005) Posteriormente se realiza un centrifugado y luego se aade el detergente sarcosyl con la finalidad de eliminar la membrana lipdica celular ayudando en la liberacin de los cidos nuclecos; pues el detergente es necesario a menudo para eliminar las
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membranas (http://www.microbial-systems.com)y con ella otras molculas como las protenas, enzimas y carbohidratos; as mismo el detergente logra separar las fracciones de protenas asociadas al ADN teniendo as la molcula de ADN sola. Luego se agrega la Proteinasa K para que digiera completamente el resto de protenas en la solucin as mismo logra inactivar rpidamente a las nucleasas que degradan el ADN. Pues segn (www.wikipedia.com) esta Proteinasa K es una enzima que se activa rpidamente cuando existen qumicos que desnaturalizan protenas como los detergentes y si observamos ya habamos echado el detergente Sarkosyl as que de alguna manera facilitbamos la actividad de la enzima; pues la actividad de esta Proteinasa es estimulada por desnaturalizantes como el detergente. Por otro lado tambin se realiza la extraccin (eliminacin) de protenas con el fenol y el cloroformo ya que segn Zavala (2005) la eliminacin de protenas se termina utilizando solventes orgnicos como el fenol y el cloroformo; as mismo segn Wiseman (1986) los disolventes orgnicos tienden a precipitar las protenas

rpidamente o bien a desnaturalizarlas es por ello que al observar los resultados de la Densidad ptica (DO) notamos una ligera diferencia entre muestras que trabajaron con cloroformo y las que no lo hicieron. Por otro lado en la prctica no se utilizo el fenol sino slo el cloroformo adems de que no haba esta sustancia en nuestro laboratorio es de vital importancia la precaucin ya que segn Gonzalez (1995) el fenol es

altamente txico y siempre que se utilice se necesita de una cmara de extraccin. Luego se aade o se emplea acetato de amonio para precipitar aquellas fracciones o restos de protenas y tener una solucin con ADN ms pura. Segn Zavala (2005) Para poder concentrar nuestro ADN despus de la eliminacin de las protenas, se utilizan una serie de sales entre las que se emplean acetato sdico,,acetato de amonio. Para terminar el ADN es precipitado con un alcohol en este caso con el etanol, se recomienda etanol por ser ms voltil fcilmente y y se puede eliminar de la muestra ms en el

finalmente se realiza la centrifugacin y se resuspende

amortiguador TE para su cuantificacin. (Zavala, 2005)


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Al obtenerse el pellet que es en si el ADN, obtenido luego de haber efectuado todo el proceso de extraccin se evala lo que es el grado de pureza de nuestro ADN en relaciones de absorbancias de 260,230 y 280nm esto segn tienne (2001) se

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determina con la relacin de DO (densidades pticas) 260/280 nm es aproximadamente 1,8. Con respecto a la relacin de absorbancia 260/280 se obtiene que en la mayora se encuentran en el rango de uno y segn tienne (2001) dice que si existe

contaminacin por protenas la relacin ser sensiblemente inferior a 1,8 por lo tanto nuestro ADN obtenido presenta contaminacin con protenas y anillos aromticos. Por otro lado existe otra forma de determinar dicha pureza de ADN obtenido pues cuando no se dispone de cantidades suficientes de DNA al medir la DO en el ultravioleta se puede realizar una estimacin sobre minigel con tincin de bromuro de etidio (tienne , 2001)

V.

CONCLUSIONES:
Se logro extraer el pellet el cual es el ADN a travs de una serie de procedimientos que implicaron mayor rigurosidad en cuando a la esterilizacin para obtener un buen trabajo.

Se encontr que el ADN obtenido estaba contaminado con protenas y sustancias aromticas y por lo tanto no era totalmente puro esto se determino gracias a la densidad ptica obtenida por relaciones de absorbancias.

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EXTRACCIN Y CUANTIFICACIN DE ADN VI. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS:


Zavala Jorge (2005) Manual de Tcnicas Bsicas de Biologa Molecular. Yucatn Mxico. Ediciones de la Universidad Autnoma de Yucatn Gonzlez Delkin et al(1995) Protocolos para Marcadores Moleculares.Unidad de investigacin en Biotecnologia. Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT),Cali Colombia Wiseman Alan (1986) Principios de Biotecnologia. Editorial Acribia. Zaragosa Espaa tienne Jacqueline (2001) Bioqumica gentica, biologa molecular Editorial Masson. Barcelona Espaa http://webcache.googleusercontent.com/search?q=cache:m9TvyzrdgAJ:www.e ncolombia.com/medicina/enfermeria/enfermeria3300construccion2.htm+deterg ente+de+sarkosyl&cd=1&hl=es&ct=clnk&gl=pe http://www.microbial-systems.com

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