ROTEIRO DAS PRATICAS DE BROMATOLOGIA

Profa Dra Roseane Fett 2006

Composio Centesimal
O valor energtico de um alimento pode ser determinado pela energia qumica obtida de seus constituintes orgnicos, lipdios, protenas e carboidratos, juntamente com a energia fornecida pelos constituintes em menor quantidade como os cidos orgnicos. A determinao experimental da energia envolve um ou dois procedimentos, o uso de bomba calorimtrica ou do clculo de energia que fornece resultados aproximados. A bomba calorimtrica envolve a ignio do alimento em containeres de metal, sob alta presso de oxignio (usualmente cerca de 25 atmosferas). O resultado a oxidao dos constituintes orgnicos resultando em gua e dixido de carbono juntamente com xidos, nitrognio, sulfurosos e fosforosos e conseqente liberao da energia e do calor. Este calor absorvido pela gua contida na bomba e resulta em um aumento na temperatura da gua o qual permite estimar o valor da energia do alimento. Embora a bomba calorimtrica seja uma tcnica segura, simples e precisa, a matria-prima original da qual foi feita a medida de energia no alimento pode no corresponder a mesma no organismo humano. Muitos constituintes da fibra diettica, por exemplo, no digeridos no sistema digestivo humano, alimentos com alto teor em fibras, a bomba calorimtrica pode superestimar o verdadeiro valor energtico do alimento. Enquanto que constituintes no fibrosos, normalmente considerados digerveis, podem no ser totalmente digeridos e absorvidos pelo organismo humano. O verdadeiro valor energtico de um alimento pode ser medido pelo valor calrico (energia total) de um alimento, menos as ocorrncias como: digesto incompleta; absoro incompleta; valor energtico da fibra no alimento; efeito da fibra apressando o transporte e excreo de gorduras e protenas, reduzindo a quantidade de energia derivada deste. Em conseqncia disto, em muitos pases, a bomba calorimtrica no o mtodo de escolha para determinar o contedo de energia do alimento. Em lugar deste, o valor energtico do alimento determinado pelo clculo aproximado das anlises individuais de cada constituinte presente. O valor energtico (valor calrico) de um alimento dado por: Valor calrico (kj/100g) = [(% carboidratos x17) + (% protena x17) + (% de gordura x 37)] ou kcal/100g = [( % carboidratos x 4) + ( % de protena x 4) + (% de gordura x 9)]. O termo valor calrico derivado do uso de calorias como a unidade original de energia. Sendo assim, 1 caloria eqivale a 4,1833 joules, e o valor calrico em calorias por kg pode ser obtido pela aplicao deste fator de converso. usado tambm no estudo dos alimentos como uma unidade alternativa do valor calrico. Isto equivalente a 1000 calorias. A composio centesimal de um alimento exprime de forma bsica o valor nutritivo ou valor calrico, bem como a proporo de componentes em que aparecem, em 100g de produto considerado, os grupos homogneos de substncias do alimento. Composio qumica ou composio centesimal de

um alimento so conhecidas atravs de anlises qumicas de determinao: Umidade e volteis a 105C; Cinza ou resduo mineral fixo; Lipdios (extrato etreo); Protdeos (N x fator de correo); Fibra alimentar; Glicdios ou Nifext, quando determinado por diferena. Ento o valor calrico (Kcal em 100 g) a soma de: Onde P = contedo de protenas (%); L= contedo de lipdios (%); C= contedo de carboidratos (%) .

Tabela 1. Relao dos fatores de converso dos principais componentes de um alimento. Componentes Lipdios Protenas Carboidratos (exceto poliis) cidos orgnicos Polidextrose Poliis lcool (etanol) *1 caloria equivale a 4,1833 joules.
VALOR CALORICO

Fator de converso (kcal/g) 9,0 4,0 4,0 3,0 1,0 2,4 7,0

Fator de conveno (kj/g) 37,65 16,73 16,73 12,55 4,18 10,04 29,28

O valor energtico (valor calrico) de um alimento dado por Valor calrico (kj/100g) = [(% carboidratos x17) + (% protena x17) + (% de gordura x 37)] O termo valor calrico derivado do uso de calorias como a unidade original de energia. Sendo assim, 1 caloria eqivale a 4,2 joules, e o valor calrico em calorias por kg pode ser obtido pela aplicao deste fator de converso. usado tambm no estudo dos alimentos como uma unidade alternativa do valor calrico. Isto equivalente a 1000 calorias. Ento o valor calrico (Kcal em 100 g) a soma de: P x 4,0 + L x 9,0 + C x 4,0 Onde P = Contedo de protenas (%); L= Contedo de lipdios (%); C= Contedo de carboidratos (%).

UMIDADE Considera-se geralmente como umidade, a gua presente em um alimento. Esta gua apresenta-se de duas maneiras. a) Umidade de superfcie: a gua presente na superfcie externa, como por exemplo, no gro de trigo. Esta umidade facilmente evaporada. b) Umidade absorvida: a gua encontrada no interior de certos alimentos ou produtos alimentcios, sem, no entanto combinar-se quimicamente com os mesmos. Esta umidade muitas vezes est concluda, tornando sua evaporao mais difcil. Neste caso, o material a ser submetido a eliminao de gua por evaporao, deve ser reduzido a partculas pequenas para possibilitar a sua liberao. Na manteiga, margarina e produtos similares, a gua separar-se temperatura de 130 C sob forma de pequenas partculas, as quais to logo sejam liberadas, evaporam violentamente espalhando a gordura em todos os sentidos. Para prevenir essas perdas durante a determinao, costuma-se usar um recipiente padro (bquer para manteiga) cuja principal caracterstica apresentar as paredes bastante altas. No falaremos da gua de cristalizao de determinadas substncias qumicas, pois ela se encontra comumente nos alimentos. TCNICA GRAVIMTRICA COM O EMPREGO DE CALOR Este mtodo est baseado na determinao de perda de peso do produto submetido ao aquecimento. a) Mtodo gravimtrico a 105C Este mtodo est baseado na determinao da perda de peso, do produto submetido ao aquecimento. o mtodo mais usado. A maioria dos mtodos mais usados habitualmente implicam a desidratao da amostra, at peso constante, sob determinada temperatura e presso. Material : estufa de secagem a 105 3C, cpsula de alumnio ou borosilicato. Procedimento: pesar de 5-10 gramas do produto ou amostra mdia em cpsula previamente submetida a temperatura de 105C e pesada, levar estufa por 5 horas, ou manter o material at que a diferena entre pesagens no seja superior a 0,01g. Clculo: Relacione a perda de peso por 100 gramas da amostra. umidade % m/m = P - p x 100 P . onde: P = massa em g da amostra. p = massa em g da amostra seca.

TCNICA GRAVIMTRICA SEM O EMPREGO DO CALOR Este mtodo utilizado quando se deseja preservar princpios termolbeis, e em casos especiais, como o dos alimentos muito aucarados, que tendem a se caramelizar.

b)Mtodo gravimtrico a frio. Indicado para alimentos que no podem ser submetidos ao aquecimento trmico (105C), como no caso de alimentos muito aucarados, pois, caramelizam-se. Material: dessecador + cido sulfrico, cpsula de alumnio ou porcelana, bomba de vcuo, balana analtica. Procedimento: pesar exatamente cerca de 2-5 gramas da amostra a ser analisada, colocar no interior de um dessecador no qual foi previamente adicionado cido sulfrico. Promover o vcuo. Realizar movimentos no dessecador nas primeiras 12 horas. Aps 24 horas, abra o material. Repetir a operao at que a diferena entre pesagens no seja superior a 0,01g. Clculo idntico, a tcnica anterior.

RESDUO SECO Nos produtos lquidos ou de alto teor de umidade, mais usado considerar o resduo seco (slido totais) obtido, para a avaliao dos slidos existentes no produto. Material Pipeta de 10 ml, cpsula de platina de 50 ml, estufa a 105 C, dessecador com cido sulfrico. Procedimento a) Transfira com auxlio de uma pipeta 10 ml de amostra, se a mesma for lquida, ou pese 10 g se amostra for slida, para uma cpsula de platina de 50 ml, previamente aquecida a 105 C por 2 horas, resfriada em dessecador at a temperatura ambiente e pesada. Esfrie em dessecador com cido sulfrico at a temperatura ambiente. Pese. Repita as operaes de aquecimento (30 minutos) e resfriamento, at peso constante Clculo 100 x N = resduo seco por cento p/v (ou p/p no caso de amostra slida). A N = n. de g de resduo seco A = n. de ml da amostra (ou n. de gramas de amostra ou mL) b) Subtraia de 100 g de amostra o nmero de g de umidade por cento. Considere a diferena como o n. de g do resduo seco por cento Clculo

100 A = resduo seco por cento p/p A = n. de g de umidade por cento RESDUO MINERAL FIXO (CINZAS) A frao cinzas compreende o resduo mineral fixo que no destrudo pela queima do produto. Sua composio depende, at certo ponto, da temperatura e do tempo em que se pode processar a ignio. As cinzas podem ser calculadas em relao ao produto e em relao ao produto dessecado. Evidentemente, os valores numricos obtidos sero diferentes em cada caso, havendo, portanto necessidade de se exprimir, no resultado, as condies em que se processou a determinao. Consideram-se cinzas totais o resultado da incinerao do produto temperatura de 500-550C em mufla, ou do vermelho sombrio. A ignio deve ser prolongada at que a cinza mostre cor uniforme; normalmente essa cor branca ou cinzenta, ocorrendo casos em que apresenta vermelha ou avermelhada, verde ou esverdeada, por causa do excesso de certos elementos presentes; de qualquer modo, as cinzas no devem apresentar pontos de carvo. As cinzas devero ficar brancas ou levemente acinzentadas. (Em caso contrrio, esfriar, adicionar 0,5 ml de gua, secar e incinerar novamente). Algumas gotas de azeite comestvel, adicionadas inicialmente amostra, facilitam a carbonizao. Algumas amostras contendo sais de metais alcalinos, que retm propores variveis de dixido de carbono nas condies da incinerao, so tratadas, inicialmente, com soluo de carbonato de amnio ou cido sulfrico diludo e, aps secagem do excesso do reagente, aquecidas e pesadas. O resduo , ento, denominadas Cinzas carbonatadas ou Cinzas sulfatizadas, respectivamente. Muitas vezes vantajoso combinar a determinao direta de umidade e a determinao de cinzas, incinerando o resduo obtido na determinao de umidade. A determinao de cinzas insolveis em cido, geralmente cido clordrico a 10 %, p/p, d uma avaliao da slica, (areia) existente na amostra. Alcalinidade nas cinzas outra determinao auxiliar, no conhecimento da composio. Dificuldades prticas que envolvem a obteno das cinzas: a) Materiais muito ricos em fsforo; b) Produtos muito gordurosos; c) Produtos com elevado teor de material alcalino. No primeiro caso, uma massa vtrea envolve o carvo inicialmente formado, tornando-o dificilmente atingvel subseqentemente. Nessas condies, com pacincia, procura-se desintegrar o bloco formado, colocando,

cuidadosamente, sobre o material, que ento, dever estar frio, uma gota de gua destilada ou cido ntrico. No segundo caso, h quase sempre formao de espuma, que acarreta a perda da amostra. A ignio deve ser lenta e paciente. No terceiro caso, a dificuldade reside em se obter, em dois ou mais ensaios, resultados concordantes. De fato, pequenas variaes no tempo ou na temperatura de ignio ocasionam variaes devidas a maior ou menor decomposio dos carbonatos e volatilizao dos cloretos; h ainda o perigo de hidratao das cinzas quando fora do dessecador, ou mesmo de perdas mecnicas, por serem leves e fofas. O material rico em gua deve ser previamente dessecado, cuidado que previne o sobressalto e a conseqente perda durante a determinao. A ignio deve ser gradual, com assistncia do analista. S depois de formado o bloco de carvo, poder o analista deixar que a operao prossiga sem superviso direta. aconselhvel quando a operao for executada em bico de gs, colocar o cadinho ligeiramente inclinado sobre a chama. Os cadinhos empregados podem ser de porcelana, quartzo, vitreosil, ao inoxidvel, nquel ou platina. O uso de cada tipo depende do caso considerado, porm, para os trabalhos rotineiros de determinao de composio centesimal, so perfeitamente aceitveis os cadinhos de porcelana, quartzo ou vitreosil. O tempo necessrio para uma perfeita incinerao depende tanto da temperatura empregada, quanto do tipo de material examinado, assim como a sua quantidade. Pode variar de alguns minutos a algumas horas. O teor de cinzas em alimentos pode variar dentro do limite de 0,1 15%, dependendo do alimento e das condies em que este se apresenta. A ttulo ilustrativo temos a seguir alguns exemplos: Mtodo por Incinerao FUNDAMENTO O mtodo est baseado na determinao da perda de peso do material submetido ao aquecimento a 550 C. , portanto, um mtodo gravimtrico. A perda de peso nos fornece o teor de matria orgnica do alimento. A diferena entre o peso original da amostra e essa perda, fornece a quantidade de cinzas presente no produto. Material: forno mufla, cadinho de porcelana. Procedimento: em cadinho calcinado e tarado, pesar cerca de 2 gramas da amostra. Comear, a incinerao aos poucos, em bico de gs ou chapa eltrica, procurando aquecer igualmente todas as faces do cadinho. Quando o produto estiver transformado em massa de carvo e cessar o desprendimento de fumaa, transferir o cadinho para mufla a 550C, deixando-o por espao de tempo suficiente para total destruio da matria orgnica. Esperar a temperatura baixar de 80C, retirar e colocar em dessecador. Pesar at peso constante. Clculo: A diferena entre o peso lquido do cadinho e o peso bruto aps a incinerao nos d a quantidade de cinzas na tomada de ensaio. Calcular para 100g de produto dessecado e para 100g de produto integral.

Clculo: 100 x N = cinzas % m/m P FRAO EXTRATO ETREO Os mtodos rotineiros para determinao quantitativa de lipdios baseiamse na extrao intermitente da frao lipdica por meio de um solvente orgnico adequado. Aps extrao e remoo do solvente, determina-se gravimetricamente, a quantidade de lipdios presentes. O resduo obtido no , na verdade, constitudo unicamente por triglicerdeos, mas por todos os compostos que, nas condies da determinao, possam ser extrados pelo solvente. Geralmente, so fosfatdeos, esteris, vitaminas A e D, carotenides, leos essenciais, etc., mas em quantidades relativamente pequenas, que no chegam a representar uma diferena significativa na determinao. Os solventes mais comumente usados so: o ter etlico anidro (ter sulfrico) e o ter de petrleo frao 30-60C. A mistura desses dois tambm recomendada. O ter etlico, apesar de ser um excelente extrator para lipdeos, tem algumas desvantagens: a) deve estar completamente livre de gua (anidro), necessitando, portanto, de uma srie de manuseios e cuidados; b) contendo gua, dissolver tambm alguns mono e dissacardeos provocando desvios na determinao; c) a amostra a ser usada deve, portanto, estar completamente seca; d) no extrai completamente derivados como a lecitina; e) altamente inflamvel e, quando oxidado, explosivo, e f) sua recuperao deve ser acompanhada com grande cuidado. O ter de petrleo, por sua vez, apesar de no ser o solvente por excelncia, traz uma srie de vantagens: a) no extrai outras fraes que no seja a lipdica; b) no afetado por pequenas quantidades de gua e c) a sua recuperao por destilao muito mais conveniente, porm seu custo muito maior. A extrao pode ser levada a efeito em um extrator intermitente sendo o mais comum o aparelho de Soxhlet. Neste aparelho o produto a ser extrado fica completamente protegido da indesejvel elevao da temperatura. O material colocado no cartucho deve ser previamente dessecado, pois assim, o ter penetra rapidamente em sua massa, alm de ser prevenida a possvel extrao conjunta de substncias indesejveis, solveis em gua, bem como arrastamento da prpria gua, o que provocaria um erro. O material deve ser finamente dividido, para permitir melhor atuao do solvente. O tempo de extrao varivel dependendo da natureza do produto. Temse indicao do ponto final do processo quando uma gota do solvente recm destilado no acusar a presena de gordura (teste da mancha na folha de papel). Recupera-se por destilao a maior parte possvel do solvente. Neste caso os teores de substncias etreo-solveis podem ser desde traos como no caso do amido, ou at de 15 %, como no caso do abacate. As carnes e pescados tambm apresentam um teor bastante varivel de lipdios, esta variao est em funo da manipulao do alimento e condies do animal. N = massa em gramas de cinza. P = massa em gramas da amostra.

Em se tratando de material lquido, esse deve ser colocado sobre fibra de amianto recentemente calcinada e resfriada, a seguir ser dessecado e s ento levado para o cartucho Soxhlet. Materiais que se aglomeram facilmente formando pastas consistentes, devem ser manipulados com areia lavada e seca, antes de serem levados ao cartucho. Uma extrao completa dos lipdios se torna difcil em produtos contendo alta proporo de protenas, e a presena de carboidratos tambm interfere. Em muitos casos, ocorre o encapsulamento dos lipdios, ou seja, os triglicerdeos ficam envoltos por molculas de protenas. Este fenmeno ocorre, normalmente, quando um alimento lquido foi transformado em slido, como o caso do leite em p. Para estes casos, utiliza-se o mtodo modificado de extrao, onde so feito tratamento prvio da amostra com lcali ou cido. No tratamento com cido emprega-se HCl em concentrao prxima a 6N e aquecimento. A protena hidrolisada pelo cido, e os lipdeos ficam livres para extrao com solvente. No tratamento com lcali, o produto tratado com hidrxido de amnio e lcool. O lcool precipita a protena, que se dissolve no hidrxido, restando os lipdios para serem extrados com solvente. Uma vez evaporado ou destilado o solvente, determina-se gravimetricamente o resduo obtido. Em certos casos, determinam-se volumetricamente os lipdios obtidos, tratando a amostra com reagentes (solvente mais cido ou lcali) em butirmetro, fazendo-se em seguida uma centrifugao. O solvente contendo os lipdios extrados pode ser medido atravs de uma leitura direta na escala do butirmetro. Mtodo de Soxhlet Material: Extrator de Soxhlet; ter etlico (anidro) ou ter de petrleo; Cartucho de Soxhlet. Procedimento: Pesar cerca de 2-5 g da amostra em vidro de relgio e dessecar em estufa ou usar amostra obtida no final da determinao da umidade. Transferir a substncia seca para um cartucho previamente desengordurado, cobrir a amostra com um pedao de algodo desengordurado. Extrair no aparelho Soxhlet (balo previamente aquecido por l hora em estufa a 105C, resfriado em dessecador at temperatura ambiente e pesado), com ter etlico por 6 horas. Terminada esta etapa, dois procedimentos so possveis. a) Dessecar o material extratado at peso constante. A diferena de peso entre a tomada de ensaio e o produto final corresponde quantidade de extrato etreo da amostra. Calcular para 100g. b) Separar o ter por destilao (at cerca de 9/10 do volume), eliminar o ter residual em banho-maria secar o balo em estufa at que duas pesagens consecutivas no apresentem variaes de peso. Essa pesagem corresponde, diretamente, quantidade de extrato etreo da tomada de ensaio. Calcular para 100g do produto. Para este caso o balo do extrator de Soxhlet dever ser previamente tarado. Clculo: Relacionar a quantidade de substncia lipdica obtida na tomada de ensaio para 100 gramas de "produto seco" e/ou em 100 g de produto integral.

100 x N = lipdios % m/m P Mtodos volumtricos

onde N = massa em g de lipdios P = massa em g da amostra.

Nestes mtodos, os lipdios contidos na amostra so dissolvidos em cido sulfrico concentrado em tubos calibrados (ex. butirmetro de Terchert), a mistura centrifugada para separar a fase aquosa da fase oleosa e, aps atingir a temperatura especfica, a quantidade de lipdios presentes dada atravs da leitura direta na escala calibrada, em que est contido o lipdio. Os mtodos mais utilizados so: mtodo de Gerber e mtodo de Babcock. Mtodo de Gerber Este mtodo foi desenvolvido por volta do ano de 1892 como sendo o mais rpido para determinao prtica de lipdios. Entretanto com o surgimento de mtodos instrumentais, o mtodo de Gerber perdeu sua importncia. Contudo, devido sua execuo simples e aplicao, apresenta exatido e reprodutibilidade nos resultados. Os especficos tubos de Gerber ou butirmetro de Terchert foram desenvolvidos para os diferentes tipos de produtos lcteos, com escalas apropriadas e especficas. O procedimento envolve medidas especficas da quantidade de amostra a ser adicionada, seguida de medidas especficas de cido sulfrico e lcool amlico para auxiliar na separao da fase aquosa e oleosa. A adio de cido sulfrico causa aumento na temperatura, que aumenta a medida em que os lipdios so dissolvidos. A mistura centrifugada em uma centrfuga especial de Gerber a 1100 rpm por um tempo determinado, aps os tubos calibrados so colocados em banho-maria a 65C para padronizar a temperatura das amostras e a leitura dada direto na escala do butirmetro. FRAO NITROGENADA (PROTICA) O contedo em protena bruta do alimento determinado atravs do seu contedo em nitrognio, embora o nitrognio possa ser proveniente de outros componentes, no somente das protenas, componentes como cidos nuclicos, protdeos, aminocidos, sais de amnio, nitratos, bases pricas, etc. A determinao do nitrognio total nos fornece a informao muito reduzida do valor de protenas de um alimento. Conhecendo-se a proporo de uma protena em particular, multiplicando-se o valor do nitrognio pelo fator desta e assim estima-se o contedo em protena. A maior parte das protenas tem 16 por cento de nitrognio, portanto o fator para converter o nitrognio em protena 100/16 ou 6,25 (protena padro da carne). Por conveno se designa protena bruta (N x 6,25). Nem todas as protenas dos alimentos contm 16 por cento de nitrognio e em conseqncia necessrio aplicar outros fatores multiplicadores. O mtodo de KJELDAHL (AOAC, 1984) foi descrito h quase um sculo, em 1883. Johan Gustav Christoffer Thorsager Kjeldahl publicou um trabalho de ttulo Um novo mtodo para determinaes de nitrognio em compostos orgnicos em uma revista dinamarquesa, sendo que o sucesso do mtodo foi imediato e desde ento o mais amplamente usado indicado para amostras de
10

origem biolgica. Neste mtodo, por meio de uma digesto cida, o nitrognio da amostra transformado em amnio (NH4+), o qual posteriormente separado por destilao e finalmente pela titulao. O mtodo basicamente dividido em trs etapas: Digesto - o nitrognio orgnico transformado em amnio e os componentes orgnicos so convertidos em CO2, H2O, etc... Destilao fase em que o gs amnia liberado e recolhido em uma soluo receptora. Titulao - determinao quantitativa da amnia recolhida contida na soluo receptora. Dependendo da tcnica, a separao da amnia omitida, fazendo-se a sua determinao diretamente no material, aps digesto. Em face das diferentes temperaturas exigidas para a decomposio das substncias orgnicas, pois algumas substncias no se decompem temperatura normal de ebulio do cido sulfrico, torna-se necessrio aumentar a severidade de reao, pela adio de determinados sais, sendo os mais comuns: o sulfato de potssio ou de sdio (que elevam o ponto de ebulio do cido sulfrico de 180C para, aproximadamente 400C, pela formao de S2O7, tornam a digesto mais rpida). Mesmo assim, a oxidao da matria orgnica ainda relativamente lenta, podendo ser acelerada pela adio de catalisadores ou agentes oxidantes. Os sais de cobre (CuSO4 5H2O) e selnio metlico (Se) so os mais comumente usados. Transformam o oxignio e o ativam (oxignio ativo), tornando-o de maior poder de oxidao. A ao ativadora do selnio pode ser explicada por meio das seguintes reaes:
Se + 2H2SO4 H2SeO3 2SO2 + H2SeO3 + H2O Se + H2O + 2 [O]

Da mesma forma, o sulfato cprico funciona produzindo oxignio ativado, a fim de apressar a digesto:
2H2SO4 O2 + 2 Cu++ 2CuO 2SO2

como

catalisador,

+ 2H 2O + O 2CuO

2 Cu++ + 2 [O]

O uso de uma combinao de catalisadores benfico, porque promove melhor efeito associativo do que cada um dos catalisadores separadamente. O uso da mistura cobre e selnio no acarreta perda de nitrognio, desde que a concentrao do sulfato seja alta; porm, quando a concentrao do sulfato for baixa, o uso da mistura poder mesmo assim, acarretar perda de nitrognio. As reaes que se passam durante o processo da determinao dos compostos nitrogenados podem ser assim resumidas. Digesto - durante a fase de digesto, coloca-se no balo Kjeldahl a amostra embrulhada, de preferncia, em papel impermevel, juntamente com a mistura digestora e o H2SO 4 concentrado. Faz-se o aquecimento em blocos de aquecedores, e provavelmente as seguintes reaes so observadas.

11

Matria orgnica

H2SO4 + catalisador

SO2 + CO2 H2SO4 [H]

+ H2O + R - NH2

R-NH2 + H2O

R - OH + NH3

RCONH2 + H2O 2NH3 + H2SO4

RCOOH + NH3 (NH4)2SO4

sulfato de amnio

O carbono contido na matria orgnica oxidado e o CO2 se desprende, e no final da digesto o material fica completamente claro, depois de passar por uma fase bastante escura, no incio da digesto. Alm dos agrupamentos proticos, existe nitrognio sob forma de amina, amida e nitrila, que so transformados em gs amnia (NH3). Este gs formado reage com o cido sulfrico (H2SO4), formando (NH4)2SO4, conforme indicaram as reaes. O sulfato de amnio formado, que fica no balo, ao se esfriar, forma cristais. Destilao - Pode ser feita por aquecimento direto ou por arraste a vapor, sendo prefervel este ltimo. O sulfato de amnio tratado com hidrxido de sdio (NaOH 1+1), em excesso, e ocorre a liberao do gs amnia (NH3), conforme reao a seguir:
(NH4)2SO4 + 2NaOH
sulfato de amnio

2NH4OH + Na2SO4
sulfato de sdio

NH4OH

NH3 + H2O
amnia

Ao se adicionar o NaOH (1+1), devem-se usar algumas gotas de fenolftalena, no destilador, para garantir um ligeiro excesso de base. O gs NH3 desprendido ento recebido em um Erlenmeyer contendo cido brico (H3BO3) com indicador, previamente adaptado ao conjunto.
NH3 + H3BO3
borato de amnia

NH4H2BO3

O H3BO3 + indicador que, no incio, era de cor rosa (laranja), adquire a cor verde medida que se vai formando o NH4H2BO3 Titulao - a ultima fase o NH4H2BO3 titulado com uma soluo padro de HCl 0,01N ou 0,1N com fator conhecido at a viragem do indicador.
NH4H2BO3 + HCl H3BO3 + NH4Cl

12

MTODO DE KJELDAHL Frao Protica Material - cido sulfrico isento de nitrognio; catalisador misto (sulfato de potssio 100 g, sulfato de cobre 10 g, selnio 2 g); cido clordrico 0,1N ou 0,01N fatorado; soluo indicador misto (0,50% verde de bromocresol + 0,75% de vermelho de metila em lcool etlico); hidrxido de sdio a 50% e cido brico 4%. Procedimento: Pesar cerca de 1 g da amostra e transferir para um balo de Kjeldahl, juntar cerca de 2 g do catalisador misto, e 20 mL de cido sulfrico concentrado. Aquecer at ebulio em capela qumica por cerca de 4-6 horas. Nesta fase da digesto, ser observado um escurecimento do lquido e, depois, ao passo que o aquecimento vai se prolongando, passa a pardo, ficando finalmente incolor. A funo do catalisador reduzir o tempo de digesto. O clareamento do lquido no indica o fim da digesto. Para se ter certeza de que a operao est terminada, adicionar mistura um cristal de permanganato de potssio, se este no descorar, no tem matria orgnica no digerido. Obs: Quando se usa aparelho tipo micro-Kjeldahl, em ebulio lenta, 30 minutos sero suficientes para assegurar uma digesto adequada. Adicionar ao tubo de destilao, cerca de 50 mL de gua destilada. Conectar o tubo ao sistema de destilao e ligar o aparelho, aps adicionar cuidadosamente com agitao a soluo de hidrxido de sdio a 40%, o lquido passar de azul a pardo, o que indica que meio alcalino. 4) Destilar recebendo o destilado em 50 mL de soluo cido brico a 4% + gotas de vermelho de metila ou alaranjado de metila. Destilar at receber cerca de 200 mL de volume. Titular o destilado com soluo de HCl 0,1 N se for utilizado H3BO3 como soluo receptora. Clculo: Peso da amostra (mg) P Titulao da amostra (mL) .V Sabendo-se que 1(um) mL de HCl 0,1N reage com 0,0014 g de nitrognio: N de meq. de HCl = N meq.de N na amostra O total de cido brico consumido pela destilao menos o nmero de mL de HCl 0,lN gasto na titulao, multiplicado por 0,0014 nos dar a quantidade de nitrognio presente na amostra % de N. Fator 6,25 normalmente usado para se transformar a % de nitrognio em protena, levando-se em conta que as protenas contm, em mdia, 16% de nitrognio. 100 g protena 16 de N x 1 de N X = 6,25 Resultado multiplicado por 6,25, nos dar a quantidade de protena da amostra. = % de protena bruta. Relacionar o resultado obtido para 100 g de produto integral ou 100 g do produto seco

13

V x f x 0.0014 x 6,25 x 100 = protena % m/m P onde: V = n mL HCl 0,1N gasto na titulao ; f = fator de correo do cido; P = n gramas da amostra. FRAO NITROGENADA - PROTICA E NO PROTICA uma tcnica alternativa que permite reconhecer a poro de nitrognio de origem protica e no protica do alimento analisado, podendo ser aplicada a todos os tipos de produtos alimentcios. Material e reagentes : frascos de Kjeldahl de 800 mL, funil de Bchner de 12 cm de dimetro, frascos do tipo Kitasato, papel filtro Whatman n.541, soluo a 3% de acetato de cobre monohidratado m/m; soluo a 10% de sulfato de alumnio e potssio ( dihidratado ) m/m, antiespumante (silicona). cido sulfrico isento de nitrognio, catalisador misto (sulfato de sdio anidro 100 g, sulfato de cobre 10 g), cido clordrico 0,1N ou 0,01N padronizado , soluo indicador misto (0,50% m/v verde de bromocresol + 0,75% m/v de vermelho de metila em lcool etlico), hidrxido de sdio a 50% e cido brico 4% m/v. (No caso da no possuir cido sulfrico isento de nitrognio, realizar uma determinao em branco do mesmo, para posterior eliminao da interferncia no clculo). Procedimento: pesar cerca de 2 gramas da amostra com mais de 25 % m/m de protena crua, cerca de 1 grama para faixas de 25-50 % m/m de protena crua e cerca de 0,5 grama para amostras com mais de 50 % m/m de protena crua. Transferir para um balo de Kjeldahl e adicionar aproximadamente 50 mL de gua deionizada, prolas de vidro e 1-2 gotas de antiespumante. Aquecer em ebulio durante 30 minutos (refluxo). Enquanto a amostra estiver aquecida, adicionar 2 mL da soluo de sulfato de alumnio e potssio, homogeneizar, em seguida, adicione 2 mL da soluo de acetato de cobre 3% m/m, homogeneizar com vigor, deixar esfriar. Filtrar usando vcuo. Lavar o balo e o precipitado com 50 mL de gua destilada fria. Para determinar o nitrognio protico, analisar o precipitado por meio da tcnica do nitrognio total de Kjeldahl. O nitrognio no protico analisado por meio da mesma tcnica, a partir do lquido filtrado. Os resultados respectivos dos slidos (precipitado) e lquidos por meio do Kjeldahl oferecem diretamente os dados do nitrognio protico (NP) e no protico (NNP) respectivamente. PS: Pode-se tambm, analisar por diferena , sendo que de posse do contedo de nitrognio total e do nitrognio protico , podemos calcular o nitrognio no protico.

14

2g de amostra + 50 mL de gua deionizada

esfrie

Ebulio 30 min

Adicione 2 mL de sulfato de alumnio

homogeneze

Adicione 50 mL de acetato de

Calcule o N protico no resduo e N no protico no filtrado

Determine o nitrognio no resduo e no filtrado pelo mtodo de Kjeldhal

Filtre a vcuo lave com gua deionizada

Fluxograma da determinao do nitrognio protico e no protico e alimentos. FRAO FIBRA Denominam-se, de fibras dietticas os carboidratos indisponveis de origem vegetal que so difceis ou impossveis de serem digeridos pelas enzimas endgenas do sistema digestivo do organismo humano. A Fibra Alimentar (FA) uma frao complexa, composta de polissacardeos e lignina, que se origina, principalmente, da parede celular e do cimento intercelular de tecidos vegetais. Os polissacardeos (celulose, hemicelulose, substncias pcticas, -glucanas e gomas) que a compem, apesar de constiturem a maior parte da FA, esto associados a outras substncias como cutina, suberina, taninos, fitatos, lignina podendo, ainda, conter compostos, formados durante o processamento, como produtos de Maillard e amido retrogradado. Esta complexidade torna difcil a anlise da frao fibra existindo diversas metodologias. A chamada fibra bruta, obtida atravs da extrao cida e alcalina, deve ser abandonada por fornecer valores subestimados de FA. Esse processo destri da a frao solvel da fibra e quantidades variveis da frao insolvel. As tcnicas baseadas no uso de detergente cido e ou/ neutros, se no acompanhadas do uso de amilases e da determinao de nitrognio residual, podem apresentar valores superestimados, como, por exemplo, em leguminosas, por inclurem amido e protena no solveis e, alm disso, no permitirem a avaliao dos componentes solveis. Mtodo de Henneberg Consta, fundamentalmente, de uma digesto em meio cido (H2SO4 1,25%) seguida de uma digesto em meio alcalino (NaOH 1,25%). O resduo mineral fixo dessas digestes representa a fibra, simulando o que ocorre em in vivo. O teor de fibra em alimentos varia de acordo com sua origem. Alimentos de origem vegetal apresentam de 0.5 a 1.5% de fibra.

15

Material - soluo de cido sulfrico a 1,25%; soluo de hidrxido de sdio a 1,25%; lcool absoluto, ter etlico; gua destilada (fria e quente) e papel de filtro (pesado). Procedimento: Pesar cerca de 2g da amostra mdia do produto seco e desengordurado (obs. para desengordurar proceda a uma extrao total por meio de ter e evapore totalmente o ter, ou ento pode ser usada amostra em que foi determinado o extrato etreo), evitando assim um excesso de saponificao da gordura durante a hidrlise bsica, e conseqentemente, prevenir a formao de espuma. Transferir ento quantitativamente a amostra para um frasco digestor adaptado a um refrigerante de refluxo com placa eltrica pr-aquecida. Digesto cida: Adicionar a amostra 100 mL do cido sulfrico 1.25%, e adaptar o tubo ao bloco digestor e ferver, durante 20 minutos. Aps filtrar em funil de Bchner, ainda quente sobre o papel filtro comum, de boa capacidade filtrante. Lavar com gua destilada o frasco, e em seguida o papel filtro. Quando a filtrao estiver praticamente terminada, iniciar a digesto alcalina com a soluo de NaOH a 1.25%. Digesto alcalina: retornar o resduo contido no papel-filtro para o frasco usado para a digesto cida e com auxilio de gua quente fazer voltar todo o resduo para dentro do frasco. Adicionar 100 mL da soluo de NaOH 1,25% e levar novamente ebulio nas mesmas condies anteriores, durante 20 minutos. Ao final desse, filtrar a soluo com papel filtro devidamente pesado, retirando por meio de gua destilada quente todo o resduo existente no frasco. Geralmente a filtrao alcalina rpida. Verificar por meio de papel indicador, se a gua retirou todo o lcali. Lavar se necessrio, at que isso acontea. Lavar depois, com cerca de 20 mL de lcool etlico o material no filtro e, a seguir com 20 mL de ter etlico, tendo o cuidado de projetar o jato sobre a massa de fibra para que haja penetrao do lquido na mesma. Evaporar e transferir o papel filtro com o resduo para uma estufa a 105C at peso constante. Clculo: O peso da fibra total dado pela diferena apresentada do peso do papel. Calcule para 100g de material seco e integral. 100 x S = n de g fibra P %m/m S = massa em g do resduo da amostra no papel, menos as cinzas ( papel e amostra) P = massa em g da amostra inicial

Obs. Quando se utiliza um papel filtro especfico, com teor de cinzas conhecido, pode-se dobrar o papel filtro contendo a fibra em um cadinho calcinado e pesado, e determinar as cinzas totais do resduo fibra. O teor de cinzas obtido menos o peso das cinzas do papel filtro especfico, representam a parte mineral da fibra na tomada de ensaio. A diferena entre a parte mineral da fibra e fibra total nos dar a frao fibra do alimento.

16

FRAO GLICDICA OU NIFEXT Corresponde ao extrato livre de nitrognio (nitrogen free extract) estando tambm excluda a frao lipdica. Engloba diversos compostos, tais como: fculas e amido, acares, gomas, resinas, cidos orgnicos, etc. O teor de glicdios em alimentos varia de praticamente zero para as carnes, at teores bastante elevados no caso das farinhas, uma vez que estas apresentam cerca de 75%. Clculo: Somar os nmeros correspondentes s percentagens das cinco determinaes precedentes (umidade, cinzas, lipdios, protenas e fibra). Diminuir o nmero obtido de 100. A diferena ser correspondente ao valor da frao Nifext para 100g do produto.

17