CROMATOGRAFIA

La cromatografa es un mtodo fsico de separacin para la caracterizacin de mezclas complejas, la cual tiene aplicacin en todas las ramas de la ciencia y la fsica. Es un conjunto de tcnicas basadas en el principio de retencin selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. Las tcnicas cromatogrficas1 son muy variadas, pero en todas ellas hay una fase mvil que consiste en un fluido (gas, lquido o fluido supercrtico) que arrastra a la muestra a travs de una fase estacionaria que se trata de un slido o un lquido fijado en un slido. Los componentes de la mezcla interaccionan en distinta forma con la fase estacionaria. De este modo, los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando. Despus de que los componentes hayan pasado por la fase estacionaria, separndose, pasan por un detector que genera una seal que puede depender de la concentracin y del tipo de compuesto. Diferencias sutiles en el coeficiente de particin de los compuestos da como resultado una retencin diferencial sobre la fase estacionaria y por tanto una separacin efectiva en funcin de los tiempos de retencin de cada componente de la mezcla. La cromatografa puede cumplir dos funciones bsicas que no se excluyen mutuamente:

Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos ms puros y que puedan ser usados posteriormente (etapa final de muchas sntesis). Medir la proporcin de los componentes de la mezcla (finalidad analtica). En este caso, las cantidades de material empleadas son pequeas.

Las distintas tcnicas cromatogrficas 3 se pueden dividir segn cmo est dispuesta la fase estacionaria:

Cromatografa plana. La fase estacionaria se sita sobre una placa plana o sobre un papel. Las principales tcnicas son:

Cromatografa en papel o Cromatografa en capa fina Cromatografa en columna. La fase estacionaria se sita dentro de una columna. Segn el fluido empleado como fase mvil se distinguen: o Cromatografa de lquidos o Cromatografa de gases o Cromatografa de fluidos supercrticos
o

La cromatografa de gases es til para gases o para compuestos relativamente voltiles, lo que incluye a numerosos compuestos orgnicos. En el caso de compuestos no voltiles se recurre a procesos denominados de "derivatizacin", a fin de convertirlos en otros compuestos que se volatilizen en las condiciones de anlisis. Dentro de la cromatografa lquida destaca la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC, del ingls High Performance Liquid Chromatography), que es la tcnica cromatogrfica ms empleada en la actualidad, normalmente en su modalidad de fase reversa, en la que la fase estacionaria tiene carcter no polar, y la fase mvil posee carcter polar (generalmente agua o mezclas con elevada proporcin de la misma, o de otros disolvente polares, como por ejemplo metanol). El nombre de "reversa" viene dado porque tradicionalmente la fase estacionaria estaba compuesta de slice o almina, de carcter polar, y por tanto la fase mvil era un disolvente orgnico poco polar.

Una serie eluotrpica, es un rango de sustancias de diferentes polaridades que actan como fase mvil y que permiten observar un mejor desplazamiento sobre una fase estacionaria.

Tipos Cromatografa en papel Cromatografa en capa fina Cromatografa de gases Cromatografa lquida en fase inversa Cromatografa lquida en fase normal Cromatografa lquida de intercambio inico Cromatografa lquida de exclusin Cromatografa lquida de adsorcin Cromatografa de fluidos supercrticos

Fase mvil Lquido Lquido Gas Lquido (polar) Lquido (menos polar) Lquido (polar)

Fase estacionaria Lquido ( molculas de agua contenidas en la celulosa del papel ) Slido Slido o lquido Slido o lquido (menos polar) Slido o lquido (polar)

Slido

Lquido

Slido

Lquido

Slido

Lquido

Slido

Cromatografa en papel
Ejemplo de cromatografa en papel de clorofila (obtenida de hojas de espinaca) con un disolvente orgnico. La cromatografa en papel es un proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar anlisiscualitativos ya que pese a no ser una tcnica muy potente no requiere de ningn tipo de equipamiento.

La fase estacionaria est constituida simplemente por una tira de papel de filtro. La muestra se deposita en un extremo colocando pequeas gotas de la solucin y evaporando el disolvente. Luego el disolvente empleado como fase mvil se hace ascender por capilaridad. Esto es, se coloca la tira de papel verticalmente y con la muestra del lado de abajo dentro de un recipiente que contiene fase mvil en el fondo. Despus de unos minutos cuando el disolvente deja de ascender o ha llegado al extremo se retira el papel y seca. Si el disolvente elegido fue adecuado y las sustancias tienen color propio se vern las manchas de distinto color separadas. Cuando los componentes no tienen color propio el papel se somete a procesos de revelado. Hay varios factores de los cuales depende una cromatografa eficaz: la eleccin del disolvente y la del papel de filtro Cromatografa en capa fina La cromatografa en capa fina se basa en la preparacin de una capa, uniforme, de un absorbente mantenido sobre una placa, la cual puede ser de vidrio, aluminio u otro soporte. Los requisitos son un absorbente, placas , un dispositivo que mantenga las placas durante la extensin, otro para aplicar la capa de absorbente, y una cmara en la que se desarrollen las placas cubiertas.

La fase mvil es lquida y la fase estacionaria consiste en un slido. La fase estacionaria ser un componente polar y el eluyente ser por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad sern los menos polares. Polaridad de los compuestos orgnicos en orden creciente: hidrocarburos < olefinas < fluor < cloro < nitro < aldehdo aldehdo < ester < alcohol < cetonas < aminas < cidos < amidas

Cromatografa de gases

La cromatografa de gases es una tcnica cromatogrfica en la que la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatogrfica. La elucin se produce por el flujo de una fase mvil

de gas inerte. A diferencia de los otros tipos de cromatografa, la fase mvil no interacciona con las molculas del analito; su nica funcin es la de transportar el analito a travs de la columna. Existen dos tipos de cromatografa de gases (GC): la cromatografa gas-slido (GSC) y la cromatografa gas-lquido (GLC), siendo esta ltima la que se utiliza ms ampliamente, y que se puede llamar simplemente cromatografa de gases (GC). En la GSC la fase estacionaria es slida y la retencin de los analitos en ella se produce mediante el proceso de adsorcin. Precisamente este proceso de adsorcin, que no es lineal, es el que ha provocado que este tipo de cromatografa tenga aplicacin limitada, ya que la retencin del analito sobre la superficie es semipermanente y se obtienen picos de elucin con colas. Su nica aplicacin es la separacin de especies gaseosas de bajo peso molecular. La GLC utiliza como fase estacionaria molculas de lquido inmovilizadas sobre la superficie de un slido inerte. La GC se lleva a cabo en un cromatgrafo de gases. ste consta de diversos componentes como el gas portador, el sistema de inyeccin de muestra, la columna (generalmente dentro de un horno), y el detector.

Diagrama de un cromatgrafo de gases

Cromatografa lquida

La Cromatografa lquida, tambin conocida como Cromatografa de lquidos, es una tcnica de separacin y no debe confundirse con una tcnica cuantitativa o cualitativa de anlisis. Es una de las tcnicas analticas ampliamente utilizada, la cual permite separar fsicamente los distintos componentes de una solucin por la absorcin selectiva de los constituyentes de una mezcla. En toda cromatografa existe un contacto entre dos fases, una fija que suele llamarse fase estacionaria, y una mvil (fase mvil) que fluye permanente durante el anlisis, y que en este caso es un lquido o mezcla de varios lquidos. La fase estacionaria por su parte puede ser almina, slice o resinas de intercambio inico que se encuentran disponibles en el mercado. Los intercambiadores inicos son matrices slidas que contienen sitios activos (tambin llamados grupos ionognicos) con carga electrosttica (positiva o negativa). De esta forma, la muestra queda retenida sobre el soporte slido por afinidad electrosttica. Dependiendo de la relacin carga/tamao unos constituyentes de la mezcla sern retenidos con mayor fuerza sobre el soporte slido que otros, lo que provocar su separacin. Las sustancias que permanecen ms tiempo libres en la fase mvil, avanzan ms rpidamente con el fluir de la misma y las que quedan ms unidas a la fase estacionaria o retenidas avanzan menos y por tanto tardarn ms en salir o fluir. ste es el principio fundamental de la cromatografa. Un ejemplo notable es la cromatografa de intercambio inico. Las columnas ms utilizadas son las de slice. cromatografa de intercambio inico
La cromatografa de intercambio inico (o cromatografa inica) es un proceso que permite la separacin de iones y molculas polares basadas en las propiedades de carga de las molculas. Puede ser usada en casi cualquier tipo de molcula cargada, incluyendo grandes protenas, pequeos nucletidos y aminocidos. La solucin que debe inyectarse es usualmente llamada "muestra" y los componentes separados individualmente son llamados analitos. Es usada a menudo en purificacin de protenas, anlisis de agua o control de calidad.

Cromatografa de fluidos supercrticos

La cromatografa de fluidos supercrticos (SFC) es una tcnica hbrida entre la cromatografa de gases (GC) y la HPLC, que combina lo mejor de ambas tcnicas. Esta tcnica es importante porque permite la separacin de mezclas en las que no es adecuada la aplicacin de la GC ni de la HPLC. En concreto, se aplica a compuestos no voltiles o trmicamente inestables que no pueden ser separados mediante GC, o aquellos que contienen grupos funcionales que imposibilitan su deteccin en HPLC.