INTRODUCCION

La PCR cuantitativa se realiza en un termociclador con capacidad de hacer incidir sobre cada muestra un haz de luz de una longitud de onda determinada y de detectar la fluorescencia emitida por el fluorocromo excitado. Este termociclador es un aparato con capacidad para calentar y enfriar rpidamente las muestras, de modo que se aprovechen las cualidades fisicoqumicas de loscidos nucleicos y las enzimticas de el ADN polimerasa. El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de cambios de temperatura que se repiten en 25 - 40 veces, llamados ciclos, donde cada uno posee un mnimo de tres etapas: la primero, en torno a los 95 C, permite la separacin de los cidos nucleicos de doble cadena; el segundo, a una temperatura en torno a los 50-60 C, permite el alineamiento de los cebadores al ADN molde; el tercero, a 68 - 72 C, facilita la polimerizacin por parte de la ADN polimerasa. Debido al pequeo tamao de los fragmentos amplificados usualmente en este tipo de PCR puede omitirse el ltimo paso, pues la enzima es capaz de amplificar durante la rampa entre la temperatura de alineamiento y la de desnaturalizacin. Adems, algunos termocicladores aaden a cada ciclo unos segundos a otra temperatura, por ejemplo 80 C, a fin de reducir el ruido por la presencia de dmeros de cebadores cuando se emplea un colorante inespecfico. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad de parmetros, como: la enzima usada para la sntesis de ADN, la concentracin de iones divalentes y desoxirribonucletidos (dNTPs) en la reaccin y la temperatura de unin de los cebadores.

CLASIFICACIN
Podemos clasificar las tcnicas de PCR cuantitativa segn el empleo de fluorocromos no especficos o bien de sondas moleculares dependientes de la secuencia.

En las tcnicas basadas en fluorocromos inespecficos se detecta la generacin exponencial de ADN de doble cadena empleando un fluorocromo que se une inespecficamente a aqul. Un ejemplo de colorante que permite esta deteccin es el SYBR Green), que, excitado mediante luz azul (max = 488 nm) emite luz verde (max = 522 nm).7 Posee la vevntaja de requerir slo un par de cebadores para efectuar la amplificacin, lo que abarata su coste; sin embargo, slo es posible amplificar un producto en cada reaccin. Las tcnicas basadas en sondas especficas utilizan al menos un oligonucletido marcado fluorescentemente. Tpicamente esta sonda est unida a dos fluorocromos e hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo (forward) y el inverso (reverse); esto es, en el amplicn. De este modo, cuando la sonda est intacta, presentan una transferencia energtica de fluorescencia por resonancia (FRET). Dicha FRET no se produce cuando los dos fluorocromos estn distantes debido a la degradacin de la sonda mediante la actividad 5'-3' exonucleasa de la ADN polimerasa, o bien debido a la separacin fsica de los fluorocromos por un cambio en la conformacin de la sonda. Esto permite monitorizar el cambio del patrn de fluorescencia y deducir el nivel de amplificacin del gen.

ANLISIS DE TEMPERATURA DE FUSIN

Distintas curvas de fusin de varias productos de PCR (en colores distintos). Se observan reacciones con amplificacin de un producto especfico (rosa, azul) y otras con resultado negativo (verde, naranja); se seala con una flecha el pico de fusin dado para los dmeros de los cebadores, diferente al esperado para el producto de amplificacin en cuestin. La Q-PCR permite, empleando un fluorocromo de unin inespecfica a la doble hebra de ADN, generalmente SYBR Green, identificar fragmentos amplificados de DNA concretos a partir de la temperatura de fusin (tambin denominado valor Tm, del ingls melting temperature), que es especfica para el fragmento amplificado que se est buscando; y cuyos resultados son obtenidos a partir de la observacin de la curva de disociacin de las muestras de DNA analizadas.9

Ello permite, a diferencia de PCR convencional, prescindir del posterior empleo de tcnicas de electroforesis para la visualizacin de los resultados de todas las muestras. Porque, pese a que la PCR cuantitativa es una tcnica cintica, suele ser evaluada a punto final. As esta tcnica lleva a la obtencin de resultados ms rpidos, y/o en el menos gasto de reactivos empleados en las tcnicas de electroforesis; si segn el criterio del investigador, posteriormente es necesario correr en geles solo las muestras cuyo resultados previos en el PCR en tiempo real se pueden considerar dudosos y/o para ratificar resultados en muestras positivas.

CUANTIFICACIN DE LA EXPRESIN GNICA

La cuantificacin puede realizarse en trminos absolutos o relativos. En el primer caso, la estrategia es relacionar la seal de amplificacin obtenida con el contenido en ADN empleando una curva de calibrado; para este enfoque es vital que la PCR de la muestra y de los elementos de la recta de calibrado posean una misma eficiencia de amplificacin. En el segundo caso, se expresa el cambio en los niveles de expresin de ARN mensajero(ARNm) interpretado como ADN complementario (ADNc, generado por retrotranscripcin del ARNm); esta cuantificacin relativa es ms fcil de realizar, puesto que no requiere curva de calibrado, y se sustenta en la comparacin entre el nivel de expresin del gen a estudiar versus un gen control (tambin llamado de referencia, interno o normalizador o, en ingls, housekeeping gene). Por tanto, en la cuantificacin relativa es irrelevante en qu unidades se expresa la cuantificacin, y sus resultados son comparables entre mltiples experimentos de RT-Q-PCR. De hecho, el propsito de emplear uno o ms genes de normalizacin es corregir la variacin no especfica, como las diferencias en la cantidad y calidad del ARN empleado, que pueden afectar a las eficiencias de retrotranscripcin y de PCR. No obstante, el aspecto crucial es que la estabilidad del gen de referencia sea una realidad. La seleccin de los genes internos se ha realizado clsicamente en Biologa Molecular analizando la estabilidad de la expresin en estudios cualitativos o de baja sensibilidad, como el examen visual de geles de ARN, densitometra de Northern blots o PCR semicuantitativa (PCR mimic). En plena era de la genmica, es posible realizar una aproximacin a gran escala empleando loschips de ADN para muchos organismos. No obstante, se ha descrito que la mayora de los genes empleados como normalizadores en la cuantificacin de la expresin de ARN mensajero varan segn las condiciones experimentales. Por ello, es preciso realizar un estudio metodolgico previo a emplear a fin de seleccionar, con ayuda de herramientas estadsticas, los ms apropiados.

MODELIZACIN
A diferencia de la PCR de punto final (PCR convencional), la PCR en tiempo real permite cuantificar el nivel de producto obtenido en cualquier momento de la amplificacin mediante la seal de fluorescencia (en realidad, mediante su nivel sobre un umbral). Los valores de fluorescencia, expresados como logaritmos a fin de estudiar fcilmente la fase exponencial de amplificacin, que aparece como una lnea recta al representar grficamente el logaritmo de la fluorescencia frente al nmero de ciclo; este segmento, denominado segmento cuantificable, permite valorar la cantidad de ADN inicial.

Grfica de la Izquierda (A)

Las cinticas de tres PCR de tres muestras distintas (K, L y M) de concentraciones de ADN inicial decrecientes (concretamente, se reducen a la dcima parte cada vez) se representan en un grfico del logaritmo de la fluorescencia (en ordenadas) frente al ciclo de PCR (en abscisas). No se representan las fases previas a la exponencial. 1. Zona de segmentos cuantificables de cada muestra. En gris la zona de saturacin, fuera ya de la zona lineal. 2. Cada uno de los segmentos cuantificables permite definir una ecuacin de la recta de tipo U=ax+b, que permite modelizar la eficiencia de la amplificacin (la pendiente a) y, mediante la ordenada en el origen b, la cantidad de ADN en el ciclo 0, al menos tericamente. 3. Si bien, puesto que las medidas experimentales conllevan un error, dicha cuantificacin arrastra un error estocstico. Si las muestras de concentraciones K, L y M fueran amplificadas durante ms ciclos, se obtendran cinticas diferentes, si bien bastante prximas (ser representan sus segmentos cuantificables en rojo, rosa y naranja). Cada una de estas medidas permite establecer una nueva ecuacin, representada en puntos del mismo color. Las ordenadas en el origen ( b) diferentes son tambin medidas. As, podemos evaluar el error o incertidumbre de la tcnica evaluando las diferencias entre las pendientes b (EK, EL, EM). 4. No obstante, dicha imprecisin en la medida vara para cada muestra (EK es inferior a EL, que es, a su vez, ms pequea que EM). Una proyeccin de la ecuacin de la derecha sobre eleje de

ordenadas o una de sus paralelas dar lugar a un error dependiente de la concentracin de ADN inicial.

Grfica de la derecha (B)

1. Las ecuaciones obtenidas segn los segmentos cuantificables pueden extrapolarse hacia el eje de abscisas, aunque se trate de un valor carente de significado bioqumico sino simplemente matemtico. 2. Los ngulos que modelizan el error experimental (lneas de puntos rojos, naranjas o rosas) permiten definir las nuevas incertidumbres EK, EL y EM. Estas incertidumbres son mayores que en la grfica de la izquierda (grfica A), si bien se mantiene su proporcionalidad. Por tanto, sobre la medida ahora generamos un error independiente de la concentracin de ADN inicial. 3. Es posible proyectar rectas paralelas entre s, sobre la recta definida sobre una paralela al eje de abscisas de modo que se corten los segmentos cuantificables por la mitad. Este segmento es denominado umbral de deteccin. 4. Los valores en X (nmero de ciclos) de estas intersecciones son denominados CT (o Ct, del ingls cycle threshold, cuya traduccin es ciclo umbral), aunque tambin pueden llamarse CP (del ingls crossing point, o punto de cruce). Se trata, pues, de los valores matemticos definidos sobre el espacio de reales positivos y no de los enteros positivos (aunque una fraccin del ciclo no posea realidad experimental). Estos valores, inversamente proporcionales a la cantidad de ADN inicial, suelen poseer una incertidumbre sobre la medida mnima, en general inferior al 5%.

RECTAS DE CALIBRADO
Como se indicaba en el apartado de cuantificacin, emplear el CT, como valor matemtico, permite obtener resultados fiables, pero este hecho puede no ser explotado directamente. A fin de conocer la cantidad de ADN inicial, es preciso pues realizar nuevas transformaciones matemticas que requieren conocer la eficiencia de PCR, que suele determinarse gracias a una recta de calibrado.

Grfica de la izquierda (A) Las nuevas muestras F, G, H, I, J, K, L, M y N, de concentracin de ADN inicial decreciente (un orden de magnitud cada vez) son amplificadas mediante PCR en un mismo experimento. Cada cintica permite determinar un CT para cada uno (es decir, un nmero en referencia a un ciclo en concreto). Se representan las concentraciones de ADN como nmero de molculas por tubo (en este caso, F posee 70 millones y N, 0,7).

Los rendimientos representados corresponden a n reacciones, cuya fiabilidad se debe a la existencia de rplicas independientes en la reaccin, personal y reactivos. La fluorescencia se muestra en unidades arbitrarias y el ruido de fondo ha sido limpiado. Cabe destacar que la muestra Nn no ha amplificado en absoluto. Los valores CT medios en funcin de la cantidad de ADN inicial de todas las rplicas pueden representarse en un grfico semilogartmico. De este modo, la recta de calibrado para estos valores medios puede definirse gracias a una regresin lineal con un determinado coeficiente de correlacin (r2) que, para ser considerado de calidad, debe poseer un valor de 0,9999. No obstante, han de representarse los errores, generalmente definidos segn el rango de valores obtenidos para un punto

Con estos datos, es posible estudiar: 1. La fase cuantitativa y detectable de la PCR. En la cual todas las muestras son detectables y se alinean en todos sus puntos con su recta particular. Generalmente, esta fase comprende las concentraciones de ADN iniciales en torno a 102 o 108 copias del cido nucleico. Por debajo de estas cifras los fenmenos estocsticos alteran perceptiblemente los resultados, si bien es posible compensarlos con un alto nmero de rplicas en las medidas. Por encima de estos valores, el ruido de fondo es suficientemente bajo como para no poder ser determinado; en este caso, es posible compensar esta deficiencia mediante un protocolo de PCR con una eficiencia muy alta o, de forma ms simple, diluyendo la muestra inicial. 2. La fase a veces detectable pero no cuantitativa de la PCR. Que comprende las concentraciones de ADN inicial entre una copia y la decena de copias. El porcentaje de muestras medidas, en el ejemplo de la grfica, se indica mediante las concentraciones M y N, o sea 83% para una concentracin media de siete copias y 28% cuando tres de los cuatro tubos contienen una copia (0,7 de concentracin, o -0,15 en logaritmo). La dispersin de las medidas, y por ello el margen de error, se incrementan perceptiblemente. Ntese que un buen nmero de medidas M y N no se alinean con su

recta particular, aunque no lo hagan por motivos de azar. Por tanto, slo replicando ms veces las medidas es posible determinar con precisin esta fase. 3. La recta de calibrado, por tanto, representada en un grfico semilogartmico da lugar a una recta definida por la frmula Y = aX + B donde: Y es el CT medido por el termociclador. La pendiente a deriva de la eficiencia de la PCR, y puede ser calculada mediante la ecuacin

Ntese que en el esquema se representa el caso ms frecuente en el que la concentracin est expresada en logaritmos decimales. Esta pendiente est a menudo considerada como una constante de amplificacin para cada gen, par de cebadores y condicin de PCR particular. Por ello esta pendiente o eficiencia de amplificacin se emplea para cuantificar en la PCR cuantitativa. X es la concentracin de ADN inicial expresada en logaritmo de copias/tubo, ng/L, unidades arbitrarias, etc. B es un punto matemtico sin realidad experimental (log 0 = 1/) que, sin embargo, puede ser empleado para calibrar cada experimento de PCR (los runs, en ingls) con sus semejantes. De este modo, si las rectas de calibrado lo fueron por su interseccin al origen B, la dispersin ser menor, salvo para los puntos M y N. 1. La recta de regresin no pasa por el punto central de la dispersin en cada medida para las concentraciones M y N, pero s segn la pendiente y un factor de amortiguacin. Esto es: si consideramos CT medios para L y N sern modelizados de mejor manera mediante un polinomio de segundo grado. El software de algunos termocicladores permite tener en cuenta esta amortiguacin, si bien hay que tener en cuenta que: Dicha amortiguacin es extremadamente variable de una recta de calibrado a otra, y la correccin que se modeliza no

corresponde probablemente a aqulla que pasa por la muestra cuantificada. El

software comercial lo modeliza para una sola muestra. La imprecisin en la cuantificacin a estas concentraciones es tan importante que la modelizacin de la amortiguacin puede ser necesaria. Esta amortiguacin corresponde, cuando se dibujan las rectas, a una reduccin de la pendiente luego de un aumento de la eficacia de PCR, as que el incremento de los efectos estocsticos puede reducirse. Ntese adems que esta amortiguacin se define principalmente segn la concentracin ms baja (N, 0,7 copias en el ejemplo). O lo que es lo mismo, no podr realizarse amplificacin alguna si no se tiene al menos una molcula completa del ADN a amplificar. El sesgo producido en la distribucin gaussiana del error puede provocar esta aparicin de datos extraos o amortiguaciones medias. Luego la recta de calibrado permite una cuantificacin para un protocolo experimental dado pero hay que tener en cuenta que existen multitud de fuentes de error potenciales, como diferencias de composicin qumica del tampn de reaccin, de las muestras (presencia de protenas, ARN, etc) e incluso del diluyente (el agua, generalmente).

ENFOQUES

Como se indicaba anteriormente, es posible por tanto cuantificar la expresin gnica en trminos absolutos como en relativos (es decir, por comparacin con la expresin de otro gen). En el segundo caso, es de vital importancia seleccionar como gen estndar aqul que cuya expresin realmente no vare cuando se somete al individuo al tratamiento experimental cuyo efecto en la transcripcin se desea estudiar (por ejemplo, un estrs ambiental,17 bitico18 o tipo de tejido19 ). Cuantificacin absoluta Que se basa en las caractersticas de la fase exponencial de la curva sigmoide de emisin de fluorescencia.20 Responde a la ecuacin:

donde Q es la cantidad de ADN, n corresponde al nmero de ciclo, o es el ciclo de partida y E la eficiencia de la reaccin.Luego en el ciclo en el que se sobrepasa el nivel umbral (esto es, el CT), se dice que:

Cuantificacin relativa Que establece una relacin R entre la cantidad de ADN inicial de una muestra respecto de la de un testigo, que se asume se expresa de forma invariable e independiente del tratamiento. En su deteccin tenemos que: sustituyendo de (1) tenemos que y, por tanto

Desde 2002 existe una tendencia a emplear varios genes normalizadores para realizar una cuantificacin relativa fiable; de este modo, se generan factores de normalizacin que ponderan de algn modo el impacto de cada gen interno; una aproximacin comn se basa en el empleo de medias geomtricas de estos genes normalizadores.