Reao Polimersica em Cadeia (PCR)

PCR - consiste em fazer cpias de DNA in vitro, usando os elementos bsicos do processo de replicao natural do DNA.

Polymerase Chain Reaction

PCR is a method for rapid amplification of specific target segments of DNA or cDNA in vitro replication of DNA or cDNA PCR products are called amplicons

PCR Amplifica uma Seqncia Alvo

Seqncia Alvo Replicao in vitro do DNA DNA DNA Supercoiled Alternncia de temperaturas a cada ciclo: DESNATURAO ANELAMENTO Cromossomo POLIMERIZAO

Alternncia de temperaturas a cada ciclo

1. Denature: 94 C - 96 C Separate double helix template into two single strands 2. Anneal: 37 C - 65 C Primers bind to specific initiation sites on single 3. Extension: 72 C DNA polymerase uses dNTPs to stranded DNA add dNMP units to the growing strands, according to the base pairing rule; polimerization.

Evoluo da PCR
1985
Primeira publicao - Science Cetus Corporation R. Saiki, S. Scharf, F. Faloona, K. Mullis, G. Horn, H. Erlichand N. Arnheim Amplificao enzimtica da -globina para o diagnstico da anemia falciforme

Evoluo da PCR
1989
Taq DNA polimerase termoestvel Automao na PCR Molcula do ano - Science. Hoffmann-La Roche Inc. & Cetus Desenvolvimento da PCR em diagnstico

Lago do Yellowstone National Park

Primeiro ciclo da PCR

lvo Seqncia A

Primer 2

Primer 1

Denaturao pelo calor 95C - 30 a 50 s

Anelamento dos primers

lvo 55 - 64C Seqncia A

3 Primer 2 5

Primer 1 DNA Polymerase

Extenso

Aps sucessivos ciclos

No. de Ciclos
1 cycle = 2 Amplicon

No. Amplicon Cpias por Alvo 2 4 8 16 32 64 1,048,576 1,073,741,824

1 2 3 4

2 cycle = 4 Amplicon

3 cycle = 8 Amplicon 4 cycle = 16 Amplicon

5 cycle = 32 Amplicon

5 6 20

6 cycle = 64 Amplicon

7 cycle = 128 Amplicon

30

Polimerizao feita por uma DNA polimerase termoestvel = sntese exponencial de molculas de DNA. So utilizados dois primers- que delimitam o segmento amplificado

Cada uma das novas fitas de DNA extendidas a partir dos primers serve como template para sntese de uma nova fita. Isso garante o aumento exponencial do nmero de novas fitas. Todas as fitas de DNA sintetizadas durante a PCR tm a sequncia dos primers na extremidade 5 e a seqncia complementar aos primers na posio 3
5 3
primers

3 5
complemento dos primers

POLIMERIZAO: 5

Todas as DNA-POLIMERASES requerem para seu funcionamento: Molcula de DNA - molde Primer de oligonucleotdeo Magnsio dNTPs

Qualquer seqncia alvo de DNA pode ser amplificada por PCR

A localizao da seqncia alvo feita pelos primers. Oligonucleotdeos com 20 - 24 bases so usualmente seletivos o suficiente para localizar um stio nico em um genoma de alta complexidade, tal como o genoma humano. O pareamento dos primers com a seqncia alvo se faz pelo estabelecimento de pontes de hidrognio, segundo o pareamento convencional descrito por Watson e Crick: A T C G

Componentes da PCR

Mg

2+

DNA Polymerase

dCTP dGTP dTTP dATP Primer

PCR Buffer and Salt

Buffer Salt

Provides optimal ionic strength for maximum enzyme activity Maintains optimal pH for enzyme activity Influences DNA hybridization kinetics or Tm of the primers

Magnesium Ions Are Needed To Stimulate Taq Polymerase

Taq
Mg

Mg++ Range 1 - 4 mM

1 g de DNA genmico tem 3 x 105 cpias do genoma de mamferos

No = nmero inicial de cpias de DNA-dupla fita (template) Nf = nmero final de cpias da seqncia alvo (dupla fita) Y = eficincia da extenso do primer por ciclo n = nmero de ciclos

Interferncia da eficincia da amplificao sobre a quantidade final do produto aps 25 ciclos

A eficncia mdia de amplificao 0,85. Pequenas alteraes para menos podem fazer com que o produto no seja detectado.

Cintica da PCR
- Fase de screening - ciclos iniciais Os primers procuram o template de DNA com as seqncias que lhes so complementares (agem como as sondas nos experimentos de hibridizao). Encontrar a seqncia complementar no to difcil, pois os primers esto em considervel excesso em relao ao template. - Fase intermediria O processo de amplificao est ocorrendo, levando ao acmulo exponencial do fragmento de DNA. O pareamento do primer com a seqncia que lhe complementar j est bem facilitada, pois j existem vrias cpias das seqncias alvo. - Fase tardia ou fase de plat A amplificao j sub-tima devido limitao dos reagentes e competio dos produtos gerados com os primers disponveis.

Plateau Effect

O aumento exponencial do no de cpias ocorre at um determinado no de ciclos, que ser varivel de reao para reao.
As causas do plat so vrias:
- Perda da atividade da enzima - Todas as enzimas disponveis esto ocupadas com a sntese de DNA - Acmulo de produtos amplificados que tendem a parear entre s, em detrimento do pareamento com os primers. Aumenta possibilidade de amplificao de produtos inespecficos. - Gasto dos reagentes, especialmente de primers, mas tambm de deoxinucleotdeos. - Acmulo de pirofosfato, resultante das ligaes fosfodisteres - Competio com outros produtos que vinham sendo amplificados com eficincia menor mas tambm foram se acumulando, etc

Taq DNA Polymerase

1.Native Taq DNA Polymerase
Thermo-stable DNA polymerase Isolated from Thermus aquaticus

2.AmpliTaq DNA Polymerase

Recombinant enzyme Modified form of Taq DNA Polymerase gene expressed in E. coli

Extension Rate of AmpliTaq

Temperature 75 C 55 C 37 C 22 C Extension Rate 75 nucleotides/sec 24 nucleotides/sec 1.5 nucleotides/sec 0.25 nucleotides/sec

Fidelity in PCR
Fidelity
Accuracy of replication

Fidelity in PCR
High % of products have sequence identical to target

High fidelity PCR

Only necessary if one intends to clone individual PCR products

Taq Misincorporation Rate

1 error/50-100,000 bases incorporated at 70oC

Gene 108: 1 (1991)

PCR Misincorporation: a Two-Step Process

Misinsertion usually results in termination.

Misextension results in full-length product that amplifies as efficiently as wild type.

Conditions Affecting Fidelity

Increase Fidelity
[dNTP] [Mg++] Tempanneal [Enzyme] or ext. time # cycles
balanced 40-50M each 1:1 with dNTP

Decrease Fidelity
1-2mM each; imbalanced 6-8mM Mg++

The Optimization
Fidelity Yield

Optimization - Why?
Optimize PCR amplification to:
Increase yield of the reaction (efficiency) Increase specificity (especially when high background exists) Improve reproducibility (i.e., well-to-well, runto-run)

Optimization Parameters To Be Considered

Primer Design Cycling Conditions Reagent Concentrations Hot-start Buffer Components

Primer Design
15 - 30 nucleotides in complementary region Random base distribution with average G+C content Base pairing to target at 3' end is critical Avoid long A+T and G+C-rich regions if possible Check for internal secondary structure Avoid primer complementarities - specially at the 3' ends (Primer-dimers) Use computer program to determine uniqueness of primers Assure that primers in a set have annealing temperature within 2 C - 3 C of each other

Primer-Dimer
Product Approximately the Length of the Two Primers Added Together

Post-Primer Design Considerations

Primer Tm Calculation Annealing Temperature Selection Three Temperature vs. Two Temperature PCR Annealing Temperature Estimate For Primers < 20 bases:
Tm = 4C * (#Gs + #Cs) + 2C * (#As + #Ts) Tanneal = Annealing temperature = Tm - 4 C

Annealing Temp Optimization

Tm - 4 C Anneal Temp

More Specificity

Less Specificity

Annealing Temp Optimization

touch down PCR
Expl: variar a temperatura de annealing entre 65oC e 55oC, reduzindo a temperatura em 1oC a cada 2 ciclos, durante 20 ciclos. Fazer mais 10 ciclos a 55oC.

PCR gradiente
Distribuio de temperaturas pelo bloco, baseada em 2 parmetros: Temp. mdia e faixa de variao (expl. 61oC 10oC).

Cycling Conditions Three-Temperature PCR

Two-Temperature PCR

Requirements Primer Tm > 59 C

Advantages High Specificity Short Cycling Time

Standard Reaction Concentrations Using AmpliTaq DNA Polymerase

PCR Reagents
Reaction Volume Enzyme units [MgCl2] [dNTPs] [primers] 1X Buffer Genomic DNA Template

Standard Concentrations
50 L 1.25 units 1.0 - 4.0 mM 200 M each 0.2 - 1.0 M each 10 mM Tris-HCl, pH 8.3 50 mM KCl 1-500 ng (300-150000 copies)

Mg++ Optimization
Mg++

Mg++ range 1 4mM

Taq

Mg++
++ ++

Taq

- - - - - -

PCR Primer Concentrations

Normal

0.1 - 1.0M
More Specificity Less yield Less Specificity More yield

Hot Start: A Method to Increase Pre-PCR Specificity

What is hot start?

Hot Start PCR is a simple modification of the original PCR process in which the amplification reaction is started at an elevated temperature.

AmpliTaq Gold/ Taq Platinum Hot Start PCR

Modified, inactive AmpliTaq, 94 kDa Heat restores the polymerase activity (95C5-12min) Uses 1X PCR Gold Buffer with appropriately optimized Mg2+ concentration Room temperature reaction setup

Hot Start: A Method to Increase Pre-PCR Specificity

Room Temp Setup Hot Start

115 bp band

10 Copy HIV in 1 ug HP DNA

Sources Of Non-Specificity
Mispriming (either correct or wrong size, wrong intervening sequence)
MgCl2 too high Annealing temperature too low First few cycles

Pre-PCR Mispriming
Necessary conditions
Abundant ssDNA (primers) in test sample Pre-PCR incubation of all reactants at permissive temperature Significant DNA polymerase activity at permissive temperature

Remedy: Hot Start

Hot Start Procedures To Increase PCR Specificity

Manual Hot Start PCR AmpliWax AmpliTaq Gold/ Taq Platinum

Hot Start Technique with AmpliWax PCR Gems

Manual Hot Start PCR

Manual Hot Start PCR Tube Reagent subset 4-25 C Transfer to cycler Heat to 60-80 C Missing Reagent 75-80 C

Disadvantages Labor intensive May led to contamination

Amplitaq
Cycle

AmpliTaq Gold Taq Platinum

AmpliTaq Gold PCR Tube Reagents

+ Taq
4-25 C Transfer to cycler

Heat activation
Cycle

Advantages Easy room temperature setup Enzyme activates by heat before the first cycle

Traditional PCR
100 80
specific product

Temperature (C)

60

40

20

Time

Hot Start PCR

100

10 min activation

80

specific product

Temperature (C)

60

40

20

Time

Nested - PCR
Alternativa para melhorar a especificidade e a sensibilidade da PCR.

Multiplex PCR
Screening for genetic diseases
Ex: Duchenne Muscular Dystrophy

Screening for purposes of viral identification

Ex: Human Papilloma Virus

Analyzing mutations in cancer research

Ex: Research on the p53 Gene

Detecting polymorphisms for human identification

Ex: AmpliType PM PCR Amplification and Typing Kit

Deteco e tipagem de HPV

PCR multiplex que amplifica um fragmento de 450 pb - HPVs em geral e um outro de 250 pb referente aos vrus oncognicos

450pb

250pb

Regio L1

RT-PCR
DNA- Polimerase no usa RNA como template Primeiro necessrio fazer a transcrio reversa do RNA em cDNA RT: Reverse Transcriptase Aps a transcrio reversa, prossegue-se normalmente com a PCR

Diagnstico e Tipagem de Vrus da Dengue

RT-PCR

Semi-Nested PCR

482pb 290pb

111pb 111pb 290pb 482pb

Pequenas quantidades de DNA, dispensa conhecimento prvio de seqncias alvo, nico iniciador pequeno (~10 bases) de seqncia inespecfica, baixa estringncia.

Randomly Amplified Polymorphic DNA RAPD

Fingerprint de DNA

RAPD e Tipagem de Cryptococcus

Coeficiente de Jaccard/UPGMA
(Nishikawa, M.M.)

Deteco de produtos amplificados

Eletroforese em gel de agarose aps colorao com brometo de etdio Eletroforese em gel de poliacrilamida revelado pela prata (PCR + RFLP) Hibridizao com sondas marcadas fornece um aumento na sensibilidade e especificidade da amplificao PCR + deteco colorimtrica em placas de microtitulao

Ensaio colorimtrico de deteco por hibridizao com sondas de captura

ON IC L P AM

Denaturao

Denaturao das fitas

Biotina Hibridizao Sonda ligada placa

AMPLICON

BSA

BSA

Revelao por sistema colorimtrico (Conjugado Avidina-Peroxidade, Substrato)

Avidina-peroxidase
AMPLICON

Biotina Tetrametilbenzidina (TMB) Substrato

BSA

Microplaca

AMPLICON

Perxido de Hidrognio

Leitura da Absorbncia (OD)

Sonda
BSA

Inibio da PCR
Contaminates da amostra de DNA podem inibir fortemente a reao de PCR.

Inibidores da Polimerase
- Fenol - Proteinase K - Agentes quelantes em excesso (EDTA) - Hemoglobina e outras protenas das hemcias - SDS (Sodium Dodecyl Sulphate) - Elevadas concentraes de sal

Contamination Control

PCR Carryover
No Carryover PCR Carryover

"pos"

"pos"

(+)

(+)

"neg"

"neg"

(-)
4687C04

(+)

To avoid PCR Carryover Contamination

Physical separation of pre- and post-PCR amplifications Use filter-plugged pipette tips Aliquot reagents into daily use amounts Judicious selection of number and type controls Small number of low copy positive controls Large number of reagent controls Large number of negative controls Replicate samples UV Treatment UNG / dUTP

Designated DNA Work Areas Showing Activities Within Each Area

DNA Extraction Work Area Sample digestion Organic extraction Centricon microconcentration PCR Setup Work Area Combining reaction components

Amplified DNA Work Area DNA amplification - cycling

HOLLAND et al. 1991: descreveram pela 1a vez a

atividade de SNTESE de DNA associada atividade EXONUCLESICA 5 3da Taq DNA polimerase

Model of 5
5

3 Nuclease Activity
3

Quantificao em tempo real

LEE, 1993: explorou esta caracterstica da enzima para criar o sistema de sondas TaqMan
TaqMan - 5 Nuclease PCR
Polymerization
Probe

TaqMan Probe
R Q

Strand displacement

TaqMan Fluorescent Dyes Passive Reference

ROX

Reporter Quencher

Cleavage

Polymerization completed

Reporter FAM TET PR JOE R HEX VIC Quencher

TAMRA

Quantificao em tempo real

Taq DNA Pol

Cada vez que sintetisada uma nova fita h aumento da intensidade da emisso fluorescente

Quantificao em tempo real

Detector de seqncias a laser, automatizado

O ciclador trmico ABI Prism 7700 est equipado com cabos de fibra ptica que direcionam a luz do laser para cada um dos tubos contendo as amostras

O sistema coleta a emisso fluorescente entre 500 e 600 nm em cada um dos 96 poos, em intervalos de 3 a 10segs. Os cabos levam a emisso fluorescente de volta cmara CCD.

Representao de um plot da amplificao em tempo real

O plot da amplificao mostra 3 fases distintas:

h linha basal: no houve clivagem suficente do corante-reprter para que se possa detectar a fluorescncia h fase log: a quantidade de amplicon dobra a cada ciclo h fase plat: no h mais aumento no nmero de amplicons

Valor de CT inversamente proporcional ao logaritmo do nmero de molculas alvo inicial

Ct Ct No ponto referido como Ct a fluorescncia aumenta acima da linha basal, de forma exponencial. Amostras mais concentradas (com maior no de templates iniciais) mostram valores menores de Ct. Esse fenmeno criou um novo paradigma para quantificao por PCR: avaliado o momento de aparecimento do sinal, e no quanto sinal gerado aps um dado nmero de ciclos.

Curva padro de quantificao

O sistema TaqMan tambm utilizado para fazer discriminao e quantificao allica

Sonda que faz o pareamento com mismatch no tem estabilidade no local e no clivada pela Taq Pol

Molecular Beacons DNA Probes

A T CAT C

T G A A A C

GC GG GC AT AT C G C G

C C T C C A

O oligonucleotdeo usado como probe sintetizado de modo a possibilitar a formao de uma estrutura secundria entre as extremidade 5e 3
CGT T TCAT AGT AGGGAGGT A
CGCAAAGTATCATCCCT CCAGG G C A T A T C G C G

FQ

Toda fita nova gerada durante a amplificao alvo para o annealing do beacon, aumentado a intensidade de fluorescncia

SYBR Green
Deteco do produto gerado na amplificao com o corante fluorescente SYBR Green. O corante se intercala na dupla fita de DNA. Se h aumento do nmero de fitas duplas, h aumento proporcinal da intensidade de fluorescncia.

Menos especfico do que a sonda TaqMan e o sistema de Molecular beacons

O sistema de quantificao em tempo real tem tido as seguintes aplicaes:

1 - Anlise de expresso gnica - RNA total (RT- PCR) 2 - Identificao de alelos em DNA genmico 3 - Anlise de seqncias virais, bacterianas ou de protozorios a partir de vrias fontes 4 - Anlise de patgenos em alimentos 5 - Anlise de produtos transgnicos, etc.... O sistema permite a deteco simultnea de at 3 fluorocromos diferentes, de modo que o controle interno ou externo pode ser analisado simultaneamente analise da molcula alvo.

Diferentes aplicaes da tcnica da PCR

1. Estudo do padro de expresso gnica (transcritos raros) 2. Seleo de clones recombinantes, com primers complementares a seqncias do vetor, em ambos os lados do stio de clonagem 3. Sequenciamento direto de produtos amplificados 4. Deteco de mutaes em genes especficos (diagnstico precoce em estudos de cncer e doenas genticas, estudos teraputicos para a determinao do mecanismo de ao de substncias mutagnicas) 5. Estudos diagnsticos de doenas infecciosas, deteco de bactrias, vrus e protozorios parasitos 6. Diagnstico pr-natal em caso de risco 7. Elucidar relaes evolutivas entre espcies, utilizando material arqueolgico 8. Grande potencial na Medicina Forense (impresso digital de DNA)