Universidad Nacional de Trujillo

Dpto. Microbiologa y Parasitologa Curso T-P: EPIDEMIDOLOGA CLNICA

Muestras para el diagnstico de malaria Mtodo de identificacin: Directo y indirecto de malaria

Santos Nlida Murga Gutirrez
Dra. Ciencias Biomdicas Profesora Principal Universidad Nacional de Trujillo

Septiembre 01, 2012.

Malaria humana
Agente etiolgico: Plasmodium vivax P. falciparum P. malariae P. ovale Vector: Anopheles (hembra) Reservorio: hombre

Muestras para el diagnstico de malaria

Sangre perifrica Sangre venosa

Diagnstico de la enfermedad

I. Microscopa
Gota gruesa y frotis
Gotagruesa: Muestra de una gota de sangre sobre una lmina de vidrio, teidos luego con Giemsa. Muy til cuando parasitemia es baja Frotis: Capa delgada y nica de clulas sanguneas, fijadas con metanol y coloreadas con Giemsa. til para observar la morfologa de los parsitos presentes en los GR.

Limpieza y almacenaje de lminas portaobjetos

Lminas portaobjeto para toma de muestra hemtica en gota gruesa deben procesarse antes de su uso (lavadas, secadas y almacenadas correctamente). Lminas nuevas lavar con detergente neutro y agua limpia; previo remojo en agua con detergente por 30 min a 1h, enjuagar con agua continua. Cada lmina debe ser pulida individualmente con esponja y luego secarlas con un trozo de tela de algodn. Lminas limpias deben cogerse por los bordes para evitar dejar grasa. Descartar lminas portaobjeto cuando: - Tengan coloracin iridiscente u opaca. - Presenten rajaduras o superficies irregulares. - Estn sucias. Lminas portaobjetos limpias podrn ser envueltas en papel delgado en grupos de 10. Almacenar en cajas de cartn y en lugar seco (evitar polvo y humedad).. Tomar medidas de proteccin cuando se manipula sangre para evitar la contaminacin con agentes de transmisin sangunea (hepatitis viral B, C, G, VIH, etc.) de riesgo potencial.

Registro
Para asegurar la fcil localizacin de los pacientes es importante Ilenar la informacin requerida en una ficha de toma de muestra diseadas por el Ministerio de Salud (MINSA). No olvidar que equivocarse en el Ilenado correcto de estos formatos de registro, sera equivocarse en la lectura de la gota gruesa.

Procedimiento para la obtencin de la muestra

La muestra de sangre perifrica se obtiene para preparar dos pelculas; una gruesa (gota gruesa) y una delgada (frotis), para su examen microscpico. La gota gruesa est conformada por numerosas capas de clulas sanguneas, en su mayora glbulos rojos, que son deshemoglobinizados durante la coloracin con Giemsa. Facilita la deteccin de los parsitos. El frotis es una capa delgada, nica de clulas sanguneas. Facilita la observacin de las caractersticas morfolgicas de los parsitos en los glbulos rojos, sobre todo para la identificacin de la especie del parsito, cuando ste no ha podido ser identificado por GG. Se usa para rotular e identificar al paciente.

Toma de muestra y preparacin de gota gruesa y frotis

Calidad de la gota gruesa y del frotis

Observacin microscpica de gota gruesa

Etapa de trofozoito joven

Etapa de trofozoito mediano y adulto

Etapa de esquizonte

Etapa de gametocito

Observacin microscpica en frotis

Clculo de la densidad parasitaria

Aplicar los siguientes criterios: a. Si despus de contar 200 leucocitos, 10 + parsitos han sido identificados y contados, registrar los resultados en N de parsitos por 200 leucocitos. b. Si despus de contar 200 leucocitos, < 10 parsitos han sido identificados y contados, continuar el recuento hasta 500 leucocitos y registrar los resultados en N de parsitos por 500 leucocitos. c. En caso de parasitemia alta, realizar el recuento en funcin del N de parsitos, y registrar su recuento hasta 500 y reemplazar su valor en la frmula con la cantidad de leucocitos encontrados.

Prueba QBC (Quantitative Buffy Coat).Prueba rpida que utiliza el anaranjado de acridina que colorea el ADN del parsito pero necesita un microscopio de inmunofluorescencia. Involucra coloracin con este colorante de la capa de glbulo rojos formada en el tubo capilar (centrifugado).

II. Diagnstico inmunolgico

Fluorescencia e inmunofluorescencia

Microscopa puede ser positiva y RDTs puede ser negativa

III. Diagnstico molecular

Amplificacin del ADN Reaccin en cada de la polimerasa
Se basa en la deteccin de las secuencia de cidos nucleicos especficos a los parsitos de Plasmodium. Mediante primers especficos dirigidos a la subunidad menor ribosomal (18S) especfico para cada especie de Plasmodium. Los productos de amplificacin pueden ser visualizados en geles de agarosa 2% con bromuro de etidio. Ventajas /Desventajas

Caracterizacin molecular de los genes pfhrp2 y pfhrp3 Secuenciamientos Cultivo de P. falciparum