DESCRIEREA MICROSCOPULUI

Se numete microscop binocular pentru c permite examinarea cu ambii ochi i lumipan pentru c are ncorporat n el sursa de lumin. Un astfel de microscop este constituit din trei pri principale: partea mecanic, partea optic i sistemul de iluminare.

Partea mecanic este format la rndul ei din urmtoarele componente: piciorul sau talpa microscopului, coloana microscopului, msua sau platina microscopului i tubul microscopului. Piciorul sau talpa microscopului este o pi es care prin forma i greutatea sa asigur stabilitate microscopului i servete ca suport pentru celelalte componente. n cazul microscopului Olympus CX 21 talpa este de form aproximativ dreptunghiular i are ncorporate n ea sursa de lumin i o parte a dispozitivului de transmis lumina. Pe lng acestea mai conine transformatorul, iar pe partea lateral prezint 2 butoane. Unul este pentru pornit-oprit, iar cellalt este folosit la reglarea intensitii luminii i prezint o scal de reglare a intensitii de la 1 la 6. Coloana microscopului servete drept suport pentru: msu, tub i sistemul optic. Este fixat pe talpa microscopului i are o form ncurbat. n extremitatea liber, coloana adpostete tubul microscopului care nu este vizibil. Pe prile laterale prezint cte 2 butoane (vize) situate pe aceeai ax. Viza macrometric permite deplasarea preparatului microscopic n raport cu obiectivul printr-o micare rapid (vizibil cu ochiul liber) i pe o distan mare (cca. 4 cm). Cu ajutorul ei se obine imaginea preparatului microscopic. Aceast imagine necesit o mbuntire, o finisare, pentru a avea claritatea necesar observrii detaliilor fine. Viza micrometric permite deplasarea preparatului n raport cu obiectivul pe o distan mic printr-o micare foarte lent (ce nu poate fi observat cu ochiul liber). Aceast deplasare fin va permite o reglare de mare precizie a imaginii. De altfel, prin micarea acestei vize se face finisarea (clarificarea) imaginii preliminare obinute cu ajutorul vizei macrometrice. Msua sau platina este ataat de coloana microscopului n poziie orizontal. Ea este format din dou plci metalice dispuse una peste cealalt. Componenta inferioar are o form aproximativ ptrat, este fix i prezint n zona central un orificiu de form rotund care permite trecerea luminii ce vine de la condensor nspre preparatul microscopic n timp ce componenta superioar, de form dreptunghiular este mobil (poate fi deplasat nainte i napoi).. Msua prezint un dispozitiv pentru fixarea preparatului, i este prevzut cu un bra articulat acionat de un resort. El servete la fixarea i imobilizarea preparatului de examinat pe msua microscopului. Ei sunt fixai de o in metalic. Aceasta este situat la partea mobil a msuei i se poate deplasa lateral (stnga-dreapta). Sub msu, n partea dreapt, se gsesc dou uruburi montate pe acelai ax, care alctuiesc carul mobil (cruciorul) al msuei. urubul superior este mai gros i prin rotirea lui este acionat placa superioar a msuei care se va deplasa nainte i napoi n funcie de dorina examinatorului. Cum preparatul microscopic este fixat la partea anterioar a acestei componente i imobilizat cu sistemul de cleme, nseamn c micnd componenta superioar a msuei deplasm preparatul nainte sau napoi, n raport cu obiectivul (care rmne fix). urubul inferior este mai subire i prin rotirea lui este acionat sistemul de cleme. Preparatul imobilizat cu sistemul de cleme poate fi deplasat la dreapta sau la stnga (n raport cu obiectivul), dup cum dorete examinatorul. n felul acesta cu ajutorul celor dou uruburi ale carului mobil se va putea deplasa preparatul microscopic n timpul examinrii nainte i napoi (cu ajutorul urubului superior), la dreapta i la stnga (cu ajutorul urubului inferior). Aceste micri sunt necesare pentru ca examinatorul s poat explora ntreaga suprafa a seciunii histologice existente pe preparatul de examinat. Viza condensorului se afl sub msu, n partea stng i permite deplasarea acestuia n sus sau n jos, modificnd n acest fel cantitatea de lumin ce va fi trimis n planul preparatului microscopic Tubul microscopului este dispus n extremitatea liber a coloanei i asigur legtura optic ntre sistemul obiectiv i sistemul de prisme. n partea lui inferioar tubul microscopului este prevzut cu un dispozitiv numit revolver. Revolverul este format din dou discuri metalice: unul superior fix i unul inferior rotativ. Discul inferior este prevzut cu patru orificii n care se monteaz prin nfiletare obiectivele microscopului. Revolverul este prevzut la interior cu o piedic (un arc de oel) care servete la fixarea obiectivelor n axul optic. Prin rotirea revolverului se poate aduce n axul optic obiectivul dorit, poziionarea lui corect fiind confirmat de un mic zgomot metalic pe care l emite arcul revolverului n momentul cnd obiectivul a ajuns n poziie corect. n partea superioar a tubului se gsete sistemul de prisme. Partea optic este alctuit din urmtoarele componente majore: sistemul obiectiv, sistemul de prisme i sistemul ocular. Sistemul obiectiv este reprezentat de 4 obiective care, aa cum am mai menionat, sunt montate pe discul inferior (rotativ) al revolverului. Un obiectiv este un tub metalic n care se afl montat un sistem de lentile. Prima lentil (cea care privete spre obiectul de examinat) este plan convex, fiind dispus cu faa plan spre exterior

(spre preparatul microscopic). Ea poart numele de lentil frontal i este lentila de baz a obiectivului adic cea care preia imaginea obiectului de examinat. n funcie de mediul care se interpune ntre obiectul de examinat i lentila frontal a obiectivului se deosebesc dou feluri de obiective: obiective uscate la care ntre obiectul de examinat i lentila frontal se interpune aerul i obiective cu imersie la care ntre preparatul microscopic i lentila frontal se interpune un lichid, numit lichid de imersie. Obiectivele uscate ale microscopului sunt n numr de 3 i au urmtoarea putere de mrire: 4x, 10x, i 40x. Puterea de mrire este notat pe fiecare obiectiv naintea cifrei care exprim apertura lui numeric. Cel de al 4-lea obiectiv al microscopului este obiectivul cu imersie care are o putere de mrire de 100x. Sistemul de prisme este format dintr-o prism de baz care preia imaginea de la obiectiv i prin intermediul altor prisme (prisme deviatoare) o distribuie spre cele dou oculare, realiznd vederea binocular a imaginii microscopice. Prismele sunt astfel concepute nct schimb direcia razelor de lumin primite de la obiectiv de aa manier nct examinarea la microscop s se poat face n poziia cea mai comod posibil. Sistemul ocular este reprezentat de cele dou oculare situate la partea superioar a sistemului de prisme. Ocularul este un tub metalic n care s-a montat un sistem de lentile. Microscopul este dotat cu oculare plane cu cmp larg, cu o putere de mrire de 10x. Puterea de mrire a ocularului este nscris n partea lui superioar. Distana dintre oculare poate fi reglat n funcie de distana interpupilar a fiecrui examinator. Tubul n care este montat ocularul din stnga este prevzut cu un dispozitiv rotativ care permite corectarea diferenei de dioptrii dintre cei doi ochi ai examinatorului.

Sistemul de iluminare este alctuit din sursa de lumin i dispozitivul de transmis lumina. Sursa de lumin este reprezentat de un bec halogen de 6 V i 20 W. Alimentarea becului se face de la reeaua de 220 V prin intermediul unui transformator inclus n tapa microscopului care are la ieire un curent de 6 V. Dispozitivul de transmis lumina este format din totalitatea componentelor pe care razele luminoase dispersate venite de la sursa de lumin le vor ntlni n calea lor spre obiectul de examinat. Prima pies a acestui dispozitiv este o pies de form cilindric prevzut cu dou lentile ce poart numele de colector. Rolul colectorului este de a direciona razele luminoase, adic el primete razele de lumin dispersate ce vin de la sursa de lumin, pe care le va orienta n aa fel nct la ieirea din colector fasciculul luminos va fi format din raze paralele ntre ele. Ele vor fi trimise n sus, sub form de fascicul de raze paralele, printr-un geam dispus pe partea superioar a tlpii microscopului. Fasciculul de raze va ntlni apoi o diafragm numit diafragma de apertur dup care va ptrunde n condensor. Modificarea orificiului diafragmei de apertur se face cu ajutorul unei rotie prezente n partea inferioar a condensorului. Condensorul este un dispozitiv prevzut cu dou lentile i are rolul de a concentra fasciculul de raze paralele pe care le capteaz cu prima lentil, astfel nct ele vor fi adunate (concentrate) sub forma unui punct (spot) luminos ce va fi trimis n planul preparatului microscopic. Lumina primit de la condensor va strbate preparatul microscopic i va intra n lentila frontal a obiectivului concurnd la formarea imaginii n microscop.
EXAMINAREA LA MICROSCOPUL OPTIC
Pentru a examina n condiii optime la microscopul optic, sunt necesare cteva operaiuni care preced examinarea propriu-zis. Altfel spus, microscopul trebuie pregtit n vederea examinrii. Aceast pregtire const n urmtoarele operaii: 1) se poziioneaz butonul de reglare a intensitii luminoase n dreptul cifrei 3; 2) se apas pe butonul de pornire-oprire; 3) se coboar msua cu viza macrometric pentru a avea acces uor pe msu. n felul acesta preparatul poate fi aezat uor n cea mai corect poziie i nu exist riscul zgrierii lentilei frontale a obiectivului sau a lamelei preparatului; 4) se aeaz preparatul microscopic pe msu cu lamela n sus i se imobilizeaz cu ajutorul celor doi valei; 5) cu ajutorul carului mobil deplasm preparatul pn cnd seciunea colorat se suprapune peste spotul luminos trimis de condensor; 6) se aduce n axul optic obiectivul 4X, prin rotirea revolverului n sensul acelor de ceasornic. Dup efectuarea acestor operaiuni, microscopul este pregtit pentru examinare. Prin dotarea lui tehnic, microscopul permite o palet larg de operaiuni, motiv pentru care o s prezentm operaiunile cele mai des utilizate. Pentru examenele curente se folosesc obiectivele 4X, 10X, 40X. Obiectivul 100X se folosete numai n anumite situaii.

OBINEREA IMAGINII MICROSCOPICE CU OBIECTIVELE 4X, 10X, 40X

n cazul examenelor curente, obinerea imaginii preparatului de examinat se face ntotdeauna cu obiectivul cu puterea de mrire cea mai mic (4X) i numai ulterior se trece la obiectivul urmtor (dac este cazul). Trebuie precizat c microscopul este pregtit pentru examinare aa cum am prezentat anterior.

OBINEREA IMAGINII CU OBIECTIVUL 4X.

Dac structurile din preparatul microscopic ce urmeaz a fi examinate sunt de dimensiuni mari, ele nu necesit pentru examinare (cel puin pentru imagini de ansamblu) dect trepte mici de mrire. n aceast situaie se examineaz (cel puin iniial) cu obiectivul 4X. Privind lateral (la preparat i nu n oculare), ridicm msua cu viza macrometric pn n poziia cea mai de sus. Apoi privind n oculare, coborm ncet, tot cu viza macrometric, pn cnd obinem imaginea preparatului. n acel moment lum mna de pe viza macrometric i n continuare vom lucra numai cu viza micrometric. Imaginea obinut cu ajutorul vizei macrometrice este o imagine preliminar care necesit anumite mbuntiri calitative pentru ca noi s putem observa detaliile fine ale preparatului. Pentru aceasta, imaginea obinut cu ajutorul vizei macrometrice o vom finisa (clarifica) cu ajutorul vizei micrometrice. n acest moment imaginea este corespunztoare i examinatorul poate deplasa preparatul cu ajutorul carului mobil n direcia dorit astfel nct s poat examina tot ceea ce dorete de pe suprafaa de seciune. Trebuie menionat faptul c este necesar ca imaginea s fie clarificat n permanen cu viza micrometric pentru ca ea s fie de cea mai bun calitate. Acest lucru este necesar deoarece imaginea bine reglat ntr-un punct al preparatului nu se va pstra la aceeai calitate dup deplasarea n alt punct. n timpul examinrii o mn va aciona carul mobil i cealalt viza micrometric.

OBINEREA IMAGINII CU OBIECTIVUL 10X

Fr a mai modifica imaginea obinut cu ajutorul obiectivului 4X, prin rotirea revorverului aducem n axul optic al microscopului obiectivul de 10X. Cu ajutorul vizei micrometrice clarificm imaginea. Dac este cazul reglm intensitatea luminii cu ajutorul butonului de reglare de pe partea lateral a tlpii microscopului. Dup ce examinm i cu acest obiectiv seciunea colorat dac exist aspecte ce dorim s le examinm cu un obiectiv cu putere de mrire mai mare, aducem aceste aspecte n centrul cmpului microscopic i trecem la examinarea cu obiectivul 40X.

OBINEREA IMAGINII CU OBIECTIVUL 40X

Fr s modificm n nici un fel imaginea reglat pentru obiectivul 10X, aducem n axul optic obiectivul 40X prin rotirea revolverului n sensul acelor de ceasornic. Dac imaginea a fost corect reglat pentru obiectivul 10X, ea se pstreaz i la schimbarea pe obiectivul 40X doar c pierde din claritate. Imaginea va fi n continuare clarificat numai cu viza micrometric (utilizarea vizei macrometrice este total contraindicat). Dac este cazul reglm intensitatea luminii cu ajutorul butonului de reglare de pe partea lateral a tlpii microscopului. Examinatorul poate acum studia toate detaliile care l intereseaz. La ncheierea examinrii, se rotete revorverul i aducem n axul optic al microscopului o poziie n care nu avem fixat nici un obiectiv. Cu ajutorul vizei macrometrice coborm msua pentru ca preparatul s poat fi luat uor. Obinerea imaginii microscopice se face aa cum am mai spus, ncepnd de fiecare dat cu obiectivul 4X. Acest obiectiv cuprinde n cmpul microscopic o suprafa mare din preparat ceea ce permite localizarea uoar a unor structuri, chiar dac uneori nu permite observarea unor detalii foarte fine ale acestora. ntotdeauna, localizarea structurilor pe suprafaa de seciune se face cu obiectivul 4X. Dac dorim s observm anumite detalii identificate cu obiectivul 4X, vom examina cu obiectivul 10X i dac este cazul cu obiectivul 40X. Ordinea n care se lucreaz cu aceste obiective (4X, 10X, 40X) este ntotdeauna aceasta. Fiecare obiectiv are destinaia lui i trebuie folosit ca atare.

De reinut!
Pentru o examinare corect care s asigure o imagine de calitate i protecia aparatului i materialelor este obligatorie respectarea acestei modaliti de examinare. Regulile care nu trebuie n nici un caz uitate sau ignorate sunt: preparatul se aeaz pe msu ntotdeauna cu lamela n sus; dup obinerea imaginii cu obiectivul 4X, nu se mai utilizeaz viza macrometric; pentru celelalte obiective (10X i 40X) este suficient viza micrometric. dac, dintr-un motiv sau altul, n timpul examinrii, imaginea s-a dereglat, nu se foreaz reglarea ei cu viza macrometric ci se reia examinarea de la capt (cu obiectivul 4X); n nici un caz nu se ncearc obinerea imaginii cu viza macrometric pentru fiecare obiectiv n parte.

Recoltarea probelor
Recoltarea este operaiunea de prelevare a unor mici fragmente de esut sau organ, fie din organismul viu, fie de la cadavre. Dei este considerat de multe ori o operaiune banal (i tratat cu superficialitate) ea reprezint de fapt una din cele mai importante etape ale efecturii preparatului permanent. Acionarea cu brutalitate sau instrumentar neadecvat asupra organului sau esutului din care se recolteaz piesa, poate cauza modificri (artefacte de recoltare) care pot pune n real dificultate pe cel care va examina n final preparatul histologic. Pentru realizarea unei recoltri corecte este necesar respectarea cu strictee a unor reguli: recoltarea trebuie fcut cu instrumentar corespunztor i foarte bine ascuit (bisturiu cu lame de unic folosin, lame de brbierit etc.) i s nu se exercite presiuni, traciuni sau alte manopere asemntoare ce pot cauza ruperea sau strivirea unor structuri; n cazul recoltrii probelor de la cadavre, operaiunea trebuie efectuat n cel mai scurt timp posibil pentru evitarea instalrii alterrilor post-mortem; se recolteaz fragmente de esut sau organ sub form de felii a cror grosime nu trebuie s depeasc 5 mm, iar direcia n care se face secionarea va determina orientarea final a seciunilor, important mai ales n cazul unor organe cum ar fi muchii sau pereii organelor cavitare. Dac piesele sunt mai groase exist riscul ca ele s nu poat fi ptrunse n timp util de agenii fixatori. Dac grosimea este corespunztoare, celelalte dimensiuni (lungimea, limea) nu sunt foarte importante din punctul de vedere al fixrii, putnd fi alese n funcie de necesiti; cnd pe suprafaa organului din care recoltm proba exist leziuni vizibile macroscopic, seciunea trebuie astfel orientat nct fragmentul prelevat s cuprind att esut lezat ct i esut sntos; recoltarea pieselor din diferite esuturi i organe trebuie s se fac ntr-o anumit ordine stabilit n funcie de rapiditatea cu care ele ncep s se altereze. Astfel, structurile cele mai sensibile sunt glandele endocrine, apoi mucoasa gastric i intestinal, sistemul nervos, testiculele, rinichii etc; imediat dup recoltare piesele trebuie introduse n recipientul cu soluie fixatoare (bucat cu bucat).

Fixarea probelor
Pentru studiul histologic nu este suficient ca proba de examinat s fie transparent i s posede un contrast optic adecvat. Celulele i esuturile (mai ales cele prelevate de la animale) sunt instabile din punct de vedere fizic i chimic. Tratamentele la care ele sunt supuse pentru obinerea preparatului microscopic le-ar putea distruge n mod grav dac ele nu ar fi stabilizate ntr-un anumit fel. Fr modificarea amplasrii lor spaiale, proteinele structurale i ali constitueni trebuie fcui insolubili pentru toi reactivii la care urmeaz s fie expuse. Celulele i materialele extracelulare trebuie conservate astfel nct modificrile structurale i de compoziie chimic ale pieselor prelucrate histologic s fie minime. Aceast conservare este subiectul fixrii. Mai simplu spus, fixarea are ca scop ntreruperea fenomenelor vitale din celule i esuturi, cu pstrarea ct mai fidel a structurii acestora. Dup prerea majoritii specialitilor histologi, fixarea este operaiunea cea mai delicat dintre toate etapele realizrii preparatului histologic permanent. Greelile survenite n timpul fixrii compromit iremediabil rezultatul final al prelucrrii histologice. Materialul biologic poate fi fixat prin metode fizice sau prin metode chimice. Pentru majoritatea studiilor histologice sunt utilizai fixatorii lichizi. Substanele ce pot fi folosite pentru fixarea chimic a pieselor biologice sunt numeroase i diverse. Ele pot fi folosite ca fixatori simpli sau ca amestecuri fixatoare. Agenii fixatori simpli utilizai n tehnica histologic sunt foarte numeroi, iar dintre acetia amintim: alcoolul etilic, alcoolul metilic, acetona, cloroformul, acidul acetic, acidul tricloracetic, acidul picric, clorura mercuric (sublimatul), formolul etc. De cele mai multe ori aceti ageni fixatori intr n compoziia unor amestecuri fixatoare, cu excepia ultimului care este folosit frecvent ca fixator simplu. Formolul comercial este o soluie apoas de formaldehid 40%. Dac formolul este utilizat ca fixator n soluii apoase simple, el trebuie diluat cu cteva zile nainte. Modul de preparare: considernd formolul comercial ca fiind o soluie cu concentraia de 100%, din care se prepar diferite soluii de lucru. De exemplu: pentru formol histologic 10% se dilueaz 10 ml formol concentrat cu 90 ml ap distilat. Fixarea se face cel puin o sptmn la temperatura camerei. Marele avantaj al fixrii cu formol este faptul c dup ncheierea perioadei de fixare, piesele pot fi pstrate n continuare n fixator, fr ca ele s sufere modificri majore care s compromit prelucrarea ulterioar. Datorit acestui avantaj, formolul este cel mai utilizat fixator.