Practica N 3

DETERMINACIN DE LOS PRODUCTOS DE FERMENTACION EN UNA MUESTRA DE JUGO DE MARACUYA.

Camilo Bonilla (24140259), Diego Cifuentes (24140279) y Jorge Martnez (26140296). Departamento de Qumica, Facultad de Ciencias Exactas y Matemticas, Universidad de Nario, Calle 18 N 50 02 Torobajo; San Juan de Pasto, Colombia.

Resumen: La catalasa es una enzima antioxidante presente en el citoplasma de los eritrocitos y est involucrada en la transformacin del perxido de hidrgeno generado durante el metabolismo celular. Se evalu la

Palabras Clave: Introduccin: La glucosa ocupa un papel central en el metabolismo de pantas, animales y muchos microorganismos. Es relativamente rica en energa potencial por lo que es un buen combustible [1]. La gluclisis es una ruta inicial del catabolismo y se divide en 10 pasos que convierte una molcula de glucosa en dos molculas de piruvato, con la generacin de dos molculas de ATP y NADH por medio de la degradacin de carbohidratos de almacenamiento como glucgeno y almidn que dan lugar a la glucosa y hexosas relacionadas [2]. Las funciones principales de la glucolisis son: La generacin de molculas de alta energa (ATP y NADH) como fuente de energa celular en procesos de respiracin aerbica y anaerbica, la generacin de piruvato que pasar al Ciclo de Krebs, como parte de la respiracin aerbica y la produccin de intermediarios de 6 y 3 carbonos que pueden ser ocupados por otros procesos celulares [3]. Cuando las clulas no posean mitocondrias (eritrocito) o cuando requieran de grandes cantidades de ATP (el msculo al ejercitarse), el piruvato sufre fermentacin anaerobia en una segunda va que permite obtener molculas de NAD+ para ser incorporadas a la gluclisis. El tipo de fermentacin vara respecto al tipo de organismos: en levaduras, se produce fermentacin alcohlica, produciendo etanol y CO2 como productos finales, mientras que en msculo, eritrocitos y algunos microorganismos se produce fermentacin lctica, que da como resultado cido lctico o lactato [2].

La fermentacin lctica es realizada por muchas bacterias (bacterias lcticas, entre ellas lactobacillus), hongos, algunos protozoos y muchos tejidos animales; en efecto, la fermentacin lctica tambin se verifica en el tejido muscular cuando, a causa de una intensa actividad motora, no se produce una aportacin adecuada de oxgeno que permita el desarrollo de la respiracin aerbica. Este proceso es la base para la obtencin del yogur y muchos derivados lcteos [4] y puede ser descrito de una manera general por la siguiente reaccin:
COO C CH3 OH H+
Lactato deshidrogenasa

COO H C CH3 OH Lactato

Piruvato NADH + NAD+

La fermentacin alcohlica es realizada hongos microscpicos unicelulares (levaduras), estas estn presentes de forma natural en algunos productos como las frutas, cereales y verduras. Entre las mas importantes utilizadas en procesos de fermentacin tenemos: Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces fragilis, Torulaspora y Zymomonas mobilis [5]. El etanol resultante se emplea en la elaboracin de algunas bebidas alcohlicas, tales como el vino, la cerveza, la sidra, el cava, etc. Aunque en la actualidad se empieza a sintetizar tambin etanol mediante la fermentacin a nivel industrial a gran escala para ser empleado como biocombustible [6], este proceso puede ser descrito de una manera general por la siguiente reaccin:

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H C O
Alcohol deshidrogenasa

Parte experimental

CH3CH2OH Etanol

CH3 Acetaldehido NADH + H+ NAD+ Ambos tipos de fermentacin tienen en comn la conversin de glucosa en piruvato. El destino final del piruvato es el que diferencia la fermentacin alcohlica de la fermentacin lctica. El proceso general para los dos tipos de fermentacin se puede resumir como se indica en la figura1 [2].
Glucosa Glucosa-6-fosfato Fructosa-6-fosfato Fructosa-1,6-bisfosfato Gliceraldehido-3-fosfato 3-fosfoglicerilfosfato 3-fosfoglicerato 2-fosfoglicerato Fosfoenolpiruvato Piruvato Lactato Fermentacin lctica Acetaldehido Etanol Fermentacin alcohlica fosfato de hidroxiacetona

Desarrollo de la gluclisis y las fermentaciones lctica y alcohlica:

Reactivos A 5 5 Am 5 5 B 5 5 tubos Bm C 5 5 5 5 -

Cm D Dm MB (mL) 5 5 Glu (mL) 5 LA (mL) LP (mL) 5 Y (mL) 5 5 Na2SO3 0,5 0,5 (g) Calentamiento de los tubos a 35 40 C por una hora ATA 2 2 2 2 2 2 (mL)
Tabla 1. Reactivos utilizados para la determinacin de los productos de gluclisis: MB (muestra de maracuy); Glu (glucosa 10%); LA (levadura en agua); LP (levadura en Na2HPO4); Y (yogurt); ATA (cido tricloroactico).

Se rotularon 8 tubos de ensayo como A, Am, B, Bm, C, Cm, D, Dm y se agrego los reactivos tal como indica la tabla 1. Posteriormente se mezcl y filtr el contenido de cada tubo, el filtrado se utiliz para realizar las pruebas de caracterizacin de los metabolitos implicados en la gluclisis y en las fermentaciones. Determinacin de etanol: Prueba de Lugol: Se tomaron dos tubos de ensayo y se agrego respectivamente 2mL del filtrado de los tubos A y Am, otro tubo con 2mL de etanol al 5% fue utilizado como patrn. Posteriormente e agreg a cada tubo 0,1 g de carbonato de sodio y una vez disuelto se coloc los tubos en bao mara a 70C, se aadi lentamente gotas de reactivo de Lugol hasta que la solucin tomo el color caracterstico de yodo y se llevaron a bao mara durante tres minutos ms en el bao mara. Luego se enfri los tubos con agua, se observo los cambios presentados en las soluciones. Oxidacin por cromo: se tomaron tres tubos de ensayo de la misma manera que en el procedimiento anterior (A, Am y patrn). A cada tubo se aadi 0,5 mL de solucin sulfocrmica

Figura 1. Esquema general para el proceso de la fermentacin.

En el presente trabajo se evidenciara el procesos de gluclisis por medio de la fermentacin lctica y la fermentacin alcohlica, basados en la identificacin del producto principal de la gluclisis: cido pirvico (piruvato) y productos de la fermentacin del cido pirvico: cido lctico (lactato), acetaldehdo y etanol, obtenidos a partir de la accin de la levadura saccharomyces cerevisiae (para la fermentacin alcohlica) y la bacteria lactobacillus del yogurt (para la fermentacin lctica).

Practica N 3 diluida a cada tubo, se llevaron a bao mara y se observo los cambios en las soluciones. Determinacin de acetaldehdo. Se tomaron dos tubos de ensayo y se agrego respectivamente 2mL del filtrado de los tubos B y Bm, otro tubo con 2mL de acetaldehdo al 5%fue utilizado como testigo. Posteriormente se agreg 0,5 mL de solucin fresca de nitroprusiato de sodio y 2 mL de piperidina acuosa a cada tubo se agit y se observo los cambios en las soluciones. Determinacin de la presencia de piruvato. Prueba con nitroprusiato sdico: Se tomaron dos tubos de ensayo y se agrego respectivamente 2mL del filtrado de los tubos C y Cm, otro tubo con 2mL de acido piruvico fue utilizado como patrn. Posteriormente se calentaron los tres tubos hasta ebullicin e inmediatamente se agreg se agreg 1 g de sulfato de amonio solido a cada tubo y dos 2 gotas de solucin de nitroprusiato sdico, los tubos se mezclaron vigorosamente y se dej deslizar amoniaco concentrado a cada tubo hasta verificar la formacin de 2 fases, se observo los cambios en las soluciones. Prueba con 2,4-dinitrofenilhidrazina: se tomaron tres tubos de ensayo de la misma manera que en el procedimiento anterior (C, Cm y patrn). A cada tubo se adicion 1 mL de solucin saturada de 2,4-dinitrofenilhidrazida y se mezcl fuertemente, en seguida se coloc 3 gotas de las soluciones contenidas otros tres tubos, a estos se les agrego 1mL NaOH al 10% y se diluy hasta 5 mL con agua. Se observ los cambios en la solucin. Determinacin de acido lctico. Se tomaron dos tubos de ensayo y se agrego respectivamente 1mL del filtrado de los tubos D y Dm, otro tubo con 1mL de acido lctico fue utilizado como patrn. Se adicion a cada tubo 1 mL de ter etlico y se agitaron las soluciones intensamente. Se dej los tubos en reposo hasta observar la formacin de dos fases, se extrajeron las fases etreas en otros tubos y se agreg un volumen igual de solucin de cloruro frrico a cada tubo a un volumen igual al obtenido de la fase etrea, se observo los cambios en las soluciones.
Resultados Prueba Muestra Anillo verde (+) Tubo Glucosa

Patrn

Etanol (Lugol) Etanol (cido sulfocrmico) Acetaldehdo cido pirvico (nitroprusiato)

Anillo fucsia
(+)

Anillo azul
(+)

Sln. Rojiza
(+)

Sln. Rojiza
(+)

Sln. Rojiza
(+)

Sln roja

Sln roja

Sln azul

(-) (-) (+) Presip. Presip. Presip. Amarillo Amarillo Amarillo (+) (+) (+)

cido pirvico (dinitrofenilhidrazina) Azulada Azulada Azulada (+) (+) (+) Sln. Sln. Sln. cido lctico verdosa Verdosa Verdosa (+) (+) (+)
Tabla 2. Resultados para las pruebas de identificacin de los metanolitos procedentes de la glucolisis y de las fermentaciones. + (Resultado positivo); - ( resultado negativo)

Sln.

Sln.

Sln.

La tabla 2 muestra los resultados para cada una de las pruebas realizadas con el fin de identificar cada uno de los metabolitos de inters procedentes de la gluclisis y de las fermentaciones. Para considerar positiva o no una prueba bast nicamente con la comparacin de los tubos en los cuales se llevo a cabo la glucolisis o fermentacin con un tubo patrn el cual contena previamente el metabolito de inters (tubo patrn). Se consider positiva la prueba si el resultado obtenido en el tubo patrn era comparable con los resultados para los tubos donde se llevo a cabo la glucolisis o fermentacin.

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Anlisis de Resultados. La gluclisis se encuentra dividida en dos fases: la primera, de gasto de energa y la segunda en la que obtiene energa. La primera fase consta en transformar una molcula de glucosa en dos molculas de gliceraldehdo, una molcula de baja energamediante el uso de 2 ATP. Esto permite duplicar los resultados de la segunda fase de obtencin energtica. En la segunda fase, el gliceraldehdo se transforma en un compuesto de alta energa, cuya hidrlisis genera una molcula de ATP, y como se generaron 2 molculas de gliceraldehdo, se obtienen en realidad dos molculas de ATP. Esta obtencin de energa se logra mediante el acoplamiento de una reaccin fuertemente exergnica despus de una levemente endergnica. Este acoplamiento ocurre una vez ms en esta fase, generando dos molculas de piruvato. De sta manera, en la segunda fase se obtienen 4 molculas de ATP y un rendimiento neto de 2 ATP [2].

transforman rpidamente en los respectivos productos como [1]. El piruvato es un intermediario comn en las dos fermentaciones y para poder detectarlo fue necesario realizar una inhibicin con Na2HPO4 para evitar la conversin del cido pirvico a cido lctico o en acetaldehdo. Esto fue evidenciado tanto en el tubo C como en el Cm tal y como muestra la tabla 2. Este tipo de resultado era el esperado para el tubo C y no para el tubo Cm puesto que este no contena levadura con inhibidor por o lo tanto la glucolisis no se pudo llevar a cabo en este tubo.

Figura 1. Repcentacion grafica de una curva tpica de la ecuacin de Michaelis-Menten

glucosa

2piruvato

2NAD+ 2NADH + 2H+ 2ADP + 2Pi 2ATP 2H2O

Figura 1. Esquema general para el proceso glucolisis muestra el rendimiento neto de ATP.

El primer paso en la primera fase es la fosforilacin de la glucosa, para activarla y esta manera aumentar su energa y as poder utilizarla en otros procesos cuando sea necesario puesto qu es mas reacctiva. Esta activacin ocurre por la transferencia de un grupo fosfato del ATP, una reaccin catalizada por la enzima Hexoquinasa, la cual puede fosforilar a molculas similares a la glucosa, como la fructosa y manosa. Las ventajas de fosforilar la glucosa son 2: La primera es hacer de la glucosa un metabolito ms reactivo, mencionado anteriormente, y la segunda ventaja es que la glucosa-6-fosfato no puede cruzar la membrana celular, a diferencia de la glucosa, ya que en la clula no existe un transportador de G6P. De esta forma se evita la prdida de sustrato energtico para la clula. Los intermediarios metablicos son en general sustancias de una vida corta debido a que se

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Bibliografa [1] David Nelson & Michael Cox. Glycolysis, Gluconeogenesis and the Pentose Phosphate Pathway. Lehningher's Principles of Biochemistry. W.H.Freeman. (2004).

[2] C. Mathews. K Van Holde. Metabolismo de os

hidratos de carbono I: procesos anaerobios en la generacin de energa metablica . Bioqumica. McGraw-Hill. (2000).

[3] Romano AH & Conway T. Evolution of carbohydrate metabolic pathways. Res Microbiol. 147(6-7):448-55 (1996). [4] D. Gallego S., J. Surez M., A. Trujillo R. Fermentacin lctica en continuo con "lactobacillus bulgaricus": A partir de suero dulce de leche desproteinizado. Alimentacin, equipos y tecnologa. 16 (1997) Pp. 61-64

[5] Stelle D. Buchanan Bacteriology. Read Books. (2007). [6] H.J. Vzquez. Fermentacin alcohlica: Una opcin para la produccin de energa renovable a partir de desechos agrcolas, Ingeniera Investigacin y Tecnologa VIII. 4. 249-259, 2007