GUA DE TRABAJOS PRCTICOS- CUESTIONARIO DE BIOLOGA MOLECULAR

1) Por PCR se amplific un segmento del gen de la -globina de 800 kpb. El mismo contiene una secuencia de corte por SmaI a 400 kpb del extremo 5, y otra secuencia de corte por Eco RI a 700 kpb desde el extremo 5. a) Dibuje en el esquema cul sera la distribucin de bandas en un gel teido con bromuro de etidio, donde en cada calle se corri el fragmento sin cortar o los productos obtenidos luego de cortar el mismo con Sma I, Eco RI y con las dos enzimas: SmaI + Eco RI. calle 1: SmaI calle 2: Eco RI calle 3: SmaI + Eco RI calle 4: Fragmento sin cortar

calle

kpb
1000

-800

-600

-400

-200

-100

b) Si a partir del gel corrido en el item a) se realiza un Northern-blot utilizando una sonda radioactiva cuya secuencia es complementaria a las primeras 100 kpb desde el extremo 5del fragmento, cmo esperara ver la autorradiografa . Dibuje.

calle

kpb
1000

-800

-600

-400

-200

-100

c) Si en lugar de la sonda nombrada en el item b) se utilizara una sonda de 200 pb que hibrida con el fragmento en la secuencia comprendida entre las 300 y 500 pb a partir del extremo 5, cmo esperara ver el resultado de la autorradiografa. Dibuje.

calle

kpb
1000

-800

-600

-400

-200

-100

2) Se efecta una PCR con los siguientes reactivos: ADN a amplificar, oligonucletidos complementarios que delimitan una regin de 300 pb (primers), buffer, Mg2+ y Taq polimerasa. Los productos obtenidos luego de las reacciones de amplificacin fueron separados por electroforesis en un gel de agarosa teido con bromuro de etidio. Luego de la corrida electrofortica, en el gel se observa: a) 1 banda a la altura del marcador de tamao de 300 bases. b) No hay producto de amplificacin. c) Varias bandas inespecficas. d) 2 bandas. 3) A continuacin se muestra el mapa de restriccin de un fragmento de ADN.

SmaI 1300 pb 1 500

SmaI

900

1300

Los productos obtenidos luego de cortar el fragmento con SmaI se analizan por Southern blot utilizando una sonda de 200 nucletidos que hibrida entre los pares de base de posicin 800 y 1000 del fragmento del esquema. En la autorradiografa se visualiza: a) Dos bandas de 400 y una de 500 pb respectivamente b) Solamente una banda de 200 pb c) Dos bandas de 200 y 400 pb respectivamente d) Solamente una banda de 400 pb 4) Se realiza la tcnica de deteccin de mutaciones con sonda alelo-especfica. Qu resultados espera encontrar si el paciente presenta una enfermedad recesiva? a) Que slo hibride la sonda normal.

b) Que slo hibride la sonda mutada c) Que no se pueda cortar con ninguna enzima de restriccin d) Que tanto la sonda normal como la mutada hibriden en dos muestras de ADN del paciente. 5) Un bioqumico realiza un Southern blot de ADN genmico humano siguiendo los siguientes pasos: 1) corte del ADN genmico con enzimas de restriccin, 2) separacin electrofortica de los fragmentos, 3) transferencia a membrana de nitrocelulosa, 4) bloqueo de la membrana con ADN de esperma de salmn, 5) calentamiento de la membrana para desnaturalizar el ADN, 6) incubacin con una sonda radiactiva simple cadena de 500 bases especfica para el gen que codifica para la tiroglobulina, 7) exposicin con pelcula y obtencin de la autorradiografa. En la autorradiografa se puede visualizar: a) Una banda que coincide con el marcador de 500 pb. b) Se revela la membrana completa. c) Una banda que coincide con el nmero de bases que posee el gen de la tiroglobulina. d) Varias bandas de distinto nmero de bases. 6) Qu resultado esperara usted de un Southern blot dnde el operador se olvid de sumergir la membrana en lcali y continu correctamente con los pasos siguientes? a) Se observa la banda especfica. b) No se observa banda alguna. c) Se observan numerosas bandas inespecficas. d) Se revela toda la membrana. 7) Qu resultado esperara usted de un Western blot dnde el operador se olvid de agregar el anticuerpo primario? a) Se observa la banda especfica. b) No se revela nada. c) Se observan numerosas bandas inespecficas. d) Se revela toda la membrana. 8) Para sintetizar ADNc doble cadena a partir de ARNm se necesita: a) Primers especficos, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, Transcriptasa reversa, DNA polimerasa. b) Primers especficos, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, Transcriptasa reversa, DNA polimerasa, nucleasa S1. c) oligo dT, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, Transcriptasa reversa, DNA polimerasa, nucleasa S1. d) Primers especficos, oligo-dT, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, Transcriptasa reversa, DNA polimerasa, nucleasa S1.

9) En la reaccin de PCR, cul es el paso siguiente a la desnaturalizacin del ADN: a) Hibridacin de los cebadores al ADN templado. b) Enfriamiento de la reaccin a 72 C. c) Extensin del cebador. d) Agregado de la Taq polimerasa. 10) Para amplificar un fragmento de ADN por PCR se debe: a) Conocer toda la secuencia a amplificar. b) Conocer las secuencias flanqueantes a dicho fragmento. c) Conocer una secuencia interna del fragmento a amplificar. d) Conocer una secuencia flanqueante y una interna del fragmento a amplificar. 11) Qu resultado esperara usted de un Northern blot dnde el operador se olvid de lavar la membrana luego de agregar la sonda radioactiva: a) Se observa la banda especfica. b) No se revela nada. c) Se observan numerosas bandas inespecficas. d) Se revela toda la membrana. 12) La tcnica de huellas dactilares de ADN se utiliza actualmente en: a) diagnstico de enfermedades hereditarias

b) la introduccin de un gen de una especie no relacionada en otra especie. c) criminalstica y reconocimiento de individuos por parentezco familiar. d) la deteccin de mutaciones en genes que producen diversas enfermedades. 13) Por PCR se amplific un segmento del gen de la albmina de 1000 kpb. El mismo contiene una secuencia de corte por SmaI a 200 kpb del extremo 5, y otra secuencia de corte por Eco RI a 500 kpb desde el extremo 5. a) Dibuje en el esquema cul sera la distribucin de bandas en un gel teido con bromuro de etidio, donde en cada calle se corri el fragmento sin cortar o los productos obtenidos luego de cortar el fragmento con Sma I, Eco RI y con las dos enzimas: SmaI + Eco RI. calle 1: SmaI calle 2: Eco RI calle 3: SmaI + Eco RI calle 4: Fragmento sin cortar

calle

kpb
1000

-800

-600

-400

-200

-100

b) Si a partir del gel corrido en el item a) se realiza un Northern-blot utilizando una sonda radioactiva cuya secuencia es complementaria a las primeras 100 pb desde el extremo 5del fragmento, cmo esperara ver la autorradiografa . Dibuje.

calle

kpb
1000

-800

-600

-400

-200

-100

c) Si en lugar de la sonda nombrada en el item b) se utilizara una sonda de 200 pb que hibrida con el fragmento en la secuencia comprendida entre las 400 y 600 pb a partir del extremo 5, cmo esperara ver el resultado de la autorradiografa. Dibuje.

calle

kpb
1000

-800

-600

-400

-200

-100

14) Las vacunas obtenidas por tcnicas de recombinacin de ADN, son ms seguras que las que se fabricaban antiguamente porque: a) Se producen en levaduras y no en bacterias. b) Se usan vectores de clonado. c) Se usan animales transgnicos d) No se utiliza el virus atenuado o inactivado, por lo cual se elimina el riesgo de infeccin.

15) En la terapia gnica, se inserta una secuencia gentica correcta para reemplazar material gentico defectuoso, en un organismo vivo entero o en algunas de sus clulas. Para introducir eficientemente ese material gentico, pueden usarse como vectores: a) plsmidos o csmidos b) retrovirus, adenovirus o liposomas. c) adenovirus solamente d) retrovirus solamente 16) Una enfermedad est relacionada con una mutacin que afecta el sitio de corte de una enzima de restriccin. Este conocimiento puede ser utilizado para desarrollar un mtodo de diagnstico basado en a) huellas dactilares de ADN b) RFLP c) Clonado de ADN

d) Northern blot 17) Indique cul de los siguientes pasos NO corresponde a la deteccin de huellas dactilares de ADN. a) corte con enzimas de restriccin b) transferencia a membrana de nitrocelulosa c) hibridacin con sondas alelo especficas d) electroforesis en gel de agarosa

18) Si necesitamos amplificar un fragmento especfico de ADN, las tcnicas que actualmente pueden utilizarse son: a) Secuenciacin y Northern blot. b) Southern blot c) Clonado en bacterias mediante vector y Reaccin en cadena de la polimerasa d) Amplificar el ADN especfico en bacterias utilizando un vector de expresin. 19) Cmo deberamos proceder si queremos producir una vacuna para Hepatitis B por tcnicas de ADN recombinante? a) Necesitamos conocer la secuencia del ADN correspondiente a una protena glicosilada de superficie del virus de Hepatitis B y expresarlo en levaduras. b) Necesitamos inactivar el virus de Hepatitis B y clonar el ADN de todas sus protenas. c) Necesitamos conocer la secuencia del ADN correspondiente a un antgeno glicosilado de superficie del virus de Hepatitis B y expresarlo en bacterias. d) Necesitamos inactivar el virus de Hepatitis B y clonar el ADN de algunos de sus antgenos de superficie y expresarlos en bacterias. 20) Para la realizacin de un Northern Blot qu pasos cree conveniente seguir? e) Digerir el ADN, correrlo en un gel de agarosa, transferir a membrana e hibridar con una sonda marcada radioactivamente. f) Aislar el ARN total, digerirlo con enzimas de restriccin, correrlo en un gel de agarosa, transferir a membrana e hibridar con una sonda marcada radioactivamente. g) Aislar el ARN mensajero, correrlo en un gel de agarosa, transferir a membrana e hibridar con una sonda marcada radioactivamente. h) Desnaturalizar el ADN por calor, correrlo en un gel de agarosa, transferir a una membrana e hibridar con una sonda marcada radioactivamente. 21) Usted est trabajando en la industria farmacutica y le proponen producir insulina por biotecnologa a gran escala. a) Indique que informacin necesita y cules son las herramientas de biologa molecular con las que debera contar. b) Explique paso a paso cmo procedera y las tcnicas a utilizar. c) Le parece que este sistema es ms econmico que el de purificar la protena desde el pncreas de vaca o cerdo? Por qu? d) Qu puede comentar acerca de la seguridad de su utilizacin en individuos diabticos frente a la insulina extrada desde vacas o cerdos? 22) Para la realizacin de un Southern Blot, qu pasos cree conveniente seguir? a) Aislar el ARN total, separar por tamao, transferir a una membrana e identificar un fragmento b) Aislar el ADN, digerirlo con enzimas de restriccin, separar por tamao, transferir a una membrana, desnaturalizarlo e identificar un fragmento de inters mediante el uso de una sonda. c) Aislar las protenas de un tipo celular, separarlas por tamao en gel de poliacrilamida-SDS, transferirlas a una membrana y reconocer una protena de inters mediante el uso de anticuerpos. d) Desnaturalizar el ADN por calor, cortarlo con enzimas de restriccin, separarlo por tamao, transferir a una membrana e identificar un fragmento mediante el uso de una sonda. 23) Las bibliotecas de ADN copia son: a) Las que contienen todos los fragmentos de ADN derivados de un genoma particular.

b) Las que contienen las secuencias de los ARNm de los genes que se expresan en una determinada clula o tejido. c) Las que contienen los genes que se expresan en un grupo de tejidos de un genoma particular. d) Las que contienen las secuencias de aminocidos de las protenas codificados en los genes de un organismo. 24) Con el objetivo de producir insulina por ingeniera gentica a gran escala, necesitaremos: a) Conocer el gen de la insulina humana y usar un vector de clonado para cada cadena en bacterias. b) Conocer el gen de la insulina humana y usar un vector de expresin en un organismo eucariota como las levaduras. c) Conocer el gen de la insulina humana y usar un vector de clonado para cada cadena en bacterias y luego unir las cadenas in vitro. d) Conocer el gen de la insulina humana y usar un vector de expresin en bacterias para cada cadena, purificarlas y luego unir las cadenas in vitro. 25) A usted lo contratan en el Ministerio de Salud para disear proyectos para el estudio epidemiolgico de enfermedades genticas conocidas. Despus de una evaluacin exhaustiva de la situacin, se decide a utilizar la tcnica de sondas alelo- especficas. a) Cul es la informacin previa que debera tener para aplicar correctamente esta tcnica? b) Explique brevemente todos los pasos necesarios para la obtencin de los resultados por esta tcnica. c) Si en una familia donde existen individuos que sufren de una determinada enfermedad gentica, le da como resultado de la tcnica que son todos normales Qu se le ocurre que podra haber pasado? d) Un mdico del mismo grupo le informa que Usted podra haber utilizado tambin la tcnica de testeo de mutaciones por PCR. Explique en qu se basa esta afirmacin. 26) Usted necesita realizar un estudio de deteccin de enfermedades genticas conocidas dentro de una poblacin. Si dichas mutaciones no ocurren dentro de sitios de restriccin de endonucleasas, qu tcnicas podra utilizar? a) Sondas alelo-especficas y/o testeo de mutaciones por PCR. b) Huellas digitales de ADN o DNA fingerprint. c) Clonado de ADN en bacterias y Southern Blot. d) Polimorfismos en el tamao de fragmentos de restriccin (RFLP). 27) Cul de los siguientes procedimientos NO es parte del proceso normal para la obtencin de un clon de ADN recombinante en bacterias? a) Digestin del ADN celular y plasmdico con endonucleasas de restriccin. b) Produccin de un ADN recombinante usando ADN ligasa y una mezcla de de ADN celular y plasmdico digerido con enzimas de restriccin. c) Separacin del ADN recombinante por electroforesis usando la tcnica de Southern blot para determinar el tamao del fragmento deseado. d) Transformacin de bacterias con el plasmido recombinante y seleccin usando antibiticos 28) Explique en qu consiste paso a paso la tcnica de Secuenciacin de Sanger. a) Se secuenci un fragmento de ADN de un individuo normal y de un paciente. El patrn de bandas obtenido se muestra abajo. Leyendo la secuencia de nucletidos escriba ambas secuencias marcando la diferencia entre ambas. Normal A C G T A Paciente C G T

29) Cul de las siguientes afirmaciones NO CORRESPONDE a la tcnica de Reaccin en cadena de la polimerasa? a) Se agregan alta concentracin de primers, los cuatro deoxirribonucletidos fosfato, ADN polimerasa termoresistente y la muestra de ADN especfica. b) La muestra de ADN especfica se trata con lcali para ser desnaturalizada. c) Luego de separar las cadenas del ADN especfico, se baja la temperatura para que los primers puedan complementar con el fragmento de ADN. d) La ADN polimerasa termoestable cataliza la sntesis del ADN especfico en direccin 5a 3. 30) Se denomina biblioteca genmica a: a) Un listado informatizado de secuencias de ADN conocidas. b) Bacterias con plsmidos que contienen fragmentos de ADN representando la informacin gentica de un organismo. c) Bacterias con plsmidos que contienen secuencias de ADNcopia representando la informacin gentica de un tejido especfico. d) Una recopilacin de las secuencias de aminocidos de las protenas codificadas en los genes. 31) Cul de las siguientes herramientas de la tecnologa del ADN recombinante est INCORRECTAMENTE apareada con su uso? a) endonucleasas de restriccin - produccin de fragmentos de ADN para el clonado de genes. b) ADN ligasa - enzima que corta ADN y crea extremos cohesivos. c) transcriptasa reversa - produccin de ADNc a partir de ARNm. d) electroforesis - anlisis del polimorfismo en la longitud de fragmentos de restriccin (RLFP). 32) Usted est trabajando en el Plan Nacional de Investigacin en Diabetes y necesita clonar el gen de la Acetil CoA Carboxilasa, una enzima de la sntesis de cidos grasos, con el objetivo de estudiar la regulacin de dicho gen por insulina en diferentes condiciones metablicas. a) Qu tcnica utilizara para estudiar la expresin del gen de la Acetil Coa Carboxilasa? b) Explique brevemente en qu consiste la tcnica que eligi y qu elementos necesitara en este caso en particular. c) En un plan de deteccin de enfermedades genticas, descubre que existe un porcentaje de individuos que posee una mutacin del gen de la Acetil CoA Carboxilasa, que genera un nuevo sitio de restriccin para Eco RI dentro del mismo. Utilizando una sonda marcada radioactivamente como se indica en la figura, cul le parece que sera la calle de la autorradiografa correspondiente a la muestra de un individuo normal, cul de un portador y cul de un individuo enfermo? Justifique. El gen entero mide 2 Kb. I------------------ 2 Kb ----------------------I 1,5 Kb 0,5 Kb

I---------------------------------- I--------------I

Eco RI

Eco RI (sitio mutado) Eco RI

Sonda

33) Se transforman bacterias Escherichia coli competentes con un plsmido recombinante el cual posee un gen que confiere resistencia a la ampicilina y el gen que codifica para la -galactosidasa el cual est interrumpido por fragmento de ADNc. Se ponen a crecer las bacterias en agar nutritivo con ampicilina (en presencia de IPTG y sustrato cromognico X-Gal) en estufa a 37C. Al da siguiente se observa: a) Un sobrecrecimiento bacteriano. b) Un nmero reducido de colonias azules. c) Un nmero reducido de colonias blancas. d) No crecieron bacterias. 34) Se transforman bacterias Escherichia coli competentes con un plsmido recombinante que posee el gen que confiere resistencia a la ampicilina y el gen que codifica para la beta-galactosidasa. Este ltimo est interrumpido por el fragmento de ADNc. Se ponen a crecer las bacterias en agar nutritivo con el sustrato cromognico X-gal y tetraciclina en estufa a 37C. Al da siguiente se observa: a) Un sobrecrecimiento bacteriano. b) Un nmero reducido de colonias azules. c) Un nmero reducido de colonias blancas. d) No crecieron bacterias 35) Qu esperara obtener para un resultado satisfactorio de clonado de ADN realizado con un vector que confiere resistencia a Ampicilina y cuyo sitio de clonado mltiple contiene el gen de la galactosidasa, tras colocarse el sustrato de dicha enzima en el medio de cultivo: a) Colonias azules en ausencia de ampicilina. b) Colonias azules en presencia de ampicilina. c) Colonias blancas y azules en ausencia de ampicilina. d) Colonias blancas en presencia de ampicilina.