INTRODUCERE

MOTTO:
Genetica a nceput prin a fi o tiin imposibil. Visele ei, nscute din entuziasm, preau o superb, dar inutil prelungire a alchimiei. Avea parfumul, misterul medieval i ndrzneala tiinelor interzise. Pornea aproape din vid. Tria din iluzii i erori. Dar nimic i nimeni nu o mpiedica s promit c va transforma lumea. Emoionant i nspimnttoare perspectiv. (C. MAXIMILIAN, 1984)

Reprezentnd poate cea mai ocant dintre provocrile tiinei contemporane, clonarea poate fi privit ca un proces de duplicare (i nu de reproducere), n urma cruia rezult un material genetic identic, care nu este ns obinut prin mijloace sexuale. n cadrul reproducerii sexuate, se produce combinarea a dou ADN-uri, unul provenit de la tat i cellalt de la mam, pe cnd n cazul reproducerii asexuate - asemenea clonrii - nu se perpetueaz dect informaia genetic a unui singur printe. n lumea plantelor, clonarea se poate produce n mod natural la plantele care se nmulesc vegetativ, proces care duce la identitatea genetic a descendenilor. Ea se aplic n agricultur i silvicultur, precum i n grdinrit. Dac clonarea este ntlnit n mediul natural nu doar n regnul vegetal ci i n cel animal (n cazul speciilor care se reproduc asexuat), oamenii de tiin au fcut posibil realizarea ei i n medii artificiale (laboratoare), aplicnd-o i la vertebrate. Adevrata senzaie a produs-o experimentul din 5 iulie 1996, cnd Ian Wilmut a clonat primul mamifer: oaia Dolly. n 1999, mitul a fost spulberat. Dolly se nscuse btrn! Au urmat ns vaca, oarecele,

porcul, gina. Prin clonare se pot obine organisme cu caliti "programate". De exemplu, la Institutul Roslin s-au desfurat experimente pentru a se ajunge la vaci care s produc lapte foarte apropiat, din punctul de vedere al compoziiei, de cel uman. Savanii au luat n calcul i posibilitatea ca prin clonare s fie nlocuite animalele de cas care au murit sau s fie refcute speciile ameninate cu dispariia. i de la clonarea animalelor, atenia oamenilor de tiin s-a ndreptat n mod firesc nspre clonarea uman. Nu se poate ns vorbi despre clonarea uman fr a aduce n discuie aspectul etic al problemei. n vara lui 2000 a aprut teoria copilului din doi tai: Clonarea face femeia inutil n perpetuarea speciei i homosexualii pot s se reproduc singuri", afirma un reputat expert britanic n biotehnologie. Imaturitatea acestei ramuri a tiinei, faptul c tehnica clonrii (mai ales la animalele superioare i implicit la om) nu este pe deplin stpnit i impactul major pe care deja l are n societate (cu influene directe asupra condiiei fiinei umane), sunt o parte din motivele pentru care reacia general este una de respingere. "Joaca de-a Dumnezeu" este specific speciei umane, dar nu e recomandat, mai cu seam cnd experimentm pe noi nine. nc de la naterea lui Dolly, cercettorii au nceput s i pun ntrebarea ct de departe se poate merge cu aceast tehnic. Majoritatea oamenilor de tiin au avertizat asupra riscurilor pe care clonarea le presupune n cazul oamenilor. Tehnica nu este nc pus la punct i presupune riscuri i malformaii congenitale, diformiti, deficiene ale sistemului imunitar, mbtrnire prematur. Mai mult, evoluia psihic i mental a unui copil clonat este o mare necunoscut, deoarece observarea evoluiei animalelor clonate nu a dat nici un indiciu cu privire la acest aspect. Teologi i lideri religioi din ntreaga lume s-au pronunat mpotriva clonrii, condamnnd ncercrile oamenilor de a se substitui voinei divine. Anul 2002 a stat sub semnul acestor dezbateri, n urma anunului fcut de o companie american (Advanced Cell Technology), privind obinerea de celule - sue embrionare umane n scop terapeutic (pentru reproducerea esuturilor unor organe umane, cu scopul de a fi transplantate). Se face deosebirea, n acest sens, ntre clonarea reproductiv i cea terapeutic, aceasta din urm fiind privit cu mai mult ngduin, deoarece se consider c ar putea reprezenta o ans uria pentru medicina contemporan. Clonarea n scop terapeutic vizeaz obinerea i utilizarea de celule stem (celule embrionice nedifereniate, omnipotente), n vederea utilizrii n terapia de nlocuire a esuturilor. Am ales CLONAREA ca subiect central al lucrrii de licen din dorina de a cunoate i de a nelege n profunzime aceast tehnic, att de
2

controversat i mediatizat, dar considerat totodat o mare realizare a oamenilor de tiin. Literatura de specialitate a constituit un punct de sprijin n prezentarea principalelor aspecte ale acestei teme i, astfel, n elaborarea lucrrii. Dup cum sugereaz i titlul (Clonarea, din perspectiva tiinei i a bioeticii), lucrarea se compune din dou capitole principale, care abordeaz subiectul din cele dou puncte de vedere. Astfel, primul capitol, Clonarea, din perspectiva tiinei, cuprinde un scurt istoric al clonrii, informaii privitoare la clonarea de gene, precum i date de ordin tiinific, legate de clonarea organismelor (plante, animale i oameni). Cel de-al doilea capitol, Clonarea din perspectiva bioeticii, face referire la problemele de ordin etic i social ridicate de procedeul clonrii. Accentul n acest caz cade, desigur, pe clonarea uman. n aceast direcie am analizat problema sub diferite aspecte, n funcie de implicaiile juridice, religioase i sociale pe care clonarea le-ar presupune. Concluziile de la finalul lucrrii surprind schematic principalele preri personale la care am ajuns n urma documentrii, referitoare la clonarea artificial i efectele pe care o eventual aplicare la scar larg a acestei tehnici le-ar putea avea asupra tiinei, dar i asupra indivizilor i a societii n general. Nu n ultimul rnd, doresc s mulumesc coordonatorului tiinific al lucrrii, Lector univ. dr. tefnescu Grigorie pentru sprijinul acordat. Fr ndrumarea sa, culegerea informaiilor necesare n realizarea acestei lucrri ar fi fost mai dificil i mai puin eficient.

CAPITOLUL I CLONAREA, DIN PERSPECTIVA TIINEI

Ceea ce au fcut cei de la Roslin a reprezentat Sfntul Graal al biogeneticii. John Case Codul genetic

I.1. Din istoria clonrii

Primul pas teoretic s-a svrit n urm cu 50 de ani, n Laboratorul de biologie molecular al Universitii Cambridge din Anglia (1953). Doi cercettori, ulterior laureai ai Premiului Nobel (n anul 1962) - americanul James Watson (n.1928) i britanicul Francis Crick (n.1916) - au stabilit structura acidului dezoxiribonucleic (ADN), substana care posed inclus n structura sa informaia genetic a unui organism. Al doilea pas l-a fcut un alt laureat al Premiului Nobel (1980); e vorba de Paul Berg de la Universitatea Stanford din California (U.S.A.) care, mpreun cu echipa sa, a reuit n anul 1971 s transfere o gen (fragment de ADN) dintr-o celul bacterian n alta. Toate aceste descoperiri fascinante au condus la noi i ndrznee cercetri,

imposibile nainte i au deschis calea manipulrilor genetice de diverse categorii, nu lipsite ns de riscuri. Una din acestea este clonarea, cea mai uluitoare i mai controversat dintre manipulrile genetice. Clonarea este tehnica de obinere a unor celule/organisme identice (din punctul de vedere al zestrei genetice), care pot fi calificate drept clone. Progresele obinute n producerea culturilor in vitro de organe, esuturi i celule vegetale au determinat ca ingineria genetic s fie considerat cel mai promitor domeniu al biologiei experimentale. Se cultiv cu succes in vitro organe vegetative (rdcini i frunze), sau organe reproductive (antere i polen, ovare i ovule, embrioni i endosperm). Se cultiv, de asemenea, esuturi provenite din orice parte a plantei, sau o singur celul care poate fi clonat. Astfel, a devenit posibil regenerarea de plante complete de la calus sau de la o celul unic. Primele experiene de clonare la vertebrate s-au realizat la amfibieni. Avnd n vedere c ovulele mamiferelor sunt de o mie de ori mai mici dect ale amfibienilor, de-abia dup 1980 s-a realizat clonarea la obolani, oi, vaci etc., ns doar pn la stadiul de 8-16 celule. Se credea c dup aceast faz embrionar (aproximativ 14 zile de la fecundare), clonarea nu mai este posibil ntruct n celulele devenite somatice, difereniate, pierzndu-i totipotenialitatea, ADN-ul este definitiv i ireversibil alterat i, prin urmare, nu mai posed patrimoniul genetic care s mai dea natere unui nou organism normal. Dar aceast certitudine s-a prbuit n urma naterii primului mamifer clonat oaia Dolly (la 24 februarie 1997, cercettorii de la Institutul Roslin din Edinburgh, Scoia, au fcut public reproducerea cu succes, pe cale asexuat, a primului mamifer, utiliznd ADN-ul unei singure celule provenind de la o oaie adult).
5

Acest reuit aducea n discuie posibilitatea clonrii umane. De aceea, la 4 martie 1997, Preedintele SUA, Bill Clinton, a interzis utilizarea fondurilor federale pentru clonarea uman, invocnd probleme etice profunde. n iulie 1997, aceiai cercettori britanici au clonat un miel, Polly, care port, potrivit acestora, gene umane. Ei sper astfel s poat produce, pe viitor, proteine umane pentru utilizare medical. Clonarea lui Dolly este proclamat, n decembrie 1997, de ctre revistele de tiin drept cel mai avansat proiect tiinific al anului. Institutul Roslin devine, n mai 1999, proprietatea Companiei americane de biotehnologie Geron Corp. La scurt timp dup acest fapt, Japonia, India i majoritatea rilor europene au interzis clonarea i au impus legi care s supervizeze cercetrile n acest domeniu. i totui, n octombrie 1999, un grup de cercettori japonezi i propun s cloneze un mamut din celule ngheate gsite n Siberia. Procesul se apreciaz c va dura cel puin 5 ani. Dac reuesc, ei vor s deschid un parc n Siberia, dedicat Epocii Glaciare. Procedeul pe care l vor folosi presupune impregnarea cu sperm recoltat de la un mamut congelat, a unei femele de elefant indian. n paralel vor ncerca i cu ADN extras de la un cadavru de mamut descoperit congelat n 1994. ntr-un studiu publicat n revista Nature la 27 mai 1999, cercettorii anun descoperirea unor diferene genetice la Dolly, care sugereaz mbtrnirea prematur a mamiferului, ceea ce pune sub semnul ntrebrii eficacitatea procesului de clonare. Cercettorii de la o Universitate din Honolulu au anunat ntr-un raport publicat n revista Nature Genetics la 1 iunie 1999 realizarea prin clonare a unui oarece (Fibro), pornind de la o celul din coada unui oarece adult. S-au utilizat 700 de celule din coada oarecelui adult, doar 274 s-au transformat n embrioni, iar singurul care a supravieuit a condus la naterea lui Fibro.
6

Prima clonare la primate s-a realizat n anul 2002, cnd la Centrul pentru primate din Beaverton (Oregon) a luat natere maimua Tetra. Februarie 2002 cercettorii japonezi care au clonat mai muli cobai, se pronun asupra incertitudinii reuitei procesului de clonare (datorit gradului mare de mortalitate a clonelor). n aceeai lun, oamenii de tiin au afirmat c un cobai clonat a devenit obez. Cercettorii de la Universitatea din Texas, A&M, au afirmat, n aceeai perioad, c au clonat o pisic, botezat CC (carbon copy). Experimentele legate de clonarea uman, nu s-au lsat ateptate. n luna mai a anului 2002, un expert n fertilizare, Panayiotis Zavos, din Lexington, Kentucky a declarat n cadrul unui congres de profil, c anul 2002 va fi anul clonelor i c lucreaz la clonarea unei fiine umane. El a solicitat Congresului s urgenteze legalizarea clonrii, pentru a-i putea definitiva cercetrile. n noiembrie 2002, dr. italian Severino Antinori, un expert n fertilizare, declar public c n ianuarie 2003 se va nate prima clon uman i c alte dou femei sunt nsrcinate cu embrioni clonai. Pe 27 decembrie 2002, Clonaid, o companie a unui grup care crede c oamenii au fost creai de extrateretri, anun naterea, la data de 26 decembrie, prin cezarian, a primei clone umane, o feti pe nume Eva, cu o greutate de 3,1 kg. Compania a anunat c se ateapt naterea altei clone, n Europa, la nceputul anului 2003. Brigitte Boisselier, preedintele societii Clonaid, fondat de secta raelienilor, a anunat naterea, n 5 ianuarie 2003 a celui de-al doilea bebelu clonat, ntr-o ar din nordul Europei, ca fiic a unui cuplu de lesbiene olandeze. Clonaid a anunat naterea a nc 3 bebelui clonai pn la nceputul lunii februarie.
7

Cum nu exist ns dovezi concludente n ceea ce privete reuita clonrii umane, aceste afirmaii sunt privite cu reticen de ctre oamenii de tiin i opinia public. Biogeneticianul Rudolph Jaenisch, specialist n clonare animal, la Whitehead Institute, Cambridge, nu crede n reuita raeliilor. De asemenea, comunitatea tiinific internaional se arat extrem de sceptic. n mijlocul febrei clonrii umane, moartea vestitei Dolly a trecut aproape neobservat. La 6 ani i jumtate de la natere, suferind prematur de artrit i o boal a plmnilor, Dolly a fost eutanasiat n februarie 2003 i donat Muzeului Naional al Scoiei din Edinburgh. n aceeai perioad (februarie 2003), moare n mod neateptat, din cauze necunoscute, prima oaie clonat n Australia, la vrsta de 2 ani i 10 luni.

I.2. Clonarea genic

Termenul de clonare genic (clonare ADN) semnific producerea de copii exacte (clone) ale uneia sau unor anumite gene cu ajutorul tehnicilor de inginerie genetic. ADN-ul care conine gena urmrit este fragmentat cu ajutorul enzimelor de restricie. Fragmentele rezultate sunt incluse n vectori de clonare, cum ar fi de exemplu plasmidele bacteriene sau bacteriofagii, care transfer ADN-ul recombinat n celule gazd corespunztoare, de exemplu celule bacteriene de Escherichia coli. Alte variante ale acestei tehnici sunt includerea de ADN complementar n vectorii de clonare sau preluarea fragmentelor de ADN nude direct din mediu de ctre bacteriile gazd (este mai puin eficient dect transferul realizat cu ajutorul vectorilor). n interiorul celulei gazd ADN-ul recombinat este replicat, din celula gazd bacterian rezultnd o colonie de celule care conin gena clonat. Aceste colonii pot fi identificate prin diverse metode, iar apoi pot fi selecionate i cultivate.
8

Dup ce se realizeaz o selecie a clonelor recombinate, fragmentele de ADN ce prezint interes vor fi analizate. Gena de interes poate fi amplificat prin utilizarea tehnologiei PCR (reacia polimerazei n lan), fiind subclonat ntr-un vector specific i introdus ntr-o gazd nou, sau gena poate fi modificat prin mutagenez in vitro, iar funciile sale (modificate) sunt studiate ulterior. Clonarea genic uureaz secvenierea genelor; de asemenea, permite obinerea unor cantiti mari de produse proteice: insulina uman de exemplu, este produs n prezent de bacterii care conin gena clonat a insulinei. I.2.1. Transferul ADN-ului recombinat n celule gazd Tehnicile care urmresc manipularea direct a ADN-ului prin clonare molecular, avnd ca model transferul de gene din celula animal n celulele bacteriene, se desfoar n etape succesive, una dintre acestea fiind obinerea genelor de interes. Aceasta se poate realiza fie prin izolarea genelor naturale, fie prin sinteza chimic a unor molecule de ADN ce codific proteinele dorite. Reuita experimentelor n urma interveniilor prin diverse procedee este condiionat de prezena integral a genei dorite i a unei ct mai mici cantiti de ADN nesemnificativ sau parazit periferic. Obinerea fragmentelor de ADN ce servesc pentru clonare se poate realiza practic pe patru ci: - izolarea genelor din ADN-ul natural cu ajutorul enzimelor de restricie; - fragmentarea mecanic a ADN-ului; - sinteza enzimatic a ADN-ului dublu catenar complementar (ADNc); - sinteza chimic a genei; I.2.2. Clonarea de gene n celule bacteriene
9

Clonarea unei gene sau a ADNc ce codific o anumit protein reprezint doar prima dintre numeroasele etape necesare pentru a produce o protein recombinat, utilizabil n practic. Urmtoarea este aceea a introducerii genei ntr-o gazd convenabil i de a asigura un sistem de exprimare eficient. Clonarea genelor n celulele bacteriene ofer unele avantaje ce in de: simplitatea celulei, timp scurt de generaie, cantitile mari de produs la un cost relativ sczut, experien n ceea ce privete cultivarea acestora la scar industrial. O alternativ de gazd pentru clonare o reprezint celulele de drojdii (n special Saccharomyces cerevisiae), care, fiind celule eucariote, pot oferi unele avantaje ce in de modificrile posttranslaionale, de secreia anumitor proteine n mediu (puine n mod natural), ceea ce d posibilitatea obinerii compusului dorit ntr-o stare destul de pur. Industria biotehnologic a nregistrat deja rezultate remarcabile, mai ales n ceea ce privete domeniul medicamentelor, prin utilizarea genelor de interes. Tot cu ajutorul ingineriei genetice s-a reuit producerea de anticorpi monoclonali, utilizai deja pentru diagnosticarea unor infecii i a cancerului, examinndu-se n prezent posibilitatea utilizrii lor terapeutice. I.2.3. Clonarea de gene n celula vegetal i animal Speciile vegetale prezint o mare diversitate genetic, iar cele slbatice constituie un mare rezervor genetic, din care se pot obine gene importante din puct de vedere practic. Prin aplicarea noilor tehnologii (ingineriei genetice), controlate corect de ctre om, se pot obine rezultate considerabile n ameliorarea plantelor: se pot introduce n plante gene noi sau se poate mbunti exprimarea genelor deja existente. Un experiment de clonare de gene n celulele animale are aceleai etape eseniale ale oricrui experiment de inginerie genetic: izolarea genei de
10

interes, introducerea sa ntr-un vector de clonare specific i apoi ntr-o celul gazd i, n final, realizarea condiiilor de exprimare a genei clonate. n cazul clonrii de gene n celulele mamaliene, alegerea unui vector corespunztor reprezint o problem special. Un vector de exprimare eficient trebuie s fie capabil s se multiplice att n E. Coli, ct i n celula mamalian.

I.2.4. Originea clonal a cancerelor Un mare progres n medicin s-a realizat n momentul n care s-a putut demonstra c o neoplazie nu rezult dintr-o stare anormal a unui organism sau esut, ci aproape toate procesele neoplazice i au originea ntr-o singur celul anormal, cu alte cuvinte, cancerele sunt clonale. Originea clonal a cancerelor a fost demonstrat n cazul cancerelor experimentale, obinute prin clonare celular n culturi de celule. Celulele tumorale sunt un fel de clone renegate, multe tumori derivnd dintr-un grup de celule de acelai fel care se multiplic necontrolat. Omul a reuit s profite de pe urma fenomenului de proliferare tumoral. Miznd pe capacitatea celulelor tumorale de a se multiplica la nesfrit, atta vreme ct li se asigur condiii potrivite, cercettorii au realizat alte tipuri de celule. Celulele productoare de anticorpi sunt fuzionate cu celule tumorale, rezultnd celule hibridoma, care produc anticorpi i se reproduc la nesfrit. Anticorpii obinui se numesc anticorpi monoclonali, fiind produi, fiecare n parte, de o anumit linie clonal celular. Aplicaiile lor sunt numeroase i valoroase pentru cercetare i n medicin. Pot fi utilizai, de exemplu, ca reactivi de diagnostic. Astzi, n terapia bolilor tumorale se ntrevede posibilitatea identificrii i distrugerii intite a anumitor molecule ARNm, care induc translaia informaiei pentru sinteza unor substane oncogene.
11

Cu ajutorul experienelor de clonare s-a reuit citirea de secvene de ADN de pe lanul ADN al genomului unui organism. Pasul urmtor l reprezint obinerea unor modificri ale acestor segmente ADN, cu ajutorul unor tehnici de inginerie genetic, ct i introducerea acestor segmente astfel modificate de ADN n celule sau organisme, unde aceste modificri urmeaz a se exprima.

I.2.5. Clonarea genic i descifrarea genomului uman Proiectul de studiu al genomului uman va deschide o er nou n dezvoltarea tiinelor medicale, va crea premise ca medicii s poat dispune rapid de portretele genetice ale nou-nscuilor (structura genomului celular), n vederea depistrii rapide a predispoziiei genetice pentru anumite boli, lundu-se, n consecin, msuri preventive. Prin realizarea acestui proiect, analizele prenatale i diagnosticul genetic vor intra in diagnosticul medical de rutin. Crearea unei biblioteci de clone de gene umane este primul pas utilizat n scopul descifrrii genomului uman, urmat de identificarea i cartografierea genelor. Clonarea de gene se refer la multiplicarea ADN-ului (a secvenelor nucleotidice respective din structura acestora). Clonarea ADN se recomand totdeauna atunci cnd e necesar izolarea i multiplicarea unui segment ADN dintr-un genom, n cazul nostru o gen. Prin clonarea fragmentelor de ADN originar din genomul uman, rezult materialul pentru biblioteca de gene. La nceput, multiplicarea acestui ADN se fcea prin anumite tehnici de inginerie genetic, in vitro, n celule bacteriene de Escherichia coli; din 1985, multiplicarea acestui ADN a devenit posibil i in vivo, prin utilizarea reaciei polimerazei n lan (PCR). Cu ajutorul acesteia, doar n cteva ore, din probele
12

de ADN se obine un numr mare de copii identice corespunztoare unei anumite gene. Genele din genomul eucariot sunt transferate cu ajutorul unui vehicul corespunztor n organismul procariot, iar apoi aceste noi gene transferate se multiplic cu o rat foarte mare n organismul procariot. n acest fel, organismele procariote (microorganisme tip bacterii), cu o rat foarte mare de multiplicare pot fi utilizate pentru sinteza anumitor gene din organismele superioare. Acest tip de combinaie ADN in vitro, urmat de clonarea genelor nou transferate, se folosete astzi pe scar industrial. Reacia polimerazei n lan (PCR) este folosit pentru cercetarea unor cantiti foarte mici de ADN dintr-un produs biologic, avnd anumite avantaje: - fiind foarte sensibil, reacia poate pune n eviden chiar i prezena unei singure molecule de ADN, n probele de cercetat, deoarece reacia ofer posibilitatea multiplicrii (clonrii) ADN-ului chiar i n afara celulei vii; - reacia permite chiar i multiplicarea unei singure molecule de ADN. Ca urmare, i gsete aplicaii n: medicina judiciar, studii de evoluie biologic, studii ecologice, arheologie. I.2.6. Clonarea ADN-ului Clona bacterian reprezint un grup de celule bacteriene identice din punct de vedere genetic, care provin dintr-o singur celul bacterian. Clonarea se poate realiza prin ncorporarea (printr-o tehnic de recombinare ADN) a unui fragment de ADN strin ntr-un vector care ulterior este introdus i multiplicat ntr-o celul gazd. n biologia molecular, clonarea semnific obinerea unei culturi de celule dintr-o celul unic, astfel nct s se obin o poulaie uniform din punct de vedere genetic. I.2.6.1. Etapele principale ale metodei de clonare:
13

1. extragerea unui fragment ADN, prin tierea ADN-ului genomic, cu ajutorul enzimelor de restricie; 2. introducerea fragmentului ADN ntr-un vector; 3. introducerea vectorului recombinant (plasmid care a nglobat fragmentul ADN strin) n celula gazd; 4. selectarea celulelor bacteriene care conin vectorul recombinant. Clonarea se recomand atunci cnd este necesar izolarea i multiplicarea unui segment de ADN (dintr-un genom). n majoritatea experimentelor de clonare, se folosesc celule bacteriene de E. coli. I.2.6.2. Biblioteca genomic ADN (secvene de exoni i introni) Dac genomul unui organism este secionat cu enzime de restricie, iar diferite fragmente de ADN sunt clonate (n celule bacteriene), se va obine un numr de clone corespunznd diferitelor amestecuri (vector plasmidic + segment ADN). Totalitatea acestor clone rezultate din genomul unui organism iniial reprezint biblioteca genomic ADN. Acest mod de clonare reprezint tehnica mpucrii (shotgun). Clona ADN genomic a unuia i aceluiai organism este totdeauna identic i independent de tipul celular, deoarece toate celulele aceluiai organism posed o nzestrare genetic identic. Din aceast bibliotec se obin secvene ADN necesare pentru tehnica de hibridizare; acestea vor fi folosite drept secvene ADN cu rol complementar (cu secvene ADN cunoscute), n vederea identificrii unor fragmente ADN noi, necunoscute, a cror secvene nucleotidice trebuie cercetate i identificate. Clonele genomice ADN vor conine att secvene de introni, ct i de exoni, corespunztoare genomului celulei respective de origine. Clonele din biblioteca genomic ADN se folosesc pentru: - cercetarea structurii complete a genelor; - cercetarea structurii exonilor i intronilor; - cercetarea secvenelor reglatoare.
14

I.2.6.3. Biblioteca ADNc (ADN copie dup matria de ARNm matur) Reprezint doar o informaie pur format numai din secvene de exoni. Spre diferen de biblioteca genomic ADN, care rezult din clonarea de fragmente ADN originar direct din genom, fragmentele ADNc se sintetizeaz artificial n laborator, pe o molecul de ARNm matur, drept copie complementar (n prezena reverstranscriptazei). n timp ce clonele de ADN genomic sunt identice pentru toate celulele aceluiai organism, clonele ADNc sunt diferite pentru diferitele tipuri de celule ale aceluiai organism. Clonele din biblioteca ADNc se folosesc n special n scopul analizei directe a secvenelor de baze care codific un anumit aminoacid sau produsul proteic final (codificat de respectivul fragment ADNc). Secvena clonelor ADNc este studiat n special prin experimentele de hibridizare.

15

CLONAREA ORGANISMELOR
Printre organismele unicelulare, ca bacteriile, clonarea este un proces natural. Cnd reproducerea bacterian are loc prin diviziune celular, fiecare dintre cele dou celule fiice este clona celeilalte. Dezvoltarea tehnicilor de cultur in vitro a celulelor animale i vegetale a creat premisele pentru obinerea de clone celulare. n procesul de clonare, o singur celul este cultivat pentru a forma o colonie de celule identice. O astfel de tulpin sau sue pur genetic constituie o clon celular.

I.3. Clonarea la plante.

Procesul este cunoscut nc din antichitate, deoarece empiric s-a observat la plante c prin tierea unei crengue dintr-un individ i nrdcinarea sa se obin indivizi identici cu planta de origine. De altfel, nsi denumirea de clonare provine de la grecescul klon care nseamn crengu, rmuric, buta. Clonarea a fost iniial folosit la plantele care se pot nmuli vegetativ, cum este via-de-vie, pomii fructiferi etc. i care n acest fel i pstreaz intacte caracteristicile genetice. Un segment din corpul plantei se poate desprinde pentru a forma o alta, identic cu planta de provenien. i ciupercile
16

se pot nmuli printr-un fragment din corpul lor, numit, la fel ca la alge, muchi i licheni, tal. Fragii de pdure (Fragaria vesca) i cpunul (Fragaria ananasa) se nmulesc predilect prin clonare (lstrire). Marcotajul folosit de viticultori este i el o clonare, reprezentnd mijlocul cel mai eficace de a transmite nsuirile bune ale unui soi de vi-de-vie descendenilor. I.3.1. Clonarea plantelor obinute prin cultur in vitro La plante, celulele manifest fenomenul de totipoten prin care, pe un mediu de cultur in vitro favorabil, dintr-o celul preluat din frunze, tulpin, inflorescen etc., se obine un organism normal. Mai mult, la plante exist posibilitatea ca prin cultura de celule cu numr de cromozomi redus la jumtate prin cultura de polen, antere, ovule, ovare, s se obin organisme haploide, plante dezvoltate normal, dar sterile. Prin tratamente adecvate, de pild cu ajutorul colchicinei, aceste plante i dubleaz numrul de cromozomi, se diploidizeaz i devin linii pure genetic sau linii izogene. Este o metod modern, mult utilizat n programele de ameliorare a plantelor. Regenerarea in vitro dintr-o celul difereniat a unei plante ntregi are la baz fenomenele de totipoten i dedifereniere. n procesul de regenerare de organisme n cultura in vitro de celule vegetale se pot obine protoclone, n cazul plantelor regenerate din protoplaste (celule vegetale lipsite de perete celular), somaclone, n cazul plantelor regenerate din celule somatice (2n), i gametoclone, n cazul plantelor regenerate din esuturi gametice (n). Adesea, n cultura de celule i esuturi vegetale este generat variabilitatea genetic ce este transmis la plantele regenerate i la descendenii lor. Acest tip de variabilitate a fost denumit de P. J. Larkin i W. R. Scowcroft (1981) variaie somaclonal, ea constituind o nou surs de genotipuri utile pentru programele de ameliorare.
17

Mai mult, la plante s-au realizat n ultima vreme linii celulare stabile genetic, care pot fi crescute n suspensii pe medii nutritive similar culturilor de microorganisme (bacterii, drojdii etc.). Aceste linii celulare au mare importan aplicativ, ele putnd fi cultivate industrial n fermentatoare sau fitostate, constituind o alternativ la cultura plantelor n condiii naturale. Se cultiv astfel linii celulare (adevrate clone celulare), capabile s produc substane farmacologic active pentru industria medicamentelor, aditivi alimentari, produse cosmetice etc. De la astfel de linii celulare cultivate in vitro se pot obine produi metabolici de mare valoare economic, cum sunt alcaloizii din celulele de tutun, saponinele din celulele de Panax ginseng i Radix ginseng (plante utilizate pe scar larg n medicina tradiional chinez), carotenii din morcovi, antibioticele din Phytolacca americana etc.

Fig.1. Obinerea de plante clonate din culturi celulare I.3.2. Metode i tehnici de bioinginerie vegetal
18

Prin aceste metode, se pot face culturi in vitro de rdcini, de meristem apical, de frunze, embrioni, endosperm, antere, ovare, microspori izolai, esuturi vegetale, sau celule singulare. Sunt de asemenea posibile polenizarea i fecundarea in vitro. Cultura in vitro de esuturi i celule este aplicat cu succes n cteva scopuri i anume: propagarea rapid i n mas a unor soiuri, prezervarea materialului genetic de la genotipuri valoroase, realizarea i meninerea de plante libere de viroze. I.3.2.1. Cultura i clonarea monocelular Cultura unei singure celule a fost realizat nc din 1930 de ctre Wright.T. i col., care au cultivat i clonat o celul bacterian patogen. Ulterior, s-a reuit cultura i clonarea unei singure celule de fungi, a unei celule vegetale i animale. Principiul de baz al culturii de celule izolate este capacitatea acestora de a-i manifesta totipotena, capacitate demonstrat experimental de Steward F. C., care a reuit s regenereze plante normale i fertile din celule ale floemului secundar din rdcini de morcov, cultivate n suspensie, n mediu lichid. Acest principiu fusese, de altfel, definit nc din 1839 de Schwann T., n felul urmtor: Orice celul somatic, desprins din legturile ei fireti cu cellalte celule i esuturi i cultivat pe un mediu corespunztor, se poate comporta ca i un zigot (celul care n mod normal este totipotent), adic se poate divide continuu, poate da natere unui esut diferit de cel din care provine i poate reconstitui planta ntreag. Celulele pot fi obinute de la calus produs pe un mediu solid sau de la celule n suspensie, n care alturi de mici agregate celulare pot fi i monocelulare. I.3.2.2. Iniierea culturilor de monocelule i clonarea
19

Primul succes privind izolarea unei singure celule de la plantele superioare a fost posibil datorit observaiilor acumulate din experienele anterioare cu celule bacteriene. O singur celul izolat, cultivat in vitro, nu se divide, n timp ce existena mai multor celule n acelai mediu, induce capacitatea de proliferare. Dac se plaseaz pe un mediu, o celul izolat i o colonie hrnitoare, celula se multiplic, genernd colonii, care, atingnd o anumit mrime, devin capabile s se dezvolte izolat pe un alt mediu. Dac se obin astfel, diferite clone, pornind de la celule provenite dintr-o singur colonie celular de tutun, s-a constatat c fiecare clon posed caracteristici diferite. Cteva din acestea genereaz muguri sau plante ntregi, altele nu; unele elaboreaz clorofil, altele nu. Astfel de clone creeaz posibilitatea evidenierii heterogenitii genetice a coloniilor celulare. Pentru cultura in vitro a unei singure celule se utilizeaz trei metode: a) Metoda nurse-raft sau a suportului nutritiv, care const n plasarea celulei izolate pe o hrtie de filtru deasupra esutului de calus care acioneaz ca o surs de hran. Tehnica de lucru, dup Hildebrandt A. C. (1977) implic recoltarea unei singure celule din cultura de suspensii celulare sau de la cultura de calus pe mediu cu agar, cu ajutorul unei micropipete sau a unui microscop binocular. Cu o zi-dou anterior recoltrii celulelor, un ptrat de hrtie de filtru steril (8x8 mm), se plaseaz aseptic n vrful calusului provenit de la specia de la care este obinut i celula. Hrtia de filtru este umectat cu mediu nutritiv lichid, al esutului de calus hrnitor. Celula plasat pe hrtia de filtru se poate divide i produce o mic colonie celular dup cteva zile, pn la cteva sptmni, n funcie de specie. Transferul monocelulei pe suportul de hrtie de filtru va fi rapid realizat pentru a evita
20

uscarea excesiv a celulei lichidului pe hrtie. De la celulele care supravieuiesc se vor dezvolta mici colonii celulare, care vor fi apoi transferate direct pe mediu proaspt pentru a continua creterea. b) Metoda microculturii const n cultura aseptic ntr-o pictur de mediu lichid, nconjurat de ulei mineral pe o lam microscopic. Tehnica de lucru dup Hildebrandt A.C. (1977) i iniiat de Jones L. E. i col. (1960) cuprinde urmtoarele operaiuni: cu o micropipet steril se ia o pictur direct din cultura de suspensie celular, sau suspensia se toarn ntr-un vas Petri i se prelev o singur celul cu micropipeta, suspensia fiind observat la microscopul binocular. Pictura de mediu cu una sau mai multe celule se plaseaz pe o lam microscopic steril i se nconjur de ulei mineral. Cte o pictur de ulei mineral se pune pe fiecare latur a picturii de mediu, iar peste cele dou picturi de parafin se aeaz cte o lam steril. O a treia lamel este plasat peste mediul de cultur cu celula, fcnd legtura ntre cele dou lamele laterale, realizndu-se astfel, o microcamer care include o singur celul, nconjurat de pictura de ulei mineral. Camera de microcultur este plasat apoi ntr-un vas Petri i incubat. Celulele pot supravieui i crete timp de mai multe zile i chiar luni, ntr-o singur pictur de mediu nutritiv, fr ca acesta s fie schimbat. Cnd colonia celular e suficient de mare, se ridic aseptic lamela i colonia celular este transferat pe mediu proaspt, lichid sau cu agar. c) Metoda plating-ului folosit pentru clonarea unor specii vegetale a fost iniiat i experimentat de Bergmann I. Monocelulele sunt obinute de la suspensii celulare cultivate n
21

mediu lichid White. n scopul obinerii unor suspensii unicelulare se folosesc dou filtrri succesive a suspensiei celulare iniiale. n baloane Erlenmeyer care conin mediu lichid proaspt, aproximativ din volumul lor, se ataeaz cte un tub care are la unul din capete o sit filtrant ai crei pori au diametrul 0,3 mm, respectiv 0,1 mm. n urma primei filtrri se separ colonii mai mari de la o singur celul, iar coloniile mici trec prin sita filtrant n mediul lichid. A 2-a filtrare permite separarea monocelulelor de la colonii de celule mici. O singur celul a fost apoi izolat prin plating-ul suspensiei pe mediu White cu sau fr agar, n vase Petri. Vasele sunt apoi izolate, pentru a preveni uscarea excesiv a agarului i se incubeaz la 22 C, la lumin difuz. ntr-un strat fin de agar de 1 mm, celulele pot fi observat la microscop prin capacul vasului Petri. Prima diviziune se observ ntre a 2-a i a 40-a zi dup plantare. I.3.3. Micromultiplicarea clonal a soiurilor valoroase Elaborarea unor metode eficiente de cultur in vitro de celule i esuturi vegetale a fcut posibil multiplicarea rapid, n laborator, a unor genotipuri valoroase. De exemplu, n cazul orhideelor care se nmulesc extrem de dificil, se poate realiza prin metoda culturilor de esuturi o rat de nmulire foarte rapid, de 100 000 de plante pe an, pornind de la o singur plant-mam. Toi indivizii obinui sunt identici genetic cu planta de origine, constituind adevrate clone. Micromultiplicarea vegetativ permite producerea a milioane de plante provenite de la acelai genotip cu valoare practic, prin clonare. Propagarea vegetativ in vitro se aplic cu precdere la plantele ornamentale, orhidee, cpuni, arbori forestieri,pomi fructiferi, cartof, via-de-vie etc. Prin cultura in
22

vitro de esuturi i celule se obin fr dificulti la majoritatea speciilor vegetale calus, de la care, prin difereniere pot fi regenerate plante complete. Rezultate bune se obin prin utilizarea culturii de meristeme. Acestea pot fi: meristeme apicale, primordii foliare, primordii florale. De asemenea, pentru cultura in vitro se poate utiliza esut din orice parte a plantei. Speciile de plante ornamentale care beneficiaz substanial de cultura in vitro sunt orhideele. Se asigur prin multiplicare clonal producerea n mas de plante calitativ superioare, precum i obinerea unor plante de la hibrizi valoroi. Cultura in vitro de meristem de orhidee permite o cretere de 5 la 10 ori a numrului de plante/lun. De exemplu, la specii de orhidee din genul Cymbidium, dintr-un singur explant de meristem, prin clonare in vitro, n decursul unui an, se pot obine peste 4 milioane de plante identice. Dup circa 4 ani de la trecerea plantulelor n ser se obin plante apte de nflorit. Plantele obinute prin cultura in vitro manifest deci o mare uniformitate i un coeficient de nmulire foarte ridicat. Un alt exemplu concludent l constituie specia Chrysanthemum morifolium, la care, dintr-un apex s-au format 9 milioane de plante/an pe calea sistemului de micromultiplicare, pe cnd, prin sistemul de nmulire vegetativ prin butai, au rezultat mai puin de 30.000 plante/an. La alte specii de plante ornamentale cu importan economic, aparinnd la diferite genuri (Anthirium, Pelargonium, Begonia, Freesia, Chrysanthemum, Dianthus, Gerbera, Syringa, Rosa, Forsythia, Magnolia .a.), se aplic de asemenea, cu rezultate pozitive, micromultiplicarea vegetativ. Prin cultura in vitro de esut meristemal sau de embrioni s-a obinut calus. Acest sistem de culturi s-a extins pentru producia comercial de clone (Anthirium andreanum i A. scherzerianum). La via-de-vie, n fiecare lun se pot realiza 5 clonri, astfel c prin cultura unui singur meristem se pot produce mai mult de 10 milioane de clonri/an.
23

Din explante regenerate i clonate in vitro, transplantate n mediul septic din sere, rezult plante care nfloresc la 7-8 luni la garoaf (dintr-un singur explant meristemal tulpinal de garoaf, cultivat in vitro, dup aproximativ 60 de zile, se pot obine 40-50 plantule), la 10-12 luni la crizantem etc. Cultura in vitro de explante din muguri tulpinali de circa 1 mm, urmat de clonri succesive pe medii adecvate s-a realizat cu succes i la Gerbera, la care s-au obinut plantule complet conformate, care, dup transferare pe mediu septic au produs plante mature cu nflorire normal. Aceste plante sunt de o calitate superioar, viguroase, sntoase i mult mai ieftine. n general, clonarea plantulelor neoformate in vitro, nu numai la orhidee, dar i la alte plante ornamentale i cultivarea lor pe medii aseptice poate determina obinerea celui mai mare indice de multiplicare a unui individ sau genotip dorit. Acest procedeu are avantajul c explantul donor fiind sntos, alturi de obinerea a mii de plante, copii fidele ale unui exemplar unic, duce la obinerea unor plante n totalitate sntoase, eradicate de viroze. La cpun, cultura de meristeme pentru obinerea de plante libere de viroze a fost prima dat realizat prin cultura de meristeme a 55 de clone de la plantele infectate, din care 24 clone cu 4 virusuri, 25 de clone cu 2 virusuri, 4 clone cu un virus i 2 clone cu 3 virusuri. n absena termoterapiei, toate cele 55 de clone meristemale au fost libere de viroze. Multiplicarea industrial i obinerea de plante libere de viroze la cpun se bazeaz pe metoda culturii in vitro pe mediu bazal de meristeme, dup care urmeaz testarea pentru virusuri a plantelor obinute. Prin acest procedeu e posibil obinerea de milioane de plante/an, pornind de la o singur plant mam. La plantele adaptate la reproducerea vegetativ, prin clonarea plantelor din generaia F1, vigoarea hibrid (heterozisul) poate fi fixat n toate generaiile asexuate. Aceast modalitate va putea fi aplicat i la specii obinuit sexuate (porumb, floarea-soarelui, sfecl etc.), n urma perfecionrii
24

clonrii unor esuturi, realizarea embrigenizrii i reconstituirea unor plantule in vitro. Micromultiplicarea clonal, pe de-o parte, fixeaz genotipul (eliminarea meiozei inhib segregarea), iar pe de alta, prin controlul mediului de cultur se poate realiza o testare mult mai eficient i complex chiar la nivel celular (prin clonare celular), iar selecia se aplic pe un numr incomparabil mai mare de indivizi. Prin clonare este posibil inducerea i detectarea de mutaii la celule cultivate in vitro (ex.: clonele celulare care pe mediu complet cresc normal, n timp ce pe unul sau pe altul dintre mediile de selecie sunt defective, relev o mutaie auxotrof, care le face incapabile s sintetizeze baze azotate, aminoacizi, vitamine etc., care lipsesc din mediu.) Diviziunea in vitro a protoplatilor a dat natere, dup cteva zile, unor colonii celulare, din care, dup clonare i adugarea substanelor de cretere (auxine i citokinine) a proliferat calus. Pentru plantele de cultur, n urma preparrii unor protoplati cu capacitatea de a regenera plante ntregi, tehnicile de clonare a genei i de ncorporare a genelor dorite n alte celule, n vederea mbuntirii caracteristicilor de cretere sau nsuirilor de calitate, prezint beneficii poteniale enorme. n eprubete, noile plantule sunt foarte mici, i pe mediu de agar se dezvolt foarte lent, mai ales cnd din mediu au fost consumate unele substane nutritive. Plantulele pot rmne n aceeai stare mai multe luni, practic fr cretere. Dup circa 6 luni, sau n fiecare an, planta se cloneaz, iar explantul tulpinal cu un nod i o frunz se transfer, n condiii aseptice, pe mediu de cultur, ntr-o nou eprubet. Astfel, prezervarea genotipurilor prin cultur in vitro reduce spaiu, timp i bani.

25

Fig.2. Plante clonate i cultivate in vitro I.3.4. Riscuri presupuse de clonarea plantelor I.3.4.1. Vulnerabilitatea genetic Reproducerea vegetativ prezerv neschimbat structura genotipurilor. Ca urmare, fragmentarea sau clonarea corpului unei singure plante iniiale, d natere unei descendene format din indivizi uniformi genetic (clone). Aadar, la speciile cu nmulire vegetativ, soiurile constau dintr-o clon sau o populaie de clone asemntoare fenotipic. Soiurile clonale se pot heterogeniza n urma unor mutaii genice somatice (care pot afecta capacitatea de producie, culoarea, mrimea i forma florilor, fructelor sau frunzelor, tipul creterii, adaptabilitatea etc.) sau alte modificri genetice (dislocaie, ploidie) care se manifest prin includerea n muguri (variaii mugurale). Cnd asemenea variaii mugurale, aprute spontan sau induse cu ajutorul unor ageni fizici sau chimici afecteaz caracteristici fenotipice detectabile,ele pot fi supuse seleciei.

26

Astfel, prin aplicarea seleciei intraclonale se pot pune bazele unor noi clone, respectiv unor noi soiuri. Uniformitatea genetic, care determin uniformitate fenotipic, trebuie s caracterizeze i soiurile linii pure i soiurile de prim generaie hibrid, F1, ca i soiurile clonale noi, fiind cerut de industria alimentar i comer. Uniformitatea genetic, alturi de multe trsturi pozitive, determin i multe riscuri dintre care profund negativ este faptul c uniformitatea genetic invit epidemiile, determinnd vulnerabilitatea genetic a culturilor la boli i duntori, precum i la condiii de mediu nefavorabile. Acest fenomen, al vulnerabilitii genetice, apare fie datorit faptului c genele de rezisten s-au pierdut n procesul de ameliorare, fie c patogenii sau schimbat prin mutaie, rezultnd rase noi, care, gsind condiii favorabile de mediu, realizeaz atacul n mas al culturilor. I.3.4.2. Riscuri de ordin evolutiv: pierderea variabilitii genetice Se consider c formele asexuate nu formeaz specii, nu au potenial evolutiv, sunt linii moarte ale evoluiei (Cain, 1958; Eldredge, 1985). n accepia Teoriei Sintetice a Evoluiei (TSE), formele asexuate nu formeaz nici populaii, nici specii, ci doar colecii de clone independente. n aceeai accepie, obiectul esenial al seleciei este organismul individual. Dar, cum poate aciona selecia asupra formelor agame dac organismele din fiecare clon sunt identice din punct de vedere genetic? Evident, selecia nu poate aciona asupra acestor organisme, ea rmne fr obiect, iar clonele, i, n general, formele agame devin lipsite de potenial evolutiv. Totui, nu toi cercettorii sunt de acord cu aceast condamnare a formelor agame. Khokhlov (1966), Serebrovsky (1973) consider c grupurile apomictice de plante reprezint linii evolutive de mare perspectiv. Din acest
27

punct de vedere e semnificativ faptul c ele sunt foarte frecvente printre graminee i compozite, familii prospere, n plin evoluie. Plantele cu flori au evoluat n strns corelaie cu insectele polenizatoare. Dar aceast dependen a plantelor fa de polenizatori, poate deveni o restricie, un risc: dispariia unor polenizatori, sau condiii climatice nefavorabile pot duce la periclitarea reproducerii. Trecerea la reproducerea agam poate prezenta att un avantaj direct, ct i o important direcie strategic. Avantajul direct const n aceea c ruperea legturii cu polenizatorii poate s permit ocuparea unor habitate unde acetia sunt rari sau lipsesc. De exemplu, Viola mirabilis, pe lng flori normale, vizitate de insecte, are i flori ce nu se deschid i se autopolenizeaz (cleistogame). Acest fapt i permite s se instaleze n interiorul pdurilor, unde sunt mai puine insecte i s nfloreasc timpuriu, cnd insectele sunt n numr mic. Ruperea dependenei de polenizatori prin trecerea la reproducerea apomictic este, dup prerea lui Kamilov, o nou faz n evoluia biosferei, faz caracterizat printr-o mai mare autonomie n evoluia plantelor cu flori i care poate avea profunde implicaii asupra evoluiei insectelor, a altor grupe de animale, ca i asupra unor procese ecologice eseniale, inclusiv a structurii trofice a ecosistemului i, deci, asupra circuitelor biogeochimice. Care sunt, deci, perspectivele evolutive ale formelor asexuate? Un prim aspect al acestei probleme implic pierderea celei mai importante surse de variabilitate (recombinarea genetic), deci a materialului asupra cruia poate lucra selecia. i totui, cercetrile din ultimele dou decenii arat c formele asexuate sunt mult mai variabile dect se credea nainte. Exist mai multe surse ale variabilitii lor. n primul rnd, ca la oricare organisme, i la acestea apar mutaii. Este drept, dup cum observ Nogler (1984), rolul acestora nu trebuie supraestimat, mai ales al celor recesive, innd seama c asexuaii sunt adesea poliploizi. O alt surs o reprezint autosegregarea schimbri n
28

rearanjamentele genotipului n timpul formrii celulei-ou i, n fine, apariia de diferite anomalii ca pierderea sau apariia ntmpltoare a unor cromozomi (Nogler, 1984). Exist i alte surse de variabilitate genetic a indivizilor reprodui asexuat. Astfel, posibilitatea recombinrii genetice a mitocondriilor, heterogene din punctul de vedere al materialului lor genetic, fr ca celulele rezultate prin diviziune mitotic s conin informaie genetic diferit (Bra, 1989). Studiul variaiei alozimelor la formele asexuate atest existena unei diversiti genetice a clonelor (Innes i Hebert, 1982). Indivizii care alctuiesc clone prezint acelai genotip, din cauz c au luat natere prin nmulire vegetativ. n cazul nmulirii sexuate, n schimb, intervine recombinarea genetic, astfel c fiecare gamet mascul sau femel este rezultatul unui proces probabilistic, prin care genele motenite de la genitori formeaz combinaii noi. n urma fecundrii, fiecare individ astfel rezultat are un genotip particular, ceea ce asigur diversitatea genetic a indivizilor unei populaii. Acest lucru face posibil adaptarea populaiilor la cele mai diverse condiii de mediu i, respectiv, supravieuirea. Selecia reprezint o metod de ameliorare prin care se urmrete eliminarea de la nmulire a plantelor care nu corespund obiectivelor urmrite i nmulirea, n continuare, a celor care sunt adecvate scopului urmrit. Metoda tipic de selecie pentru plantele ce se pot nmuli vegetativ este selecia clonal care reprezint o selecie individual simpl (cu o singur alegere), n care elita aleas este nmulit pe cale vegetativ. Selecia clonal poate valorifica orice tip de variabilitate, descendenii vegetativi ai unei elite reproducnd toate caracteristicile plantei din care provin i fiind, practic, identici ntre ei.

29

I.4. Clonarea la animale

I.4.1. Clonarea animalelor pe cale natural Cteva tipuri de nmulire asexuat sunt responsabile de apariia clonelor animale n natur: fisiunea (la celenterate, unii corali, oligochete, turbelariate), nmugurirea (la spongieri, celenterate), sciziunea i regenerarea, dar cea mai spectaculoas este partenogeneza (naterea virginal, adic a unui nou individ dintr-un ovul nefecundat). Aceasta este ntlnit la unii crustacei (ex. Daphnia), la afide, viermii rotiferi, unele insecte. Totui, n cazul partenogenezei nu rezult ntotdeauna clone ale femelei partenogenetice, deoarece intervine meioza, ducnd la indivizi haploizi. Clone rezult n cazul partenogenezei nereducionale, aceti indivizi fiind diploizi i nesupui riscului de manifestare a defectelor ereditare, aa cum sunt cei haploizi. Exist chiar i vertebrate al cror mod de perpetuare a speciei sau de supravieuire este reprezentat de partenogenez. Un exemplu l reprezint o oprl din Caucaz Lacerta saxicola armeniaca specie la care embrionii masculi mor n stadiile timpurii ale dezvoltrii, astfel nct masculii acestei specii nu exist n natur. I.4.2. Clonarea animal artificial Celula animal poate fi cultivat in vitro, similar microorganismelor. i la animale se pot obine prin cultura in vitro clone celulare provenite dintr-o singur celul iniial, clone care au acelai genotip, fiind formate din celule identice genetic. Celulele luate de la animale vertebrate i plasate n cultur pot fi cultivate aproximativ 50 de generaii (diviziuni), dup care intr n criz, manifestnd fenomenul de senescen i pier. Exist ns i unele celule care depesc aceast criz, sufer modificri, se nmulesc indefinit i devin teoretic nemuritoare. n special celulele de natur tumoral manifest aceast
30

capacitate i in vitro ele pot deveni clone celulare. Este celebru cazul liniei celulare HeLa, provenind de la celule preluate n 1952 dintr-o tumoare (carcinom cervical) a unei femei Henrietta Lacks, care este nemuritoare i se cultiv in vitro de multe decenii, n numeroase laboratoare. I.4.2.1. Tehnici utilizate n scopul clonrii de animale Exist dou metode de producere a clonelor. Prima este reprezentat de scisiunea gemelar. Celulele n primele faze embrionare, deci pn la nidarea n uter, cnd sunt nc omnipotente i nedifereniate, sunt divizate i astfel se obin, artificial, gemeni identici, avnd acelai material genetic. Dintr-un asemenea embrion, obinut pe cale sexuat, se pot obine puini indivizi clonai. A doua metod, asexuat, const n transfer nuclear: din ovulul nefecundat (sau chiar fecundat) se extrage (sau se inactiveaz) nucleul i se introduce n loc nucleul oricrei celule (cu excepia spermatozoidului) a unui alt individ. Fuziunea are loc n urma unei descrcri de curent electric.

Fig.3. Schema metodei de clonare la animale prin transfer nuclear La animalele vertebrate, clonarea s-a realizat prin cea de-a doua metod (transplantarea de nuclei n ovule enucleate). nc n 1955, R. Briggs i T. J.
31

King, de la Institute for Cancer Research din Philadelphia, au elaborat o metod pentru transferul de nuclei din celulele embrionare de la broasca Rana pipiens n ovulele enucleate. Ei au constatat c dac transferul de nuclei se realizeaz pn n faza de blastul trzie, are loc dezvoltarea normal a organismelor. Dac transferul se realizeaz dup acest stadiu, celulele i pierd totipotena. Desigur c animalele regenerate din acest transplant de nuclei erau identice cu individul de la care s-au preluat nucleii, toate avnd acelai genotip i alctuind o adevrat clon. Ulterior, n 1968, J.Gurdon a realizat clonarea la broasca sud-african Xenopus laevis prin transferul de nuclei din celulele epiteliale ale intestinului de la mormoloc n ovulele enucleate prin iradiere cu doze mari de radiaii UV. Aceasta nseamn c celulele respective i pstreaz totipotena o anumit perioad de timp, astfel c, avnd acelai genotip, prin clonare n ovulele la care s-a ndeprtat nucleul, dau natere la indivizi identici genetic cu animalul de la care s-au preluat nucleii.

Fig.4. Reprezentarea schematic a experienei de clonare prin transfer de nuclei din celule embrionare n celule enucleate la broate
32

Cercetri privind fenomenul totipotenei la mamifere au artat c dup fecundare, oul se divide n 2, 4, 8 etc. celule, dnd natere, n aproximativ 3 zile, la circa 40 de celule uniforme, care formeaz o morul. n ziua a 4-a, n morul apare o cavitate care se transform n blastocist. Acesta este format din dou tipuri de celule: la periferie un strat de celule plate (trofoblaste), iar n interior, un grup de celule care formeaz masa intern. Trofoblastele vor forma placenta dup implantarea blastocistului n uterul matern, iar masa intern va forma embrionul propriu-zis. Aceasta este prima difereniere celular observat. n a 5-a zi, n masa intern, are loc a 2-a difereniere celular: la suprafa, celulele ectodermice, iar dedesubt, celulele endodermice. La oarece s-a observat c celulele embrionare i pstreaz totipotena numai pn cnd embrionul are 8 celule. Primul semnal care modific aceast totipoten intervine n faza de 16 celule, cnd se separ cele dou tipuri celulare: celule externe (trofoblaste) i celule interne, care formeaz embrionul propriu-zis. Cercetrile au demonstrat c pentru transplantul de nuclei n vederea clonrii este necesar utilizarea de embrioni timpurii, n care celulele i pstreaz totipotena fiind egal capabile s dea natere unor indivizi identici genotipic, adic unei clone. n 1981, K.Ilmensee i P.C.Hope au transferat nuclei din celule embrionare de oarece n ovule enucleate i au obinut indivizi dezvoltai normal. Enuclearea s-a produs prin eliminarea cu ajutorul unei micropipete a celor doi pronuclei din ovulele fecundate. Acesta este de fapt fenomenul de clonare a mamiferelor. Exist i o alt metod de clonare, prin care se obin gemeni monozigoi. Astfel, la taurine J.P. Ozil (1982) de la Staiunea de Cercetri Jouy-en-Josas (Frana) a colectat embrioni dup 6-7 zile de la fecundare, atunci cnd sunt formai din 60-80 de celule. Dup aceea a realizat la microscop o deschidere n
33

zona pellucid care nconjoar embrionul, acesta a fost extras i tiat n dou, dup un plan de simetrie bilateral. Cele dou jumti de embrion au fost reintroduse n zona pellucid i replasate n dou femele receptoare. S-au obinut astfel mai mule cupluri de gemeni monozigoi, identici. Experiene de clonare a animalelor domestice pornind de la nucleii din celulele embrionare s-au realizat i la noi n ar, la taurine, la Universitatea de tiine Agricole din Timioara, iar la Staiunea de Cretere i Ameliorare a Ovinelor de la Palas-Constana, experiene de clonare s-au efectuat la ovine. n ambele cazuri s-au obinut rezultate pozitive. Un mare progres l-a realizat o echip de cercettori scoieni condus de J. Wilmut (1997). Este vorba de transferul unui nucleu dintr-o celul difereniat, provenit din glanda mamar a unei oi din rasa Finn Dorset, ntr-un ovul nefecundat de la o oaie din rasa Scottish Blackface, creia i s-a eliminat nucleul cu o micropipet. Celulele difereniate din glanda mamar au fost mai nti cultivate timp de o sptmn pe un mediu nutritiv in vitro pentru dedifereniere, adic pentru a redeveni totipotente. Celula enucleat a fost plasat alturi de nucleul respectiv provenit din glanda mamar i, cu ajutorul unor impulsuri electrice uoare, ovulul a acceptat nucleul exogen. Operaia s-a produs pe un mediu de cultur, iar dup 6 zile embrionul respectiv, care coninea exclusiv informaia genetic (ADN) a oii donor, a fost implantat n uterul unei oi adoptive din rasa Blackface. La terminarea perioadei de gestaie s-a obinut un miel genetic identic cu oaia donor a nucleului. Este vorba de o copie perfect, obinut prin clonare. Experiena a fost foarte dificil, deoarece din 277 de transferuri de nucleu s-au obinut numai 29 de embrioni, dintre care a supravieuit unul singur i a devenit oaia Dolly. (fig.4.) Importana deosebit a acestei metode const n faptul c pentru clonare se folosesc nuclei din celule difereniate de la un organism adult. Aceasta n timp ce prin transplantul de nuclei din embrion se utilizeaz celulele
34

nedifereniate, care sunt totipotente. Din punct de vedere practic, metoda prezint avantajul c de la un organism adult se pot obine astfel de copii, perfect identice din punct de vedere genetic.

Fig.5. Dolly (rasa Finn Dorsett) i mama purttoare (rasa Blackface) O problem important n acest caz o constituie anomaliile descoperite de cercettorii care au urmrit ndeaproape evoluia lui Dolly. Clona avea la natere o greutate cu aproximativ 1/3 mai mare dect a mieilor nscui pe cale natural. La rasa Finn Dorsett, mieii obinuii nu ating la natere dect n mod excepional un maximum de 7 Kg. n plus, n cromozomii oii clonate au fost depistate modificri structurale care apar, de regul, la exemplare mai n vrst. Astfel, la doar 6 ani i jumtate de la natere, organismul lui Dolly se manifesta n conformitate cu vrsta ei genetic (12 ani i jumtate). mbtrnirea ei prematur este demonstrat i de faptul c s-a mbolnvit de artrit i de cancer pulmonar, ceea ce este anormal pentru o oaie de doar 6 ani i jumtate. n aceste condiii, cercettorii care au creat-o pe Dolly au hotrt s o eutanasieze, corpul ei fiind apoi supus autopsiei, n scopul unei i mai bune observaii privind starea organismului obinut prin clonare.
35

I.4.2.2. Etapele producerii unei clone Clonarea de animale se realizeaz prin transplant de nuclei din celulele unui embrion n ovocitele enucleate de la alte organisme de aceeai specie. Ca urmare, toi indivizii din clon vor avea originea comun, dintr-un singur embrion. Etapele producerii unei clone de embrioni sunt urmtoarele: pregtirea femelelor receptoare, pregtirea embrionilor donatori de nuclei, pregtirea ovocitelor receptoare, transferul de nuclei. a) Pregtirea femelelor receptoare Un grup de femele va fi supus sincronizrii estrului n vederea utilizrii lor ca receptoare pentru embrionii rezultai din transferul de nuclei. b) Pregtirea embrionilor donatori de nuclei Se recolteaz ovocite din foliculii antrali ai ovarelor prelevate la abator, astfel nct s nu treac mai mult de trei ore de la sacrificare. Apoi, ovocitele sunt introduse ntr-un mediu de cultur special pentru maturarea in vitro, timp de 22 de ore. Urmeaz fecundarea cu sperm decongelat prin coincubare timp de 6 ore. Zigoii rezultai sunt cultivai n continuare 4-6 zile i selectai pentru a servi ca donatori de nuclei. La sfritul acestui interval de timp, embrionii vor fi n stadiul de morul, fiind formai din 32-64 blastomere. c) Pregtirea ovocitelor receptoare Ovocitele din ovare prelevate de la abator se vor cultiva in vitro, timp de 24 ore, pentru maturare. Apoi, aceste ovocite, aflate n metafaza II, sunt enucleate prin aspirarea cu o pipet special a globulului polar i a citoplasmei adiacente care conine placa metafazic. Ovocitele enucleate, denumite citoplati, sunt splate i cultivate nc 18-20 ore pentru ca s se produc maturarea citoplasmei.

36

d)Transferul de nuclei Pentru transferul de nuclei, fiecrui citoplast i se va introduce n spaiul perivitelin, cu ajutorul unei pipete speciale, un blastomer obinut din embrionul donator n stadiul de morul. Aceste micromanipulri se repet pn cnd toate blastomerele morulei sunt transferate n citoplati. Embrionii obinui se numesc embrioni clonai. Dup ce sunt meninui n cultur nc 7 zile pn la stadiul de blastocist, ei sunt transferai n coarnele uterine ale femelelor receptoare, pregtite n prealabil n acest scop. (fig. 5)

Morula cu blastomere

ovocite enucleate (citoplaste)

clona de embrioni (32-64)

Fig.6. Obinerea clonei de embrioni prin transferul de blastomere n ovocite enucleate Clonarea embrionilor este ns departe de clonarea celulelor adulte. Din acest motiv, clonarea lui Dolly dintr-o celul adult a fost considerat un salt uria n tehnologia reproducerii. I.4.2.3. Cum a fost obinut Dolly Se nltur ADN-ul din nucleul unui ovul luat de la mama-surogat. Acest material genetic va fi apoi nlocuit de ADN-ul preluat i izolat dintr-o celul a individului ce urmeaz a fi clonat, iar ovulul, care va conine astfel doar informaia genetic a individului respectiv, se va divide ca orice embrion normal, fiind ulterior reintrodus n uterul mamei. Cercettorii de la Institutul
37

Roslin au realizat primul caz de clonare a unui mamifer prin transplantarea nucleului unei celule care aparinea unei oi din rasa Finn Dorsett n ovulul denuclearizat al unei mame-gazd din rasa de oi scoiene cu faa neagr. S-a stimulat apoi artificial diviziunea celular, iar uterul respectivei oi cu faa neagr a fost purttorul viitoarei clone. Dolly reprezint copia fidel a unei oi Finn Dorsett. Demersul tiinific care a avut ca rezultat final naterea primului mamifer clonat dintr-o celul adult a fost n realitate mult mai dificil i de lung durat. Primul pas a fost realizat la Wistar Institute din Philadelphia, n 1983, unde Davor Solter i Jim McGrath au stabilit un protocol pentru transferul nucleelor de la un embrion de oarece la altul. Munca lor a demonstrat posibilitatea general a utilizrii tehnologiei transferului nuclear la mamifere i a introdus o modificare a tehnicii utilizate la broate, crescnd cu mult rata de supravieuire a embrionilor. n loc de a izola nucleelor din nveliul lor celular, cum fcuse Gurdon, Solter i McGrath au meninut nucleelor protejai corespunztor n interiorul mediului lor citoplasmatic nconjurat de o membran celular. Dei procedeul a fost numit transplantare nuclear, ei nu au transplantat niciodat nuclee direct n embrionii primitori, ci implantau celulele donoare lng embrioni i lsau ca un fenomen de fuziune s aduc nucleul donor n citoplasma celulei primitoare. Meninnd celulele donoare intacte pn n momentul fuziunii, ei au reuit s protejeze materialul genetic din interior. Ca urmare, 90% din embrionii reconstruii cu nuclee de la ali embrioni au supravieuit i s-au dezvoltat corespunztor. Urmtorul progres pe drumul ctre Dolly a fost realizat n 1986 de Steed Willadsen (Institute of Animal Psychology din Cambridge, Anglia). Ceea ce a fcut diferit Willadsen a fost utilizarea de ovule nefertilizate fr nucleu ca primitori pentru nucleul donor, mai degrab dect embrioni unicelulari. El a
38

anunat naterea unor miei sntoi care fuseser clonai din celule donoare derivate din embrionul cu 8 celule. Dup opt ani, un alt progres important n clonare a fost fcut de Neil First de la University of Wisconsin, n 1994. De aceast dat s-au utilizat celule donoare de vac, obinute dintr-un stadiu embrionar chiar mai avansat i s-au nscut patru viei. Astfel, Keith Campbell i Ian Wilmut de la Roslin Institute din Edinburgh, Scoia, au nceput s fac experiene pe oi. Au obinut cu uurin miei dup transplantare nucleare de la celule donoare din embrion de nou zile i i-au extins cercetrile la celule donoare obinute din culturi de celule embrionare crescute n laborator pe o perioad de cteva sptmni. Ei i-au comunicat rezultatele ntr-un articol din martie 1996: oaie clonat prin transfer nuclear dintr-o linie celular cultivat. i au trecut apoi la celulele donoare mai avansate, utiliznd exact aceleai tehnici. Dolly s-a nscut n ziua de 5 iulie 1996. Ea a rezultat din fuziunea unui ovul nefertilizat, fr nucleu, cu o celul donoare obinut din glanda mamar a unei oi de ase ani. A fost primul mamifer clonat dintr-o celul adult i este la distan de o generaie de fenomenul de fertilizare care a adus de fapt mpreun gameii prinilor ei genetici. Existena lui Dolly a fost anunat comunitii tiinifice ntr-un articol publicat n revista Nature, pe 27 februarie, 1997. Ali doi miei au fost obinui de asemenea, coninnd celule obinute de la un fetus.

39

Fig. 7. Tehnica de clonare a oii Dolly, utiliznd celule din glanda mamar a unei oi adulte
40

Problema cea mai grav este ridicat de rata foarte sczut de reuite: pentru Dolly au fost necesare 277 de ncercri (fuziuni obinute iniial ntre celulele donoare i ovulele nefertilizate). Dr. Harry Griffin, membru al echipei care a clonat-o pe Dolly, a avertizat c tehnica actual de clonare este nc la nceput, fiind ineficient, deoarece s-au utilizat pentru Dolly 277 de ovule pentru a obine o sarcin reuit, recoltnd ovule de la circa 40 de oi donatoare, dar i riscant, deoarece o mare parte din sarcini au euat, astfel nct am avut miei care au murit imediat dup natere. I.4.3. Avantaje ale clonrii de animale n ultimii ani, tot mai muli cercettori aduc argumente n favoarea realizrii, n viitor, pe scar larg, a clonrii unor animale de ferm, avantajele fiind urmtoarele: - folosirea n practic a unor populaii reduse numeric de organisme clonate cu performane economice deosebite; - meninerea biodiversitii genetice, mai ales n cazul raselor de animale cu efective sczute, prin obinerea de clone care sunt apoi congelate (embrioni congelai); - obinerea de populaii de animale rezistente la ageni infecioi. Spre exemplu, porcii folosii n prezent pentru xenogrefe pot fi infectai cu retrovirusuri ce se pot transmite i la om. De aceea, clonarea i analiza celulelor aflate n cultur nainte ca acestea s fie folosite pentru fuziune, vor permite selecionarea de animale necontaminate; - obinerea unor populaii de clone, ceea ce ar reprezenta un lot extrem de omogen (animale identice) utilizabil n experimentele de testare a unor medicamente sau n cele de analiz a comportamentului alimentar sau al originii unor maladii. Conform prerii unor specialiti, aceasta ar
41

conduce la diminuarea numrului de animale de experien de aproximativ cinci ori; - obinerea de animale transgenice clonate prin introducerea n celulele folosite pentru fuziune a unor vectori purttori de gene de interes (de exemplu, a genelor pentru hormonul de cretere).

I.5. Clonarea la om I.5.1. Clonarea terapeutic. Celulele stem.

n funcie de scop, distingem ntre clonarea reproductiv menit s produc indivizi umani identici cu un altul de clonarea terapeutic, care urmrete obinerea unor culturi de celule perfect compatibile cu esuturile i organele donatorului, utilizate n vederea unui transplant specific, n cazul anumitor maladii. n vreme ce clonarea reproductiv este vehement dezaprobat, clonarea terapeutic, mai accesibil din punct de vedere al tehnicii, dar i mai puin problematic moral, are mai multe anse de realizare. I.5.1.1. Tipuri de celule stem Celulele stem sunt celule totipotente, care au capacitatea de a forma orice celul a corpului nostru, aparinnd oricrui esut. Existena lor se poate dovedi esenial pentru realizarea unor transplanturi de o calitate superioar i o serie de companii din domeniul biotehnologiei s-au dedicat producerii de celule stem embrionare. I.5.1.1.1. Celulele stem embrionare Imediat dup fertilizare, celula-ou rezultat ncepe s se divid. La om, dup cinci zile se ajunge la o sfer de celule (blastocist), alctuit dintr-un strat exterior de celule i un buton embrionar, fixat de peretele sferei, n interiorul
42

acesteia. Din stratul exterior se formeaz placenta, iar din butonul embrionar, embrionul uman. n stadiul de blastocist, celulele din butonul embrionar nu sunt nc specializate n tipuri de celule cu rol bine definit. Acestea au fost denumite celule stem (trunchi). ntr-un raport intitulat Stem Cells and the Future of Regenerative Medicine (Celulele stem i viitorul medicinii regenerative) se spunea: n ultimii trei ani s-a reuit s se extrag celule stem [embrionare umane] din blastocist i s fie pstrate n laborator n stare nedifereniat n linii celulare de cultur. ntruct toate aceste celule rmn nedifereniate, oamenii de tiin sper c, folosind sistemul biochimic corespunztor, celulele stem vor putea fi dirijate s se dezvolte n toate tipurile de celule necesare n terapia de nlocuire a esuturilor. n cadrul a dou studii efectuate pe animale, cercettorii au manipulat celule stem embrionare obinnd celule care produc insulin, pe care le-au transplantat apoi la oareci diabetici. n primul studiu, simptomele asociate cu diabetul au fost eliminate, pe cnd n cel de-al doilea, noile celule nu au reuit s produc suficient insulin. Oamenii de tiin au nregistrat succese pariale i n cadrul altor studii similare n ceea ce privete restabilirea funciei nervoase n cazuri de traumatism al mduvei spinrii i n corectarea simptomelor bolii Parkinson. Aceste studii ofer sperane, dar nu i dovezi care s ne conving c terapii asemntoare pot fi eficiente i la om, precizeaz Academia American de tiine Naturale. Principalul motiv de ngrijorare ar fi c metoda de extragere a celulelor stem embrionare distruge n mare parte embrionul. Academia American de tiine Naturale arat c acest lucru mpiedic respectivul embrion uman s se dezvolte pentru a deveni o fiin uman. Pentru cei care consider c viaa unei fiine umane ncepe chiar din momentul conceperii, cercetrile asupra celulelor stem embrionare constituie o violare a principiilor care interzic distrugerea
43

vieii umane i recurgerea la terapii ce folosesc viaa uman ca mijloc pentru atingerea unor scopuri, indiferent ct de nobile ar fi ele. Dei cercetrile asupra celulelor stem embrionare continu, unii oameni de tiin i concentreaz eforturile asupra unui tip de celule stem care sunt un subiect mai puin controversat: celulele stem adulte. I.5.1.1.2.Celulele stem adulte Celula stem adult, afirm National Institutes of Health din Statele Unite, este o celul nedifereniat care se gsete ntr-un esut difereniat, cum ar fi mduva osoas, sngele i vasele de snge, epiderma, mduva spinrii, ficatul, tractul gastrointestinal i pancreasul. Iniial cercetrile au sugerat c posibilitile de folosire a celulelor stem adulte sunt mai limitate dect n cazul celulelor stem embrionare. Totui, ultimele descoperiri fcute n cadrul studiilor pe animale au lsat s se neleag c anumite tipuri de celule stem adulte au capacitatea s se diferenieze ntr-un tip de esut diferit de cel din care au fost extrase. Celulele stem adulte luate din snge i din mduva osoas, numite celule stem hematopoietice (CSH), au capacitatea de a se regenera continuu n mduv i de a se diferenia complet n toate tipurile de celule care se gsesc n snge. Acest tip de celule este deja folosit la tratarea leucemiei i a altor boli de snge. Potrivit opiniei pe care o au n prezent unii oameni de tiin, CSH-urile par s produc i celule nesanguine, cum ar fi celulele hepatice i celulele care seamn cu neuronii i cu alte tipuri de celule ce se gsesc n creier. Folosind un alt tip de celule stem extrase din mduva osoas a oarecilor, nite cercettori au fcut o alt descoperire important. Din studiul lor, publicat n revista Nature, reiese c aceste celule au aceeai multifuncionalitate ca i celulele stem embrionare. Totui, cercettorii care lucreaz cu celulele stem adulte trebuie s depeasc obstacole majore. n
44

schimb, avantajele medicale pe care le ofer ele nu vor implica distrugerea embrionilor umani. I.5.1.1.3. Celulele germinative embrionare n afar de celulele stem embrionare i celulele stem adulte, au fost izolate i celulele germinative embrionare. Aceste celule sunt extrase din celulele crestei gonadale a unui embrion sau a unui fetus, celule care produc ovule sau sperm (creasta gonadal se transform ulterior n ovare sau testicule). Dei celulele germinative embrionare se deosebesc n multe privine de celulele stem embrionare, ambele tipuri sunt pluripotente, ceea ce face posibil elaborarea unor tratamente revoluionare. Totui, entuziasmul i fascinaia generate de asemenea posibile terapii sunt temperate de controversele strnite de sursa de obinere a celulelor, care sunt extrase fie din fetui avortai, fie din embrioni. I.5.1.2. Metode utilizate pentru obinerea artificial de celule stem Din pcate, culturile de astfel de celule nu pot fi folosite dect pentru autotransplant, fiind respinse de sistemul imunitar al pacienilor din cauza incompatibilitii genetice. Soluia n acest caz pare a fi producerea de celule stem personalizate. Plecnd de la ADN-ul fiecrui beneficiar de transplant, se poate obine un embrion-clon care nu este introdus ntr-un uter, ci este utilizat drept cultur de celule stem (nedifereniate, capabile s dea natere oricrui tip de esut, constituind materialul ideal pentru refacerea esuturilor necrozate). Lu Guangxiu, de la Colegiul Medical Xiangya, China, cunoscut pentru unele cercetri de fertilizare in vitro, susine c a reuit s cloneze embrioni umani pn la stadiul n care a obinut o cultur de celule stem. Cercettoarea chinez crede c a depit dificultatea principal care apare n situaiile
45

obinuite, i anume respingerea de ctre trupul bolnavului a esuturilor transplantate. Clonnd chiar celulele pacientului, ansele de respingere scad simitor. Pn acum, celulele stem erau produse din embrionii de care clinicile de fertilizare in vitro nu mai aveau nevoie. Cu toate acestea, nici n cazul chinezilor nu se poate vorbi de clonarea unor embrioni umani dezvoltai. Totui, cercettoarea consider c tehnica aplicat de Ian Wilmut poate fi mbuntit, evitnd eecurile de pn acum, n care majoritatea embrionilor mureau repede, fr a avea timp s se dezvolte pn la stadiul de blastocite, termen care presupune un grup de cteva sute de celule. Noua tehnic poate fi prezentat astfel: nu se ndeprteaz nucleul ovulului, ci se injecteaz nucleul unei celule aparinnd celui pe care dorim sl clonm, se ateapt un timp i cele dou celule sunt lsate mpreun pentru a se realiza un fel de acomodare, de toleran. Abia apoi se aplic denucleizarea i, ulterior, stimulul necesar pentru ca acest complex s-i nceap diviziunea. Punctul slab este c nici aa nu pot fi evitate pierderile, estimndu-se c numai 5% din embrioni au atins nivelul de blastocite. Celulele stem, prin urmare, nu i-au continuat nmulirea, timpul lor de via fiind prea sczut. Pe data de 25 noiembrie 2001, Advanced Cell Technology (ACT) anuna publicarea rezultatelor obinute n urma cercetrilor efectuate asupra celulelor umane legate de transferul nuclear i partenogenez. Raportul respectiv a fost publicat n Journal of Regenerative Medicine i anuna c celulele umane reprogramate pot furniza esut pentru transplant. n aceast direcie i-au ndreptat eforturile cercettorii de la ATC. Prima metod descris de acetia a constat n partenogenez (dezvoltarea unui nou individ dintr-un ovul nefertilizat). n ultimii ani, cercettorii au reuit s realizeze partenogenez artificial n cazul mai multor grupe de mamifere superioare, dei adesea aceasta conducea la dezvoltri anormale ale ftului. ATC a reuit s activeze un astfel de ovul uman nefertilizat, care a dat natere
46

unui soi de embrion, similar blastocitelor, din care ar putea fi difereniate celulele stem n tipurile de esuturi de care are nevoie pacientul respectiv. Articolul din Journal of regenerative Medicine prezint succesele obinute ntro serie de astfel de partenogeneze, fr a intra n detaliile referitoare la modul de izolare a celulelor stem. O a doua cale de obinere a celulelor stem este transferul nuclear n celule somatice, adic clonarea terapeutic a unui numr restrns de celule stem. n acest caz, unui ovul uman i este ndeprtat ADN-ul propriu, care e nlocuit cu ADN-ul persoanei care trebuie s beneficieze de respectivul transplant ipotetic. Acest ADN este recoltat dintr-o celul somatic adult a pacientului. n studiul celor de la ATC se arat c nucleul implantat n ovulul cu ADN-ul ters a reuit s se reprogrameze i s i autoinduc trecerea dintr-o stare protoembrionic (din considerente etice, joaca de-a duplicarea celulelor stem a fost oprit atunci cnd s-a ajuns la stadiul de dezvoltare embrionar ce numra ase celule.) Cert este c reprogramarea celulei umane este posibil, susine Jose B. Cibelli, vicepreedinte al ATC, principalul autor al raportului incriminat. Scopul declarat al companiei sale este acela de a crea linii de celule stem capabile s se diferenieze ntr-o varietate de alte tipuri de celule (musculare, cardiace, neuronale, sangvine etc.) necesare n tot attea tipuri de transplant. Eforturile noastre permit utilizarea clonrii terapeutice ca pe o surs inepuizabil de celule compatibile din punct de vedere imunitar pentru inginerie tisular i transplant. Nu dorim s crem fiine clonate, ci s elaborm terapii vitale pentru o sum variat de afeciuni, incluznd diabetul, infarctul miocardic, cancerul, SIDA, maladiile neurodegenerative, precum Parkinson i Alzheimer, susine i cellalt vicepreedinte al ATC, Robert Lanza.
47

O a treia tehnic, despre care articolul din Journal of Regenerative Medicine nu vorbete, dar despre care autorii si susin c exist, cel puin teoretic, este transferul ovoplasmic. Acesta implic recoltarea citoplasmei dintr-un ovocit i transferarea ei ntr-o celul adult sntoas a pacientului, transformnd-o astfel ntr-o celul stem primitiv. I.5.1.3. Perspective promitoare pentru medicin Utiliznd clonarea ca tehnologie de baz, cercettorii sper s vindece o mulime de boli. Ar putea fi generate celule nervoase ca tratament pentru boala Parkinson, noi celule cardiace sau hepatice ar putea mbunti funcia altor organe bolnave, vase de snge noi ar putea fi utilizate pentru a le nlocui pe cele afectate de arterioscleroz. Unica soluie pentru refacerea numrului de celule pierdute de ctre organismul bolnavului, pare a fi nlocuirea cu celule stem. Se crede c ele vor putea fi nvate s formeze esuturi de un anumit tip. n plus, pornind de la celulele pacientului, prin clonare se va elimina pericolul respingerii materialului transplantat, acesta fiind n mod natural acceptat de ctre organism. Leucemia mieloid, un cancer lent progresiv, al celulelor stem ale sngelui poate fi vindecat ntr-un singur mod, care presupune dou etape: n primul rnd un tratament cu substane chimice capabile s distrug celulele canceroase. Acest tratament distruge ns i celulele stem, care sunt necesare pentru a completa n fiecare zi rezerva de celule difereniate din snge, pe msur ce celulele mai btrne mor. n absena celulelor stem, o persoan de altfel sntoas n-ar putea supravieui. A doua etap a tratamentului este deci esenial: nlocuirea celulelor stem eliminate cu unele noi, furnizate de un donator. ntruct celulele stem sunt localizate n mduva osoas, este vorba de un transplant de mduv, caz n care e nevoie de un donator cu o foarte bun
48

compatibilitate tisular (ntre persoanele nenrudite, ansa unei bune compatibiliti este de doar 1: 20 000). De aceea, muli oameni consider c un copil care are nevoie de un donator compatibil reprezint un motiv convingtor i justificat etic pentru ca prinii s apeleze la clonarea copilului bolnav, obinnd donatorul perfect. Potrivit unui raport ntocmit de Institutul American al Sntii celulele stem ar putea deine cheia la nlocuirea celulelor care se pierd n multe boli devastatoare. Medicii folosesc celulele stem de mai muli ani pentru a trata diferite boli de snge. Aceste terapii implicau, n general, un transplant de mduv osoas, bogat n celule stem care produc snge; n prezent ns, medicii prefer s obin celule stem din sngele circulator. ntruct terapiile cu celule stem ofer sperana regenerrii unor esuturi noi, sntoase, ele au ajuns s poarte numele generic de medicin regenerativ. Totui, unele aspecte legate de aceast tiin aflat la nceput de drum sunt foarte controversate, considerndu-se c folosirea celulelor stem umane mai ales a celor obinute din embrioni i fetui constituie o desconsiderare a vieii umane. I.5.1.4. Medicina regenerativ i riscurile presupuse de aceasta Indiferent de tipul de celul stem folosit (embrionar sau adult), terapiile vor prezenta n continuare dezavantaje majore chiar i n cazul n care oamenii de tiin vor stpni bine metodele de obinere a esuturilor pentru transplant. Un obstacol ar fi respingerea esutului strin de sistemul imunitar al primitorului. n prezent, soluia const n administrarea unor medicamente de suprimare a sistemului imunitar; acestea au ns efecte secundare grave. Ingineria genetic ar putea ajuta la depirea problemei dac celulele stem ar fi modificate n aa fel nct esuturile obinute din ele s nu par strine pentru noua lor gazd.
49

O alt posibilitate ar fi utilizarea de celule stem extrase chiar din esutul bolnavului. n primele teste clinice efectuate pentru tratarea lupusului s-au folosit celule stem hematopoietice prelevate din esutul bolnavului. Diabetul insulino-dependent ar putea reaciona favorabil la terapii de acest gen atta timp ct noul esut nu e susceptibil la acelai atac autoimun care s-ar putea s fi cauzat apariia diabetului. i cei care sufer de boli de inim pot beneficia de pe urma terapiilor cu celule stem. O sugestie ar fi ca bolnavii care sunt vulnerabili la astfel de boli s doneze n prealabil celule stem, pentru ca ele s fie cultivate n laborator, iar mai trziu s fie folosite pentru nlocuirea esutului cardiac afectat. Se consider c, prin clonarea bolnavilor, problema respingerii imunitare ar putea fi depit, clonele respective nefiind ns lsate s se dezvolte dect pn la stadiul de blastocist, cnd pot fi recoltate celule stem. esuturile cultivate din aceste celule stem vor fi identice din punct de vedere genetic att cu esuturile donatorului, ct i cu cele ale primitorului i, prin urmare, nu vor declana nici o reacie imunitar. ns aceast soluie nu numai c este considerat de muli inacceptabil din punct de vedere moral, dar ar putea fi i inutil n cazul n care clonarea se face pentru a vindeca o boal transmis genetic. Rezumnd problema respingerii imunitare, Academia American de tiine Naturale a afirmat: Pentru ca transplantul de celule s poat fi practicat n medicina regenerativ, oamenii de tiin trebuie s neleag n ce mod poate fi prevenit respingerea celulelor transplantate, ceea ce constituie, n fond, una dintre cele mai mari probleme din acest domeniu de cercetare. n plus, transplantul de celule stem embrionare prezint i riscul formrii unor tumori, mai ales a unui tip de tumoare numit teratom. n mod normal, diviziunea i diferenierea celular urmeaz un program genetic precis. ns aceste procese se pot deregla cnd celulele stem sunt extrase din blastocist, cultivate in vitro i introduse apoi ntr-o fiin vie. Aadar, un alt obstacol
50

imens pentru cercettori este s afle cum s controleze n mod artificial aceste procese complexe: diviziunea i diferenierea celular. Aceasta innd cont de faptul c cercetrile asupra celulei stem sunt abia la nceput i exist mari lacune n cunotinele dobndite, ceea ce ridic bariere n calea implementrii noilor terapii.

I.5.2.Clonarea reproductiv
n 1979 L.B.Shettles de la Universitatea Columbia din New York a clonat prin transfer nuclear embrioni umani, care s-au dezvoltat pn la stadiul de morul. n 1983, doi savani de la Universitatea G. Washington, Jerry Hall i Robert Stillman, au produs, prin sciziune gemelar embrioni umani. Ei au luat de fapt 17 embrioni umani, ntre stadiul de dou celule i cel de opt celule, au ndeprtat nveliul de zona pellucida i apoi au separat celulele din fiecare embrion. Fiecare celul a fost apoi nconjurat de un nveli sintetic i lsat s se dezvolte singur ntr-un vas de laborator. Dup cteva zile, Hall i Stillman au gsit 48 de embrioni nou formai, dezvoltndu-se normal. Experimentul a fost ntrerupt n acest punct, din considerente etice, i embrionii au fost ndeprtai. Profesorul doctor genetician Mircea Covnic numete cteva din riscurile clonrii umane: 1. Nivelul actual al cunotinelor. Clonarea uman se afl la un nivel experimental, astfel nct rezultatele sunt neprevzute i nedorite. 2. Vrsta clonei. Embrionul-clon provenit de la un individ matur va avea din start vrsta individului respectiv. Durata de via a unui astfel de om este perfect determinat. Atunci cnd apare o nou via, ceasul su biologic este pus la zero. De altfel, cercettorii au observat c animalele clonate mbtrnesc mult mai repede.
51

3. Mutaii. Celula de la care se pleac a funcionat deja o perioad de timp ntr-un organism. Pe parcursul vieii individului, celula a suferit o serie de mutaii pe care le pstreaz i fiina clonat. Din aceast cauz, clonele sunt expuse unui numr foarte mare de boli degenerative. Din contr, unii oameni de tiin aduc ca argument n favoarea clonrii umane tocmai posibilitatea de a scpa de unele anomalii genetice. Cel mai frecvent tip de defect genetic congenital rezult din prezena unui numr anormal de cromozomi. Trisomia 21, responsabil de sindromul Down, este cel mai rspndit exemplu. Aceste anomalii sunt produse de greeli care se petrec cnd materialul genetic se reduce la jumtate in cursul procesului de formare a gameilor. Prin clonare, ns, nu exist nici o reducere a materialului genetic i astfel, ansa ca greeli de acest tip s apar este mai redus. A doua clas se anomalii genetice, ca frecven, rezult prin motenirea a dou copii mutante ale unei gene, aflate la prini n stare recesiv (de exemplu: boala Tay-Sachs, siclemia, fibroza chistic etc.). Prin clonare, manifestarea acestor gene nu se mai produce. Mai puin frecvent, o mutaie poate s apar n materialul genetic al gameilor, ceea ce poate duce la un defect congenital al persoanei care se nate. Prin clonare, manifestarea unei astfel de mutaii n materialul genetic adus de nucleul donor, are o probabilitate mai sczut. Doi cercettori, unul american, Panayiotis Zavos, profesor la Universitatea din Kentucky, i unul italian, Severino Antinori, celebru de ctva timp prin faptul c a ajutat o femeie de 62 de ani s rmn nsrcinat, prin implementarea n uter a unui ovul deja nsmnat, au fcut cercetri cu scopul de a realiza primele clone umane. Pn acum s-au ntreprins experiene pe cinci specii de animale, iar rata foarte mare de eecuri a dat natere multor semne de ntrebare privind succesul clonrii umane. Doar 1% din clonrile animale efectuate pn n prezent au avut un rezultat pozitiv, dar i dintre acestea, covritoarea majoritate a suferit
52

serioase disfuncii: ficat prost funcional, tensiune anormal, plmni subdezvoltai, grave deficiene ale sistemului imunitar. Dei concluzia este c pentru nivelul actual al tehnicii clonarea este foarte periculoas, Antinori i Zavos susin c pot depi aceste handicapuri aflnd din timp care sunt embrionii bolnavi i ndeprtndu-i. Acceptnd totui reuita clonrii, nu tim ct i cum va evolua clona. Viaa acesteia ar putea fi un ir lung de probleme medicale, mai cu seam datorit faptului c, cel mai probabil, sistemul imunitar va fi foarte slbit. Cele mai importante probleme privind clonarea uman sunt de natur etic i vor fi dezbtute n linii mari n capitolul urmtor, n care clonarea este privit prin ochiul critic al bioeticii.

53

CAPITOLUL II CLONAREA, DIN PERSPECTIVA BIOETICII

Problema nu este doar s fii n stare s m clonezi pe mine sau pe dumneata, sau vaca cu laptele cel mai grozav. Ai putea s-i readuci la via pe Beethoven, pe Custer sau pe Elvis i s devin copiii notri. Sau pe propria dumitale mam. Sau ai putea s dezvoli organe nlocuitoare, canibaliznd clonele ori de cte ori ai nevoie de un nou plmn, de un nou ficat sau de o nou inim. i poi imagina problemele etice, ca i pe cele sociale. Ce se ntmpl cu adopia, cnd fiecare poate s-i comande copii ale lui, sau ale altuia, prin pot? i cnd poi combina clonarea cu tehnologia ADN recombinat, este uor si imaginezi clone care nu sunt chiar oameni fiine asemntoare fungicide, bune de folosit drept carne de tun, gladiatori sau sclavi. n loc de ferme organice, ferme de organe. Oameni disponibili.

John Case Codul genetic

II.1. Bioetica i tiina n condiiile dezvoltrii tehnico-tiinifice contemporane, bioetica trebuie s fie un rspuns la provocrile tiinei ce se deplaseaz, de regul, n afara legilor morale i juridice. tiina reprezint astfel soclul bioeticii, n virtutea creia libertatea i autonomia de cercetare nu se pot realiza fr respectul absolut al drepturilor i libertilor umane. n acest sens, Micarea Universal pentru Responsabilitatea tiinei (MURS), militeaz pentru introducerea unui nou articol n Declaraia Universal a Drepturilor Omului, i anume acela dup care cunoaterea tiinific nu trebuie utilizat dect pentru a servi demnitatea, integritatea i devenirea omului. Astfel, pentru a nu nclca drepturile omului, tehnologiile biomedicale moderne nu vor transforma omul
54

ntr-un obiect, nu vor estompa dreptul la via privat, tiina nu se va dezvolta necontrolat, dup criterii de profit. n consecin, nu tiina trebuie respins, ci aplicarea sa incorect, fiind nevoie ca tiina s fie eficace, fr a fi opresiv. Bioetica se impune astfel ca o legtur de filiaie ntre tiin i drepturile omului i include dou aspecte: al respectului omului ca ntreg (fragmentat astzi n gamei, embrioni, organe pentru transplant etc.) i al evitrii oricror abuzuri asupra libertii de exprimare a omului. n condiiile n care omul a devenit stpn al procreaiei, ereditii i creierului, la rigoarea rece a tiinei trebuie adugate i profunzimea refleciei inspirate de dragostea pentru om. Arta de a dirija cercetarea tiinific prin bioetic devine un gardian al aplicrii acestor cuceriri la om. n faa progresului tiinific i tehnologic biomedical ce poate amenina viitorul drepturilor omului, respectul valorilor umane rmne singura pavz. De aici caracterul universalist att al tiinei, ct i al bioeticii. Ct timp tiina este o provocare, bioetica trebuie s fie un rspuns. n anul 1993 UNESCO a nfiinat un Comitet Internaional de Bioetic (CIB), care a elaborat n 1997 o Declaraie Universal a Genomului Uman, pentru protecia acestuia, n ideea de a salva integritatea speciei umane. Se subliniaz, de asemenea, c genomul uman are o natur evolutiv i este subiect de mutaii, motiv pentru care nici o persoan nu poate face obiectul unei discriminri bazate pe considerente i caracteristici genetice. Din domeniul bioeticii mai fac parte: fecundarea artificial in vitro, transplantul de organe, eutanasia i nu n ultimul rnd, clonarea. II.2. Clonarea - o tehnic controversat Vestea naterii lui Dolly a provocat consternare. Guvernul britanic a decis s recompenseze savantul responsabil de crearea lui Dolly, Ian Wilmut, cu retragerea oricror fonduri suplimentare pentru cercetrile sale. Teama unei
55

iminente clonri umane a fcut ca reaciile s fie multiple i vehemente n toat lumea: de la preedintele de atunci al SUA, Bill Clinton, care a cerut ncetarea experienelor privind ncercrile de clonare uman i a suspendat subveniile de la stat, la Comitetele Naionale de Etic, Consiliul European, pn la Organizaia Mondial a Sntii. Clonarea fiinelor umane, se spune n declaraia Parlamentului European, nu poate fi absolut justificat i tolerat de societate, ntruct ea reprezint o grav violare a drepturilor fundamentale ale omului, e contrar principiului egalitii dintre fiinele umane fiindc permite o selecie eugenist i rasist a speciei umane, lezeaz demnitatea fiinei umane. Declaraia Universal a Genomului Uman a fost urmat de o hotrre privind interzicerea clonrii umane, dat de Adunarea General a ONU. Viznd acelai lucru, la nivel european, Convenia de Bioetic a lansat un Protocol asupra clonrii umane. II.2.1. Clonarea uman Prin clonare, persoana uman este redus la dimensiunea ei material, adic biologico-genetic. Totui, unii cercettori consider procedura ca fiind benefic, n special pentru medicin i trec peste considerentele de alt ordin dect cel tiinific. Poteniale beneficii medicale: - posibilitatea ca prin tehnica clonrii s se poat realiza nlocuirea celulelor i esuturilor bolnave; - crearea de organe perfect compatibile cu corpul bolnavilor care au nevoie de un transplant; - studierea diferenierii celulare n paralel cu studiul i dezvoltarea tehnicilor clonrii; - ofer cuplurilor sterile posibilitatea de a avea copii nrudii genetic.
56

Geneticianul Hans Ionas a ntocmit n 1997 o list cu potenialele avantaje ale clonrii umane, printre care: - posibilitatea de a produce indivizi geniali, frumoi, cu caliti excepionale, care vor mbunti rasa uman - se vor produce indivizi sntoi, evitndu-se riscurile bolilor ereditare care apar prin nmulirea natural, sexuat - toate familiile sterile vor putea sa aib copii. - oricine va putea s aib un copil aa cum i dorete, alegnd sexul, culoarea ochilor, a prului, gradul de inteligen etc. - prinii crora le moare copilul vor putea s-l reproduc cu ajutorul unor celule ale acestuia, pstrate de la copil nainte de a muri. - utilizarea clonei n scopuri terapeutice (este pstrat n stare embrionar i la nevoie va putea furniza material biologic, esuturi, organe pentru transplant.) i lista continu cu avantaje care se apropie i mai mult de domeniul SF-ului. Problema statutului embrionilor ridic ns numeroase bariere n calea cercetrilor de clonare. John Robertson, renumit etician i avocat, susine c embrionul merit un respect mai mare dect cel acordat oricrui alt esut uman, datorit potenialului su de a deveni o persoan i a semnificaiei simbolice pe care o are pentru muli oameni. Totui, nu ar trebui tratat ca o persoan, deoarece nu i-a dezvoltat nc particularitile de persoan i ar putea s nu i realizeze niciodat potenialul su biologic. Poteniale neplceri i dezavantaje: - pierderea variabilitii genetice; - probleme necunoscute de ordin psihologic cu impact asupra familiei i societii;
57

- tehnica clonrii nu e suficient de avansat, fiind n acest moment foarte ineficient; - pierderea individualitii (cu toate c o clon poate fi foarte diferit de original din punct de vedere psihologic, dup cum i gemenii monozigotici au personaliti diferite). Din punct de vedere evoluionist, clonarea e profund nerecomandabil. Evoluia se bazeaz pe o continu combinare a genelor. Prin clonare, procesul seleciei naturale e mpiedecat i astfel, evoluia poate fi stopat. II.2.2. Aspecte juridice Unul dintre principiile de baz n cercetarea biomedical consider c trebuie luate toate msurile pentru reducerea repercusiunilor studiului asupra integritii fizice i mentale a subiectului sau asupra personalitii sale. Statele membre ale Consiliului Europei i Comunitatea European au adoptat la Oviedo (4 aprilie 1997) Convenia privind drepturile omului i bomedicina. Articolul 2 (cap. I) al Conveniei, referitor la prioritatea fiinei umane, atrage atenia asupra faptului c interesele i bunstarea fiinei umane trebuie s prevaleze asupra intereselor singulare ale societii sau ale tiinei. Prin art. 18 (cap.V) al aceleiai Convenii este interzis crearea de embrioni umani n scopul cercetrii. n alte ri, documente precum Convenia American a Drepturilor Omului consider astfel de cercetri posibile numai n anumite condiii, ftul fiind considerat persoan nc din momentul concepiei. Adunarea parlamentar a Consiliului Europei a emis actele ce protejeaz drepturile embrionilor, i anume: Recomandarea 1046 (1996) privind utilizarea embrionilor i feilor umani n scop diagnostic, terapeutic, tiinific, industrial i comercial, respectiv Recomandarea 1100 (1989) asupra utilizrii embrionilor i feilor umani n cercetarea tiinific. n esen, se interzice
58

crearea de embrioni umani prin fecundaie in vitro n scopul cercetrii acestora n cursul vieii sau dup moartea lor. Se interzice clonarea, producerea de himere, alegerea sexului prin manipulare genetic, cercetrile i experienele asupra embrionilor umani vii, crearea de gemeni monozigoi, implantarea unui embrion uman n uterul altei specii sau invers, fuziunea gameilor umani cu gameii altor specii, meninerea embrionilor in vitro dup a 14-a zi de la fertilizare. Este interzis, de asemenea, meninerea n via a embrionilor i fetuilor umani n mod artificial, n scopul obinerii de material utilizabil. Pentru prima oar, genetica i biotehnologiile tind s confere omului puterea imediat i necontrolat n materia gestionrii i manipulrii individualitii sale biologice. ns, Conform Declaraiei Universale a Drepturilor Omului, respectarea drepturilor prevaleaz asupra nevoilor de cercetare. Declaraia reafirm, n acest sens, c practicile contrare demnitii umane, cum ar fi clonarea, nu sunt permise. Tratatul privind interzicerea clonrii, adoptat de statele membre ale Consiliului Europei, prevede interzicerea replicrii oricrei persoane, vii sau moarte indiferent de tehnica folosit, de motivele invocate (securitate naional, prevenirea de fapte penale, protecia sntii publice etc.). pedepsele pentru nclcarea acestor prevederi sunt: nchisoarea, ridicarea licenei, distrugerea laboratoarelor. n faa unei descoperiri tiinifice, prima etap este aceea a evalurii consecinelor morale pentru om, dup care urmeaz etapa consacrrii legale a recomandrilor morale. Criteriul esenial al unor astfel de recomandri sunt efectele nocive ale descoperirii pentru om, deci probabilitatea unor riscuri pentru el i modul n care aceste riscuri pot fi contrabalansate de avantajele descoperirilor tiinifice pentru societate.
59

Un Protocol adiional la Convenia pentru protecia drepturilor omului i a demnitii fiinei umane fa de aplicaiile biologiei i medicinei, referitor la interzicerea clonrii fiinelor umane a fost ncheiat la 12 ianuarie 1998 de ctre Statele membre ale Consiliului Europei. Prin Art.1, al Protocolului este interzis orice intervenie avnd drept scop crearea unei fiine umane genetic identice unei ale fiine umane, vii sau moarte, clonarea de fiine umane fiind considerat contrar demnitii umane, putnd altera caracterele speciei umane i echivalnd cu o eugenie pozitiv ce pretinde a elibera omul de fatalitile genetice. Rezoluia pleac de la adevrul c fiecare om este un unicat, i, consecutiv, diferenierea individual devine baza noii etici, individualitatea uman constituind sursa fundamental a evoluiei speciei umane. Interveniile tiinifice care pot modifica genomul uman, aa cum este clonarea, sunt interzise i prin Convenia Consiliului Europei din 1996 privind drepturile omului i demnitatea uman n faa descoperirilor tiinifice. Totui, avnd n vedere c prin clonare s-ar putea gsi soluia pentru o serie de boli netratabile n prezent, unele ri (de exemplu Marea Britanie) au legalizat utilizarea embrionilor umani pentru cercetrile ndreptate n direcia vindecrii unor maladii ca Parkinson i Alzheimer. II.2.3. Clonare versus religie Clonarea, mai ales cea reproductiv, ridic o serie de probleme etice, motiv pentru care reprezentanii marilor religii au simit nevoia s se pronune asupra acestei proceduri. De exemplu, Uniunea Comunitilor Evreieti din America i Consiliul Rabinic au dat o declaraie prin care sprijin clonarea terapeutic, dar nu i pe cea reproductiv. Purttorul de cuvnt al Comunitilor evreieti, Nathan Diament, a afirmat c declaraia dat va ajuta publicul s neleag faptul c exist o baz religioas i moral pentru a sprijini acest tip de cercetri, cel
60

puin la fel de puternic precum cea care se opune lor. Senatorii Diane Feinsten i Arlen Specter au propus Senatului american aprobarea clonrii de embrioni pentru obinerea de celule stem. De fapt, nu exist o poziie oficial a iudaismului fa de clonare, ci o multitudine de puncte de vedere. Exist i genul de abordare care se apropie de viziunea catolic i islamic i care condamn categoric orice tip de clonare, aa cum exist i o poziie mai nuanat, care admite clonarea, dar numai pentru mbuntirea hranei i pentru gsirea de tratamente i medicamente noi. Problema se refer, n fond, la ct de departe suntem dispui s mergem n numele principiului care ne ghideaz n transformarea lumii n care trim. Unii lideri religioi evrei pledeaz pentru un moratoriu de cinci ani, timp n care s cntrim i s ncercm s nelegem consecinele psihice, sociale i politice ale clonrii reproductive. De remarcat c atitudinea evreilor din SUA este diferit de cea a catolicilor i protestanilor. Astfel, poziia catolic, exprimat de cardinalul Theodore McCarrick, arat c utilizarea embrionilor n cercetrile privind celulele stem i-ar putea face pe oamenii de tiin s preia rolul lui Dumnezeu i s-l reduc pe om la un simplu ansamblu de pri de care te poi dispensa. nsui Papa Ioan Paul II a declarat c orice form de clonare uman se opune nvturilor cretine, nerespectnd principiul conform cruia oamenii sunt fiine nzestrate cu un suflet creat i dat de Dumnezeu. Este contrar credinei s ne punem n locul creatorului, arogndu-ne un rol care nu ne aparine. A clona nseamn, n fond, a exercita asupra fiinei umane un control genetic pn acum imposibil, deoarece genele clonei vor fi predeterminate. Mai mult, Biserica catolic a atras atenia i asupra suferinei la care sunt supuse animalele n cadrul experienelor i, mai cu seam, asupra imperativului scoaterii n afara legii a oricror experiene n care genele unor specii diferite de animale pot intra n contact (n SUA s-au fcut deja experiene n care s-au implantat celulelor unor vaci nuclee din celulele unor
61

oi, maimue i porci) i, cu att mai mult, amestecarea genelor umane cu gene animale. Potrivit credinei cretine, animalele sunt tot creaia lui Dumnezeu i nu pot fi considerate simple obiecte. Grania dintre cele nsufleite i cele nensufleite nu trebuie s fie uitat n numele progresului cunoaterii. Biserica catolic condamnase clonarea uman nc cu zece ani nainte de a veni pe lume oaia Dolly, n documentul Donum vitae, deoarece este considerat o negare total a demnitii procrerii umane. Un individ clonat nu are un tat i o mam, e un produs de laborator, o fiin obinut n serie, un obiect fcut la comand. Tentativele sau ipotezele fcute pentru a obine fiine umane fr nici o legtur cu sexualitatea, trebuie considerate ca fiind contrare moralei, deoarece se mpotrivesc demnitii att a procrerii umane ct i a unirii conjugale. (Donum vitae) Pe de alt parte, la Conferina medicilor islamici din SUA, publicul a ntrebat dac religia islamic admite clonarea, iar rspunsul oferit de dr. Hassan Hathout a fost c n principiu nu, dar c se admite ingineria genetic. Pentru islamism, dou sunt temele legate de clonare: dac astfel se aduce atingere statutului lui Dumnezeu de suprem i unic creator i n ce msur poate fi omul creator, altfel spus, care este limita (dac exist una), a interveniei omului asupra creaiei lui Dumnezeu. Consiliul Islamic Fiqh, care a avut loc ntre 28 iunie i 3 iulie 1997, a hotrt c pentru un musulman, credina sa nu este n nici un fel influenat de noile tehnici ale ingineriei genetice. Clonarea poate fi acceptat, dar numai pentru lumea vegetal i animal. Medicii musulmani realizeaz doar intervenii care nu acioneaz la nivel genetic. Nu este admis combinarea materialului genetic ntre specii, existnd riscul apariiei de specii noi, ntr-un mediu care nu le este natural. De asemenea, nu se admit intervenii asupra portretului genetic al unui om, considernd c astfel i se neg voina i i se
62

limiteaz posibilitatea de a-i construi un destin propriu. Prin urmare, islamul accept ingineria genetic, cu unele amendamente i este reticent n privina clonrii. Interesul multor conductori religioi este dat de mai multe probleme pe care le ridic clonarea: pericolul de a ne pierde diversitatea biologic, de a utiliza eutanasia cu scopul de a ne dispensa de indivizii considerai nereuii dup standardele vremii, c se vor nate oameni lipsii de un atribut esenial (liberul arbitru), incapabili da a-i gsi propriul drum n via, contieni fiind c n proporie de 99% imit un alt om, deja existent. II.2.4. Posibile situaii problematice Dispariia legturilor de rudenie, pericolul consangvinizrii: so-soie, tat-fiu/fiic, mam-fiu/fiic. Prin acest sistem de reproducere asexuat pot aprea combinaiile cele mai stranii: un copil, de pild, poate fi tatl sau mama fratelui sau surorii sale; un fiu, o fiic, poate fi frate sau sor cu propria mam, sau propriul tat. George Annas, bioetician i avocat la Boston University, a avertizat c clonarea unei persoane ar modifica radical nsi definiia unei fiine umane prin producerea primei fiine umane cu un singur printe genetic. n cazul unei familii n care prinii (devenii recent sterili) decid s-i mreasc familia clonnd un copil pe care l au deja, copilul mai mare ar fi printele genetic al celui mai mic, sau ar fi pur i simplu gemeni identici (dar de vrste diferite)? Descrierea relaiei genetice dintre persoana clonat i persoana care a furnizat celula pentru clonare este problematic. Consecina genetic a clonrii poate fi cu adevrat stranie. Cnd un copil clonat este crescut de strmoul genetic adult care devine mama social a clonei -, o generaie din arborele genealogic al familiei devine dubl.
63

n cazul n care o femeie ar decide s se cloneze dup ce a avut deja copii prin concepie natural, copilul care se va nate va deveni mama genetic a frailor i surorilor mai mari. Clonarea poate aduce o generaie suplimentar (reprezentat de nsi persoana clonat) ntre un printe i copilul su genetic. Astfel, printr-un singur act de clonare, suntem constrni s reconsiderm nelesul noiunilor de prini, copii i frai, precum i modul de nrudire ntre ei. De asemenea, se nasc o serie de ntrebri privind statutul social al eventualelor clone. O alt direcie, oarecum de domeniul fantasticului, vizeaz clonarea indivizilor decedai, de la animale de cas la personaliti istorice, pornind de la mostre de ADN din esuturile celui disprut. n 2000, un grup ocult din California, Proiectul celei de-a doua veniri, a vrut s realizeze a doua venire a Mntuitorului pe Pmnt prin inginerie genetic. Grupul credea c ar putea obine o mostr de ADN dintr-una dintre relicvele presupuse ale lui Iisus i s o injecteze n ovulul unei fecioare. Dar un reputat biolog american l-a tiat avntul: pentru clonare sunt necesare mostre de ADN perfect pstrate. Secta Raeliilor i-a anunat chiar intenia de a-l clona pe Hitler. Presa german a rspndit n 2002 zvonul c un faimos genetician german, Hans Gerhard, ar fi autorul unor metode revoluionare care au fcut posibil clonarea lui Adolf Hitler n persoana unui copil pe nume Helmut. Totui, chiar dac zvonul ar avea un fundament real, nu sunt motive de ngrijorare, deoarece n cazul lui Adolf Hitler, Stalin etc., brbaii originali au ajuns n funcii de conducere prin evenimente personale i istorice care nu se vor mai repeta niciodat. O clon nu este o reeditare a individului. Copiaz doar zestrea genetic a celui clonat, nu i personalitatea lui. La doar dou sptmni de la anunarea naterii lui Dolly, s-a constituit compania Clonaid, cu sediul n Bahamas (sub conducerea savantei franceze
64

Brigitte Boisellier), cu intenia de a construi o clinic unde vor fi oferite servicii de clonare.

II.3. Ce este Clonaid?

Micarea Raelian, intitulat astfel dup numele liderului ei Rael, numr 55 000 de membri n 84 de ri. Scopul sectei este dobndirea vieii eterne. Ei sper s se poat clona pentru a-i transfera contiina, memoria i toate cellalte atribute ale sufletului i/sau ale personalitii n creierele clonelor nou create. Alternativ, unii dintre ei sunt dispui s se transfere n structuri nevii, de tipul computerelor, pentru a ncerca o via etern, dar acorporal. Rael promite c toate aceste minuni vor fi posibile n urmtorii 20 de ani. Cndva, clonarea nu era dect o ambiie nc nerealizat, ca i zborul. Astzi este o realitate. Societatea Clonaid a anunat chiar punerea n vnzare a primei maini de clonat (BMS 2010), cu scopul mrturisit de a intensifica eforturile pentru clonarea fiinelor umane pretutindeni n lume . Este vorba de un sistem de fuzionare celular embrionic, ce ar fi capabil s creeze o pulsaie electronic stabil, necesar pentru dezvoltarea unui embrion uman pn la stadiul de blastogenez, ce corespunde trecerii unei perioade de cinciase zile de la fecundare, cnd embrionul este constituit din 100 pn la 150 celule. Conform lui Peter Raven, preedintele AAAS (Ascociaia American pentru Avansul tiinei), preteniile de realizare a clonrii umane aparinnd companiei Clonaid nu pot fi verificate, iar practica dezvluirii rezultatelor n conferine de pres este contrar standardelor acceptate n comunitatea tiinific. Dar indiferent dac aceste afirmaii se vor dovedi adevrate sau false, pe baza informaiilor tiinifice pe care le avem la dispoziie, noi credem c clonarea reproductiv a fiinelor umane este o procedur prematur i
65

potenial duntoare progeniturii astfel create. Clonarea reproductiv nu trebuie ns confundat cu metodele de obinere a unor celule capabile s trateze anumite afeciuni sau rni. Mai mult, subliniaz Alan Leshner, director executiv al AAAS i editorul revistei Science, acest gen de afirmaii reprezint un deserviciu adus societii i pot genera confuzie n privina diferenelor dintre cercetarea folosind metode de clonare, care poate conduce la importante tratamente medicale noi, i ncercrile de clonare reproductiv, care incumb un risc substanial fa de mam i de ftul implicat.

66

CONCLUZII
Ca student biolog, am ncercat s abordez problema clonrii din ambele puncte de vedere (tiinific i bioetic), n mod obiectiv. Personal, consider c lumea geneticii este fascinant, iar clonarea poate fi vzut ca un pas uria n tehnologia tiinei. Totui, nu se poate face abstracie de problemele profund morale pe care le ridic. Pentru c orice descoperire care atinge profund fiina uman nu mai face n exclusivitate obiectul tiinei, ci i pe cel al moralei i spiritualitii. Principalele idei care se pot desprinde n urma parcurgerii acestei lucrri pot fi sintetizate n cteva concluzii: aplicarea tehnicii clonrii plantelor i a animalelor domestice se poate dovedi util prin obinerea de copii perfecte ale unui individ valoros din punct de vedere economic n schimb, clonarea uman (de ordin reproductiv), este interzis, ca urmare a efectelor grave, de natur social i moral implicate. clonarea de esuturi i organe n scop terapeutic are mai multe anse de a fi acceptat, dei ntrebri de ordin etic apar i n acest caz clonarea uman este o cutie a Pandorei care trebuie s rmn nchis, deoarece un om perfect ar fi sortit eecului, pierznd capacitatea de adaptare la un mediu cu condiii mereu n schimbare. pentru c omul, n imensa lui curiozitate i dorin de autodepire nu poate fi oprit de nite ntrebri, fie ele de ordin tiinific, etic sau religios, singurul mod de a ncetini avntul cercettorilor ar fi o interdicie legal a clonrii umane la nivel mondial. Fiecare existen uman, nscut dintr-un miracol care transcende tiina, este unic. Cred c trebuie s respectm darul acesta minunat i s rezistm tentaiei multiplicrii indivizilor umani.
67