ESTUDIO DE PARMETROS QUE INFLUYEN EN LA ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LA INVERTASA.

Montserrat Cruz Rodrguez*, Alejandra Guilln Garca, Mara Jos Navarro Flores, Nathalie Ortega Espinosa, Damaris Itzel Torres Trinidad, Luis Daniel Valenzuela Molina.
Instituto Tecnolgico de Tuxtla Gutirrez. *monsiurhp7@hotmail.com.

Resumen.
La invertasa es una enzima inducible en Aspergillus niger y sus principales sustratos inductores son la sacarosa y rafinosa, es especfica para romper la unin de tipo -D-fructofuransido. Se evalu la actividad enzimtica de sta, as como parmetros que influyen en ella. Se encontr una afinidad de la invertasa hacia la sacarosa con una Km= 2.27 mg/ml y Vmax =36.36 mg A.R/mg Enzima*min, as mismo se comprob que el efecto de la concentracin de sacarosa es proporcional a la act. Enzimtica de la invertasa, y se encuentr mayor eficacia trabajando la enzima a 55C; as tambin la presencia de AgNO3, y CaSO4 fueron satisfactorios, comprobando su inhibicin y activacin respectivamente.
Palabras clave: invertasa, parmetros, actividad enzimtica, azcares reductores.

Introduccin. Dentro de los procesos biotecnolgicos se pueden utilizar cinticas de crecimiento biolgico y cinticas de reaccin qumica y/o enzimtica. Un elemento esencial en cualquier estudio cintico es la disponibilidad de un mtodo de determinacin conveniente para medir la velocidad de formacin de productos o la velocidad de desaparicin de sustratos (Fersht, 1980). La capacidad enzimtica es en realidad la funcin de la enzima, es decir, la capacidad que presenta sta para acelerar una reaccin qumica, la cual se puede determinar midiendo la cantidad de sustrato que desaparece o la cantidad de producto formado por unidad de tiempo, lo cual nos lleva a conocer la velocidad de reaccin. Inicialmente, las reacciones transcurren linealmente, pudindose tomar la pendiente de esta recta como velocidad inicial. A tiempos ms largos, el progreso de la reaccin se aparta de la linealidad. Esta cada de la velocidad de reaccin se debe a la disminucin significativa de la concentracin de sustrato (Muiz, 2006).

Todas las reacciones qumicas son afectadas por diversos factores como el aumento de concentracin del producto, cambios de pH, inactivacin del enzima, fuerza inica y temperatura. Efecto de las concentraciones de sustrato sobre la actividad enzimtica: la velocidad de una reaccin enzimtica depende de la concentracin del sustrato mientras la enzima no se encuentre saturada. A mayor concentracin del sustrato, a una concentracin fija de la enzima se obtiene la velocidad mxima. Despus de que se alcanza esta velocidad, un aumento en la concentracin del sustrato no tiene efecto en la velocidad de la reaccin (Mara de Lourdes Cortes, 2010). Si a un sistema enzima-sustrato se le aaden sustancias que impiden la actividad propia de la enzima, el sistema ha sido inhibido, denominando inhibidores a los componentes de bloquear la reaccin; a menudo estos agentes impiden la actividad de casi todas las enzimas. Los principales agentes responsables de inhibir a las enzimas son cidos, sulfitos, metales

pesados como mercurio, la plata y plomo (Palou et al, 1999). La invertasa, es una enzima producida por plantas y microorganismos y se usa como modelo para el estudio de enzimas glucosiladas, secretadas por levaduras y hongos filamentosos. Es una enzima inducible en Aspergillus niger y sus principales sustratos inductores son la sacarosa y rafinosa. Interviene en la reaccin de hidrlisis de la sacarosa a D-glucosa y Dfructosa en la que ocurre un cambio en la rotacin ptica de dextro a levgiro, razn por que la sacarosa hidrolizada es llamada azcar invertida. La invertasa tambin es conocida como sacarasa, -fructofuranosidasa, fructofuransido fructohidrolasa, y es especfica para romper la unin de tipo -D-fructofuransido (Voet y Voet, 1995). En el presente trabajo, se estudi y examin la actividad enzimtica y parmetros cinticos de la invertasa, en la hidrlisis de la sacarosa, evaluando tambin los efectos que ocasionan diferentes concentraciones de sustrato y enzima, as como su actividad a diferentes temperaturas, pH y con presencia de cofactores positivos y negativos.

Materiales y mtodos. Se evaluaron efectos de 6 variables (concentracin de sacarosa, pH, temperatura, concentracin de invertasa, presencia de un inhibidor y la presencia de un cofactor) en la actividad enzimtica de la invertasa Sigma. Para la obtencin de la curva patrn de azcares reductores (A.R), as como para todas las pruebas de este experimento se emple el Mtodo de Miller (2ml de DNS en cada tubo).

Todos los tubos de estos experimentos se llevaron a un volumen de 10 ml con agua destilada, y se trabaj a una temperatura ambiente de 29C. Para evaluar el efecto de la concentracin de la sacarosa se emplearon 7 pruebas y un blanco, cada tubo contuvo 0.5 ml de regulador de acetatos a 0.05M con un pH de 4.6, 0.05ml de invertasa 50g/ml y sacarosa 0.03 M (2, 1.5, 1, 0.5, 0.25, 0.1, 0.05, 1 ml, respectivamente), llevando cada tubo a un volumen de 10 ml con agua destilada. Para el efecto de pH se emplearon 5 tubos y un testigo, cada uno contena 1ml de sacarosa 0.3M, 0.5 ml de invertasa 50g/ml y 0.5 ml de regulador de citrato 0.2 M (2.5, 3.6, 4.6, 5.45, 6.37 y 4.6 pH, respectivamente). Para la evaluacin del efecto de temperatura se utilizaron 6 tubos y un testigo, cada uno contuvo 1ml de sacarosa 0.3M, 0.5 ml de invertasa 50g/ml y 0.5 ml de regulador de acetato 0.05 M a un pH de 4.6. Las temperaturas de las incubaciones de los tubos fueron 10, 20, 30, 55, 65, 80, 36C, respectivamente. Para las pruebas del efecto de la concentracin de invertasa se usaron 4 tubos y un testigo; cada tubo contena 0.05ml de invertasa (0.01, 0.02, 0.03, 0.04 M, respectivamente); para la evaluacin del efecto de un inhibidor se utilizaron 0.5 ml AgNO3 en un tubo y en otro se emplearon 0.05ml de CaSO4 como activador, todos los tubos en estas 3 evaluaciones contenan 1ml de sacarosa 0.3M y 0.5 ml de regulador de acetatos con un pH de 4.6. Para obtener los parmetros cinticos de la enzima se emple el diagrama de Lineweaver-Burke.

Resultados y discusin. En la curva patrn de azcares reductores obtenida se obtuvo una regresin lineal con una R2= 0.9941, la cual nos permiti trabajar con gran certeza los clculos posteriores para los dems experimentos. El efecto de la concentracin de sacarosa es proporcional a la actividad enzimtica de la invertasa, tal como se observa en la grfica 1. El efecto del pH no pudo ser observado debido a que slo se obtuvieron datos de absorbancia de dos tubos debido a que las dems muestras desarrollaron una coloracin muy turbia, esto a consecuencia que la concentracin de enzima manejada fue alta, por lo que recomendamos para prximos experimentos manejar una concentracin menor a 50g/ml de invertasa. En la prueba del efecto de la temperatura (grfica 2) obtuvimos un comportamiento de campana, indicando que la invertasa obtuvo una actividad enzimtica mayor a los 55C. Como se observa en la grfica 3 se obtuvo que la concentracin de invertasa es proporcional a la actividad enzimtica. La presencia de AgNO3 y CaSO4 se corroboraron como inhibidores y activadores respectivamente, de la actividad enzimtica de la invertasa (cuadro 1). Los parmetros cinticos de la invertasa fueron: Km de 2.27mg/ml y Vmax de 36.36 mg A.R/mgEnzima*min, obtenidos mediante la ecuacin de Lineweaver-Burk (grfica 4).

El fabricante de Sigma Invertasa reporta como valores de pH y temperatura ptimos de 4.5 y a 55C, respectivamente; por lo que el valor obtenido de temperatura coincidi con el obtenido en este trabajo experimental, indicando que la enzima se encuentra en buen estado y las condiciones con las que se trabajaron fueron las adecuadas.

Grfica 1 Efecto de la concentracin del sustrato (sacarosa) en la actividad enzimtica de la invertasa.

Grfica 2 Efecto de la temperatura de incubacin en la actividad enzimtica de la invertasa.

Grfica 3 Efecto de la concentracin de la invertasa en su actividad enzimtica.

Sin presencia CaSO4 AgNO3 Vel rxn de (+) (-) invertasa cofactor (mg A.R/mg E.E *min) 7.2933 18.5066 5.12 Cuadro 1 Efecto de la presencia de un cofactor+ (CaSO4), cofactor (AgNO3) en la actividad enzimtica de la invertasa.

Bibliografa.
Fersht, A. 1980. Estructura y Mecanismo de los Enzimas. Espaa: Reverte. P. 85. Muiz, O. 2006. Apuntes de Bioquimica Vegetal. Bases Para Su Aplicacion Fisiologica. Mxico : Universidad Autonoma de Mxico, 2006. Salcedo, . 2003. Estudio del efecto de la precoccin y adicin de inhibidores para

controlar el pardeamiento del banano durante la elaboracin de harina precocida. Loja. Ecuador. P. 39. Voet D. y Voet G. J. 1995. Biochemistry. 2 edicin Wiley. E.U.A. pp.1361.

Grfica 4 Clculos de parmetros cinticos de la invertasa mediante la linealizacin de Lineweaver-Burk.

Conclusiones. La concentracin de sacarosa es proporcional a la actividad enzimtica de la invertasa hasta el punto en que llega la saturacin de sta misma. Se reafirm lo que la bibliografa nos sugiere, existe una temperatura y pH ptimo en la cual tiene mayor efectividad esta enzima, a las concentraciones utilizadas de enzima se encontr mayor trabajo a 55C. Se sugiere trabajar con una concentracin de enzima no mayor a 0.032 mg/ml. As tambin se comprob la inhibicin de AgNO3 disminuyendo la velocidad de reaccin de la invertasa y la importancia de la activacin de CaSO4 duplicando sta misma. Se obtuvo que la invertasa tiene gran afinidad a la sacarosa y una Vmax de 36.36 mg A.R/mg Enzima*min a una concentracin de enzima de 20mg/ml.