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Microbiologa y taxonoma microbiana

Programa desarrollado

Ingeniera en: Biotecnologa

Programa de la asignatura: Microbiologa y taxonoma microbiana

Clave: 200920416 190920416

ESAD

Microbiologa y taxonoma microbiana


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Unidad 2 Microbiologa
Presentacin de la unidad La importancia de la Microbiologa deriva de la necesidad biolgica de estudiar los organismos que no son visibles a simple vista, y que slo con ayuda de un microscopio se pueden observar, pero que su presencia en diferentes ambientes naturales o en la industria es indispensable, ya sea participando dentro de los ciclos de incorporacin de nitrgeno, azufre y carbono, como aportando sus propiedades metablicas dentro de algn proceso, Una de sus caractersticas importantes es que poseen la propiedad de adaptar su medio encontrando rpidamente las condiciones ptimas para crecer y colonizar lugares y ambientes tan variados e inimaginables que puedan existir, como la superficie de una prtesis ya implantada en el cuerpo de un paciente, un geiser a altas temperaturas, aguas con alto contenido en sales, las cavidades corporales de animales una herida, un reactor, entre muchos otros. Propsitos El alumno comprender que los microorganismos son seres diminutos, plsticos y adaptables, capaces de crecer en nmeros insospechados y expandirse haciendo uso de su metabolismo tan variado y especializado; identificarn su importancia dentro del mbito industrial y ambiental, donde incorporar los conceptos fundamentales de microbiologa, medios de cultivo, y condiciones ptimas del crecimiento con el fin de entender el desarrollo cualitativo de las bacterias. Competencia especfica

Analizar el crecimiento bacteriano mediante el estudio de su fundamentacin qumica para determinar el tipo y medio de cultivo segn los distintos criterios de anlisis de crecimiento. Microbiologa La microbiologa es una rama auxiliar de la biologa dedicada al estudio de la vida microscpica, es decir de los microorganismos de los que ya hemos hablado que comnmente se les suele llamar microbios; podemos encontrarlos en todas partes (ubicuos) ya que son los ms abundantes de la Tierra, El ser humano pudo darse cuenta de su existencia y observarlos hasta la llegada del microscopio a mediados del siglo XVII. Los primeros en visualizar la abundancia y diversidad de microorganismos a pesar de lo rudimentario de sus instrumentos, por ejemplo, los primeros microscopios fueron Robert Hooke y Antonie van Leeuwenhoek, observaron diferentes formas de vida microscpicas como levaduras, algunas bacterias entre otros microorganismos presentes en el agua de lluvia encharcada, fluidos corporales, superficies como suelos y rocas, entre otras.

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Editar de la web izquierda http://en.wikipedia.org/wiki/File:17_Rob ert_Hooke_Engineer.JPG y derecha http://www.kyrene.org/staff/sree d/Science/Scientist/Webpages/2 009_10/Period%204/Leeuwenho ek_Anton%20van/index.htm Izquierda Robert Hooke y Derecha Antonie van Leeuwenhoek 2.1 Definicin de Microbiologa La Microbiologa etimolgicamente proviene de los vocablos griegos micro que significa pequeo, bios que significa vida y logos que quiere decir estudio o tratado; por lo tanto es la ciencia que estudia los seres vivos muy pequeos, cuyo tamao se encuentra por debajo del poder resolutivo del ojo humano, por lo que se requiere el empleo del microscopio. Abarca una enorme heterogeneidad de tipos estructurales, funcionales y taxonmicos: desde partculas no celulares como los virus y hasta organismos celulares tan diferentes como las bacterias, los protozoos y parte de las algas y de los hongos. Editar de la web redisear http://smilejud ith.blogspot.c om/2010/10/ microbiologia. html Campo de estudio de la microbiologa

Podemos definir, pues, a los microorganismos como seres de tamao microscpico dotados de individualidad, con una organizacin biolgica sencilla, y que necesitan para su estudio una metodologa propia y adecuada a sus pequeas dimensiones. Las caractersticas estructurales, su fisiologa bioqumica, gentica, taxonoma, ecologa, entre otras son aspectos del estudio de la microbiologa. Tambin se ocupa del estudio de las diferentes actividades microbianas y su relacin con el ser humano, ya que pueden acarrear consecuencias tanto benficas, como perjudiciales; por esta razn se estudian los nichos ecolgicos de los correspondientes agentes, sus modos de transmisin, los diversos aspectos de la microbiota patgena en sus interacciones con el hospedador, los mecanismos de defensa de ste, as como los mtodos desarrollados para combatirlos y controlarlos, no olvidndose de aquellas que

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reportan beneficios por medio de los procesos microbianos para la obtencin de materias primas o elaboradas, y de su modificacin y mejora racional con vistas a su imbricacin en los flujos productivos de las sociedades. La microbiota comnmente denominada flora nativa de un cuerpo sano (los integrantes de esta microbiota son bacterias), son un conjunto de microorganismos que intervienen benficamente en los procesos vitales como la digestin de alimentos, la sntesis de vitaminas en el intestino, proteccin frente a patgenos, entre otras. A continuacin se muestra un cuadro de las bacterias consideradas flora normal en humanos y su localizacin anatmica:
Bacterias Staphylococcus epidermidis Staphylococcus aureus Streptococcus mitis Streptococcus salivarius Streptococcus mutans Streptococcus faecalis Streptococcus pneumoniae Streptococcus pyogenes Neisseriae Neisseria meningitidis Veillonellae B. Coliformes (E. coli) Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Haemophilus influenzae Bacteroides Espiroquetas Lactobacilos Clostridios Clostridium tetani Corinebacterias Micobacterias Actinomicetos Micoplasmas Piel ++ + Conjuntiva + +/Nariz ++ + Faringe + + + ++ + +/+/+/+/+ + + +/+ + ++ + Boca ++ + ++ ++ ++ + + + + ++ + + + +/+ + + ++ +/++ + + ++ +/+ + + + +/++ +/++ + + +/+ ++ + + +/+ + + Intestino Grueso + ++ +/Uretra ++ +/+ Vagina + + +

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++ = ms frecuente; + = comn; +/- = irregular, ocasional o transitorio.Copyright 2011 Mama.com.mx Derechos reservados http://rantes22.blogspot.com/ 2011/04/la-flora-bacterianaintestinal-podria.html

14 Nov 2011 09:00

Localizacin de la flora normal del cuerpo humano Finalmente, la Microbiologa se ocupa de todas las tcnicas y metodologas destinadas al estudio experimental, manejo y control de los microorganismos.

2.1.1. Microbiologa Ambiental


La microbiologa ambiental abarca el estudio de los microorganismos que habitan o existen en ambientes naturales o artificiales. El origen de los trabajos cientficos en este campo se basa en las observaciones de Antonie van Lewenhoeck (1677). Los microorganismos pueden existir como clulas aisladas o como agregados celulares. Las clulas microbianas aisladas son capaces de llevar a cabo sus funciones vitales de crecimiento, generacin de energa y reproduccin independiente de otras clulas. Adems pueden alcanzar una elevada densidad poblacional en cultivos y son ms fciles de manipular para estudios genticos como la manipulacin de su ADN. La microbiologa, adems de ser una ciencia que auxilia a la biologa, es una ciencia que proporciona herramientas para determinar la naturaleza de los procesos caractersticos de la vida en los que intervienen algunos microorganismos, enfocndose en la resolucin de muchos problemas prcticos que son importantes en medicina, agricultura y la industria. La fertilidad de los suelos depende en gran medida de los procesos que algunos microorganismos llevan a cabo, por entre ellos la fijacin biolgica del nitrgeno

atmosfrico, este proceso consistente en la reduccin de N2 (nitrgeno molecular) a NH4+ (amonio) a cargo de la enzima nitrogenasa, es despus de la fotosntesis, la ruta metablica ms importante para el mantenimiento de la vida en la Biosfera.

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Curiosamente, este proceso crucial slo puede ser llevado a cabo por unos pocos procariotas; los microorganismos fijadores de nitrgeno no constituyen un grupo taxonmico homogneo, la nica caracterstica que comparten es la presencia de la enzima nitrogenasa en sus procesos metablicos, dichas bacterias comprenden organismos fototrofos, como bacterias pertenecientes a la familia Rhodospirillaceae, Clorobiaceae y Cianobacteriae; organismos quimioautotrofos, como bacterias de los gneros Thiobacillus, Xanthobacter y Desulfovibrio y organismos heterotrofos como las bacterias petenecientes a la familia Frankiaceae, al grupo Rhizobiaceae y a los gneros Azotobacter, Enterobacter, Klebsiella y Clostridium.
http://www.porquebiotecn ologia.com.ar/educacion/ cuaderno/ec_24.asp?cua derno=24 14 Nov 2011 09:34

Ciclo de nitrgeno donde intervienen las bacterias Estos organismos pueden realizar la fijacin biolgica de nitrgeno independientemente o estableciendo relaciones simbiticas con otros organismos; estas formas simbiticas son entre las rizobiceas y las leguminosas, que antiguamente eran aprovechadas para la renovacin de los suelos mediante la prctica de la rotacin de cultivos.

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http://www.porq uebiotecnologia. com.ar/educacio n/cuaderno/ec_2 4.asp?cuaderno =24 14 Nov 2011 09:15

Ubicacin de las bacterias fijadoras de nitrgeno 2.1.2. Microbiologa Industrial A la Microbiologa Industrial tambin se le ha denominado biotecnologa microbiana se puede definir como el mbito de la microbiologa orientado a la produccin de elementos de inters industrial mediante procesos en los cuales intervenga, en algn paso, un microorganismo. Por ejemplo, la produccin de: alimentos (fermentacin del pan o cerveza) y suplementos dietticos (como los cultivos de algas, vitaminas o aminocidos), biopolmeros, como el xantano, alginato, celulosa, cido hialurnico, polihidroxialcanatos;3biorremediacin de entornos contaminados4o tratamiento de desechos;5as como la produccin de principios activos de inters en medicina, como la insulina y hormona del crecimiento o de sustancias implicadas en el diagnstico. La microbiologa industrial es tan antigua como la manipulacin de alimentos fermentados como el vino, pan o yogur. No obstante, durante el siglo XX su aplicacin se diversific con el nimo de generar un gran nmero de compuestos qumicos complejos de forma ms sencilla y barata que mediante sntesis orgnica; este hecho se debe a la enorme versatilidad metablica de los microorganismos que, frecuentemente, son capaces de producir los compuestos deseados o sus precursores. Por ejemplo, la microbiologa industrial ha sido clave en la produccin de penicilinas, naturales, como la penicilina G (esto es, producidas de forma totalmente microbiolgica) o semi sintticas, como la meticilina, que requieren la purificacin de un intermediario que luego ha de modificarse qumica o enzimticamente. Finalmente, la tecnologa del ADN recombinante ha permitido, con un enfoque de ingeniera gentica, diversificar an ms la disciplina, llegando a producirse protenas humanas mediante microorganismos transformados con genes humanos.
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Editar de la web http://luisita28.blogspot.com/, http://sociologiarural.skyrock.c om/,

mbito industrial de la microbiologa En la industria de los lcteos, frecuentemente se utilizan bacterias de tipo Gram (+) anaerobias, se caracterizan por una gran produccin de acido lctico, se incluyen los gneros Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc y Pediococcus. Por ejemplo la acidificacin de la leche llevada a cabo por Streptococcus lactis y cremoris, la produccin del yogurt y quesos de pasta cocida Steptococcus thermophilus. http://www.sciencep hoto.com/search?su btype=keywords&se archstring=lactobacill us&oldsearchstring= bacterias&matchtype =&sort_results=&me dia_type=images&lic ense=both&channel =sc Lactobacillus casei Shirotay algunos productos lcteos Obtenida de: www.sciencephotolibrary.com

Actividad 1. Con meln o con sanda En esta actividad comparars entre los diferentes mbitos de estudios de la microbiologa en las ramas de la microbiologa ambiental e industrial. 1.- De las diferentes ramas de la microbiologa realiza un cuadro comparativo haciendo nfasis en la importancia de cada rama. 2.- Escoge un ejemplo de aplicacin de cada una de las ramas de la microbiologa y menciona que pasara si no se llevase a cabo tal proceso. 3.- Apoya tu trabajo con imgenes y s cuidadoso con la ortografa 4.- Guarda tu documento con la nomenclatura MTM_U2_A1_XXYZ y envalo a tu facilitador (a) mediante la seccin de tareas. Nota: Te exhortamos atentamente a abstenerte de cualquier accin de plagio o copia de

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contenidos, ya que tu facilitador (a) puede detectar esta situacin sin dificultad; tu formacin exige que todo producto o tarea que reportes sea totalmente original y propio de tu iniciativa y creatividad, con el fin de que en lo sucesivo esta actitud se proyecte directamente en tu prctica profesional. 2.2. Crecimiento microbiano En un sistema biolgico se define al crecimiento como el aumento ordenado de las estructuras y los constituyentes celulares de un organismo; por ejemplo cuando se siembran microorganismos en un medio de cultivo apropiado, los mismos comienzan a dividirse activamente empleando los nutrientes que le aporta el medio de cultivo para "fabricar" nuevos microorganismos. Este proceso contina hasta que algn nutriente del medio de cultivo se agota (sustrato limitante) y el crecimiento se detiene. El aumento de la masa celular producido por acumulacin de productos de reserva no constituyen crecimiento. Editar de la web http://graficas.explora.cl/ otros/biotec/lacto.html

Visualizacion del crecimiento en caja petri y en el microscopio 2.2.1. Crecimiento Individual Consiste en el aumento del tamao y peso de las clulas que precede a la divisin celular. Esta divisin implica tambin un aumento en el nmero de clulas (proliferacin de la poblacin). Uno de los procesos que comnmente experimentan las bacterias para dividirse es la fisin binaria, a travs de la cual una clula madre al alcanzar un determinado volumen se divide dando dos clulas hijas. El proceso de fisin binaria consiste en la autoduplicacin del material hereditario seguido de la reparticin en las dos clulas hijas, las que se separan por estrangulamiento de la membrana celular y formacin de la pared celular. Podemos referirnos mas especficamente al crecimiento individual cuando realizamos el famoso experimento de germinar una semilla de frijol o de maz, al cabo de unos cuantos das observamos que comienzan a brotar las partes que van a conformar una planta madura.

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Editar de la web http://es.wikipedia.org/wiki/ Archivo:Binary_fission_es. svg y http://www.unavarra.es/ge nmic/microgral/Tema%200 2.kj%20Cultivo%20de%20mi croorganismos.pdf

Divisin celular de una bacteria mediante el proceso de fisin binaria 2.2.2. Crecimiento Poblacional Es un crecimiento respecto al nmero de clulas (proliferacin de la poblacin). Se conoce como tiempo de duplicacin generacional al tiempo en que tarda una poblacin en duplicar su nmero. Los tiempos de duplicacin varan segn el microorganismo del que se trate. Por ejemplo, para obtener la primera generacin de Eschericha coli (bacteria causante de infecciones intestinales) tarda en promedio12.5 min., Rhizobium meliloti (bacteria que fija nitrgeno atmosfrico) 1.8 hr y Nitrobacter sp (bacterias que fijan nitrgeno atmosfrico) aprox. 20 hr. Las poblaciones microbianas raramente mantienen un crecimiento exponencial prolongado. Si ello ocurriera en poco tiempo la tierra estara cubierta de una masa microbiana mayor que la de la tierra misma. El crecimiento est normalmente limitado por la disponibilidad de nutrientes y por la acumulacin de productos del propio metabolismo microbiano que en altas concentraciones resultan txicos para la poblacin.

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2.3. Cultivo de Microorganismos Un medio de cultivo, es un recurso que sirve para lograr la multiplicacin de microorganismos tales como bacterias, hongos y parsitos en el laboratorio, la finalidad de un medio de cultivo es proporcionar el ambiente ptimo para favorecer el crecimiento del microorganismo deseado. Los cultivos son empleados en los campos de la medicina humana y veterinaria como mtodos de propagacin para el estudio de las bacterias y otros microorganismos que causan enfermedades. Por ejemplo nuestras manos que estn en continuo contacto con diversas superficies que contienen un sinfn de microorganismos, por eso se recomienda lavarse antes de cada alimento y despus de ir al bao. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura ptima ajustada a las necesidades particlares del microorganismo, al igual que la humedad y presin de oxgeno, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. Se recomienda por ejemplo lavarse las manos con frecuencia para evitar que la piel adquiera caractersticas ideales para alojar microorganismos que puedan causar algn dao. Editar de la web http://cienciaslacoma.blogspot.com/2010/09/mi croorganismos-en-nuestras-manos.html

Medio muy ptimo el que crecen bacterias 2.3.1. Tipos de Cultivo Un medio de cultivo para bacterias, es una mezcla de sustancias que permiten el crecimiento de las bacterias en el laboratorio. Un microorganismo se puede cultivar o sembrar en medio lquido o en medio slido. Los medios de cultivo deben estar enriquecidos con distintos nutrientes que van, desde carbohidratos simples (azcares), protenas, lpidos (grasas) hasta sustancias complejas como la sangre o el extracto de caldo de carne, as como los requerimientos que nosotros necesitamos para crecer. Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra formada por muchos tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo slido donde las clulas que se multiplican no cambian de localizacin; tras muchos ciclos reproductivos, cada bacteria individual genera por escisin binaria una colonia macroscpica compuesta por decenas de millones de clulas similares a la original. Si esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio crecer como cultivo puro de un solo tipo de bacteria.

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Editar de la web http://es.wikipedia.org/wiki/Cultivo_(microbiolog%C3%ADa)

Izquierda medio de cultivo slido y derecha medio de cultivo liquido.

Se pueden clasificar segn sus caractersticas fsicas en: slidos, semislidos y lquidos. La diferencia es slo la cantidad de una sustancia que llevan para solidificar (agar):

Lquidos: se preparan todos los constituyentes en una disolucin acuosa (agua destilada). Ya disueltos, se reparten en matraces o tubos de ensayo que tapamos y esterilizamos con calor, proporcionan nutrientes a las bacterias y, adems, es ms fcil determinar sustancias producidas por las bacterias porque es ms fcil purificar sustancias en medio lquido. Por ejemplo el medio de cultivo lquido de cerebro corazn infusin es apto para el crecimiento de bacterias aerobias y anaerobias como los estreptococos y neumococos. Editar de la web http://www.google.com.m x/imgres?q=cultivos+bact erianos+en+tubos+de+en saye&um=1&hl=es&biw= 1280&bih=593&tbm=isch &tbnid=51jS9cBFRnSynM :&imgrefurl= y http://www.slideshare.net/ breid/pruebasbioqumicas-y-medios-decultivo-en-bacterias

Forma de esquematizar un medio de cultivo lquido

Slidos: Se procede del mismo modo que con los medios lquidos, pero, al disolver en agua destilada, aadimos de 15 a 20 g/l de agar. Lo esterilizamos y lo depositamos en placas o cajas petri cuando est a unos 60 C y cuando alcance los 50 C ya sern slidos. El agar nutritivo es utilizado como medio de cultivo slido general para obtener el crecimiento de bacterias con pocas exigencias nutritivas, otro medio el agar Mac Conkey que se utiliza para el crecimiento d bacilos Gram negativos.

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Editar de la web http://www.stockphotos.mx/image.php?img_id=4 367343&img_type=1

Forma de esquematizar un medio de cultivo slido

Semislidos: su apariencia es de gel. Slo llevan 5 g/l de agar, se utilizan poco, por ejemplo para determinar la movilidad bacteriana. Si se hace una siembra y la bacteria es inmvil, la bacteria crecer en la cara interna del tubo donde hicimos la siembra, pero si la bacteria es mvil crecer alrededor de ese tubo.

Actividad 2. Buen provecho. Esta actividad es un gran reto ya que implica crear un mapa conceptual (MMCC) en el cual reflejars tu dominio del tema anterior, al construirlo describirs en el las relaciones entre los tipos de medios de cultivo y su aplicacin en el mbito microbiolgico. En un documento de texto o archivo de imagen plasma un mapa conceptual que contenga las siguientes caractersticas: El mapa conceptual debe presentar una estructura arborescente que incluya los siguientes aspectos: 1.- concepto o idea original 2.- palabras clave 3.- conectores 4.- conectivos y palabras de conexin 5.- conceptos en diferentes niveles en este caso puedes desarrollarlo mnimo en tres niveles De esta manera a partir del concepto o idea de origen ocurre: 1.- desprendimiento de conceptos secundarios 2.- conectores y proposiciones.- conectores son palabras o preposiciones insertas entre dos conceptos y son tiles para producir nuevas proposiciones o enunciados con sentido 3.- enlaces cruzados.- son puentes entre proposiciones dentro de la arborizacin 4.- Jerarquizacin.- es el orden en ascendente-descendente en funcin de la complejidad de los conceptos o proposiciones tratados en la arborizacin del MMCC.

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El agar es un polisacrido obtenido de la pared celular de varias especies de algas rojas de los gneros Gelidium, Euchema y Gracilaria, la palabra agar viene del malayo agaragar, que significa jalea; es un elemento solidificante empleado frecuentemente para la preparacin de medios de cultivo. Se lica completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse, no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en l. Editar de la web http://www.slideshare.net/breid/pruebasbioqumicas-y-medios-de-cultivo-enbacterias

Agar La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuacin. Los medios de cultivo deben contener agua (H2O), carbono (C), nitrgeno (N), azufre (S), fsforo (P), calcio (Ca), sodio (Na), magnesio (Mg), molibdeno (Mo), cobre (Cu) y zinc (Zn); es decir como si quisiramos preparar un pastel necesitamos, leche, harina, huevo, mantequilla, saborizantes; entre otros, si alguno de estos faltara el paste no se podra terminar. Lo mismo sucede con los medios de cultivo, si falta algn nutriente no podr propiciar el crecimiento de los microorganismos. Editar de la web http://www.slideshare.net/guested7523/cre cimiento-microbiano

Ingredientes que debe contener un medio:

En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentacin de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se aaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes. El oxgeno, como constituyente del agua, es esencial para todos los organismos. Sin embargo, el oxgeno molecular es requerido de diferentes maneras por los microorganismos

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Microorganismos aerobios: Requieren de manera obligada del oxgeno necesariamente para llevar a cabo su metabolismo. Existen dos grupos los organismos aerobios estrictos que requieren oxgeno en concentraciones similares a la atmosfrica (20%) y los aerobios microaerfilos que requieren oxgeno en concentraciones inferiores a las de la atmsfera (5-10%). Microorganismos anaerobios: son aquellos organismos que no requieren de oxgeno para llevar a cabo sus funciones metablicas, pudiendo ser de tres tipos: anaerobios facultativos aquellos que crecen en ausencia y en presencia de oxgeno pero crecen mejor con oxgeno, anaerobios estrictos aquellos que no solo no requieren oxgeno, sino que su presencia los destruye y los anaerobios aerotolerantes son aquellos que no requieren oxgeno pero lo toleran; no mueren en su presencia. Medios de Cultivo: en funcin de su composicin, distinguimos dos grupos de medios de cultivo:

Medios sintticos o definidos: aquellos que contienen cantidades precisas de sustancias orgnicas e inorgnicas puras disueltas en agua destilada. Medios complejos o indefinidos: contienen sustancias altamente nutritivas, pero de composicin indefinida. Suelen llevar sustancias como extractos de carne, peptona, extractos de levadura, bovril; la ventaja de este medio de cultivo es que contiene muchos factores de crecimiento, por lo que podemos cultivar en l gran nmero de microorganismos. El inconveniente es que no conocemos lo que el microorganismo est consumiendo, ejemplos: Caldo nutritivo: extracto de carne + peptona + agua, Agar nutritivo: extracto de carne + peptona + agua + agar.

Clasificacin de los medios de cultivo Generales: son medios que requieren contenidos mnimos de C, N, S, P, energa, oligoelementos, pH adecuado. Enriquecidos: se le llama as porque algunos microorganismos no son capaces de desarrollarse en medios de cultivo generales; para lograrlo es necesario enriquecerlo con sustancias nutritivas como la sangre, el suero, extractos de tejidos animales, tales medios son enriquecidos, y los microorganismos que crecen en ellos son microoorganismos exigentes o fastidiosos; un ejemplo de este tipo de medio de cultivo es el de agar-sangre. Selectivos: aquellos que contienen uno o varios compuestos que inhiben el crecimiento de un determinado tipo de microorganismos y no afectan a otros tipos; por ejemplo el cristal violeta inhibe las Gram +. Otra manera es modificar la fuente de carbono; si sustituimos la glucosa por maltosa, seleccionamos aquellos microorganismos capaces de digerirla. Diferenciales: son medios que contienen distintos compuestos qumicos o indicadores sobre los que determinados microorganismos adquiere coloraciones especficas o reaccionan de una manera determinada. Ejemplo: Agar levine tiene colorantes especiales (eosina y azul de metileno) que nos permiten diferenciar a las colonias que

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viven en el medio. Escherichia coli forma colonias de color verde claro, mientras que E. enterobacter forma colonias de color rosa salmn. De transporte: su nica funcin es mantener vivas a las bacterias desde la toma de la muestra hasta su llegada al laboratorio. Les proporciona humedad (agar) y elimina los productos txicos (carbono activo).

Actividad 3. Foro: T eres para m Discute acerca de la relacin de las condiciones naturales en donde se desarrollan los microorganismos (microambiente) en relacin con los medios de cultivo. Ejemplo: Agar sanguis. Imita algunas de las condiciones microambientales presentes dentro del torrente sanguneo. De acuerdo a los temas vistos en clase discute porque son importantes tener una serie de condiciones ambientales ptimas para la preparacin de medios de cultivo, menciona que pasara si se modificara una de tales condiciones.

Medios de Cultivo de uso Habitual Existen un sinfn de medios de cultivo, la mayora de ellos son especficos para que crezca una bacteria en comn, los ms importantes se enuncian en la siguiente tabla:
Caldo comn Caldo de extracto de carne bovina Caldo exento de azcares Agar Tiosulfato, Citrato, Sales de bilis, Sacarosa (TCBS) Prueba de Voges-Proskauer Caldo Suero Agua-suero de Hiss Solucin Dunham Caldo triptsa fosfatado Leche Caldo de enriquecimiento para PPLO Agar-nutritivo Agar-suero Agar-sangre Medio de Edwards Agar-sangre violeta-azidasdica Medio CIN para Yersinia Agar-chocolate Agar cetrimida Caldo con carbohidratos Agar-hgado Agar-patata glicerinado Medio biliado-verde brillante Agar eosina azul de metileno (EMB) Agar verde brillante Caldo formiato-ricinoleato Agar-desoxicolato Caldo base tetrationato Agar citrato de Simmons Caldo urea Medio para la produccin de toxina por estafilococos Agar SS (Salmonella-Shigella) Agar-urea base Medio descarboxilasa base Agar fenilalanina Agar nitrato Agar acetato de plomo Agar hierro de Kliger Gelatina nutritiva Agar Mueller-Hinton Medio SIM Medio cerebral de Hibler Medio al huevo de Dorset Medio al suero hemtico de Loeffler Agar huevo glicerinado Medio de Lowenstein-Jensen Medio sinttico de Dorset Agar-sangre-glucosa-cistina Medio #110 para estafilococos Agar Bacto-Middlebrook 7H10 Agar Bacto-Middlebrook OADC Enrichment Agar oleico base Bacto-Dubos Agar de endo Medio al tioglicolato Patata Otros medios vegetales Agar soya tripticasa Agar marino Zobell Agar Mac Conkey Medio Campy

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A continuacin se enuncian caractersticas de algunos medios: Agar Eosina y Azul de Metileno (EMB) Es un medio utilizado para el aislamiento y diferenciacin de bacilosentricos Gram negativos. Este medio tambin es conocido como Agar EMB por sus siglas en ingls. Permite la diferenciacin de las colonias fermentadoras de lactosa de las no fermentadoras. Lasacarosa est incluida en el medio para detectar a los miembros del grupo coliforme que fermentan ms rpidamente la sacarosa que la lactosa. El envase donde viene el medio de cultivo contiene Digerido Pancretico de Gelatina 10.0 g/L, Lactosa 5.0 g/L, Sacarosa 5.0 g/L, Fosfato Dipotsico 2.0 g/L, EosinaY 0.4 g/L, Azul de Metileno 0.065 g/L, Agar Bacteriolgico 15.0 g/L a un pH de 7.2 0.2. Se prepara suspendiendo 36 g del medio en un litro de agua purificada, calentar con agitacin suave hasta su completadisolucin y hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121C (15 libras de presin) durante 15 minutos. Dejar enfriar a una temperatura entre 45-50C y vaciar en placas de Petri estriles, recolectar las muestras y sembrarlas tan pronto lleguen al laboratorio, sembrar las placas por estra, incubar las placas a 35- 37C durante 18 a 24 horas y observar el crecimiento. Las colonias de Salmonella y Shigella son translcidas, de color mbar o incoloras. Los coliformes queutilizan la lactosa y/o sacarosa producen colonias de color azul a negro con centros obscuros y brillometlico. Otros coliformes como Enterobacter presentan colonias mucosas de color rosa. Las cepas deEnterococcus faecalis son parcialmente inhibidas. Editar de la web http://www.instrumentalm edico.com/productos/me dios-de-cultivodeshidratados/agareosina-azul-metilenoemb-levine-500g y http://archive.microbelibr ary.org/ASMOnly/details. asp?id=2553&Lang

Medio de cultivo Agar EMB y colonias bacterianas de Enterobacter aerogenes Agar Mueller Hinton:

Es un medio utilizado para realizar las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en microorganismos aerbicos por el mtodo de Bauer-Kirby. Este medio tambin es conocido como Agar M-H. Se llevan a cabo pruebas de susceptibilidad a antibiticos, con este medio se han llevado a cabo una gran cantidad de estudios sobre susceptibilidad antimicrobiana. En este me dio la infusin de carne y la peptona de casena proveen la fuente de nitrgeno, vitaminas, carbn y aminocidos. El almidn es agregado para absorber cualquier metabolito txico y el agar es adicionado como agente solidificante. Contiene

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infusin de carne 300.0 g/L, almidn. 1.5 g/L, peptona de casena H 17.5 g/L, agar bacteriolgico 17.0 g/L a un pH de 7.4 0.2. Agitacin suave hasta su completa disolucin y hervir durante un minuto, esterilizar en autoclave a 121C (15 libras de presin) durante 15minutos. Dejar enfriar a una temperatura entre 45-50 C y vaciar en placas de Petri estriles. Para obtener desarrollo de Neisseria enfriar el medio a 45-50 C y agregar sangre de borrego desfibrinada estril al 5%calentada a 80 C. Para realizar pruebas de oxacilina y meticilina con estafilococcos el medio deber se rsuplementado con 2% de cloruro de sodio. Editar de la web http://www.azuld iagnosticdb.com /upload/index.ph p?route=product /product&produc t_id=1366 y http://atlas.med micro.info/index. php?jazyk=en&s ekce=1&podsek ce=8

Error! Referencia de hipervnculo no vlida.

Agar Mueller-Hinton y una colonia de Pseudomonas aeruginoses Caldo nutritivo:

Medio de cultivo utilizado para propsitos generales, para el desarrollo de microorganismos con escasos requerimientos nutricionales. Su uso est descripto en muchos procedimientos para el anlisis de alimentos, aguas y otros materiales de importancia sanitaria. Medio no selectivo, contiene pluripeptona y extracto bacteriano. Puede ser utilizado adems, como pre-enriquecimiento en la bsqueda de Salmonella spp. a partir de alimentos, ya que permite recuperar clulas de carne que constituyen la fuente de carbono y nitrgeno necesarias para el adecuado desarrollo daadas, diluir metabolitos txicos y sustancias inhibitorias. Contiene pluripeptona 5.0g/L y extracto de carne 3.0g/L a pH final: 6.9 0.2. Se prepara empleando 8 g de polvo por cada litro de agua destilada, calentar hasta disolver, distribuir y esterilizar en autoclave 118-121 C durante 15 minutos, dejar enfriar y sembrar los microorganismos por inoculacin directa incubndose despus en aerobiosis a 35-37C durante 24 horas.

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Editar de la web http://www.jampar.com.pe/product/detalle/ 013010079.html

Envase de medio de cultivo de caldo nutritivo Agar Hierro de Kliger: Es un medio que se emplea para la diferenciacin de cultivos puros de bacilos Gram negativos con base en su capacidad para fermentar la dextrosa y la lactosa y la produccin de sulfuro de hidrgeno. Presenta extracto de levadura y peptonas que fungen como fuentes de nitrgeno, vitaminas y minerales, el sulfato frrico y el tiosulfato son indicadores de la produccin desulfuro de hidrgeno. Tambin tiene cloruro de sodio que ayuda a mantener la presin osmtica. Funciona como agente solidificante. Contiene una mezcla de peptonas 20g/L, cloruro de sodio 5.0g/L, lactosa 10.0g/L, tiosulfato de sodio 0.5g/L, dextrosa 1.0g/L, citrato de hierro y amonio 0.5g/L, rojo de fenol 0.025g/L, agar bacteriolgico 15.0g/L, a un pH de 7.4 0.2 El mtodo de preparacin del medio, es suspender 52 g del medio en un litro de agua destilada, calentar con agitacin suave hasta su completa disolucin y hervir durante un minuto, dispensar en tubos de vidrio, tapar y esterilizar en autoclave a121C (15 libras de presin) durante 15 minutos, dejar enfriar en posicin inclinada, el color del medio preparado es rojo y se suele colocar en tubos para la siembra de microorganismos. Posteriormente para la siembra tomar una colonia bien aislada a partir de un medio slido, inocular los tubos inicialmente por picadura en el fondo del tubo (de 3 a 5 mm) y posteriormente por estra en la superficie, incubar los tubos con las tapas flojas a 35- 37C durante 18 a 48 horas, leer los tubos para la produccin de cido en el fondo y la superficie, as como la produccin de gas y sulfuro de hidrgeno. Los resultados se leen una superficie alcalina y un fondo cido (rojo/amarillo) indica fermentacin solo de la dextrosa, una superficie y fondo cido (amarillo/amarillo) indica la fermentacin de dextrosa y lactosa, una superficie y fondo alcalino (rojo/rojo) indica que no hubo fermentacin de ninguno de los carbohidratos, la presencia de burbujas o fracturas en el medio indica la produccin de gas, la presencia de un precipitado negro indica la produccin de sulfuro de hidrgeno.

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Editado de la web http://www.slideshare.net/roberch avez/medios-de-cultivo-ypruebas-bioquimica-presentation

For mas en las que se visualizan resultados de la siembra de microorganismos en agar Hierro de kliger Caldo triptosa fosfatado: Medio que sirve para propsitos generales, til para el cultivo de bacterias nutricionalmente exigentes, especialmente Streptococcus spp., a partir de diversas muestras. En el medio de cultivo, la triptena aporta los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo de microorganismos. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el fosfato disdico otorga capacidad buffer. Este medio de cultivo, es utilizado para el crecimiento de bacterias nutricionalmente exigentes. Tambin puede agregarse como adyuvante a cultivos celulares, y permite el agregado de agar, sangre o acida sdica para ser utilizado en determinados propsitos. Contiene triptosa 20 g/L, glucosa 2.0 g/L, cloruro de sodio 5.0 g/L, fosfato disdico 2.5 g/L a un pH 7.3 0.2. Se siembra directamente, a partir del material de estudio, incubndose en aerobiosis, a 35-37 C, durante 18-24 horas. Agar Salmonella-Shigella: Tambin conocido como Agar SS, es utilizado para el aislamiento de especies de Salmonella y Shigella a partir de muestras clnicas y de alimentos. El Agar Salmonella Shigela tiene un desempeo superior a otros medios para el aislamiento de especies de Salmonella y Shigella. En este medio las sales biliares #3.3 y el verde brillante actan como inhibidores de bacilos Gram positivos, de la mayora de bacilos coliformes y del swarming en Proteus spp., mientras que permiten el crecimiento de Salmonella spp. El tiosulfato de sodio y el

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citrato frico permiten la deteccin de la produccin de H2S (sulfuro de hidrgeno). La lactosa proporciona la fuente de carbohidratos, el rojo neutro y el verde brillante actan como indicadores de pH y el agar es agregado como agente solidificante, acta a un pH de 7.0 0.2C Para prepararlo se suspenden 60 g del medio en un litro de agua destilada, calentar con agitacin suave hasta su completa disolucin y hervir durante un minuto, enfriar a una temperatura entre 45-50 C y vaciar en placas Petri estriles. No esterilizar en autoclave. Para la siembra se recolectan las muestras en contenedores estriles o con hisopos estriles transportados en un medio de transporte, sembrar las muestras por el mtodo de la estra para obtener colonias aisladas, incubar las placas a 35-37 C durante 24 a 48 horas y examinar el crecimiento. Algunas cepas de Shigella spp. son inhibidas en este medio por lo que es recomendable utilizar medios adicionales. Las enterobacterias pueden ser diferenciadas en base a su capacidad de fermentar la lactosa. Las especies de Salmonella y Shigella son no fermentadoras de la lactosa y forman colonias incoloras en el Agar SS. Las especies de Salmonella que son productoras de sulfuro de hidrgeno desarrollan colonias concentro obscuro. Los coliformes son parcialmente inhibidos. E. Coli produce colonias de color rosa a rojo y pueden presentar una zona de precipitado. Las colonias de Enterobacter aerogenes son cremosas de color rosa.Citrobacter y Proteus spp. Pueden crecer produciendo colonias con centros de color gris o negro debido ala produccin de H2S. Enterobacter faecalis es parcialmente inhibido presentando colonias incoloras. Editar de la web http://www.azuldiag nosticdb.com/uploa d/index.php?route= product/product&pr oduct_id=1369 y http://blogs.umh.es/ microbiologia/files/ 2010/09/salmonella _t.jpg 16 Nov 11 10 am Medio de cultivo Agar SS y micrografa electrnica de colonias bacterianas de Salmonella spp. Como se preparan los medios Los medios de cultivo, siempre deben prepararse utilizando agua destilada (salvo el Marino). Es necesario ajustar siempre el pH. Todos los utensilios deben estar perfectamente limpios. Todos los medios deben esterilizarse. Los medios se preparan en matraces cnicos con tapa. Se pesa la cantidad de medio requerida, se disuelve o suspende en el agua. Se ajusta el pH. Se esteriliza a 121C por 20 min. Se espera a que enfri (42C) Servir 20 ml aprox. en cada caja de Petri en un

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rea estril para evitar contaminacin de los medios; de preferencia limpiar el rea con alcohol y tener cerca un mechero. Editar de la web http://ocwus.us.es /produccionvegetal/sanidadvegetal/tema_22/ page_09.htm

Pasos para elaborar un medio de cultivo en cajas petri y en tubos Esterilizacin Hmeda, autoclave (como una olla de presin). Seca, horno Gaseosa: xido etileno, formaldehido o perxido (H2O2). Filtracin: membranas de 0.45 y 0.22 m.

Editar de la web http://www.figursa.com/autoclaves.php

Autoclaves para esterilizar medios de cultivo comnmente usadas

Mtodo de siembra por agotamiento o en estra Se necesita una caja o placa petri en la cual se coloca el medio de cultivo y se procede a sembrar una muestra ya sea slida o lquida, se recomienda el uso de un asa de platino para realizar la siembra. La metodologa a seguir es como se esquematiza en la figura siguiente donde: (a) esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un mechero hasta que tenga tonalidad del rojo vivo,

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(b) introducirla en la suspensin bacteriana u objeto para recoger una muestra, (c) sembrar haciendo estras sobre la superficie de un medio slido en una placa Petri, y (d) volver a esterilizar el asa, tocar en la zona de la placa ya sembrada y hacer un segundo grupo de estras en una regin nueva de la placa. Repetir el proceso una tercera y una cuarta vez, hasta conseguir que los grupos de clulas se diluyan y se separen clulas aisladas y (e) despus de la incubacin, se desarrollan colonias aisladas. Para estar seguro de que el cultivo es puro, repetir el proceso entero; para ello tomar una colonia aislada y sembrar por estras una segunda placa. Para que los microorganismos crezcan se incuba a 37 C durante 24 horas y, en la primera zona, habr un amasijo de clulas. En la segunda, parte de la primera zona estar mejor extendida, y en la tercera y en la 4 mejor an. Si tomamos una colonia y la ponemos sobre una placa petri, tendremos un cultivo puro.

Forma de sembrar en caja petri con medio de cultivo slido. Editar de la web http://bioservice77.obolog.com/esterilizacion-calorcultivo-luz-microrganismos-335412

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Mtodo de siembra en tubo A diferencia del cultivo en placa se necesitan tubos bacteriolgicos estriles, los cuales pueden contener tanto medio de cultivo lquido como slido. El mtodo de siembra es tomando un asa de platino y esterilizarla por flameado en la llama de un mechero hasta que tenga tonalidad del rojo vivo, introducirla en la suspensin bacteriana u objeto para recoger una muestra, sembrar haciendo una picadura cuando el medio es slido, siembra en superficie diagonal y agitando el asa dentro del tubo cuando el medio es lquido. En los tubos con medio de cultivo lquido se pueden llevar a cabo diluciones sucesivas a tal grado de obtener un cultivo puro con pocas clulas que despus se sembraran en un medio slido.

Formas de sembrar en tubo Editar de la web http://mediateca.educa.madrid.org/imagen/tags.php?pag=3&tag=ensayo Despus de llevarse a cabo la siembra de los microorganismos, los medios de cultivo se ponen a incubar tal y como se especifica para cada bacteria que se desea obtener o aislar. Editar de la web http://uriel-93.overblog.com/article-32831322.html

Equipo usado para el crecimiento de microorganismos estufa incubadora o incubadora 2.3.2. Preservacin de Microorganismos Antiguamente los microorganismos han sido empleados como materia prima esencial de trabajo en la obtencin de una variedad de medicamentos (antibiticos, vitaminas y aminocidos), elaboracin de alimentos (pan, queso, leche, bebidas y licores) y fabricacin de solventes y reactivos, entre otras aplicaciones. El creciente uso de estos materiales biolgicos en la biotecnologa y la proteccin medioambiental han fortalecido la necesidad de mantener los cultivos microbianos de manera que sus propiedades permanezcan estables.

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La preservacin de cepas (muestras) microbianas debe garantizar la viabilidad, pureza y estabilidad gentica de los cultivos, caractersticas que coinciden con los objetivos de un buen mtodo de conservacin Con frecuencia la eleccin de la tcnica ms adecuada para conservar cultivos microbianos resulta difcil, pues deben tomarse en consideracin los criterios de viabilidad y pureza de las cepas, cambios poblacionales y genticos, nmero y valor de los cultivos, costo, suministro y transporte de cepas, as como la frecuencia del uso de los cultivos. El mtodo de conservacin que se elija debe garantizar la supervivencia de al menos el 70 % de las clulas por un perodo considerable de tiempo, de forma tal que la poblacin sobreviviente se asemeje a la original como sea posible, conserve las propiedades de importancia de los cultivos y minimice la ocurrencia de los eventos genticos. De igual manera debe reducir al mnimo el riesgo de contaminacin y permitir que la pureza del cultivo permanezca inalterable. A esto se le suma la distribucin, para la cual se necesitarn rplicas conservadas y empaquetadas convenientemente que permitan la llegada al lugar de destino en las mejores condiciones. Los microorganismos son enviados por varios medios: correo areo, postal o a travs de las manos, de un laboratorio a otro dentro de un mismo pas y con frecuencia a travs de las fronteras o continentes. Su distribucin y manipulacin est regulada en el mbito internacional y nacional, y para su transportacin es necesario el uso del triple empaque para asegurar que todo el personal involucrado en este proceso est protegido de la exposicin a cualquier agente contenido en el envase. Algunos cultivos son empleados como cepas controles, cepas de ensayo, cepas de produccin industrial y pueden ser utilizadas frecuentemente en un laboratorio. En estos casos, la facilidad del recobrado y el riesgo de contaminacin de los cultivos necesitan ser considerados Existen dos formas ms importantes de conservacin: I. Congelacin (a 70 C y 196 C) y liofilizacin como tcnicas que minimizan al mximo el riesgo de cambio gentico en las clulas y las mantienen viables por 10 aos o ms, as se han podido conservar materiales biolgicos como cultivos de hongos, bacterias y levaduras, algas, suero, clulas sanguneas, entre otros. El elevado costo de los equipos que emplean estos mtodos dificulta su implementacin en muchas instituciones. Se necesitan mantener libres de humedad, por lo que se ocupan materiales extra para lograrlo como arena, slica gel, perlas de vidrio; donde cesa el crecimiento, as como el almacenamiento en tierra, parafina lquida y la suspensin en agua estril (destilada o de mar). Editar de la web http://www.misequipos.com/refri geracion/Congeladores_Acero_I noxidable.php y http://www.lobov.com.ar/site/nte cnica_det.php?id=4

Izquierda un congelador y derecha un

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liofilizador II. Se propone llevar a cabo la resiembra peridica, que es una tcnica que permite la supervivencia de los cultivos en cortos perodos de tiempo. De lo que se trata es de transferir el cultivo del medio seco a uno fresco proporcionndole las condiciones ptimas de crecimiento, lo que condiciona el elevado riesgo de contaminacin y variabilidad de las caractersticas de las cepas.

Cierre de la unidad Con los temas vistos en esta unidad te pudiste dar cuenta como los microorganismos se pueden reproducir de manera muy rpida, colonizar diversos hbitats y sobre todo cuales son las condiciones y los requerimientos para dicho proceso. Pudiste constatar que los microorganismos se utilizan en muchos estudios tanto en el medio ambiente, la salud, industria entre otros. Ahora podrs integrar estos conocimientos junto con los de la unidad anterior donde tendrs un bosquejo mayor de cmo es el desarrollo cualitativo de las bacterias. Para saber ms Ver Video http://www.youtube.com/watch?v=pI3V5KPj5XQ&feature=related analiza cmo fue que se lleg al conocimiento de los microorganismos y su impacto significativo en las ciencias biolgicas. Evidencia de Aprendizaje. Mundo microbitico

Elabora un cartel para exposicin en congreso* especializado en un medio de cultivo que tu elijas, describe cmo es dicho medio de cultivo, las diferentes especies de organismos que pueden cultivarse, las condiciones necesarias para que subsistan y la importancia de la identificacin de dichas especies.

2.- apoya tu trabajo con imgenes y s cuidadoso con la ortografa 3.- guarda tu documento con la nomenclatura MTM_U2_EA_XXYZ y envalo a tu facilitador (a) mediante la seccin de tareas. Nota: Te exhortamos atentamente a abstenerte de cualquier accin de plagio o copia de contenidos, ya que tu facilitador (a) puede detectar esta situacin sin dificultad; tu formacin exige que todo producto o tarea que reportes sea totalmente original y propio de tu iniciativa y creatividad, con el fin de que en lo sucesivo esta actitud se proyecte directamente en tu prctica profesional.

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Fuentes de consulta Bibliografa bsica Gonzlez,G. M. y C. A. M. (2007) Microbiologa ambiental. Corpus. 120 pp. Pidello,A. (2011).Ecologa microbiana. Corpus Willey,J., Sherwood, L. M. y Woolverton, C. J. (2009).Microbiologa.7a ed. MGraw Hill-Interamericana. Bibliografa complementaria Atlas, M. R. y Bartha, R. (2002). Ecologa microbiana y Microbiologa ambiental. 4 ed. Pearson Addison Wesley. 677pp. Brock, D. T. y Madigan, T. M. (). Microbiologa. ed. Prentice Hall. 956 pp. Brooks, G. F., Butel, J. S. y Morse, S. A. (2011). Microbiologa Mdica. 25 ed. Mc Graw Hill. pp 815. Madigan, M. T., Martinko, J. M. y Parker, J. (2004). Brock. Biologa de los microorganismos. 10 a ed. Prentice Hall. 1089 pp. Prescott, L. M., Harley, J. P. y Klein, D. A. (2005). Microbiologa. 5a ed. McGrawHill Interamericana. 1236 pp. Solomon, P. E., Berg, R. L. y Martin, W. D. (2008). Biologa. 8a ed. Mc Graw Hill. 1338 pp. Trtora, G. J., Funke, B. R. y Case, C. L. (2007). Introduccin a la microbiologa. 9a ed.Mdica Panamericana. 956pp.