Universidad Andrs Bello Facultad de Ciencias de la Salud Departamento de Ciencias Biolgicas Laboratorio de Biologa Celular BIO 035

Trabajo Prctico N5 ORGANIZACIN SUBCELULAR

Alumnos: - Matas Gonzlez - Catalina Jorquera - Csar Magaa - Mara Jess Mora - Isidora Sobarzo Seccin: 5 Profesores: - Juan Ros - Camila Peralta

Introduccin Tpicamente se define clula como la unidad fundamental de los seres vivos, las cuales poseen estructuras complejas que realizan diversos procesos vitales. Se divide en dos grandes grupos: clulas eucariotas y procariotas. Las clulas procariontes poseen una estructura muy sencilla, cuyo lmite celular es la membrana plasmtica y en su interior se encuentra el citoplasma con el material gentico (ADN) disperso y que adems no presenta subdivisiones u organelos, un ejemplo son las bacterias. Por otro lado las clulas eucariontes, tambin estn rodeadas por una membrana plasmtica que las separa del medio externo, pero a diferencia de las anteriores en su citoplasma poseen una serie de subdivisiones denominadas organelos, los que poseen formas y funciones definidas. En estas clulas el material gentico se encuentra al interior de un organelo conocido como ncleo celula. En el citoplasma se pueden distinguir diferentes tipos de organelos: El Ncleo, es el organelo ms grande de la clula y se encuentra separado del citoplasma por una doble membrana de fosfolpidos que presenta aberturas (poros nucleares) para el intercambio de sustancias con el citoplasma, tambin contiene el ADN cromosomal empacado en fibras de cromatina. La Membrana plasmtica es una envoltura externa de la clula, que corresponde a la bicapa fluida de fosfolpidos. Las Mitocondrias son delimitadas por una doble membrana, poseen su propio ADN y sintetizan protenas. La teora propone que stas provienen de la simbiosis de una clula procarionte primitiva. Son responsables de la respiracin celular y produccin de energa. El retculo endoplasmatico se divide en dos porciones: la seccin rugosa (R.E.R) contiene adosados ribosomas y se encarga de la sntesis proteica; la seccin lisa (R.E.L) no posee ribosomas adosados y su funcin es la de sntesis de lpidos. El Aparato de Golgi es un conjunto de sacos membranosos, encargados de la modificacin, destinacin y empaquetamiento de protenas. Los Ribosomas son grandes complejos de ARN y protenas. Realizan el proceso de traduccin en la sntesis de protenas. El Citoesqueleto es una red de fibras proteicas que le dan forma y soporte a la clula y permiten el movimiento en sta. El fraccionamiento celular da como resultado la separacin de los distintos componentes celulares, pudiendo as distinguir estructuras fundamentales como ncleos y mitocondrias, cabe preguntarse, Dar resultado el fraccionamiento celular?, Podremos observar dichos organelos en el microscopio?

Objetivos 1- Entender y aplicar las tcnicas de homogeneizacin usadas en el fraccionamiento subcelular. 2- Identificar organelos celulares en el microscopio. 3- Comprender el concepto de molculas marcadoras.

Materiales y mtodos Primera actividad: Se recibi un homogenizado filtrado de hgado de rata realizado por el profesor, este se obtuvo de la siguiente manera: 1) Trasferir el homogenizado a un tubo Falcon de polipropileno y centrifugar a 600 g (2500 RPM app.) por 15 minutos a 4C. 2) Transferir el sobrenadante a tubo de centrifugacin y centrifugar a 7000 g (6000 RPM app.) por 25 min. a 4C. 3) Descartar el sobrenadante y lavar el pellet con 5 ml de IBc fro. 4) Centrifugar a 7000 g (6000 RPM app.) por 20 min. a 4C. 5) Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet conteniendo mitocondrias en 1 ml de IBc. 6) Trasferir la suspensin mitocondrial en un tubo Falcon y guardar en hielo. Una vez preparada la muestra se comenz a desarrollar el prctico. Segunda actividad: A un portaobjetos se agreg una gota de suspensin de ncleos P1 obtenida anteriormente (que se ha mantenido en hielo) colocando sobre ella un cubreobjetos para observar por el objeto de 40X. Ya observada la muestra se agrega azul de tripn observando nuevamente la preparacin de ncleos. En la tercera actividad Se rotularon 4 tubos de ensayo colocndolos en hielo, agregando a cada uno de estos tubos las siguientes soluciones:

Tubo

Succinato 0.1M 1ml 1ml 1ml 1ml

1 2 3 4

Blanco Fraccin nuclear Fraccin mitocondrial Fraccin microsomal

Azul de Agua Fraccin Fraccin Fraccin Metileno destilada nuclear mitocondrial microsomal (P1) (P2) (S2) 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml

Al agitar los tubos se agrego a cada uno 2 ml de vaselina liquida, finalmente se colocaron en un bao termo regulado a 37 C para ser observados.

Resultados

Experimento N 1: Fraccionamiento. En la primera centrifugacin Del hgado de rata (2500 rpm), observamos un pellet de color rojizo oscuro y en la parte superior un sobrenadante de un color levemente rojizo. En la segunda centrifugacin (6000 rpm) se observ pellet de rojizo oscuro y un sobrenadante color rojizo ms claro y espumoso. Estos, fueron colocados en hielo hasta el momento de los anlisis a realizar. Experimento N 2: Observacin de pellets Muestra: Pellet re suspendido de la fraccin Nuclear Tincin: Ninguna Aumento total: 400X Se observan cuerpos circulares pequeos en suspensin, semitranslucidos en gran cantidad. Muestra: Pellet re suspendido de la fraccin nuclear Tincin: Azul de tripan Aumento total: 400X Se logra observar de forma ms notoria y definida cuerpos circulares pequeos teidos de azul, los cuales corresponderan a ncleos de clulas del hgado. Se aprecian una especie de restos de tejidos que se diferencian de los ncleos. Se pueden observar caractersticas de las estructuras y una notable distincin en la coloracin. Muestra: Pellet re suspendido de la fraccin mitocondrial Tincin: Ninguna Aumento total: 400X No se logran distinguir formas fijas, nada de manera ntida solo pequeas estructuras de diferentes formas y tamao. Muestra: Pellet re suspendido de la fraccin mitocondrial Tincin: Azul de tripn Aumento total: 400X Producto del azul de tripan se tieron estructuras de forma ovalada o fusiformes, mucho ms pequeas que los ncleos, que en teora podran corresponder a las mitocondrias

Experimento N3: Apreciacin del fraccionamiento subcelular mediante marcadores moleculares.

Temperatura Evaluacin Color ambiente Tubo 1 Color Azul

Observacin y evaluacin visual La vaselina se encuentra en la parte superior, y la mezcla de succinato ,azul Metileno, Agua destilada Se encuentran en el fondo Se aprecian burbujas en la parte superior, la vaselina se encuentra en la parte superior y la mezcla en el fondo. Se observan burbujas en la porcin de la vaselina y el resto de la mezcla en el fondo Vaselina se encuentra en forma de espuma y el resto de la mezcla en el fondo

Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4

Color Azul denso opaco Color azul verdoso Color Azul de tono claro

Imagen: Muestras Utilizadas en Experimento Antes de ser Calentado.

A 37 C Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4

Evaluacin Color No existe cambio de color Cambi de Color a Caf Claro El Color Se aclara No existe cambio de color

Observacin y evaluacin visual La vaselina se encuentra separada y existe un sobrenadante sobre esta. Se aprecian burbujas en la parte superior, la vaselina se encuentra en la parte superior y la mezcla en el fondo. Se observan burbujas en la porcin de la vaselina Ocurre un cambio en la vaselina, transformndose en espuma.

Imagen: Muestras despues de bao termorregulado a 37C

Discusin

Experimento N1 El fraccionamiento celular es un proceso mediante el cual los orgnulos son separados segn su peso y tamao. Esta tcnica consiste en aumentar el campo gravitatorio de la muestra. El concepto fsico de peso se establece como la fuerza ejercida por la fuerza de gravedad sobre una determinada masa1.Al centrifugar la muestra a 2500 rpm son desprendidos los orgnulos de mayor peso, en este caso los ncleos. Luego, a 600 rpm se desprenden orgnulos como las mitocondrias. Una centrifugacin da como resultado una fase lquida o sobrenadante, ubicada en la superficie de la muestra, y una fase sedimentaria o pellet, ubicada en el fondo del recipiente. El proceso fue realizado exitosamente gracias a la ayuda de una centrfuga programada a las revoluciones y tiempo deseados, obtenindose los pellets de ncleos (P1), mitocondrias (P2) y la fraccin mitocondrial (S2). Experimento N 2 a) Al observar la muestra de pellet de ncleos (P1) se distinguieron cuerpos de forma circular, que en este caso corresponden a burbujas. No es posible apreciar claramente alguna estructura celular debido a la ausencia de una tincin que permitiera la coloracin del organelo deseado. La muestra de ncleos (P1) se tie con Azul de Tripn y es posible identificar estructuras celulares de manera ms clara. El Tripn es una tincin utilizada para identificar clulas muertas o inviables. Esta tincin difunde a travs de la membrana de las clulas muertas debido a que stas pierden la selectividad que las caracteriza. El Azul de Tripn tambin presenta gran afinidad por estructuras de origen proteico3. De lo anterior es posible aseverar que este mtodo de tincin atraviesa la membrana nuclear y se acopla a las protenas presentes en el ncleo, por ejemplo las histonas. La muestra de fraccin mitocondrial es observada como un conjunto de estructuras difusas debido a que no se utiliz ningn tipo de colorante para diferenciar alguna estructura en especfico y de manera ntida. En el pellet de fraccin mitocondrial con Tripn fue posible apreciar elementos de forma ovalada y de menor tamao que los ncleos. Es posible aseverar que dichas estructuras corresponden a las mitocondrias debido a que stas presentan su propio ADN y tambin sintetizan sus protenas; como tambin es sabido, el Tripn es afn con protenas y, al haber pasado por el proceso de fraccionamiento, la permeabilidad de la doble membrana de las mitocondrias se ve mermada dejando pasar a travs de ella a este colorante que se acopla a las estructuras de ADN.

b)

c)

d)

Experimento N 3 a) El tubo que contena la fraccin nuclear se ti de un azul denso opaco debido a que el ncleo es el organelo ms grande y tambin almacena la mayor cantidad de ADN presente en la clula. Debido a la gran proporcin de ADN presente en el ncleo la tincin se acopla en mayor grado, dando como resultado un color ms intenso. La muestra que contena la fraccin mitocondrial se torn de una tonalidad azul verdosa. Las mitocondrias contienen un porcentaje del ADN genmico, el cual difiere del ADN nuclear: el ADN de la mitocondria (tambin denominado extracromosomal) en vez de estar muy enrollado como el nuclear, tiene una disposicin circular de doble cadena4. Como la presencia de material gentico en las mitocondrias es un hecho, es posible que el Tripn se acople a ste y le d su tincin, aunque de un tono menos oscuro debido a la menor cantidad de material gentico. El tubo con fraccin microsomal se torn de un color azul claro, lo que puede ser explicado porque esta fase comprende organelos como membrana plasmtica y Retculo Endoplasmatico (R.E). Como es sabido, tanto la membrana plasmtica como una porcin del R.E (R.E Rugoso), presentan protenas o estructuras de origen proteico (ribosomas)1, los que son teidos por el Tripn debido a la afinidad de ste por las protenas. El tono ms claro se explica por el menor volumen de estas estructuras. Muestra a 37C con vaselina El tubo que contena fraccin nuclear tendi al caf claro porque, seguramente, hubo un error en el procedimiento de aislamiento de la muestra con vaselina, dejndose entrar oxgeno al tubo. Debido a lo anterior comenz la decoloracin del Azul de metileno, la cual no se complet por la obstruccin que representa la vaselina al paso del oxgeno hacia el interior del tubo, quedando la muestra del color mencionado. El aclaramiento de la muestra de fraccin mitocondrial ocurre debido a que la enzima succinato-deshidrogenasa cataliza la deshidrogenacin del Succinato en Fumarato ms un par de protones y un par de electrones. Debido a la liberacin de estos iones es que el Azul de metileno tiende a decolorar5.

Conclusin

El fraccionamiento celular s dio el resultado esperado. Con la centrfuga y el tiempo y revoluciones determinadas fue posible separar estructuras subcelulares como: ncleos (15 min; 2500 rpm), mitocondrias (25 min; 6000 rpm) y fraccin microsomal (20 min; 6000 rpm). Las diferencias de tiempo y revoluciones por minuto son debidas a los diferentes pesos y tamaos de los organelos. La observacin de ncleos y mitocondrias fue posible de realizar de manera ptima con la ayuda de tincin ya que, sin sta, solo se distinguan vagamente sus formas y tamaos. En definitiva, se reconoce el mtodo de fraccionamiento celular como una tcnica eficiente para el aislamiento de estructuras subcelulares segn su peso y tamao, aumentando su velocidad mediante una centrfuga. Por otro lado, los mtodos de tincin como elementos diferenciadores de organelos fueron de vital importancia en la ptima observacin de stos. Siguiendo sus principos de accin fue posible la identificacin de los orgnulos deseados (ncleos, mitocondrias y fraccin microsomal).

Bibliografa [1] Universidad Andrs Bello, Gua de trabajo prctico N5: Organizacin Subcelular,
Curso Biologa Celular Bio 035.

Fecha de ingreso: 29/05/2013 [2] Gerard J. Tortora,Berdell R. Funke,Christine L. Case, Introduccin a la microbiologa (2007). Editorial Mdica Panamericana, 9a Edicin, Buenos Aires. Pg. 106-107. Fecha de ingreso 29/05/2013
[3] http://es-mexi.finanzalarm.com/details/Azul_de_tripano.html Fecha de ingreso: 29/05/2013 [4] http://www.botanica.cnba.uba.ar/Pakete/3er/LaCelula/MITOCONDRIAS.htm Fecha de ingreso: 29/05/2013

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