Artigo

Betalactamases de Espectro Ampliado (ESBL): um Importante Mecanismo de Resistncia Bacteriana e sua Deteco no Laboratrio Clnico
Manuel Alves de Sousa Junior1,2, Edvana dos Santos Ferreira1, Gildsio Carvalho da Conceio2,3 1 - Universidade Catlica de Salvador - UCSal 2 - Laboratrio de Anlises Clnicas da Associao de Pais e Amigos dos Excepcionais de Salvador (APAE - SSA) 3 - Hospital Universitrio Professor Edgard Santos - UFBA

Resumo
As betalactamases formam um grande grupo de enzimas que so capazes de hidrolizar o anel betalactmico de penicilinas, cefalosporinas e monobactmicos (antibiticos betalactmicos). Dentre as betalactamases, destacam-se as betalactamases de espectro ampliado (Extended-Spectrum Betalactamase - ESBL). A produo de ESBL mediada por plasmdeos que conferem ampla resistncia aos antimicrobianos que contm o anel betalactmico em sua estrutura e agem neste anel betalactmico rompendo-o e inativando assim, o antibitico. Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae so as espcies bacterianas mais comumente encontradas produzindo ESBL, a deteco destas enzimas j foi observada em diversas outras espcies de

Enterobacteriaceae e Pseudomonadaceae. Pacientes com infeces por enterobactrias produtoras de ESBL no devem ser
medicados com antibiticos betalactmicos, o que acarretaria em falha teraputica e agravamento do quadro infeccioso. A deteco presuntiva de ESBL no acarreta custos adicionais ao laboratrio, visto que os antimicrobianos necessrios para tal deteco podem compor o conjunto de discos utilizados na rotina laboratorial em antibiogramas. O trabalho do laboratrio de microbiologia imprescindvel na deteco das enterobactrias produtoras de ESBL. A deteco precoce destas bactrias multirresistentes de suma importncia para se instaurar o tratamento adequado e as medidas de isolamento dos pacientes, necessrias para se evitar a disseminao destes patgenos em surtos comunitrios e nosocomiais. Palavras-chaves: ESBL, resistncia bacteriana, betalactamases

Introduo

variedade de mecanismos de resistncia aos antibiticos betalactmicos, um dos mecanismos mais importantes a produo de betalactamases, que so enzimas capazes de hidrolizar o anel betalactmico de penicilinas, cefalosporinas e outros antimicrobianos relacionados, tor-

nando-os inativos. Entre estes destacamos a produo de betalactamases de espectro ampliado (Extended-Spectrum Betalactamase = ESBL) principalmente em algumas espcies de bactrias Gram-negativas (1). A primeira referncia resistncia antibitica surgiu nos anos

iversos mecanismos emergentes de resistncia aos

antimicrobianos foram recentemente descritos e alguns deles so de difcil deteco pelas metodologias laboratoriais de rotina. Embora exista uma grande

152

NewsLab - edio 63 - 2004

40 com as penicilinas, tendo ressurgido com o advento dos novos antibiticos nos anos 50 e 60. Atualmente, o mecanismo de resistncia causa enormes problemas teraputicos com implicaes de sade pblica (2). As betalactamases so produzidas por bactrias Gram-positivas e Gram-negativas. As bactrias Gram-negativas apresentam um nmero extraordinrio de betalactamases, sobretudo cromossmicas e plasmidiais. H evidncias de que as enzimas que inativam os antibiticos betalactmicos eram produzidas pelas bactrias muito antes da introduo e aperfeioamento destes antibiticos no uso clnico. O uso amplo e, s vezes, indiscriminado destes antimicrobianos certamente auxiliou na disseminao da resistncia, mas no se pode responsabilizar a utilizao clnica pelo aparecimento das betalactamases (3). Em 1983 foram detectados na Alemanha (Frankfurt) os primeiros isolados clnicos de Klebsiella pneumoniae e Escherichia coli resistentes s cefalosporinas de

terceira gerao. Desde ento, tm sido descritas em todo mundo numerosas enzimas dos tipos TEM e SHV com este fentipo de resistncia (4). Muitas bactrias apresentam tambm pequenas molculas de DNA circular conhecidas como plasmdeos, que so independentes do DNA cromossmico e carregam genes que no so essenciais para a vida. Possuem a propriedade de serem transferidos de uma bactria para outra (conjugao) levando caractersticas genticas at ento inexistentes na clula receptora. Muitas vezes, os plasmdeos carregam genes que conferem bactria resistncia a antibiticos. Essa uma caracterstica gentica muito importante para a bactria, pois permite sua sobrevivncia mesmo na presena de uma substncia nociva (5). As ESBL hidrolizam as cefalosporinas (exceto as cefamicinas) e os monobactmicos, no hidrolizando, entretanto os carbapenmicos. A ao hidroltica destas enzimas bloqueada pelos inibidores de betalacta-

mase (cido clavulnico, sulbactam e tazobactam). Um dos principais problemas causados por estas enzimas decorrente do fato de sua produo ser induzida durante a teraputica antimicrobiana. Dessa maneira, quando a amostra bacteriana detectada pelo laboratrio de microbiologia, ela aparentemente sensvel s cefalosporinas de terceira gerao e penicilinas de amplo espectro, porm, durante o tratamento pode ocorrer induo da produo de grandes quantidades de enzimas e o paciente comear a evoluir mal, ocorrendo "recidiva" da infeco. Uma nova amostra da bactria isolada e esta poder se mostrar resistente a um antimicrobiano (utilizado para o tratamento) para o qual a bactria era inicialmente sensvel, podendo at ser interpretado como erro laboratorial quando da avaliao da primeira amostra (6) Quando produzem estas enzimas, os organismos tornam-se altamente efetivos pela inativao de diversos antibiticos betalactmicos. Assim, os Clnicos devem se familiarizar com o sig-

NewsLab - edio 63 - 2004

153

de uma bactria para outra. A transferncia de fragmentos de DNA cromossmico e de plasmdeos altamente disseminada nos procariotos, sendo uma das causas da notvel diversidade gentica observada nas bactrias (3). O problema da resistncia se agrava, pois a transferncia de plasmdeos ocorre entre clulas bacterianas de uma mesma populao e entre as bactrias de diferentes gneros (10). Muitas vezes carregam genes que Figura 1 - Microfotografia eletrnica de duas Escherichia coli em processo de conjugao conferem bactria resistncia aos antibiticos, como por exemplo o gene que codifica alguma nificado clnico destas enzimas e estratgias potenciais para procedimentos com este crescente problema (7). de suma importncia avaliar a freqncia de bactrias produtoras de ESBL para que se possa estabelecer como rotina no laboratrio de microbiologia clnica a incluso dos antibiticos nos testes de susceptibilidade aos antimicrobianos que auxiliam em tal identificao como ceftriaxona, ceftazidima, cefotaxima, cefpodoxima, aztreonam, tobramicina, ciprofloxacina e os discos que possuem os inibidores associados como amoxicilina/cido clavulnico, sulbactam/ampicilina ou ticarcilina/ cido clavulnico. Esta seleo pode ajudar ao Clnico, evitando ocorrncia de falha teraputica. Os objetivos deste trabalho so abordar a importncia da deteco Gentica Bacteriana As bactrias possuem um nico cromossomo circular, disperso pelo citoplasma, composto de DNA (cadeia dupla) que contm a quase totalidade das informaes, incluindo as indispensveis vida da clula (8). Os plasmdeos replicam-se independentes do cromossomo, carregam genes que no so essenciais para a vida das bactrias e podem ser transferidos, de vez em quando por conjugao, de ESBL em laboratrios de microbiologia clnica, evidenciar as possveis falhas teraputicas de diversos antimicrobianos em pacientes com infeces por bactrias produtoras de ESBL e demonstrar que a sua deteco pode e deve ser uma prtica rotineira em laboratrios de microbiologia clnica. ESBL (5) (Figura 1). Uma conseqncia dos eventos genticos ligados transferncia plasmidial tem sido observada na rpida propagao de resistncia a antibiticos transmitida por plasmdeos em populaes bacterianas aps uso indiscriminado dos antibiticos em ambientes comunitrios e hospitalares (11, 12). As bactrias podem transferir material gentico de uma para outra por meio de quatro mecanismos: conjugao, transformao, transduo e transposio (13). A conjugao um processo de transferncia de genes que requer o contato clula-clula, diferindo dos demais processos; onde na transformao ocorre captao de DNA solvel no meio por clulas doadoras, na transduo ocorre transferncia gen-

154

NewsLab - edio 63 - 2004

NewsLab - edio 63 - 2004

155

tica com auxlio dos bacterifagos e na transposio, os genes so transferidos dentro de uma mesma clula por intermdio dos transposons (DNA). Estes segmentos podem "saltar" ou autotransferirem-se de uma molcula de DNA (plasmdeo, cromossomo) para outra (plasmdeo, cromossomo, fago) (9,10). Antimicrobianos So produtos naturais de fungos e bactrias ou sintticos produzidos em laboratrios, capazes de impedir o crescimento de microorganismos ou mesmo destrulos. Algumas drogas antimicrobianas so bactericidas (matam microorganismos), enquanto outras

so bacteriostticas (inibem a sua multiplicao). Em pacientes com o sistema imune funcionando em condies adequadas, ambas as classes de drogas so efetivas e agem como auxiliares ao sistema eliminando a infeco. O principal objetivo do uso de um antimicrobiano o de prevenir ou tratar uma infeco, diminuindo ou eliminando os organismos patognicos e se possvel, preservando os germes da microbiota normal. improvvel que um nico agente quimioterpico possa apresentar todas as qualidades necessrias para utilizao no tratamento eficaz de infeces microbianas. Portanto, podem-se fazer comparaes entre os

agentes disponveis para selecionar o mais apropriado para o tratamento (9). A ao antimicrobiana direcionada contra alvos peculiares nos microorganismos (estruturas e/ou vias metablicas), ausentes no organismo humano. Este efeito minimiza o efeito txico das drogas antimicrobianas para a espcie humana. Pode ser atravs da inibio da sntese de parede celular, inibio da membrana celular, inibio da sntese protica ou atravs da inibio da sntese de cidos nuclicos (13). Os antibiticos betalactmicos constituem uma grande famlia de diferentes grupos de compostos contendo um anel betalactmico em sua estrutura (12). As penicilinas e cefalosporinas (betalactmicos) afetam a sntese dos componentes do peptideoglicano inibindo uma etapa particular, em que ligaes cruzadas so formadas entre as cadeias de peptideoglicano, este fato permite uma falha na sustentabilidade da parede celular (9). Os betalactmicos agem ligando-se s protenas carreadoras de penicilina na parede celular bacteriana. A resistncia a estes agentes geralmente envolve processos que interferem na atuao destas protenas. Resistncia Bacteriana A resistncia a antimicrobianos tem aumentado rapidamen-

Figura 2 - Ncleo central dos antibiticos betalactmicos

te nos ltimos anos no Brasil e

156

NewsLab - edio 63 - 2004

NewsLab - edio 63 - 2004

157

no mundo, gerando uma necessidade crescente do conhecimento do perfil de sensibilidade das bactrias que mais freqentemente causam infeces e do modo de disseminao da resistncia (15). Muitas bactrias possuem resistncia intrnseca a vrios grupos de antibiticos, porm o problema da resistncia aos antimicrobianos colocado quando as bactrias sofrem mutaes, originando formas resistentes (2). Os mecanismos genticos que codificam a resistncia bacteriana se exteriorizam por seis principais mecanismos bioqumicos de ao: inativao enzimtica da droga, alterao da permeabilidade bacteriana droga, alterao de sistemas de transporte na clula, retirada ativa da droga do meio intracelular, alterao do receptor droga e modificao do sistema metablico ativo para a droga e sntese das vias metablicas alternativas (13). Todos estes mecanismos citados podem ser reunidos em trs grupos: inativao enzimtica, alterao do stio de ao do antibitico e alterao do transporte do antibitico atravs do invlucro bacteriano. Um quarto mecanismo, caso especfico de resistncia as sulfonamidas e trimetropim, se relaciona capacidade da clula bacteriana de evitar a rota metablica inibida por estes antibiticos (16).

A inibio ou inativao enzimtica produzida pelos microorganismos provavelmente o principal mecanismo molecular de resistncia microbiana. Foi inicialmente descrita por Abraham e Chaim, em 1940, que demonstraram em extratos de Escherichia coli uma enzima capaz de inativar a ao da penicilina, provocando a sua abertura por hidrlise e transformando o antibitico em produto inativo. Com a introduo das cefalosporinas na dcada de 60, o termo cefalosporinase passou a ser empregado para designar as enzimas que hidrolisavam este grupo de antibiticos betalactmicos (13). Betalactamases As betalactamases constituem um grupo heterogneo de enzimas capazes de inativar as penicilinas, cefalosporinas e por vezes os monobactmicos. Estas enzimas so freqentemente produzidas por bactrias Gram-positivas e Gramnegativas, aerbias e anaerbias, e lizam o anel betalactmico por hidroxilao irreversvel da ligao amida, com inativao do antibitico. Embora o resultado final de sua ao seja o mesmo, a atividade enzimtica varivel de acordo com o tipo de betalactamase produzida e os diversos substratos existentes. Existe uma variao em especificidade de substrato entre as betalactamases: algumas hidroxilam preferen-

cialmente as penicilinas, outras tm atrao pelas cefalosporinas e algumas enzimas inativam ambas as classes de antibiticos. Em alguns patgenos, verifica-se a produo de diferentes tipos de betalactamases, onde diferentes cepas podem produzir diferentes enzimas, ou uma nica cepa pode produzir mais de um tipo de enzima. Os betalactmicos so liberados em condies naturais pelos microorganismos produtores e so os resultados de um processo evolutivo e da presso seletiva que favorecem os produtores de antibiticos. O uso amplo e indiscriminado destes agentes certamente auxiliou na disseminao da resistncia, mas no provocou o aparecimento destas enzimas. (3). A produo destas enzimas por determinadas bactrias explica a sua permanncia em um foco infeccioso quando o antibitico utilizado um betalactmico. Alm disso, pode interferir na sobrevivncia de outros microorganismos, sensveis ao antibitico, quando o germe produtor faz parte de uma flora bacteriana mista. Pode ocorrer quando, em uma amigdalite tratada com penicilina, o Streptococcus do grupo A (sensvel ao antibitico) permanece ativo mesmo aps o tratamento, devido produo de betalactamases por bactrias que fazem parte da microbiota oral como es-

158

NewsLab - edio 63 - 2004

NewsLab - edio 63 - 2004

159

tafilococos, moraxelas ou bactrias anaerbias (13). Os inibidores de betalactamases so compostos que se assemelham o suficiente aos antibiticos betalactmicos para uniremse s betalactamases, de forma reversvel ou irreversvel, para proteger os antibiticos da destruio. No surpreendente que estes compostos, que podem realizar o mesmo funcionamento dos antibiticos betalactmicos, tambm possuam uma atividade antibacteriana limitada por si mesmos. Os trs inibidores de betalactamases que tm sido aplicados na medicina clnica so o cido clavulnico, o sulbactam e o tazobactam. Possuem efeitos contra penicilinas produzidas por Staphylococcus e tm eficcia varivel contra as enzimas cromossmicas ou plasmidiais das bactrias Gram-negativas. O cido clavulnico e o tazobactam so superiores ao sulbactam em atividade contra as betalactamases transmitidas por plasmdeos de microorganismos Gram-negativos, inibindo as ESBL. Algumas enzimas de amplo espectro so resistentes atividade dos trs compostos (17). Vrios fatores determinam a eficcia de combinaes de inibidores, antibiticos, enzimas e cepas bacterianas especficas. Estes fatores incluem a magnitude com que os antibiticos ou os inibidores induzem a atividade das

betalactamases, a quantidade de enzima produzida, e a eficcia do inibidor contra o tipo especfico de betalactamase produzida. Entre as betalactamases de amplo espectro, algumas so bloqueadas por diferentes inibidores e outras no so afetadas pela sua presena (17). ESBL (Extended-Spectrum BetaLactamase) As ESBL constituem um grupo de enzimas derivadas das betalactamases clssicas TEM-1, TEM2 e SHV-1 (6). Estas enzimas conferem resistncia s cefalosporinas de amplo espectro, penicilinas e monobactans (aztreonam), sendo que essas amostras permanecem sensveis s cefamicinas e carbapenmicos. Outra caracterstica fenotpica importante que essas enzimas so sensveis ao dos inibidores de betalactamases, como sulbactam, cido clavulnico e tazobactam. As enzimas foram denominadas de ESBL devido ao fato da maioria dessas enzimas serem codificadas por genes localizados em plasmdeos, que geralmente carregam genes de resistncia a outros antimicrobianos, tais como aminoglicosdeos, trimetropim, sulfonamidas, tetraciclinas e cloranfenicol. As cepas produtoras de ESBL so geralmente multirresistentes. A produo de betalactamases o principal mecanismo de resistncia das bactrias Gram-nega-

tivas. O grau de resistncia ir depender da quantidade de enzima produzida, da habilidade dessa enzima em hidrolisar o antimicrobiano em questo (potncia) e da velocidade com que o betalactmico penetra pela membrana externa da bactria (permeabilidade da membrana). A superproduo de enzimas induzveis cromossmicas ou plasmidiais pode inativar antibiticos como o imipenem ou as cefalosporinas de terceira gerao que eram resistentes degradao por quantidades normais de enzimas. As ESBL inativam muitas das cefalosporinas de terceira gerao, enquanto que os carbapenmicos so relativamente resistentes a estas enzimas versteis. As bactrias Gram-negativas tm estado suficientemente cheias de recursos como a produo de betalactamases que inativam antibiticos em forma especfica, como o imipenem, que so resistentes ao da maior parte das outras enzimas (17). O primeiro relato de cepas produtoras de ESBL ocorreu em Frankfurt, na Alemanha em 1983, onde enzimas do tipo SHV foram isoladas de Klebsiella pneumoniae e Escherichia coli. A anlise destas cepas demonstrou posteriormente que a resistncia devia-se produo de uma betalactamase plasmidial transfervel, derivada de SHV-1, sendo denominada SHV-2. Desde

160

NewsLab - edio 63 - 2004

NewsLab - edio 63 - 2004

161

ento, tm sido descritas em todo mundo numerosas enzimas dos tipos TEM e SHV com este fentipo de resistncia. Cepas de Klebsiella spp e Escherichia coli so as bactrias mais comuns produtoras de ESBL, porm j foram detectadas em diversas espcies de Enterobacteriaceae e em Pseudomonas aeruginosa . Atualmente existem mais de 150 ESBL descritas, das quais mais de 90 so do tipo TEM e mais de 25 dos tipos SHV e OXA (14). As enterobactrias produtoras de ESBL tm sido isoladas com maior freqncia em amostras procedentes de pacientes hospitalizados, porm tambm podem ser encontradas em amostras de origem comunitria. Estes isolamentos podem aparecer de forma espordica, sem relao epidemiolgica ou dar lugar a surtos nosocomiais. O tubo digestivo atua como reservatrio potencial destes microorganismos multirresistentes. Alm disso, o habitat adequado para que a resistncia se transmita a outras espcies bacterianas (4). O aparecimento de surtos nosocomiais devido a estes microorganismos depende tanto das condies ambientais (elevado consumo de cefalosporinas de terceira gerao, manipulao dos pacientes, etc.) como das caractersticas especiais do microorganismo (fatores de virulncia, ade-

rncia, etc). Alm do consumo de antibiticos de amplo espectro, outros fatores de risco so importantes para adquirir infeco/colonizao como a cateterizao arterial e/ou urinria (6). importante conhecer o mecanismo de resistncia para que ocorra a determinao fenotpica e genotpica do microorganismo, para posterior relevncia epidemiolgica do surto. Alm de evidenciar se a mesma cepa que est causando determinado surto ou se so cepas diferentes do mesmo microorganismo. Deteco de ESBL A deteco destas enzimas em isolados de E. coli e Klebsiella pnemoniae problemtica devido variabilidade fenotpica dos tipos enzimticos, pois as expresses guardam estreita correlao com os mecanismos de ao dos antibiticos. Alguns mtodos tm sido propostos, baseados no fato da produo de ESBL ser afetada pelos inibidores de betalactamases, como o mtodo da fita E-teste (fita dupla), o mtodo da dupla difuso em gar ou mtodo de aproximao de disco, o mtodo da adio de cido clavulnico ao disco de ceftazidima e o mtodo automatizado. Apesar da aparente sensibilidade in vitro a vrios antimicrobianos, pacientes com infeces por cepas produtoras de ESBL podem no responder terapia com betalactmicos e monobactmicos. Os

carbapenmicos, imipenem e meropenem, so opes teraputicas indicadas para o tratamento de infeces por cepas produtoras dessas enzimas. Geralmente estas amostras exibem co-resistncia s quinolonas e aminoglicosdeos, portanto, o uso destes agentes deve ser baseado no antibiograma. Mutaes na cadeia de aminocidos podem ser responsveis pela falha na deteco dessas enzimas porque alteram a capacidade ou a velocidade de hidrlise de oximino-betalactmicos. As ESBL derivadas da enzima TEM e com apenas uma substituio na cadeia de aminocidos (TEM-7 ou TEM-12) apresentam baixo poder de hidrlise deste grupo de antibiticos, podendo no ser detectadas em testes laboratoriais. Outras, como aquelas derivadas das enzimas TEM-3, TEM-26, SHV-2 e SHV-4, exibem alto poder de hidrlise de betalactmicos. Por esta razo o betalactmico que ser hidrolisado de maneira mais eficaz varia muito dependendo da enzima (6). Segundo o NCCLS, para as cepas com testes positivos para ESBL no laboratrio de microbiologia clnica, devem ser reportadas no laudo como resistentes aos antibiticos betalactmicos e s combinaes de betalactamases com inibidores de betalactamases (mesmo que sensveis in vitro ). Alm disso, deve ser acrescentada uma observao re-

162

NewsLab - edio 63 - 2004

NewsLab - edio 63 - 2004

163

latando que os testes laboratoriais sugerem a produo de ESBL, para que se tomem as medidas epidemiolgicas adequadas e evitar que estas drogas sejam utilizadas no tratamento (Tabela 1). Os testes disponveis para de-

tectar cepas produtoras destas enzimas possuem limitaes devido possibilidade das j mencionadas mutaes. Interpretaes adequadas dos testes de susceptibilidade antimicrobiana so imprescindveis na deteco deste

mecanismo de resistncia (18). Discos de tobramicina e ciprofloxacina devem ser includos nos testes de deteco, pois geralmente as amostras bacterianas produtoras de ESBL tambm so resistentes a estes antibiticos (4).

Tabela I - Teste para a deteco de ESBL em Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca e Escherichia coli segundo o NCCLS Mtodo Meio de Cultura Concentrao do disco de Antibitico Teste de Triagem gar Mueller Hinton Cefpodoxima 10g ou Ceftazidima 30g ou Aztreonam 30g ou Cefotaxima 30g ou Ceftriaxona 30g O uso de mais de um agente antimicrobiano para a triagem aumenta a sensibilidade de deteco Inculo econdies deincubao Resultados Teste Confirmatrio gar Mueller Hinton Ceftazidima 30g Ceftazidima/c. clavulnico 30/10g E cefotaxima 30g cefotaxima/c. clavulnico 30/10g O teste confirmatrio dever ser feito com ambos antibiticos, sozinho e combinado com c. clavulnico

De acordo com as recomendaes da padronizao do teste de difuso Cefpodoxima 22mm Ceftazidima 22mm Aztreonam 27mm Cefotaxima 27mm Ceftriaxona 25mm = suspeita de produo de ESBL Um aumento de 5mm no dimetro para qualquer agente antimicrobiano testado em combinao com o cido clavulnico comparado com o agente sozinho = produo de ESBL

Recomendaes do Controle de Qualidade

E.coli ATCC 25922

K. pneumoniae ATCC 700603 Cefpodoxima 9-16mm Ceftazidima 10-18mm Aztreonam 9-17mm Cefotaxima 17-25mm Ceftriaxona 16-24mm

E. coli = um aumento de 2mm no halo do antibitico testado sozinho comparado com a zona de inibio quando combinado com cido clavulnico K. pneumoniae Aumento de 5mm no halo da ceftazidima Aumento de 3mm no halo da cefotaxima

164

NewsLab - edio 63 - 2004

Figura 4 Figura 3 tcnica de fcil realizao; enMtodo E-Teste O mtodo E-teste utiliza uma fita plstica que contm concentraes crescentes do agente em estudo numa placa de Mueller Hinton semeada com o inculo bacteriano padronizado com a escala 0,5 de MacFarland. Neste caso, em um dos lados da fita existe ceftazidima, e do outro ceftazidima associada a uma concentrao fixa de 2g/mL de cido clavulnico. A bactria ser considerada produtora de ESBL quando a leitura apresentar uma diminuio de pelo menos duas diluies logartmicas (quando a razo entre os dois breakpoints for igual ou maior que 8) da ceftazidima/cido clavulnico em relao ao MIC (Concentrao Inibitria Mnima) da ceftazidima. O mtodo se baseia no aumento da sensibilidade em presena do cido clavulnico, como recomenda o NCCLS para testes confirmatrios de presena de ESBL. Esta Figura 5 - Presena de " ghost-zone " Mtodo da dupla difuso ou mtodo da aproximao de disco A identificao de amostras protretanto, pode gerar resultados confusos se usada isoladamente, pois neste caso ser testada somente uma droga (Figura 4). dutoras de ESBL pode ser feita mediante a sinergia de duplo disco. Realiza-se a difuso em gar utilizando uma placa de gar Mueller Hinton inoculada com uma suspenso bacteriana ajustada com o padro 0,5 da escala de MacFarland; logo aps colocam-se os discos com carga padronizada de

NewsLab - edio 63 - 2004

165

aztreonam e cefalosporinas de terceira gerao como cefotaxima, ceftazidima, ceftriaxona; dispostos a uma distncia de 20mm de discos de amoxicilina / c. clavulnico. considerada sinergia positiva (e, portanto, detecta-se a produo de ESBL), quando se observa uma ampliao do halo de inibio em alguma das cefalosporinas ou do aztreonam ou o aparecimento de uma terceira zona irregular de inibio (conhecida como ghostzone) entre o disco composto e o disco de uma das drogas betalactmicas. Esta tcnica de fcil realizao e acessvel a qualquer laboratrio de microbiologia clnica. Este mtodo o mais utilizado na rotina laboratorial pelo baixo custo, fcil acesso metodologia e pelo tempo de obteno dos resultados. Para cepas isoladas que demonstram zonas de inibio grandes, o disco deve ser colocado a 30mm de distncia e para cepas isoladas com zona de inibio menores, uma distncia menor deve ser utilizada (20mm). A determinao desta distncia constitui a maior dificuldade do mtodo (Figuras 3 e 5). Mtodo da adio do cido clavulnico ao disco de ceftazidima Este mtodo baseia-se na comparao do tamanho do halo formado em torno dos discos de ceftazidima (30g) com o halo do disco de cido clavulnico/ceftazidima (10g/ 30g). Um aumento maior ou igual a 5mm no halo de inibio do disco

composto em comparao com o halo do disco sem cido clavulnico, indica bactria produtora de ESBL. Mtodo automatizado Alguns painis de microdiluio esto disponveis, comercializados principalmente para os sistemas MicroScan (Dade Behring) e Vitek (bioMriux). A anlise fenotpica da bactria por este mtodo proporciona uma padronizao e rapidez, o que garante boa consistncia nos resultados em detrimento aos testes em discos, com resultados aps 18-24 horas. Todavia, o mtodo automatizado tem algumas desvantagens quando comparado com difuso em gar, porque certas bactrias no crescem ou o fazem pobremente aps 4-5 horas de incubao (Proteus sp, Morganella sp, Providencia sp, Yersinia sp e outras). Outro ponto seria a dificuldade em detectar o baixo nvel de expresso deste mecanismo de resistncia. Alguns complexos fenotpicos resultantes de combinaes destes mecanismos so pobremente diferenciados pelo mtodo automatizado (18). Desvantagens na realizao destas tcnicas A hiperproduo de betalactamase cromossmica por Proteus vulgaris, Proteus penneri ou Citrobacter koseri (que uma cefuroximase inibida pelo cido clavulnico), pode resultar em uma ampliao do halo com a cefuroxima,

cefotaxima e ceftriaxona. A hiperproduo desta enzima confere resistncia a estas drogas, permanecendo a bactria sensvel ceftazidima e ao aztreonam (6) A hiperproduo de betalactamase K-1 por K. oxytoca produz ampliao do halo com a cefuroxima, ceftriaxona, aztreonam e cefotaxima, mas nunca com a ceftazidima. A hiperproduo de betalactamases confere resistncia a estas drogas, mas no ceftazidima. Portanto, para diferenciar uma cepa de K. oxytoca hiperprodutora de K-1 de uma produtora de ESBL deve-se realizar sempre o mtodo de determinao do MIC da ceftazidima, observando se este valor se reduz na presena de cido clavulnico (6) A hiperproduo de SHV-1 por K. pneumoniae, causada pela presena de mltiplas cpias do plasmdeo que as codifica, tambm pode ocasionar um fentipo comptivel com a produo de ESBL. Nestes casos, h uma aumento dos MICs da ceftazidima (4-8g/mL) e do aztreonam (1-2g/mL), afetando escassamente os MICs da cefotaxima e ceftriaxona (6) A produo de L-2 por Stenotrophomonas maltophila resulta em sinergia positiva com aztreonam devido ao hidroltica desta enzima sobre o aztreonam, sendo inibida pelo cido clavulnico. Portanto, no devemos confundir este tipo de resistncia com a provvel produo de ESBL (6)

166

NewsLab - edio 63 - 2004

NewsLab - edio 63 - 2004

167

Preveno e tratamento As medidas bsicas de preveno do aparecimento da resistncia bacteriana e disseminao de cepas resistentes consistem na adoo de medidas higinicas, de desinfeco, no reforo das tcnicas asspticas e no isolamento dos doentes afetados (2). Para o controle de surtos ocasionados por cepas produtoras de ESBL tm sido aplicadas medidas como a restrio do consumo de cefalosporinas de terceira gerao, isolamento dos pacientes colonizados e/ou infectados e educao das pessoas que trabalham diretamente com os pacientes quanto ao cuidado com a manipulao destes e a correta lavagem das mos (6). O problema do tratamento das infeces causadas por cepas de bactrias que produzem ESBL universal e ocorre principalmente em hospitais que utilizam de maneira indiscriminada as cefalosporinas de amplo espectro de ao. O tratamento de pacientes com infeces causadas por cepas que produzem ESBL fica limitado a poucos agentes de amplo espectro de ao, os quais podero tambm falhar diante de microorganismos que produzem mltiplas betalactamases, que associadas produzem mltipla resistncia. Somente alguns antibiticos betalactmicos conservam sua atividade frente s enterobactrias produtoras de ESBL. Os car-

bapenmicos so os antibiticos mais efetivos, estas drogas so muito resistentes hidrlise por este tipo de enzima. O uso de antibiticos carbapenmicos deveria ser moderado, pois tem sido descrito um aumento da resistncia a estas drogas. A durao da permanncia no hospital (Enfermaria ou Unidade de Tratamento Intensivo - UTI) um fator primordial, porque, quanto maior a estadia, mais grave a doena, mais intensos os procedimentos invasivos e a administrao de antibiticos. essencial que o laboratrio de microbiologia clnica esteja preparado para a deteco destes mecanismos de resistncia que tm surgido principalmente em surtos nosocomiais.

queno, o que aumenta a porcentagem final, como Pagani et al que utilizaram apenas 70 cepas encontrando 48% de Proteus mirabilis como produtoras de ESBL e Otkum et al, que encontraram 30% de cepas de Salmonella typhimurium produtoras de ESBL de um total de 75 cepas isoladas. O teste de aproximao de discos o mais utilizado para realizar a deteco de ESBL, pois no acarreta custos adicionais ao laboratrio visto que os antimicrobianos envolvidos neste mtodo podem ser includos no antibiograma rotineiro para microorganismos Gram-negativos. Assim, a deteco por este mtodo pode e deve ser realizada em qualquer laboratrio de microbiologia clnica mesmo no sendo em ambiente hospitalar, porm alguns aspectos devem ser enfatizados apesar da facilidade de realizao na rotina laboratorial. A determinao da distncia entre os discos deve ser feita de maneira a permitir a visualizao do aumento ou distoro dos halos. Se a amostra formar halos grandes, a distncia deve ser aumentada, entretanto se os halos forem menores devese diminuir a distncia dos discos para visualizar o efeito da ghostzone, essa variao da distncia dificulta a realizao do teste, pois deve ser adequada para cada amostra. O NCCLS recomenda a distncia de 20mm centro-centro. A interpretao altamente subjetiva, uma vez que o aparecimento

Discusso
Vrios trabalhos de prevalncia de ESBL relatam porcentagens de microorganismos produtores de ESBL para todas as Enterobacteriaceae e algumas Pseudomonadaceae em diversas partes do mundo. As bactrias isoladas com maior freqncia na produo de ESBL so cepas do gnero Klebsiella seguidas por isolados de Escherichia coli. Alguns autores apresentam porcentagens maiores de outras enterobactrias do que em Klebsiella spp, porm devem ser casos isolados de surtos ou trabalhos em que o nmero de amostras foi pe-

168

NewsLab - edio 63 - 2004

NewsLab - edio 63 - 2004

169

de uma terceira zona de inibio no pode ser quantificada. O mtodo de E-teste e a anlise automatizada requerem custos adicionais ao laboratrio, sendo ento realizados somente por laboratrios de grande porte e centros de referncia. O mtodo de adio de cido clavulnico ao disco de ceftazidima pode ser realizado em qualquer laboratrio de microbiologia, porm acarreta custos adicionais, visto que este disco combinado no est disponvel pelo mercado para a teraputica e no usualmente utilizado pelos Clnicos. Palasubramaniam & Parasakthi em 2001 na Malsia compararam os trs mtodos de identificao presuntiva de ESBL (excluindo o mtodo automatizado) e concluram que o mtodo E-teste com fita dupla combinada mostrou-se mais efetivo em todas as amostras de Klebsiella pneumoniae resistentes ceftazidima analisadas. Bedenic & Boras em 2001 na Crocia concluram em seu trabalho sobre os mtodos de deteco de ESBL que o mtodo de dupla-difuso necessita de uma padronizao mais rigorosa do inculo com a escala de MacFarland do que os outros mtodos manuais, o que demonstra a importncia do inculo para o antibiograma. Segundo Blatt em 2000, o surgimento de resistncia bacteriana aos antimicrobianos inevitvel, pela conservao das espcies, mas

o controle na utilizao dos mesmos pode limitar o aparecimento de cepas multirresistentes. Barbosa et al em 1998, concordam com esta afirmao dizendo que somente a utilizao indiscriminada dos antibiticos no pode ser responsabilizada pelas resistncias emergentes. Porm, Silva & Salvino em 2000, dizem que um longo perodo de hospitalizao e o uso abusivo de cefalosporinas de terceira gerao so fatores de risco primordiais para a disseminao de surtos por bactrias produtoras de ESBL; o que demonstra a divergncia de autores a respeito do uso indiscriminado de antibiticos como responsvel pela mltipla resistncia. O papel do laboratrio de microbiologia clnica de extrema importncia para o diagnstico, visto que a partir da anlise do antibiograma que o Clnico deve prescrever o antimicrobiano ao paciente. Se o Clnico prescrever um antibitico betalactmico para o paciente portador de uma infeco por bactria produtora de ESBL poder acarretar em falha teraputica, seja por erro do laboratrio que pode no ter detectado a produo da enzima ou por equvoco do Clnico ao indicar uma droga dotada de anel betalactmico. Assim, o paciente no vai responder positivamente ao tratamento e pode ocorrer agravamento da infeco, pois com a diminuio da flora bacteriana normal (que pode se demonstrar sensvel ao betalac-

tmico), certamente ocorrer uma diminuio da competitividade com a flora normal a depender do stio anatmico da infeco. Como a produo de ESBL pode ocorrer espontaneamente, h a possibilidade dessa produo se evidenciar no decorrer do tratamento. Ento, o paciente que estaria respondendo positivamente uma infeco por uma bactria no produtora de ESBL, passa a demonstrar um agravamento do quadro infeccioso e ocorre recidiva da infeco. Uma nova amostra do material clnico pode detectar a presena da produo de ESBL, o que pode ser interpretado como erro laboratorial. As drogas que a totalidade dos autores recomendam para o tratamento das infeces por bactrias produtoras de ESBL so os carbapenmicos (imipenem e meropenem), por estas drogas no sofrerem hidrlise pela ESBL. No entanto, Kocazeybec & Arabaci em 2002 encontraram 89,7% e 95,1% de sensibilidade in vitro para imipenem e meropenem, respectivamente, em 185 cepas isoladas de enterobactrias. Para as espcies de Klebsiella a sensibilidade foi de 98,4% para imipenem e 100% para meropenem. J em Pseudomonas aeruginosa a resistncia foi de 21,6% para imipenem e 10,8% para meropenem, o que demonstra uma maior resistncia para as cepas de Pseudomonas aeruginosa. Esta resistncia

170

NewsLab - edio 63 - 2004

NewsLab - edio 63 - 2004

171

vem ocorrendo devido produo de carbapenamases simultaneamente produo de ESBL. Assim, as drogas de escolha para o tratamento de bactrias produtoras de ESBL passam a ficar vulnerveis e a demonstrar uma resistncia at ento desconhecida aos carbapenmicos. Estes dados alertam para a necessidade do uso racional dos antibiti-

cos carbapenmicos para prevenir a apario de novos microorganismos multirresistentes. Como observado nas estatsticas, bactrias produtoras de ESBL vm sendo isoladas de surtos nosocomiais no mundo inteiro. Surtos comunitrios tambm tm ocorrido e mesmo sendo com uma freqncia menor possuem importncia epidemiolgica.

Correspondncia para:
Manuel Alves de Sousa Junior Associao de Pais e Amigos dos Excepcionais de Salvador - APAE SSA Centro Mdico e Laboratorial. Laboratrio de Anlises Clnicas Setor de Microbiologia Rua Rio Grande do Sul, 545 CEP: 41830-161. Salvador. BA E-mail: masjbiologo@bol.com.br

Referncias Bibliogrficas
1. Francisco W, Jea AHY. Resistncia -Lactamases por Presena de ESBL. www.fleury.com.br/mednews/0301/mdcontfcb0302.htm Acesso em: 15/10/2002. 2. Soares MA. Resistncia Antibitica. Pharmacia Brasileira, p. 59-62, Jan/Fev 2001. 3. Barbosa HM, Torres BB, Furlaneto MC. Microbiologia Bsica. Ed. Atheneu, So Paulo, 1998. 4. Silva CHPM. Bacteriologia - Um texto ilustrado. Ed. Eventos, Terespolis/RJ, 1999. 5. Farah Solange Bento, DNA - Segredos & Mistrios. Ed. Sarvier, So Paulo, 1997. 6. Silva CHPM, Salvino CR. Importncia do Reconhecimento das Enterobactrias Hospitalares Produtoras de Beta-lactamases de Espectro Estendido (ESBL) e suas Implicaes Teraputicas. Newslab (41): 104-112, 2000. 7. Nathisuwan S, Burgess DS, Lewis JS. Extended-spectrum beta-lactamases: epidemiology, detection and treatment. Pharmacotherapy. 21(8): 920-8, 2001. 8. Trabulsi LR, Toledo MRF. Microbiologia. Ed. Atheneu, 2ed., So Paulo, 1996. 9. Pelczar MJ, Chan ECS, Krieg NR, Edwards DD, Pelczar MF. Microbiologia - Conceitos e Aplicaes. Ed. Makron Brooks do Brasil, 2ed, vol. 1, So Paulo, 1996. 10. Tortora GJ, Funke BR, Case CL. Microbiologia. Ed. Artes Mdicas Sul, 6ed, Porto Alegre, 2000. 11. Brooks GF, Butel JS, Ornston LN, Jawetz E, Melnick JL, Adelberg EA. Microbiologia Mdica. Ed. Guanabara Koogan, 20ed., Rio de Janeiro, 1998. 12. Mims C, Playfair J, Wakelin D, Willians R, Roitt I. Microbiologia Mdica. Ed. Manole Ltda, 2ed, So Paulo, 2001.

172

NewsLab - edio 63 - 2004

NewsLab - edio 63 - 2004

173

13. Tavares W. Manual de Antibiticos e Quimioterpicos Antiinfecciosos. Ed. Atheneu, 2ed, So Paulo, 2001. 14. Peloso PFD, Leite CCF, Torres (Filho) HM. Bactrias Produtoras de Betalactamases de Espectro ampliado (ESBL). Laboratrio Richet. www.richet.com.br/microbiologiaclinica.html. Acesso em: 10/10/2002. 15. Tosin I. Avaliao do modo de disseminao da resistncia bacteriana a antibacterianos nos hospitais brasileiros. So Paulo; s. n; [137] p. ilus. Tab, 2001. 16. Barros E, Bittencourt H, Caramori ML, Machado A. Antimicrobianos - Consulta Rpida. Ed. Artes Mdicas Sul. 2ed. Porto Alegre, 2001. 17. Koneman EW, Allen SD, Janda WM, Schreckenberger PC, Winn WC. Diagnstico Microbiolgico texto y atlas color. Ed. Mdica panamericana. 5ed. Buenos Aires, 1999. 18. Blatt JM. Mecanismo de Resistncia e Deteco das betalactamases de espectro ampliado. Newslab, n. 40, p. 86-97, 2000. 19. Kocazeybek BS, Arabaci U. Use of E-tests with carbapenems for Gram-negative rods producing betalactamases. Int J Antimicrob Agents: 19(2): 159-62, 2002. 20. Bell JM, Turnidge JD, Gales AC, Pfaeller MA, Jones RN. Prevalence of extended-spectrum betalactamase (ESBL) - producing clinical isolades in the Asia-Pacific region and South Africa: regional results from SENTRY Antimicrobial Surveillance Program (1998-1999). Diagn Microbiol Infect Dis; 42(3): 1938, 2002. 21. Pagani L, Migliavacca R, Palecchi L, Matti C, Giacobone E, Amicosante G, Romero E, Rossolini GM. Emerging extended-spectrum betalactamase in Proteus mirabilis. J Clin Microbiol; 40(4): 1549-52, 2002. 22. Otkun M, Erdem B, Akata F, Tatman-Otkun M, Gerceker D, Yagci S, Ozkan E. Antibiotic resistance patterns and plasmid profiles of Salmonella typhimurium isolates in Turkey. Eur J Clin Microbiol Infect Dis; 20(3): 206-9, 2001. 23. Palasubramaniam S, Parasakthi N. Comparison of three different methods for the presuntive detection of ESBL prodution in cefatzidime-resistant strains of Klebsiella pnumoniae. Malays J Pathol; 23(2): 73-8, 2001. 24. Bedenic B, Boras A. Effect of inoculum size on sensitivity and specificity of the doubl-disk synerg test for the detection of wide-spectrum beta-lactamases. Lijec Vjesn; 123(11-12): 293-6, 2001. 25. Sociedade Brasileira de Microbiologia - SBM. MD Consultoria em Microbiologia. www.saudetotal.com.br Acesso em: 10/11/2002.

174

NewsLab - edio 63 - 2004