MEDECINE/SCIENCES 2002 ; 18 : 303-14

Le virus de lhpatite C
Jean-Michel Pawlotsky

> Le virus de lhpatite C (VHC) est un virus ARN monocatnaire linaire de polarit positive, dot dune capside icosadrique et dune enveloppe. Son gnome comporte un cadre de lecture ouvert unique, traduit en une polyprotine prcurseur secondairement clive pour donner naissance aux protines virales structurales et non structurales. Celles-ci, dotes de multiples fonctions importantes pour la biologie du virus, interagissent de faon complexe avec les protines cellulaires de lhte. Les cintiques de rplication du VHC sont trs rapides et caractrises par un tat dquilibre au stade dinfection chronique. Le VHC est un virus variable. Les souches virales se classent en 6 gnotypes et de nombreux sous-types et le virus a une distribution en quasi-espces chez les sujets infects. En dix ans, la connaissance du VHC et des mcanismes de linfection a progress de faon spectaculaire. Les progrs sont cependant freins par labsence de systme de culture cellulaire productive et par la faible disponibilit de modles animaux proches du modle humain. Le dveloppement rcent de rplicons subgnomiques, la disponibilit de systmes fonctionnels permettant de tester de nouvelles molcules vise thrapeutique et les avances de la recherche vaccinale chez la souris et le chimpanz devraient permettre dimportants progrs au cours des dix prochaines annes. <

fonctions des protines virales, et de mieux comprendre les mcanismes de la variabilit gntique virale et les cintiques de la rplication. De nombreux modles exprimentaux cellulaires ou animaux ont t dvelopps, mais un systme de culture cellulaire productive fait encore dfaut.

Service de BactriologieVirologie, Hpital Henri Mondor, 51, avenue du Marchal de Lattre de Tassigny, 94010 Crteil, France. jean-michel.pawlotsky @hmn.aphop-paris.fr

Structure des virions

Les particules virales nont jamais t visualises avec certitude en microscopie lectronique. Plusieurs groupes ont rapport lobservation de particules dallure virale au sein de vsicules cytoplasmiques dans diffrents organes et lignes cellulaires (foie de chimpanz, lignes lymphocytaires B ou T), mais il ny a aucune preuve quil sagissait rellement du VHC. Lultracentrifugation en gradient de sucrose du srum de sujets infects par le VHC permet dindividualiser deux fractions riches en composants viraux : lune de densit 1,09-1,10 g/ml, trs infectieuse, constitue de virions associs des lipoprotines de faible densit (very low density lipoproteins ou VLDL et, peut-tre, low density lipoproteins ou LDL), dont environ 30 % pourraient tre
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Le virus de lhpatite C (VHC) a t identifi en 1989 par lquipe de Michael Houghton (Chiron Corporation, Emeryville, Californie, tats-Unis). Lintgralit du gnome viral a t clone et la comparaison avec les autres squences virales connues a permis de classer le VHC au sein de la famille des Flaviviridae, dans un nouveau genre, cr pour lui, et aujourdhui exclusivement constitu de ses variants, le genre Hepacivirus. La recherche trs active mene au cours des dix dernires annes a permis de mieux connatre la structure du virus et de son gnome et les
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Article disponible sur le site http://www.medecinesciences.org ou http://dx.doi.org/10.1051/medsci/2002183303

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dfectueux ; lautre, de densit 1,22-1,25 g/ml, faiblement infectieuse in vivo et in vitro, constitue de particules virales associes des immunoglobulines spcifiques au sein de complexes immuns. Les particules virales ont un diamtre de 55 65 nm. Elles sont constitues, de lextrieur vers lintrieur, de 3 structures : (1) une enveloppe lipidique au sein de laquelle sont ancres deux glycoprotines denveloppe virales, E1 et E2, organises en complexes htrodimriques non covalents ; (2) une capside protique forme par la polymrisation de la protine de capside C ; (3) le gnome viral, constitu dune molcule dARN simple brin.

Structure du gnome

Le gnome du VHC est un ARN monocatnaire linaire de polarit positive denviron 9,6 kb. Riche en G-C, il est trs structur dans le cytoplasme des cellules infectes et dans les particules virales. Son organisation est voisine de celle du gnome des Flavivirus et des Pestivirus, les deux autres genres de la famille des Gnes des protines Gnes des protines Flaviviridae. Il comprend structurales non structurales trois rgions distinctes de 5 en 3 : la rgion 5 non 3 C E1 E2 NS2 NS3 NS4 NS5A NS5B codante, le cadre de lecture ouvert et la rgion 3 Traduction (voir Figure 2) non codante (Figure 1). La rgion 5 non codante, POLYPROTINE PRCURSEUR constitue des 341 premiers nuclotides du gnoMaturation post-traductionnelle me, comprend 3 5 codons AUG non initiateurs de la Protase NS3 traduction et 4 domaines associe NS4A Protase NS2-3 riches en structures tigesboucles. Le domaine I est le moins conserv. Les C E1 E2 NS2 NS3 NS4B NS5A NS5B domaines II, III et IV for7 Capside Enveloppe P Protase Protase NS4A ? ARN ? ment le site interne den? Hlicase Co-facteur polymrase NTPase Protase dpendante tre du ribosome (internal NS3 de lARN ribosome entry site, IRES) (Figure 2) [1], structure qui fixe la sous-unit 40S Figure 1. Structure du gnome du VHC. Le gnome du VHC est un ARN monocatnaire linaire de polarit positive du ribosome et permet denviron 9,6 kb qui comprend une rgion 5 non codante, un cadre de lecture ouvert et une rgion 3 non codanlinitiation de la traduction te. Son extrmit 5 ne comporte pas de coiffe mthyle, et la traduction se fait par un mcanisme dentre interdu cadre de lecture ouvert. ne du ribosome au niveau de lIRES. La traduction du cadre de lecture ouvert produit une polyprotine prcurseur Le cadre de lecture ouvert dont la maturation post-traductionnelle conduit la libration des protines virales structurales (capside, E1 et dbute par un codon AUG E2), de p7 et des protines non structurales (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A et NS5B). Les clivages C/E1, E1/E2, E2/p7 initiateur de la traduction et p7/NS2 sont effectus par des protases cellulaires. La jonction NS2/NS3 est clive par laction auto-catalysitu dans le domaine IV tique en cis de la protase NS2-NS3, constitue par la partie C-terminale de NS2 et la partie N-terminale de NS3. de la rgion 5 non codan- La srine protase NS3 associe son co-facteur NS4A assure quant elle le clivage de lensemble des jonctions te. Il comporte 9 024 situes en aval : NS3/NS4A, NS4A/NS4B, NS4B/NS5A et NS5A/NS5B.
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9 111 nuclotides et code pour au moins 10 protines virales distinctes (Figure 1), les protines structurales (protine de capside C, glycoprotines denveloppe E1 et E2), la protine p7 dont on ne sait sil sagit dune protine structurale, dune protine non structurale, ou dun simple produit de clivage, et les protines non structurales, NS (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A et NS5B). Enfin, la rgion 3 non codante comporte trois rgions successives, de 5 en 3 : (1) une rgion non traduite denviron 30 nuclotides, variable dune souche virale lautre ; (2) une rgion poly-U/C de longueur variable ; (3) une rgion 3 terminale trs conserve de 98 nuclotides, connue sous le nom de rgion X, replie en trois tiges-boucles successives. Celle-ci semble jouer un rle important dans linitiation de la synthse du brin dARN ngatif au cours de la rplication et fixe une polypyrimidine tract-binding protein (PTB), protine implique dans linitiation de la traduction sous le contrle de lIRES [2].

Cycle cellulaire et rplication

Fixation au rcepteur, internalisation et tapes prcoces du cycle Une interaction prcoce entre la surface des glycoprotines denveloppe et les glycosaminoglycanes situs la surface des cellules cibles pourrait tre implique dans la reconnaissance et le tropisme cellulaire du virus [3], mais la (ou les) molcule(s) rceptrice(s) responsable(s) de la fixation et de linternalisation du VHC ne

sont pas identifies. Deux candidats rcepteurs ont t proposs. La ttraspanine CD81, prsente la surface de nombreux types cellulaires comme les hpatocytes ou les lymphocytes B, semble capable de fixer spcifiquement la glycoprotine denveloppe E2 in vitro. Cette interaction peut entraner des modifications mtaboliques de la cellule cible, mais linternalisation des virions par son intermdiaire na pas t dmontre [4, 5]. Les virions infectieux pourraient galement se fixer spcifiquement au rcepteur des LDL, sans doute par le biais de leur interaction de surface avec les VLDL et les LDL, et cette fixation serait associe une internalisation des particules virales [5, 6]. Il est probable que la fixation et linternalisation des virions mettent en jeu plusieurs molcules associes formant un complexe rcepteur au sein duquel les rles respectifs des glycosaminoglycanes de surface, du rcepteur des LDL, de la molcule CD81 et dautres constituants restent dfinir. Le mcanisme des tapes suivantes du cycle reste inconnu en labsence de systme cellulaire dtude adquat. Par analogie avec les Flaviviridae, on suppose quaprs lendocytose, les gnomes viraux sont librs de leurs enveloppes dans des compartiments acides de type endosomes, puis largus dans le cytoplasme o ils vont servir dARN messagers pour la synthse des protines virales et de matrices pour la rplication.

Figure 2. Structure secondaire de la rgion 5 non codante du VHC. La rgion 5 non codante du VHC comprend 3 5 codons AUG non initiateurs de la traduction, 4 domaines riches en structures tiges-boucles (les domaines I IV, ce dernier contenant le codon AUG initiateur de la traduction du cadre de lecture ouvert), et un pseudo-nud situ lintrieur du domaine III. Le domaine I est le moins conserv. Les domaines II, III et IV forment le site interne dentre du ribosome (internal ribosome entry site, IRES), structure qui fixe la sous-unit 40S du ribosome et permet linitiation de la traduction du cadre de lecture ouvert. Les 24 40 premiers nuclotides du cadre de lecture ouvert, situs dans le gne de la capside, semblent participer la structure et au fonctionnement de lIRES, bien que ces rsultats restent discuts. (Reproduit de [1] avec permission).

Synthse des protines virales La synthse des protines virales commence par la traduction du cadre de lecture ouvert qui donne naissance une polyprotine prcurseur virale unique (Figure 1). Lentre du ribosome sur le messager se fait quelques nuclotides en amont du codon initiateur de la traduction [7]. Lextrmit 3 non codante du gnome viral semble jouer un rle rgulateur dans la traduction du cadre de lecture ouvert. Le clivage de la polyprotine prcurseur est assur par au moins trois protases, dont une cellulaire et deux virales (Figure 1) [8]. Les protines structurales sont clives par une peptidase situe dans la lumire du rticulum endoplasmique[9]. Les protines non structurales sont clives par deux protases virales [8], dune part la protase NS2-NS3, dote dune activit autocatalytique en cis permettant le clivage NS2-NS3 [10], dautre part la srine protase NS3 qui, associe son co-facteur NS4A, assure le clivage de lensemble des jonctions situes en aval. Les protines NS5A et NS5B sont secondairement phosphoryles, et NS5A pourrait subir un clivage ultrieur par une protase cellulaire librant un produit dot dun site de localisation nuclaire et de proprits dactivateur transcriptionnel [11].
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Rplication LARN polymrase dpendante de lARN (protine NS5B) et les autres protines non structurales (NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A) sassocient des protines cellulaires de lhte pour former le complexe de rplication [12]. Celui-ci est associ aux structures membranaires et vsiculaires pri-nuclaires, sige de la rplication virale. LARN polymrase synthtise un brin dARN ngatif partir du gnome, qui sert ensuite de matrice pour la synthse de nombreux brins dARN positifs qui seront encapsids et envelopps pour devenir les gnomes des particules virales noformes ou serviront de nouveaux messagers pour la synthse des protines virales. Assemblage et excrtion des virions En labsence de systme de culture cellulaire adquat, les tapes ultimes du cycle viral restent mal connues. Lassemblage est probablement dclench par linteraction entre lARN gnomique et la protine de capside, qui aboutit la formation de la nuclocapside par des mcanismes non encore lucids. Par analogie avec les Flavivirus, les nuclocapsides pourraient ensuite senvelopper par bourgeonnement lintrieur du rticulum endoplasmique et les particules virales pourraient tre excrtes par exocytose.

vit des promoteurs viraux et cellulaires, activer des facteurs transcriptionnels ou interagir avec lapolipoprotine AII. Sa coopration avec loncogne Ras a abouti la transformation de fibroblastes primaires dembryon de rat in vitro. Son expression chez des souris transgniques a t associe de faon inconstante au dveloppement dune statose hpatique et de carcinomes hpatocellulaires [14-16]. Lexistence de ces proprits in vivo et leur rle dans la pathognie de linfection restent controverss.

Structure et fonction des protines virales

Les protines virales structurales et non structurales possdent de nombreuses fonctions et proprits, dont certaines sont indispensables la production des particules virales et dautres semblent jouer un rle important dans la pathognie de la maladie virale C.

Protine de capside C Le clivage protolytique du peptide signal situ lextrmit C-terminale de la protine C donne naissance une phosphoprotine trs basique de 21 kDa, qui comporte un segment hydrophobe son extrmit C-terminale et reste localise dans le cytoplasme, proximit des membranes pri-nuclaires et du rticulum endoplasmique. Elle est trs conserve dune souche virale lautre et fortement antignique. Sa principale fonction est de servir la formation des capsides virales par polymrisation. Une forme de 19 kDa, produite par clivage protolytique du segment hydrophobe C-terminal, pourrait migrer vers le noyau cellulaire et moduler certains gnes de transcription cellulaire [13]. De trs nombreuses autres fonctions et proprits potentielles de la protine de capside du VHC ont t dcrites dans divers modles in vitro. Elle pourrait ainsi inhiber ou induire lapoptose selon le type cellulaire, contrler lacti306
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Glycoprotines denveloppe E1 et E2 Les glycoprotines E1 (gp31) et E2 (gp70) sont des protines de membrane entrant dans la composition des enveloppes virales. Comme les protines transmembranaires de type I, elles comportent un ectodomaine Nterminal et une rgion hydrophobe C-terminale dancrage dans le rticulum endoplasmique et les structures apparentes. Les 27 acides amins N-terminaux de E2 constituent la rgion hypervariable 1 (HVR1), expose la surface dE2 et site dun des principaux pitopes neutralisants du virus [17]. E1 et E2 peuvent former deux types de complexes : des htrodimres E1/E2 constitus de protines natives et stabiliss par des interactions non covalentes (voie productive) ; des agrgats htrognes lis par des ponts disulfures et interagissant avec des molcules chaperons (voie non productive), qui pourraient jouer un rle de rgulation ngative de la formation des particules virales et de la rplication [18, 19]. Les glycoprotines denveloppe sont impliques dans la reconnaissance cellulaire et linteraction des particules virales avec la (ou les) molcule(s) rceptrices et la pntration du virus dans la cellule (voir cycle cellulaire et rplication). Il est probable quelles jouent galement un rle aprs linternalisation, en particulier dans le dshabillage des particules enveloppes et dans lassemblage des virions. p7 Le rle de la protine p7 est inconnu. Elle ne semble pas indispensable lassemblage des particules virales. NS2 La protine non structurale NS2 est une protine transmembranaire de 23 kDa, insre dans la membrane du rticulum endoplasmique, qui forme avec lextrmit Nterminale de NS3 une protase auto-catalytique dont lactivit semble stimule par le zinc [20]. NS3 et NS4A NS3 est une protine hydrophile de 67 kDa qui possde un domaine protase dans son tiers N-terminal et un

domaine NTPase/hlicase dans ses deux tiers C-terminaux. Il nexiste aucun argument suggrant que ces deux domaines fonctionnels soient spars par clivage. Leur association pourrait tre le rsultat dune interdpendance fonctionnelle. Lactivit srine protase de NS3 assure le clivage des protines situes en aval (Figure 1). Elle dpend de la formation dun htrodimre stable avec NS4A, petite protine transmembranaire de 54 acides amins et ncessite la prsence de zinc [21]. La rsolution de la structure tri-dimensionnelle de NS3 et du complexe NS3-NS4A a rcemment rvl que cette protase est proche des chymotrypsines [22, 23]. Des inhibiteurs spcifiques de la protase NS3-NS4A sont en cours de dveloppement. La srine protase NS3 semble galement capable dinteragir avec des protines cellulaires de lhte au cours de linfection et pourrait avoir des proprits transformantes in vitro par des mcanismes non lucids. Lactivit hlicase de NS3, confre par son domaine Cterminal, pourrait servir sparer les brins positifs et ngatifs de lARN viral au moment de la rplication, abolir les structures secondaires des ARN positifs pour favoriser la traduction des protines virales, et permettre laccs de lARN polymrase virale aux structures trs replies, telles que lIRES et la rgion X de lextrmit 3 non codante [24]. La structure tri-dimensionnelle de la NTPase/hlicase, associe ou non un acide nuclique, a t rcemment rsolue en cristallographie aux rayons X [25, 26] et des inhibiteurs spcifiques sont en cours de dveloppement. La portion hlicase de NS3 est galement implique dans la rgulation de la transduction du signal par la protine kinase dpendante de lAMP cyclique (PKA) et semble pouvoir influencer la survie et la prolifration de sa cellule hte.

du complexe de rplication [29]. Sa fonction au sein de ce complexe reste inconnue. Elle participe probablement la rgulation de lactivit de lARN polymrase dpendante de lARN. En outre, NS5A possde de nombreuses proprits qui pourraient jouer un rle dans la pathognie de linfection. Prive de sa partie N-terminale, elle possde une fonction dactivateur transcriptionnel in vitro [30] qui pourrait jouer un rle physiologique. NS5A possde en effet un signal de localisation nuclaire situ en aval du site transactivateur et semble pouvoir tre clive par une protase cellulaire en amont de ce site [11]. Limplication de cette fonction reste dterminer, en particulier dans la carcinogense induite par le virus. De nombreuses interactions entre NS5A et des protines cellulaires de lhte ont galement t rapportes, dont le rle physiologique (en particulier dans la rsistance linterfron- au cours de linfection aigu ou du traitement anti-viral) reste hypothtique [31].

NS4B NS4B est une petite protine hydrophobe de 27 kDa, transmembranaire intgrale, et localise dans la paroi du rticulum endoplasmique o elle est oriente vers le cytoplasme [27]. Elle est associe aux autres protines non structurales au sein du complexe de rplication. Il a t suggr que NS4B pourrait avoir des proprits transformantes in vitro. NS5A NS5A est une protine modrment hydrophile qui existe sous deux formes distinctes, de poids molculaires respectifs 56 et 58 kDa, qui diffrent par leur degr de phosphorylation [28]. NS5A est localise proximit des membranes du rticulum endoplasmique o elle est associe aux autres protines non structurales au sein
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NS5B NS5B est une protine phosphoryle de 68 kDa localise proximit des membranes pri-nuclaires au sein du complexe de rplication. Elle contient des motifs conservs caractristiques des ARN polymrases dpendantes de lARN et son activit polymrasique a t dmontre in vitro [32, 33]. Sa structure tri-dimensionnelle a t rcemment rsolue par cristallographie aux rayons X [34]. Elle prsente une structure en main droite classique, avec des doigts et un pouce dfinissant une paume . Elle interagit avec lextrmit 3 de lARN viral et la polymrisation aboutit la copie du gnome complet (brin ngatif partir dun brin positif, ou brin positif partir dun brin ngatif). Les mcanismes intimes de la rplication virale restent incompltement lucids. Des inhibiteurs spcifiques de lARN polymrase dpendante de lARN du VHC sont en cours de dveloppement.

Cintiques de rplication virale

La modlisation mathmatique de la dcroissance de la charge virale sous traitement par interfron- a rcemment permis de mieux comprendre les cintiques de rplication du VHC (Figure 3) [35]. Le foie des patients infects contient deux compartiments virtuels, faits respectivement dhpatocytes infects et dhpatocytes non infects. Les hpatocytes infects produisent chaque jour des quantits importantes de virions. Une partie de ces virions infectent de nouveaux hpatocytes, alimentant ainsi le rservoir dhpatocytes infects. Celui-ci dcrot paralllement du fait de la mort par
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apoptose des hpatocytes infects. La grande majorit des particules virales produites par les hpatocytes infects est dverse dans la circulation gnrale. Elles y sont rapidement dgrades par des mcanismes mal lucids mettant en jeu des phnomnes physiques et immunologiques. Les sites extra-hpatiques de rplication virale peuvent servir de sources marginales de production de virions et de cibles pour linfection de nouvelles cellules.

Cintiques de rplication du VHC au cours de linfection aigu Les cintiques de rplication du VHC nont pas t tudies au cours de linfection aigu humaine. Les seuls Variabilit gntique virale rsultats disponibles ont t obtenus chez le chimpanz infect exprimentalement [36]. Dans ce modle, une La variabilit gntique du VHC est le rsultat de labonaugmentation exponentielle biphasique de la charge dance de la production quotidienne de particules virales virale a t observe, avec une premire phase rapide par les cellules infectes et des proprits de lARN polypendant les deux premires semaines (temps de double- mrase dpendante de lARN viral. Celle-ci commet en ment de lordre de 1,7 jours) et une seconde phase plus effet des erreurs au cours de la rplication, erreurs dont lente pendant les 3 5 semaines suivantes (temps de doublement de la frquence est de lordre de 10-4 10-5 par position lordre de 11,5 jours). Le ralentissement observ au cours de la deuxi- nuclotidique. On estime quen moyenne une mutation me phase pourrait tre expliqu par la scrtion de cytokines induite nuclotidique survient sur chaque brin dARN synthtis. par linfection. Llvation biphasique de la charge virale tait suivie En labsence dactivit correctrice de la polymrase, les dun plateau, puis dune dcroissance significative au moment du pic mutations saccumulent au cours de la rplication. La des transaminases et de la sroconversion, sans doute lie la rpon- majorit dentre elles sont ltales et conduisent la se anti-virale cytotoxique. Cette dcroissance aboutissait soit llimination de linfection (clairance des Hpatocytes Hpatocytes hpatocytes infects), soit une stabilisation en plaMort cellulaire infects non infects teau, caractristique de linfection persistante [36]. Cintiques de rplication du VHC au cours de linfection chronique Chez lhomme, linfection chronique par le VHC est caractrise par un tat dquilibre des cintiques de rplication virale (Figure 3) [35]. Linfection de nouveaux hpatocytes est en effet compense par la mort par apoptose des cellules infectes, garantissant une taille peu prs constante du rservoir de cellules infectes. La libration des virions dans la circulation gnrale est, quant elle, compense par leur dgradation priphrique, expliquant que la charge virale reste globalement inchange au cours de linfection chronique. Les cintiques de rplication virale sont cependant trs rapides, avec une demi-vie moyenne des particules virales dans la circulation gnrale estime moins de 3 heures, et une production-clairance quotidienne de lordre de 1012 particules virales par jour [35]. La demi-vie des cellules infectes semble trs variable dun patient lautre, de lordre de 2 70 jours en moyenne [35]. Ladministration de traitements anti-viraux et/ou immunomodulateurs modifie profondment lquilibre des cintiques de
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rplication virale par des mcanismes varis lis aux modes daction des molcules administres (blocage de la production virale par les cellules infectes, inhibition de linfection de nouvelles cellules, acclration de la mort des cellules infectes). Le dsquilibre induit est lorigine de la dcroissance de la charge virale sous traitement, qui peut tre lie une rduction du nombre de cellules infectes, une rduction de la production de virus par les cellules infectes, ou la combinaison des deux phnomnes. La gurison de linfection passe par la clairance complte et dfinitive des cellules infectes de lorganisme.

PRODUCTION

INFECTION DE NOVO

Cellules extra-hpatiques infectes Cellules extra-hpatiques non infectes

Compartiment plasmatique (charge virale)

DGRADATION

Compartiment de dgradation

Figure 3. Cintiques de rplication du VHC ltat dquilibre au cours de lhpatite chronique C [37]. Il existe, chez lhomme infect par le VHC, un tat dquilibre des cintiques de rplication et de clairance virales. La taille du rservoir des cellules infectes est constante, la mort par apoptose des hpatocytes infects tant compense par linfection de nouveaux hpatocytes. De mme, la libration des virions dans la circulation est compense par leur dgradation priphrique, ce qui explique que la charge virale soit globalement stable.

production de particules virales dfectueuses. Les autres sont transmises la descendance et les populations virales engendres sont soumises diffrents niveaux de pressions slectives. Les pressions de slection sexerant sur des populations dindividus infects, lies lisolement gographique de certains groupes humains et/ou leur isolement pidmiologique du fait de modes de transmission en circuit plus ou moins ferm, ont t lorigine de lmergence des gnotypes viraux et sont responsables de leur diversification. Les pressions de slection exerces par lensemble des rponses anti-virales chez un individu infect donn sont lorigine de la distribution en quasi-espces du virus.

Gnotypes du VHC Lanalyse phylognique des souches de VHC isoles dans diffrentes rgions du monde a permis de dfinir six groupes principaux ou types , numrots de 1 6, et un grand nombre de sous-types au sein de chaque type, identifis par des lettres minuscules [37]. Globalement, les types diffrent entre eux par 31 34 % de leur squence nuclotidique et environ 30 % de leur squence amino-acidique, tandis que les sous-types diffrent entre eux par 20 23 % de leur squence nuclotidique. Certains variants isols en Asie du SudEst ont un niveau de divergence intermdiaire entre le type et le sous-type. Ils ont t initialement dsigns comme les types 7, 8, 9, 10 et 11. Proches du type 6 pour la plupart, et du type 3 pour le 10a, ils ont finalement t rattachs ces derniers, bien quils soient plus loigns des autres sous-types que ceux-ci entre eux [37]. Ltude de la distribution mondiale des gnotypes du VHC et de leurs relations phylogniques permet de mieux comprendre leur mergence et leur diversification au cours des sicles, ainsi que les routes empruntes par lpidmie mondiale dhpatite C. Lorigine des Flaviviridae rencontrs chez les primates pourrait remonter la diffrenciation des espces de primates il y a environ 35 millions dannes. Le VHC aurait co-volu avec les populations humaines lors de leur migration hors dAfrique au cours des 100 000 150 000 dernires annes, tandis que ses variants actuels seraient apparus beaucoup plus rcemment [38]. Une tude rcente suggre lmergence du type 6 il y a environ 700 ans, du type 4 il y a environ 350 ans, et des sous-types 1a et 1b il y a moins de 100 ans [39]. La frquence et lextrme diversit des sous-types des types 3 et 6 en Asie et des soustypes des types 1, 2, et 4 en Afrique suggrent que ceuxci sont apparus et se sont diversifis dans ces rgions respectives, o ils circulent sans doute depuis trs longtemps parmi les populations locales. Cette hypothse est
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corrobore par la diversification lente des types 4 et 6, compatible avec une longue priode dendmie localise [39]. Au contraire, le nombre limit de sous-types de chaque type en Europe, en Amrique, au Japon ou en Ocanie suggre que lhpatite C est une pathologie dimportation rcente dans ces rgions, voluant sur un mode pidmique. La diversification rapide des soustypes 1a et 1b est le rsultat de la diffusion plantaire de ces variants au cours des 100 dernires annes [39], principalement par le biais de la transfusion de sang et de produits drivs pour le gnotype 1b, et par celle de la transfusion sanguine et de la toxicomanie par voie veineuse pour le gnotype 1a [40]. Lpidmie dhpatite C de gnotype 3 est encore plus rcente dans les pays industrialiss, comme en tmoignent les faibles distances gntiques entre les souches isoles des cinq continents [41]. Leur introduction dans les pays industrialiss remonte en effet la fin des annes 1960, date partir de laquelle leur diffusion sest faite principalement chez les toxicomanes par voie veineuse [40, 41]. Lvolution gntique du gnotype 1b semble aujourdhui se ralentir, car la prvention de la transmission transfusionnelle de lhpatite C a considrablement frein la propagation de ce sous-type. Labsence de contrle de lpidmie lie la toxicomanie par voie veineuse saccompagne en revanche dune volution rapide des gnotypes 1a et 3a, lie leur diffusion [39].

Distribution en quasi-espces du VHC Le VHC, comme de nombreux autres virus ARN, circule chez chaque patient infect sous la forme dune quasiespce virale, cest--dire dun mlange complexe et en quilibre instable de variants viraux gntiquement distincts mais apparents, car tous drivs du mme inoculum [42]. La distribution en quasi-espces du VHC favorise sa survie. En effet, la prsence simultane de variants viraux diffrents et la rapidit avec laquelle de nouveaux variants mergent permettent la slection rapide et continue des variants les mieux adapts lenvironnement au sein duquel le virus se rplique. La capacit dadaptation des quasi-espces virales aux modifications de lenvironnement joue un rle important dans la physiopathologie de linfection, aussi bien dans les mcanismes de persistance virale que dans la rsistance aux traitements anti-viraux ou la rcidive de linfection aprs transplantation hpatique. A un instant donn de linfection, la quasi-espce virale dun patient infect est en quilibre. Cependant, les quasi-espces virales se modifient en permanence pour sadapter lenvironnement au sein duquel le virus se rplique et ce, sous linfluence de trois ordres de pressions volutives.
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1. Laccumulation rapide et au hasard des mutations sur le gnome viral au cours de la rplication aboutit, du fait de contraintes contradictoires voire antagonistes, la slection continuelle des variants les mieux adapts. 2. Les pressions ngatives, lies aux contraintes conservatrices sur la squence du gnome ou des protines virales, rsultent de la ncessit de conserver les proprits fonctionnelles du gnome et des protines pour assurer la survie des variants. 3. Les pressions de slection positive exerces sur le gnome et les protines virales rsultent dinteractions complexes avec les rponses immunitaires et certaines protines de lhte. Elles voluent au cours du temps, spontanment ou sous linfluence de divers vnements extrieurs (infection intercurrente, prise mdicamenteuse, administration danti-viraux, etc.). Laccumulation des mutations au cours de la rplication est galement rpartie sur toute la longueur du gnome. La combinaison des pressions de slection cre un vritable goulot dtranglement gntique travers lequel la quasi-espce doit constamment se frayer un chemin pour survivre dans son environnement changeant, mais ces pressions varient considrablement dune rgion du gnome lautre, principalement en fonction du rle

physiologique de la portion de gnome ou de la protine correspondante et des pressions immunes qui sexercent sur la protine. Par exemple, la rgion HVR1 de la glycoprotine denveloppe E2, cible des anticorps anti-VHC neutralisants, est soumise de fortes pressions positives de la part de la rponse immune. Ces pressions sont responsables de sa variabilit et de son volution gntique rapide au cours de linfection chronique ou lorsque la rponse immune est profondment modifie, par exemple lors dun traitement par interfron- [43]. HVR1 est cependant galement soumise de fortes pressions conservatoires, lies sa conformation spatiale et son contenu en acides amins basiques, qui rsultent directement du rle probable de cette rgion de la glycoprotine denveloppe E2 dans les tapes prcoces du cycle viral [3]. Les pressions conservatoires lies la structure et la fonction de la protine NS5A et de la srine protase NS3 sont encore plus fortes, puisque celles-ci ne semblent tolrer que des changements dacides amins sporadiques, naltrant pas les proprits physico-chimiques des rsidus [44]. Certaines mutations pourraient nanmoins modifier de faon marginale la structure de ces protines et avoir des consquences fonctionnelles, comme la rduction

ECMV No IRES NS2 NS3 NS4B NS5A NS5B

ARN (voir Figure 2) Transfection dans des lignes hpatocytaires

Pas de rplication de lARN

Rplication de lARN

Sensibilit la nomycine

Rsistance la nomycine

Figure 4. Rplicons subgnomiques du VHC. Les rplicons subgnomiques contiennent de 5 en 3 : la squence IRES du VHC, le gne codant pour la phosphotransfrase de la nomycine (no), la squence IRES du virus de lencphalomyocardite (ECMV), les squences codant pour les protines non structurales NS2 NS5B et la rgion 3 non codante du VHC. Ces rplicons sont dits bicistroniques car la synthse de la phosphotransfrase est dirige par lIRES du VHC, tandis que celle des protines non structurales par lIRES de lECMV. Aprs transfection des ARN dans des lignes hpatocytaires, la slection est effectue par lajout de nomycine. Comme la transfection nest effectue quavec lARN, seuls les clones cellulaires contenant des rplicons fonctionnels qui ont la capacit de se rpliquer sont rsistants la nomycine.
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Tropisme cellulaire et compartimentation

Lanalyse phylognique des squences virales isoles de diffrents compartiments de lorganisme, comme le foie, le sang priphrique ou les cellules sanguines, a permis de dmontrer la compartimentation du VHC chez les individus infects [45, 46]. Celle-ci pourrait tre lie des cintiques diffrentes des variants dans les diffrents compartiments, mais surtout un tropisme cellulaire de certains variants, cest--dire leur capacit de se fixer spcifiquement diffrents types cellulaires, dtre internaliss et de se rpliquer dans ces cellules. Lexistence de variants lymphotropes diffrents des variants hpatotropes a t voque initialement devant la rplication prfrentielle dans des lignes cellulaires dorigine lymphode des variants isols des lymphocytes priphriques dun chimpanz infect exprimentalement [47]. Il est aujourdhui tabli que le VHC est capable de se rpliquer en dehors des hpatocytes, au moins dans certaines sous-populations lymphocytaires B et dans les cellules dendritiques [46, 48, 49]. Les paramtres dterminant le tropisme cellulaire des variants de quasi-espce du VHC semblent multiples. Les diffrences de squence amino-acidique des glycoprotines denveloppe, en particulier de la rgion HVR1, entre les variants isols de diffrents compartiments suggrent que la reconnaissance de ces variants dpend de molcules de surface cellulaire spcifiques du type cellulaire, comme par exemple les glycosaminoglycanes [3]. Les tapes ultrieures de fixation et dinternalisation du virus ne seraient ensuite assures que par les cellules possdant lensemble du systme rcepteur fonctionnel. La rplication virale de certains variants au profit dautres, dans certaines cellules, pourrait tre due des facteurs cellulaires spcifiques interagissant avec lIRES [50], ou ncessaires la rplication du gnome et la synthse des protines virales.

Les autres primates Le chimpanz est le seul primate qui puisse tre infect par le VHC. Linfection du tamarin par le virus GB de type B (GBV-B), membre de la famille des Flaviviridae prsentant 32 % dhomologie de squence avec le VHC, peut constituer un modle indirect dtude des stades prcoces de linfection. Les espoirs reposent aujourdhui sur le dveloppement de virus chimres GBV-B/VHC qui puissent infecter le tamarin. Dautres primates pourraient savrer permissifs linfection par des chimres associant le VHC dautres virus. Les petits animaux La souris reste un modle exprimental facilement accessible et prcieux pour ltude des proprits du VHC. Diffrentes lignes de souris transgniques ont t utilises pour tudier les effets pathognes des protines virales et des souris exprimant la totalit du gnome viral sont en cours de dveloppement. Des souris knock-out sont galement utilises pour identifier les composantes de la rponse immune qui sopposent la rplication du VHC, tandis que des souris transgniques exprimant des gnes humains sont utilises pour identifier des mol311

Modles dtude
De nombreux modles exprimentaux ont t et sont utiliss pour tudier la rplication du VHC, le cycle viral et la pathognie de linfection. Labsence dun systme cellulaire productif stable et les diffrences de rponse linfection du chimpanz, modle animal permissif, et de
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de lactivation transcriptionnelle induite par NS5A. Enfin, les contraintes conservatoires les plus fortes semblent sexercer dans la rgion 5 non codante, sur lIRES dont la structure secondaire et tertiaire ne supporte que trs peu de mutations, la plupart naltrant pas sa stabilit (Figure 4).

lhomme limitent cependant la progression des connaissances.

Le chimpanz Lhomologie gntique entre le chimpanz et lhomme est de plus de 98,5 %. Le chimpanz peut tre infect par le VHC et linfection suit une progression identique celle observe chez lhomme : prsence dARN viral qui est dtectable dans le sang priphrique quelques jours aprs linfection ; hpatite aigu caractrise par une lvation de lactivit srique des aminotransfrases 2 20 semaines aprs linfection ; dveloppement dune rponse immune adapte ; volution vers la gurison ou, dans 50 70% des cas, vers la persistance de linfection en dpit dune rponse immune humorale et cellulaire adapte. Comme chez lhomme, linfection chronique est associe des lsions histologiques dhpatite chronique et un risque dvolution vers le carcinome hpatocellulaire. Lutilisation du modle chimpanz est cependant limit par ses diffrences avec linfection humaine (moindre svrit de la maladie hpatique, rponses immunes attnues) et par le cot trs lev de lentretien des chimpanzs et leur accs limit en tant quespce protge. De nombreux travaux sont en cours sur ce modle, qui visent en particulier une meilleure comprhension des mcanismes de persistance de linfection et au dveloppement de vaccins thrapeutiques ou prophylactiques.

cules qui pourraient jouer un rle de rcepteur ou favoriser la rplication chez lhomme. Finalement, la xnogreffe dhpatocytes humains ou de chimpanzs des souris pourrait permettre dans le futur dtudier la rplication du VHC in vivo [51].

SUMMARY
Hepatitis C virus Hepatitis C virus (HCV) is a single, positive-strand RNA virus, with an icosahedral capsid and a lipidic envelope. Its genome contains a single open reading frame that translates into a precursor polyprotein, secondarily cleaved into both structural and nonstructural viral proteins. The HCV proteins bear various functions and interact with host infected cell proteins in a complex way. During chronic infection, HCV kinetics are characterized by a steady-state with a very high rate of virion production and clearance. HCV is variable : HCV strains can indeed be classified into 6 genotypes and a large number of subtypes, and HCV has a quasispecies distribution in infected patients. Spectacular progresses in the knowledge of HCV and the mechanisms of infection have been made during the past ten years. Progression is however slowed by the lack of a productive cell-culture system and reliable animal models. Major recent advances include the development of subgenomic replicons and other functional systems to test the inhibitory action of specific antiviral drugs, as well as vaccine developments.

La rplication en culture cellulaire Une rplication transitoire du VHC, sans production de particules virales infectieuses, a t obtenue sur diffrentes lignes cellulaires dorigine hpatocytaire ou lymphode. Le modle le plus proche de linfection humaine est la culture primaire dhpatocytes humains normaux. Il a permis de montrer que linterfron- inhibe directement la rplication du VHC au sein des hpatocytes infects. Il est galement utilis pour tudier les interactions du virus avec les molcules rceptrices et les mcanismes de la neutralisation. Le dveloppement rcent de rplicons subgnomiques capables de se rpliquer sur des lignes dhpatomes humains reprsente une avance considrable [52] (Figure 4). Ces systmes se rpliquent en effet trs efficacement et aboutissent la production de protines virales en grandes quantits. Ils permettent dtudier les interactions entre celles-ci et la cellule hte et constituent un excellent modle pour ltude de molcules vise thrapeutique inhibant spcifiquement la traduction ou la rplication du VHC. Les modles cellulaires pour les tudes fonctionnelles Diffrents modles de cellules transfectes exprimant les protines virales sont utiliss pour caractriser leurs interactions avec les composants de la cellule et certaines de leurs fonctions. Ces modles restent cependant limits car il est difficile de dmontrer que les interactions et les fonctions observes in vitro existent et jouent un rle physiologique au cours de linfection humaine. Des systmes fonctionnels permettant de tester laction des enzymes virales (protases, hlicase, ARN polymrase dpendante de lARN) ont galement t dvelopps. Ces modles savrent particulirement utiles pour tester des inhibiteurs spcifiques au stade pr-clinique de leur dveloppement.

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TIRS PART J.M. Pawlotsky

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