Oenococcus Oeni Clasificacin cientfica Dominio: Filo: Clase: Orden: Familia: Gnero: Bacteria Firmicutes Bacilli Lactobacillales Leuconostocaceae

Oenococcus DICKS et al. 1995 Sergi Ferrer ENOLAB Departamento Burjassot, Valencia de Laboratorio Microbiologa, de Universidad Microbiologa de Enolgica Valencia Oenococcus es un gnero de bacterias Gram-positivas y catalasa negativa de la familia Leuconostocaceae. La primera especie conocida de este gnero fueOenococcus oeni (que era conocida como Leuconostoc oeni hasta 1995). En 2006, se descubri unas segunda especie, Oenococcus kitaharae. Los vinos se inocularon con Oenococcus oeni cepa "Uvaferm Alpha" (Lallemand) tuvieron gracias a esta bacteria una fermentacin malolctica. Revista de enologa ACE Objetivo: Oenococcus oeni

Oenococcus oeni (sin. Leuconostoc oenos) es una bacteria Gram positiva perteneciente al grupo de las bacterias lcticas, que posee un cromosoma con un tamao de 1932 kb para la cepa GM, segn se ha deducido del anlisis de fragmentos de macrorrestriccin con diversos enzimas. La cepa PSU-1, aislada originalmente en la Penn State University y usada comercialmente para iniciar la fermentacin malolctica, posee un tamao de 1857 kb segn macrorrestriccin, o de 1820 kb segn la secuencia completa de esta cepa. Ambas cepas representan dos grupos genmicos divergentes de acuerdo con los anlisis de macrorrestriccin (construccin de mapas que indican el orden entre los lugares en que enzimas de restriccin cortan los cromosomas) y ribotipificacin (mtodo de biologa molecular que se emplea con fines taxonmicos para obtener patrones genotpicos de las cepas, basndose en el anlisis de su RNA ribosmico, altamente conservado durante la evolucin). El contenido medio en GC (la evolucin en el contenido en guanina + citosina es un indicador de la evolucin de las protenas y, por tanto, un parmetro filogentico) de la cepa PSU-1 es del 37,5 %. En la actualidad se est abordando la secuenciacin del genoma completo de O. oeni, proyecto en el que participan varios laboratorios de investigacin franceses y americanos. Por el momento, se han obtenido datos completos de la cepa de O. oeni PSU1, aunque an se encuentran en formato de borrador. Disponer de tal informacin es importante, pero ahora hay que procesar todos esos datos y correlacionarlos, tanto con actividades metablicas como con propiedades tecnolgicas. Adems, la secuencia del genoma de una cepa no va a proporcionar las respuestas a todas las preguntas que nos podemos plantear para todas las cepas y condiciones posibles. En cuanto a la identificacin y caracterizacin de genes concretos, se han publicado las secuencias de varios genes de O. oeni, entre los que se encuentran los genes ribosmicos de las subunidades 16S y 23S, los genes del enzima malolctico ( mleA) y del transporte de cido mlico (mleP), los genes de la acetolactato sintetasa (alsS) y de la acetolactato descarboxilasa (alsD), genes de la ruta de utilizacin de la arginina, como la arginina desaminase (arcA), ornitina transcarbamilasa (arcB) y carbamato quinasa (arcC), los genes de la histidina descarboxilasa (hdcA), los de varias protenas de estrs como hps18, clpX, tras, genes que codifican para RNA de transferencia, como el gen del Ala-t-RNA, del Leu-t-RNA, genes que codifican para la sntesis del Leu-t-RNA, del opern de una permeasa de un oligopptido y de un gen de la biosntesis de un polisacrido y de la subunidad b de la DNA polimerasa ( rpoC). Asimismo, se ha publicado la existencia de una secuencia de insercin IS 1165, de genes relacionados con lugares de integracin de fagos lisognicos en el cromosoma bacteriano attB y de diversos fragmentos aleatorios obtenidos por PCR. Varios de estos genes se han localizado en los mapas genticos de las cepas GM y PSU-1. Dificultad de manipulacin gentica

Con todo, no son demasiados los genes que estn perfectamente identificados en esta especie, y dada su importancia biolgica e industrial deberan existir ms genes caracterizados, especialmente los relacionados con propiedades tecnolgicas. Debido a la dificultad de manipulacin gentica que presenta este organismo, hay pocos estudios que empleen este tipo de tcnicas en O. oeni. Aunque se han encontrado algunos plsmidos en esta especie, en general no son frecuentes y la mayora de ellos son crpticos. Por tanto, no parece que tengan implicaciones de importancia en propiedades tecnolgicas de las cepas que los portan. Tambin presentan escasas relaciones entre ellos, a excepcin de unos pocos que, en realidad, podran considerarse casi el mismo plsmido aislado varias veces por distintos autores. Su contenido en GC es cercano al de la bacteria, presentando mecanismos de replicacin tipo crculo rodante uno de ellos, y bidireccional otros. Son plsmidos de caractersticas bastante particulares, incluso difciles de clonar y estudiar en plsmidos convencionales de E. coli. Con todo, no se ha avanzado tampoco mucho en el conocimiento, y menos en la aplicacin de estos plsmidos, o derivados de los mismos, a la gentica de O. oeni. La existencia de plsmidos propios en esta especie debera permitir abordar, en principio, la construccin de vectores de clonacin que se repliquen y se expresen en O. oeni, aunque hasta el momento no existen noticias de que esto se haya conseguido. Algo parecido ocurre con los bacterifagos (virus bacterianos) que atacan esta especie. Se han estudiado y caracterizado algunos fagos especficos de O. oeni, aunque no se han llegado a desarrollar todava sistemas de manipulacin gentica basados en ellos; existen, sin embargo, algunos grupos que han trabajado o estn trabajando para lograrlo. Es importante indicar que estos bacterifagos presentan muchas caractersticas comunes entre s, tanto morfolgicas como genticas o funcionales. Aunque un porcentaje importante de cepas de Oenococcus oeni son portadoras de fagos lisognicos (un 70 %), y se han detectado fagos libres en vinos (20 % de los vinos), parece que los fagos de O. oeni ocasionan slo excepcionalmente la lisis de las bacterias en vino. Por tanto, la mayora de evoluciones irregulares de la fermentacin malolctica seran atribuibles a otras causas. De todas formas, ha sido posible obtener cepas de O. oeni resistentes a fagos, que mantienen tanto esa resistencia como caractersticas tecnolgicas adecuadas durante muchas generaciones. Plsmidos y transposones Como hemos apuntado anteriormente, Oenococcus oeni presenta grandes dificultades de manipulacin gentica. Uno de los obstculos ms importantes para la consecucin de este objetivo es que, hasta el momento, no se ha conseguido llevar a cabo la transformacin gentica de O. oeni. Los intentos han sido numerosos (y los grupos de investigacin que se lo han propuesto tambin), pero hasta la fecha no se ha logrado en esta especie. Una vez ms parece ser un organismo con un comportamiento gentico muy particular, como se manifiesta al poseer plsmidos propios y fagos difciles de manipular. No obstante, nuestro grupo de investigacin ha logrado introducir plsmidos conjugativos en esta bacteria: el plsmido pVA797 ha sido transferido desdeStreptococcus sanguis a O. oeni a travs de Lactococcus lactis. Las eficiencias de este proceso son muy bajas, y se han obtenido transconjugantes en los que el plsmido original ha sufrido varias deleciones y reorganizaciones, dando lugar a otro plsmido ms pequeo denominado pLO1. Una mayor eficiencia de transconjugantes se consigui al transferir el plsmido pIP501 desde S. sanguis aO. oeni va L. lactis. Al igual que en el caso anterior, el plsmido que presentaban los transconjugantes era de menor tamao, habiendo sufrido deleciones extensas en todos los casos, que afectaban a las regiones de transferencia conjugativa y la estabilidad de los plsmidos originales. Como dato curioso del comportamiento de estos plsmidos reorganizados y delecionados inestables en O. oeni, hemos visto que al ser transferidos a L. lactis presentan una estabilidad completa en esta bacteria lctica. En otras palabras, ha sido posible introducir plsmidos conjugativos en O. oeni, pero con una baja eficiencia y dando como producto unos plsmidos menores y bastante inestables. En esta ocasin, volvemos a encontrarnos con particularidades de O. oeni que dificultan una manipulacin gentica sencilla y eficaz. Nuestro grupo de investigacin tambin ha logrado introducir por conjugacin en O. oeni los transposones Tn916 y Tn925. Estos transposones se integran en distintos sitios del cromosoma de O. oeni y no sufren aparentemente transposiciones secundarias. En este caso, la estabilidad es elevada. Todo ello, junto con el conocimiento que vamos poseyendo de stos y otros transposones, posibilitara el desarrollo de vehculos de manipulacin gentica basados en los mismos. Por el momento, seguimos a la espera, y estos dos mtodos conjugativos, mediante plsmidos y transposones, son los nicos sistemas disponibles de introduccin de DNA exgeno en Oenococcus oeni descritos hasta la fecha. Mutacin malolctica En cuanto a la obtencin de cepas mutantes mediante sistemas que no impliquen DNA recombinante, hemos podido aislar en nuestro equipo mutantes malolcticos que carecen por completo de esta actividad. Por un lado, estos mutantes permiten estudios fisiolgicos de inters bsico y tecnolgico, y por otro permiten la utilizacin de sistemas aprobados para manipulacin de organismos de inters alimentario como O. oeni. En contrapartida, tambin hemos desarrollado sistemas no recombinantes que nos permiten aislar cepas de O. oeni con capacidad de fermentacin malolctica aumentada. Las levaduras crecen con mucha facilidad en el mosto en fermentacin, mientras que las bacterias lo hacen con mucha dificultad y mucho ms lentamente. Es por ello que la posibilidad de tener una levadura capaz de hacer la fermentacin malolctica siempre ha llamado la atencin. Una vez desarrolladas las herramientas adecuadas para levaduras, los primeros intentos de construir una levadura malolctica mediante tcnicas de ingeniera gentica fueron en 1984, al clonar el gen malolctico de L. delbrueckii en Saccharomyces cerevisiae. La actividad detectada en la cepa transformada fue muy baja, ya que tan slo un 1 % de Lmalato se transformaba en L-lactato. Posteriormente se construy una genoteca de O. oeni en una cepa de E. coli incapaz de usar L-

malato. Los clones recombinantes fueron inestables y no se lleg a averiguar si eran capaces o no de llevar a cabo la fermentacin malolctica. En 1993 y 1994 se logr clonar el gen malolctico de Lactococcus lactis en E. coli y en S. cerevisiae. En ambos casos se demostr que las cepas de E. coli y de S. cerevisiae transformaban cido L-mlico en cido L-lctico, pero con una muy baja eficacia. Posteriormente, en 1997, se construy una levadura malolctica recombinante que coexpresaba el gen de la malato permeasa de Schizosaccaromyces pombe y el gen malolctico de Lactococcus lactis. A diferencia de las levaduras malolcticas previamente desarrolladas, sta era capaz de completar la fermentacin malolctica en menos de siete das en mostos de la variedad chardonnay. En este caso, la clonacin de la malato permeasa permiti que el transporte del cido mlico al interior de la levadura dejase de ser el paso limitante en el proceso de degradacin del cido mlico en la levadura malolctica. Con todo, el haber logrado que una levadura realice la fermentacin malolctica no supone la eliminacin de las bacterias lcticas para realizar este proceso en bodega. Adems del hecho que las bacterias lcticas proporcionan otros metabolitos de importancia organolptica, aparte de la conversin del cido mlico a cido lctico, tambin le confieren una mayor estabilidad microbiolgica a los vinos en los que se desarrollan. Por otro lado, si una levadura efecta la fermentacin malolctica al mismo tiempo que la alcohlica, ambos procesos no pueden desacoplarse, ni interrumpirse de forma independiente, y ello significa que o bien el cido mlico se degrada siempre completamente, o se interrumpe la fermentacin alcohlica. Sistemas de tipificacin Finalmente, en cuanto a los sistemas moleculares que se han empleado en la especie Oenococcus oeni, merece la pena indicar el desarrollo de sistemas de identificacin o de tipificacin para esta especie, y un buen ejemplo lo tenemos en un artculo de A. Bordons et al. en este mismo nmero de la revista. Muchas tcnicas se han desarrollado para ello, entre las que indicamos los RAPD (amplificacin aleatoria de DNA polimrfico), RFLP-PFGE (polimorfismo en la longitud de los fragmentos de amplificacin analizado por electroforesis en campo pulsante), 16S-ARDRA (anlisis de restriccin del DNA ribosmico 16S amplificado), FISH (hibridacin in situ con fluorescencia), etc. La mayora de ellas parecen indicar que la diversidad intraespecfica de O. oeni es baja, aunque hay indicios que podran sugerir la existencia de dos subespecies. Tambin se ha intentado relacionar datos de tcnicas moleculares con propiedades tecnolgicas u orgenes geogrficos de las cepas aisladas. Por el momento, la informacin que han obtenido distintos grupos de investigacin es no slo parcial, sino incluso contradictoria, por lo que es necesario profundizar ms y con herramientas mejores y ms potentes que las empleadas hasta el momento. En conclusin, queda por conocer lo ms interesante en la gentica de Oenococcus oeni. Pensemos que nos hallamos al inicio del camino, y hasta el momento no se han descrito apenas manipulaciones genticas en esta especie. Cuando podamos realmente controlar la gentica de este organismo, podremos plantear conocer mejor fisiolgicamente esta bacteria e incidir en sus propiedades tecnolgicas. Ello, sin duda, nos permitir trabajar con cepas mejores, ms resistentes, ms seguras, ms rpidas, y con propiedades mejoradas respecto a las actuales. Gram +, catalasa -, no esporuladas, no mviles Divisin por biparticin Microaerfilas o anaerobias facultativas y fermentadoras de azcares Morfologa: cocos y bacilos Segn el metabolismo de la glucosa pueden ser: -Homofermentativas- c. Lctico -Heterofermentativas-c. Lctico, actico, CO2, etanol, acetaldehdo, acetona, diacetilo, etc Responsables de la fermentacin malolctica Bajo ciertas condiciones pueden causar alteraciones Metabolismo de aminocidos-origina sustancias peligrosas para la salud

Origen Uva Material de bodega Inculo (Cultivos iniciadores de Oenococcus oeni. Se trata de cultivos puros o mezclas de 2-3 cepas) Evolucin durante la fermentacin En uva- poblacin muy baja Mosto- 10 -10 UCF/ml. Disminuyen por proliferacin de las levaduras durante la fermentacin alcohlica Fase final Empieza a aumentar la poblacin de bacterias lcticas (lisis de las levaduras), desaparecen los bacilos homofermentativos, luego los heterofermentativos y acaba predominando O. oeni, mejor adaptado a las condiciones de bajo pH y elevada concentracin de etanol La fermentacin malolctica se inicia cuando las UFC/ml= 6 10
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Repercusiones en el vino Desadificacin biolgica del vino Disminuye la acidez total y el mlico (sabor astringente) Aumenta el cido lctico (suavidad) Protege al vino de las enfermedades por bacterias lcticas Otras: Produccin de diacetilo (aroma a mantequilla) A bajas concentraciones bouquet

A elevadas concentraciones rancio Factores que influyen en la fermentacin malolctica Caractersticas de la variedad (relacin tartrico/mlico), residuo fitosanitarios pH del medio (Actan mejor a pH> 3.5; T ptima 4.2-4.5). El pH condiciona el crecimiento bacteriano y los sustratos que van a metabolizar (*enfermedades del vino). A mayor pH mayor facilidad para que se desarrolle la FML pero tambin mayor peligro de que aparezcan enfermedades. temperatura (19-25) Aireacin (la presencia de una pequea proporcin de O2 es favorable) Etanol (< 13%) SO2 (no superior a 50 mg/L) Prcticas de vinificacin (El tiempo de contacto del vino con los hollejos, contacto con las las, trasiegos, etc. determina n la poblacin de bacterias lcticas al final de la fermentacin alcohlica) Interaccin de las bacterias con otros microorganismos Aplicacin de la fermentacin malolctica En tintos: Mejora gustativa, Color menos rojo vivo, Aroma evolucionado (menos a uva y ms a vinosidad) En blancos Puede ser deseable: Repercute en el equilibrio grado/acidez, Disminuye la sensacin de dureza y verdor, Peligroso en vino dulce

Aislamiento e identificacin de bacterias lcticas AISLAMIENTO Medios de Cultivo 9AGB (acidic grape broth, pH4,8) (O. oeni) 9MRS

 Incubacin en estufa de anaerobiosis Temperatura y tiempo de incubacin. 30 durante 48 h Pruebas de Identificacin Gram + Morfologa (coco o bacilo) Homofermentativa heterofermentativa Fermentacin de azcares Crecimiento en condiciones de pH, T Tcnicas moleculares PCR especfica (primers del gen-enzima malolctica) (O. oeni) determinadas o

http://www.medioruralemar.xunta.es/fileadmin/arquivos/investigacion/transferencia_tecnoloxica/calidademb.pdf
El pH del vino es un factor fuertemente selectivo y generalmente por debajo de un pH de 3,5 slo las cepas de la especie Oenococcus oeni son capaces de sobrevivir y de expresar una actividad malolctica eficaz, mientras que en vinos con pH superior a este valor tambin otras especies de los gneros Lactobacillus y Pediococcus tienen la posibilidad de llevar a cabo la Fml. Oenococcus oeni es por tanto la especie que mejor se adapta a las difciles condiciones enolgicas y la que normalmente se encuentra presente en los cultivos iniciadores malolcticos presentes en el mercado, aunque ya en el pasado algunas especies de Lactobacillus demostraron una alentadora supervivencia en el vino (Davis et al., 1988; Krieger, 1989, lonvaud-Funel, 1999, Fumi 2009).

http://www.lallemandwine.com/IMG/pdf_V22_ESP.pdf TINCIN DIFERENCIAL DE GRAM

La tincin diferencial requiere ms de un tipo de colorante y se utiliza para distinguir entre varios tipos de clulas bacterianas. Una tincin diferencial tpicamente consiste de tres pasos principales: primero un colorante primario, el cual se utiliza para teir a todas las clulas en la tincin; enseguida un paso de decoloracin, el cual remueve el colorante solo de ciertos tipos de clulas y finalmente un colorante de contraste, el cual tie las clulas recin decoloradas pero no tiene efecto sobre las clulas que an retienen el colorante primario. La tincin propuesta por el mdico dans Christian Gram en 1884, es una de las tinciones diferenciales ms utilizadas en bacteriologa, que clasifica los cultivos bacterianos de menos de 24 horas en Gram positivas y Gram negativas. La reaccin de la tincin de Gram se basa en la cantidad de peptidoglucano que se encuentra en las paredes celulares de estas bacterias. Las bacterias Gram positivas tienen muchas capas de peptidoglucano, las cuales a su vez, sostienen molculas de cido teicoco. El cido teicoico reacciona con el cristal violeta y el yodo utilizado en este proceso de tincin. Un complejo de las molculas cristal violeta-yodo-cido teicoico es muy difcil de remover. Como la pared celular de las clulas Gram positivas retiene estos compuestos, es ms difcil decolorar una clula Gram positiva que una Gram negativa. Una mezcla de alcohol remueve el cristal violeta de la clula Gram negativa, pero no de la Gram positiva. Esta mezcla de alcohol tambin disuelve mucho de la capa exterior de lipopolosacrido de la pared celular de la pared Gram negativa, lo cual acelera la remocin del colorante primario cristal violeta de estas clulas.

Cuando otro colorante, usualmente safranina, se aade, las clulas Gram positivas siguen de color azul-violeta mientras que las Gram negativas absorben el color rojizo de la safranina. Al final del procedimiento de tincin, las clulas Gram positivas sern del color del cristal violeta, o colorante primario, y las clulas Gram negativas sern del color de la safranina que es el colorante de contraste. PROCEDIMIENTO: 1. Marcar un portaobjetos con el nombre del microorganismo a observar. Cada equipo deber hacer obligatoriamente cinco preparaciones (una preparacin por persona): una de E. coli, una de Bacillus sp., una de Serratia marcescens, una de Klebsiella pneumoniae y alguna de Pseudomonas. 2. Elaborar preparaciones fijas de las bacterias a observar. 3. Aadir 1 2 gotas de cristal violeta a la preparacin, hasta que se cubra por completo. Dejar actuar el colorante durante 1 minuto. 4. Una vez transcurrido el tiempo, lavar la preparacin con la pzeta sobre el recipiente de plstico para tinciones. 5. Agregar 1 2 gotas de solucin lugol a la preparacin, y dejar actuar 1 minuto. Transcurrido el tiempo, lava. 6. Con cuidado, aadir gota a gota el alcohol-acetona lavando la preparacin durante 10 segundos. 7. Aadir el colorante de contraste, safranina (1 2 gotas) y dejar actuar durante 30 segundos. Lava con la pizeta 8. Dejar secar al aire y observar al microscopio, siguiendo la tcnica de la prctica anterior para enfocar correctamente. Observar con el objetivo de inmersin. LA TINCION DE GRAM ES UNA TECNICA DIFERENCIAL COMUNMENTE EMPLEADA EN EL DIAGNOSTICO, FUE DESCUBIERTA POR HANS CHRISTIAN GRAM EN 1884 LOS REACTIVOS EMLEADOS EN LA TINCION DE GRAM SON EL CRISTAL VIOLETA (COLORANTE BASICO), LUGOL (MORDIENTE), ALCOHOL-CETONA (DECOLORANTE) Y SAFRANINA (COLORANTE DE CONTRASTE) EL CRISTAL VIOLETA SIRVE COMO COLORANTE BASICO UNIENDOSE A LA PARED CELULAR BACTERIANA, CON AYUDA DEL MORDIENTE (LUGOL) QUE REFUERZA A LA UNION DEL COLORANTE. LAS BACTERIAS GRAM POSITIVAS, DEBIDO A LA ESTRUCTURA Y COMPOSICIN qumica DE SU PARED CELULAR TIENEN EN EL COMPLEJO CRISTAL VIOLETA-LUGOL Y AUN DESPUES DEL TRATAMIENTO CON EL DECOLORANTE CONSERVA EL COLORANTE BASICO, POR LO QUE SE OBSERVAN DE COLOR PURPURA VIOLETA AL MICROSCOPIO. LAS BACTERIAS GRAN NEGATIVAS PIERDEN EL COLORANTE BASICO CUANDO SON TRATADOS CON EL DECOLORANTE DEBIDO A QUE EL ALCOHOL DISUELVE EL CONTENIDO LIPIDICO DE LA PARED CELULAR (LO QUE AUMENTA LA PERMEABILIDAD CELULAR), DANDO COMO RESULTADO LA PERDIDA DEL COMPLEJO CRISTALVIOLETA-LUGOL. LAS BACTERIAS DECOLORADAS CAPTAN ENTONCES EL COLORANTE DE CONTRASTE, RAZON POR LA CUAL ESTAS BACTERIAS SE OBSERVAN DE COLOR ROJO AL MICROSCOPIO

Materiales: Mechero de Bunsen Asa bacteriolgica Portaobjetos Varillas de vidrio (soporte) Piceta Gasas Reactivos: Cristal violeta Solucin de lugol

Alcohol acetona Safranina Aceite de inmersin TECNICA Limpiar el portaobjetos con gasas y encender el mechero. Colocar una gota de solucin salina sobre el portaobjetos y luego esterilizar el asa bacteriolgica. Tomar una pequea muestra de la cepa y diluirla en el portaobjetos. Posteriormente esterilizar el asa. Fijar la muestra al calor flamendola en el mechero (UTILIZAR PINZAS PARA TUBO), cuidando no quemar la muestra. TINCION Cubrir la muestra con cristal violeta. Esperar que transcurra 1 minuto. Escurrir y enjuagar. Cubrir la muestra con solucin de lugoly esperar que transcurra 1 minuto.Escurrir y enjuagar. Cubrir la muestra con alcohol cetona. Esperar que transcurran 5 segundos. Escurrir y enjuagar. Cubrir la muestra con safranina, y esperar que transcurra 1 minuto.Escurrir y enjuagar. Dejar secar la muestra. Agregar una gota de aceite de inmersin y observar en el microscopio a 100x. LA TECNICA DE TINCION TIENE COMO FINALIDAD CREAR UN CONTRASTE ENTRE LA CELULA Y EL MEDIO QUE LA RODEA, Y UNA DE LAS MAS IMPORTANTES, TANTO POR SU APLICACIN CLINICA PARA HACER UNA IDENTIFICACION PRELIMINAR DE LA BACTERIA, ES LA TINCION DE GRAM. ES POR ESO QUE ESTA TECNICA SE VUELVE FUNDAMENTAL EN EL ESTUDIO DE LA MICROBIOLOGIA, Y EL CONOCIMIENTO DE SU CORRECTA RALIZACION PRACTICAMENTE OBLIGATIORIO PARA TODO AQUEL QUE SE ENCUENTRA EN EL APRENDIZAJE DE LAS CIENCIAS MEDICAS.
MICROBIOLOGIA GENERAL

Segun la forma, todas las bacterias pueden reducirse, salvo escasas excepciones, a una esfera, un cilindro 0 un cilindro curvado. Como formas bsicas hay que distinguir entre cocos y bacilos rectos 0 curvados (Fig. 2.6). Como bacilos rectos aparecen al microscopio los miembros de los generos Pseudomonas y Bacillus. Los espirilos tienen la forma de una espiral o helicoidal. Se llama Vibrio a un bacilo curvado. Algunas modificaciones de estas formas basicas son caractensticas para algunas bacterias. La forma de maza y la tendencia a cambiar de forma es caracterfstica del genero Corynebacterium y de las bacterias corineformes. En muchas especies del genero Mycobacterium se presentan ramificaciones incipientes de la celula. Los estreptomicetos Began a formar incluso un micelio, semejante al de los hongos, pero se diferencia de estos por el menor dimetro eelular 1 /lm frente a> 5 /lm).

BROCK BIOLOGIA DE LOS MICROORGANISMOS (PAG 398, PDF 419)

MICROBIOLOGIA GRAL. (PAG 110 PDF) La pared celular de las bacterias Gram positivas. En las bacterias Gram positivas la red de murefna sllpone del 30 al 70% del peso seco de la pared cellllar (40 capas de grosar). En Illgar de acido meso-diaminopimelico es frecuente la presencia de acido LL-diaminopimelico 0 de lisina. En Staphylococcus aureus las cadenas tetrapeptidicas del acido mllramico estan unidas por cadenas interpeptfdicas (p. ej. cadenas de pentaglicina). Los aminmicidos implicados varfan de una especie a otra. La constitucin del esqueleto es caracterfstica de la especie y constituye una buena caracterfstica taxonomica. En la pared celular de las bacterias Gram positivas los polisacaridos, en el casu de que los haya, estan unidos par enlaces covalentes. EI contenido proteico es bajo. Con frecuencia se encuentran acidos teicoicos; son cadenas de moleculas de glicerina 0 ribitol esterificadas entre sf par puentes fosfato. Los acidos teicoicos se I.!nen probablemente a la murefna a traves del fosfato farmando una amida. La pared celular de las bacterias Gram negativas. En las bacterias Gram negativas la red de murefna presenta una sola capa (Fig. 2.25) Y supone menos del 10% del peso seco de la pared celular (en Escherichia coli B). La murefna contiene siempre unicamente meso-diaminopimelico y nunca lisina, y no se encuentran puentes interpeptfdicos. La constitucion del saco de murefna es igual en todas las bacterias Gram negativas. Junto a este esqueleto se encuentran grandes cantidades de lipoprotefnas, lipopolisacaridos y otros lfpidos, que parecen estar pegados a la estructura de murefna. Estan unidos covalentemente y representan hasta el 80% del peso seco de la pared celular. Parece ser que para mantener la estabilidad de la capa de lipopolisacaridos es imprescindible el ion Ca2+. En muchas

bacterias Gram negativas la capa de murefna se hace accesible al enzima liso;:ill1(/ que la destruye, cuando se han tratado con EDTA para eliminar los iones Cac+. Este agente ljUehlllte libera una parte de los lipopolisacaridos. Hasta ahora no han podido demostrarse acidos teicoicos. 1. Cocos, bacterias esferoidales A) Cocos Gram positivos aerobicos Micrococcus, Staphylococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus anaerobicos Peptococcus, Peptostreptococcus, Ruminococcus, Sarcina B) Cocos Gram negativos aerobicos Neisseria, Moraxella. Acinetobacter Paracoccus, Lampropedia anaerobicos Veillonella, Acidaminococcus. Megasphaera Entre los cocos Gram positivos en sentido amplio se cuentan las bacterias cocoidales del acido lactico (Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus; pag. 302). Estas s610 pueden obtener energia por fermentaci6n, no contienen pigmentos heminicos (con excepciones), y son microaerotolerantes. Frente a estos se encuentran los generos aer6bicos y anaer6bicos facultativos Micrococcus y Staphylococcus, asf como los generos anaerobicos estrictos Sarcina, Peptococcus, Peptostreptococcus y Ruminococcus. AI genero Micrococcus pertenecen las bacterias pigmentadas cuyas col9nias amarillas 0 anaranjadas aparecen frecuentemente en las pladls expuestas al aire (pag. 84 y sig.). Debido a la farmaci6n de paquetes de celulas tetradas) se las incluy6 en el genero Sarcina. Actualmente se ha reunido a Sarcina lutea, S. flava, y S. aurantiaca, entre otras. En Micrococcus luteus. Tambien se encuentra entre ellos la especie Micrococcus lysodeikticus, as! denominada por A. FLEMING debido a su elevada sensibilidad frente a la lisozima. Micrococcus es aer6bico y se caracteriza por un contenido elevado en GC (66-72%). Bacilos Gram positivos no esporulados Las bacterias Gram positivas no formadoras de esporas capaces de crecer en presencia de oxfgeno y que forman principalmente acido lactico en la fermentaci6n de los hidratos de carbono (glucosa, lactosa), se reunen bajo la denominaci6n de "bacterias del acido lactico". A elias pertenecen los generos Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Streptococcus, Pediococcus y Bifidobacterium. Esta ultima es una de las pocas bacterias anaer6bicas del acido lactico. Las bacterias del acido lactico se tratan en el apartado 8.2. Todavfa debemos citar otro bacilo Gram positivo aer6bico, Listeria monocytogenes, que apareci6 recientemente como contaminaci6n de queso para untar y que provoca la listeriosis en los consumidores En base a la morfologfa celular y otras caracterfsticas fisiologicas puede ordenarse a las bacterias Gram positivas en una serie. Las bacterias del acido lactico bacilares estan al inicio de esta serie. La mayorfa de las bacterias lacticas son bacilos de apariencia regular. La tendencia a formar celulas ramificadas 0 en forma de maza es en elias muy incipiente. Esta variabilidad morfologica es ya una regia en las bacterias corineformes, a las que pertenecen los Corynebacterium y Arthrobacter. Aun mas manifiesta es la tendencia a la ramificacion en las celulas de las micobacterias. Estas conducen ya a los proactinomicetos, que forman un micelio transitorio. Al final de esta serie se encuentran los actinomicetos. Fermentaci6n lactica y Lactobacteriaceas Las bacterias del acido lactico se reunen en la familia de las Lactobacteriaceas. A pesar de que el grupo morfologicamente se presenta como poco homogeneo, compuesto por bacilos cortos y largos, asi como por cocos, es un grupo relativamente bien caracterizado fisiologicamente. Todos los pertenecientes a el son Gram positivos, no forman esporas (con la excepcin de Sporo/actobacillus inu/inus) y son inmoviles (con excepciones). Para la obtenci6n de energia dependen exclusivamente de los hidratos de carbono y excretan acido lactico (lactato). En contraposicion a las Enterobacteriaceas tambien productoras de lactato estas son fermentadoras obligadas. No contienen heminas (citocromo, cata/asa). A pesar de su ausencia, las Lactobacteriaceas pueden crecer con oxigeno atmosferico; son anaer6bicas pero aerotolerantes; una bacteria que crezca aer6bicamente sin cota/asa es probablemente una bacteria del acido lactico. Requerimientos nutritivos y crecimiento. Otra caracterfstica de las bacterias lacticas es la necesidad de requerimientos nutritivos. Ningun representante es capaz de reproducirse en un medio mineral con glucosa y sales am6nicas. La mayoria necesitan una serie de vitaminas (lactoflavina, tiamina, acido pantotenico, acido nicotinico, acido folico, biotina) y aminoacidos, purinas y pirimidinas. Por ello se cultivan preferentemente sobre medios de cultivo complejos, que contienen cantidades relativamente altas de extracto de levadura, juga de tomate, suero e incluso sangre. Se ha visto sorprendentemente que algunas bacterias del acido lactico (entre otros fermentadares) forman citocromos cuando se desarrollan sobre medios de cultivo que contienen sangre e incluso son capaces de desarrollar una fosforilaci6n

en la cadena respirataria. Par ello, a las bacterias lacticas, 10 que les falta es la capacidad para poder sintetizar la porfirina; si se afiaden parfirinas a los medios de cultivo, algunas bacterias lacticas son capaces de formar los pigmentos con el grupo hemo correspondiente. Hay que considerar, par tanto, a las bacterias del acido lactico como un grupo metabolico que probablemente como consecuencia de su especializaci6n para desarrollarse sobre leche y otros habitats ricos en nutrientes y requerimientos nutritivos. han perdido la capacidad para la sfntesis de muchos metabolitos. Par otra parte, disponen de una capacidad que les falta a la mayarfa de los microorganismos; son capaces de utilizar el azcar de la leche (lactosa). Esta capacidad la comparten con las bacterias intestinales (p. ej. Escherichia coli). La lactosa no se presenta aparentemente en el reino vegetal; la forman los mamfferos y la excretan con la leche, 0 bien la captan mediante la leche. En la utilizaci6n de la lactosa hay que ver por tanto una adaptaci6n a las condiciones ambientales del tracto intestinal de los mamfferos. (MAS INFORMACION PAG 320 PDF) PRUEBA DE CATALASA

Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La principal excepcin es Streptococcus. Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes gneros:

Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+).

Bacillus (+) de Clostridium (-). Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de C.pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) deErysipelothrix (-)

Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse siguiendo dos tcnicas:

1. Mtodo del portaobjetos (recomendado):

Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio. Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo. Observar la formacin inmediata de burbujas (resultado positivo). Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante. Si se invierte el orden del mtodo (extender la colonia sobre el agua oxigenada) pueden producirse falsos positivos.

2. Mtodo del tubo de ensayo:

Agregar 1ml de H2O2 al 3% directamente a un cultivo puro de agar en slant densamente inoculado. Observar la formacin inmediata de burbujas (resultado positivo).

Precauciones: Si se utilizan para esta prueba cultivos procedentes de agar sangre, se debe tener la precaucin de no retirar algo de agar con el asa al retirar la colonia ya que los eritrocitos del medio contienen catalasa y su presencia dar un falso resultado positivo.
http://www.joseacortes.com/microbiologia/pruebasbioq/catalasa.htm La catalasa es una enzima que poseen la mayora de las bacterias aerobias. Descompone el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno. El desprendimiento de burbujas procedentes del oxgeno indica que la prueba es positiva.

Para el correcto desarrollo de la practica sern necesarios los siguientes materiales: portaobjetos, H 2O2 de 10 volumenes cultivos en fase exponencial de bacterias, asas e hilos de siembra, pipetas pasteur 1. Colocar una gota de agua oxigenada sobre un portaobjetos con ayuda de una pipeta Pasteur. 2. Suspender la bacteria. 3. Detectar la formacin de burbujas.

Bacteriologa General: Principios Y Prcticas de Laboratorio