Sunteți pe pagina 1din 44

UNIVERSITATEA DE MEDICIN I FARMACIE CRAIOVA

TEZ DE DOCTORAT (REZUMAT) Determinarea efectului anti-inflammator al Fructoboratului de Calciu, prin evaluarea unor markeri biochimici si a calitatii vietii. Studiu in vitro si in vivo

Conductor tiinific : Prof. Univ. Dr. ANICA DRICU

Doctorand : MD. IULIA DARIA SCOREI

2011

Studiile au fost finanate din proiectele:

Investete n oameni! FONDUL SOCIAL EUROPEAN Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013 Axa Prioritar: 1. Educaia i formarea profesional n sprijinul creterii economice i dezvoltrii societii Domeniul Major de Intervenie: 1.5. Programe doctorale i postdoctorale n sprijinul cercetrii Titlu proiect: "Sprijinirea tinerilor doctoranzi cu frecven prin acordarea de burse doctorale" Cod Proiect: POSDRU/6/1.5/S/8 Beneficiar: Universitatea de Medicin i Farmacie din Craiova

CNMP BUCURESTI, COD PROIECT: 41-063

CUPRINS

PARTEA I: Stadiul actual al cunoasterii CAPITOLUL 1. Borul din dieta umana bazata pe plante 1.1 Introducere 1.2 Aportul de Bor afecteaza sanatatea populatiei 1.3 Borul si metabolismul calciului 1.4 Borul si artrita 1.5 Efectele Borului asupra functiei creierului si performantelor cognitive 1.6 Borul din dieta amplifica efectele benefice ale acizilor grasi omega-3 la animale 1.7 Borul din dieta si riscul de cancer CAPITOLUL 2. Fructoboratul de calciu ca supliment alimentar 2.1 Compozitia moleculara a Fructoboratului de Calciu 2.2 Aportul dietetic al Fructoboratului de Calciu 2.3 Fructoboratul in tesuturi 2.4 Aportul mediu de Fructoborat 2.5 Studiile toxicologice ale Fructoboratului de Calciu CAPITOLUL 3. Fructoboratul de Calciu ca potential medicament 3.1 Activitatea antiinflamatorie a Borului 3.2 Fructoboratul de Calciu si procesele inflamatorii 3.3 Fructoboratul de Calciu si stressul oxidativ 3.4 Fructoboratul de Calciu si osteoporoza 3.5 Fructoboratul de Calciu si osteoartrita si durerea 3.6 Fructoboratul de Calciu si cancerul de san 3.7 Fructoboratul de Calciu si 10BNCT

CAPITOLUL 4. Osteoartrita. Generalitati 4.1. Patogenia artritei degenerative (osteoartritei) 4.2 Semne si simptome in osteoartrita 4.3. Subseturi ale osteoartritei primare

CAPITOLUL 5. Boala cardiaca ischemica si angina pectorala stabila. Generaltati 5.1. Efectele ischemiei. 5.2. Angina pectorala 5.3. Angina pectorala stabila

PARTEA a-II-a: CERECETRI PROPRII 1. OBIECTIVE 1.1 Studiul efectului fructoboratului asupra granulocitelor neutrofilice umane stimulate fMLP in vitro 1.2 Analiza efectului in vitro al tratamentului cu fructoborat asupra poductiei de mediatori ai inflamatiei de catre macrofagele RAW 264.7 stmulate LPS 1.3 Evaluarea efectului fructoboratului asupra inflamatiei sistemice si a markerilor dislipidemici la pacienti de varsta mijlocie, diagnosticati cu osteoartrita primara 1.4 Evaluarea efectului resveratrolului combinat cu fructoborat la pacientii cu Angina Pectorala Stabila 2. MATERIAL I METOD 2.1 Studiile preclinice 2.2 Studiile clinice 2.2.1. Evaluarea efectului Fructoboratului de Calciu asupra inflamatiei sistemice si a markerilor dislipidemici la pacienti de varsta mijlocie, diagnosticati cu osteoartrita primara 2.2.2 Efectele Resveratrolului combinat cu Fructoboratul de Ca la pacientii cu Angina

3. REZULTATE 3.1 Efectele in vitro ale Fructoboratului de Calciu asupra granulocitelor umane 3.2 Efectele in vitro ale Fructoboratului de Calciu asupra productiei de mediatori ai inflamatiei de catre macrofagele RAW 264.7 stimulate LPS 3.3 Evaluarea efectului Fructoboratului de Calciu asupra inflamatiei sistemice si a markerilor dislipidemici la pacienti de varsta mijlocie, diagnosticati cu osteoartrita primara 3.4 Efectele Resveratrolului combinat cu Fructoboratul de Ca la pacientii cu Angina Pectorala Stabila neutrofilice

4. CONCLUZII

STADIUL ACTUAL AL CUNOASTERII CAPITOLUL I. Borul din dieta umana bazata pe plante 1.1 Introducere
Borul (B) este un element nutritional esential pentru cresterea si dezvoltarea normala a plantelor (Warington, 1923). Aportul mediu zilnic de B al adultilor este estimat a fi cuprins intre 1 si 4 mg/zi, depinzand de obiceiurile alimentare (vegetarienii au un aport mai crescut de B) , locatia geografica, si alte surse de expunere la B (Hamilton & Minski, 1973; Hunt & Meacham, 2001; Rainey et al., 1999). Cele mai bogate surse de B sunt nucile, fructele uscate, ierburile aromatice, si vinul, in special vinul rosu. Complexele naturale cu B au fost izolate si caracterizate din floemul tulpinii de telina si din nectarul floral al piersicii ca esteri de acid boric cu fructoza (fructoza-B-fructoza), glucoza(glucoza-B-glucoza) si sorbitolul (sorbitol-B-sorbitol). Acestea reprezinta primele complexe solubile izolate din plante (Hu, Penn, Lebrilla, & Brown, 1997). Traditional, acidul boric si cativa dintre boratii anorganici au fost utilizati pentru suplimentarea cu B. Recent, alte cateva componente care contin B au fost introduse pe piata industriei farmaceutice cu acelasi scop (Miljkovic,

1998). Fructoboratul de calciu (CF) a fost recent demonstrat a avea un efect antioxidant (Scorei, Cimpoiasu, & Iordachescu, 2005), antiiinflamator (Scorei et al., 2007) si activitate anti-tumorala (Scorei et al., 2008).

1.2 Aportul de bor afecteaza sanatatea populatiei


In urma unor studii de metaanaliza, World Health Organization a sugerat ca dozele de B optime ar trebui sa fie cuprinse intre 1-13 mg/zi la oameni (World Health Organization, 1996). Odata cu cresterea cantitatii de B in nutritie apar anumite efecte adverse si poate sa creasca efectele estrogenului (Sheng et al.,2001) si un efect diuretic al B a fost notat in timpul administrari unei doze foarte mari (Tagawa et al.,2000). Efectele toxice ale suplimentarii cu B se refera la fertilitate redusa, scaderea motilitatii spermei si toxicitatea testiculara (Devirian &Volpe, 2003). Concentratiile scazute de B (1.48 ppm bor versus 4-6 ppm nivelul normal) in firul de par au fost asociate cu boala osteoarticulara Kashin-Beck(KBD) din China (Fang, Wu, Hu, and Huang, 2003; Peng, Lingxia, Schrauzer, & Xiong, 2000)

1.3. Borul si metabolismul calciului


Primul studiu care implica B in metabolismul calciului a aratat ca deprivarea de B creste excretia urinara de calciu si magneziu si scade nivelele de 17-beta-estradiol si testosteron la femeile aflate in perioada de postmenopauza (Nielsen, 2004). Efectele B asupra metabolismului calciului, si in special 25-hidroxicolecalciferolului, ar putea sa aiba implicatii pozitive asupra metabolismului osos incluzand un risc redus de osteoporoza (Zittermann,2003).

1.4 Borul si artrita


O dieta saraca in B, a fost asociata cu artrita reumatica (Havercroft &Ward, 1991). O comparatie facuta intre tari in ceea ce priveste incidenta si prevalenta artritei , a ajuns la concluzia ca aparitia artritei este corelata negativ cu nivelul de B din sol si din alimentatie.

1.5 Efectele borului asupra functiei creierului si performantei cognitive


O serie de studii au aratat constant ca deprivarea de B la sobolani si oameni conduce la efecte nedorite asupra electrofiziologiei creierului (Penland, 1998), iar la subiectii umani , conduce la performante cognitive semnificativ mai reduse in indeplinirea sarcinilor, implicand coordonarea ochi-mana, atentia, si memoria pe termen scurt(Penland, 1994, 1998). A fost de asemenea demonstrat ca dietele sarace in bor la oameni sunt asociate cu reducerea dexteritatii manuale, a perceptiei si memoriei pe termen lung(Penland, 1994).

1.6 Borul din dieta amplifica efectele benefice ale acizii grasi omega-3 la animale
In studiile recente de cercetare, oamenii de stiinta au ajuns la concluzia ca beneficiile acizilor grasi omega-3 asupra sanatatii osului pot fi amplificate, daca acesti acizi grasi sunt combinati cu elementul mineral B (Nielsen &Stoecker, 2006). Desi B nu a fost inca clasificat ca un nutrient esential, acest lucru va fi schimbat in curand pe baza rezultatelor studiilor, dovezi care sugereaza ca B joaca multe roluri esentiale in mentinerea santatii scheletului. Studiile ofera sustinere puternica pentru optimizarea aportului de B si acizi grasi omega-3 ca parte dintr-o strategie nutritionala pentru mentinerea oaselor puternice si sanatoase(Gorustovich, Steimetz, Nielsen, & Guglielmotti, 2008a, 2008b).

1.7 B din dieta si riscul de cancer


O dieta saraca in B conduce la un mare numar de probleme generale de sanatate si creste riscul de cancer. Cele mai comune simptome ale deficientei de B include artrita, pierderea memoriei, osteoporoza, bolile degenerative si ale cartilajului , dezechilibre hormonale si o scadere a libidoului(Scorei&Popa, 2010)

Cancerul de plamani.
Mortalitatea datorata cancerului de plamani a atins valori mai inalte pentru barbati decat pentru femei (Espey et al., 2007). O corelatie negativa a fost gasita intre aportul de B si incidenta cancerului de plamani, desi mecanismele subiacente raman neclare(Meacham et al., 2007). Exista corelatii intre cateva subtipuri de cancere de plaman si 17-beta estradiolul, si tratamentul care include Terapia de Substitutie Hormonala bazata pe 17-beta-estradiolul(HRT)( Schabath et al.,2004). Dieta scazuta in B (singura sau impreuna cu HRT) a fost corelata cu o crestere a riscului de cancer de plamani la femei (Mahabir et al.,2008). Reducerea riscului de cancer de plaman ar putea sa implice substraturile de legare a receptorului estrogenic, altul decat estrogenul, incluzand hidrocarburile aromatice policiclice (PAHs) din fumul de tigara condensate(Pike et al.,1999). Femeile cu aport dietetic inalt de B si care utilizeaza HRT ar putea sa prezinte nivele hormonale mai inalte care competitioneaza cu carcinogenii din fumul de tigara pentru receptorii de estrogen. Daca acest model este corect, crescand aportul de B in timpul HRT se va limita de asemenea potentialul carcinogenic al PAHs din fumul de tigara(Mahabir et al., 2008).

Cancerul de prostata.
Riscul de cancer de prostata a fost cu 1/3 mai mic la barbatii care ingereaza mai mult de 1.8 mg B pe zi din alimentatie , comparativ cu cei care au un aport de numai 0.9 mg B/zi. O corelatie relativ inalta(r=0.63) a fost gasita intre concentratia de B din apa si distributia cancerului de prostata in Texas(Barranco et al.,2007). O intelegere mai larga a mecanismelor celulare care implica B au aratat ca acidul boric(BA) inhiba cresterea celulei canceroase prostatice prin scaderea expresiei ciclinei A-E, prin urmare B nu induce moartea celulara(Barranco et al.,2009). Mai mult de atat, celulele tratate cu BA demonstreaza o capacitate diminuata de adeziune si migrare, care indica un potential scazut de metastazare.

Cancerul cervical
Cancerul cervical este al doilea ca si frecventa intre toate cancerele la femei in lumea intreaga(Parkin et al., 1993). Cauza acestei discrepante este inca neclara si poate sa implice o combinatie de factori de mediu, genetici, sociali si infectiosi. De exemplu, papilomavirusul uman(HPV) este o cauza primara de cancer cervical. HPV 16 si HPV 18 sunt responsabile de aproximativ 95% din totalul de cancere cervical. In conformitate cu o ipoteza, incidenta scazuta a cancerului cervical in Turcia se coreleaza cu solul imbogatit cu B. (Sayli et al., 2001; Simsek et al., 2003).Intradevar , ingestia de B din apa de baut previne riscul de cancer cervical(Korkmaz et al.,2007). Acest efect a fost sugerat a fi datorita interferentei B in ciclul de viata al HPVs, dar nici un fel de corelatie nu ar putea sa fie gasita privind incidenta cancerelor orale, care sunt de asemenea induse de catre HPVs.

Cancerul de san
Astazi, cancerul de san este cel mai comun tip de cancer diagnosticat la femei, excluzand cancerele de piele non-melanoma(Greenlee et al.,2000). Etiologia cancerului de san este legata de hormonii endogeni. Riscul de cancer de san la femeile aflate in perioada de premenopauza este direct legata de nivelele circulante ale testosteronului si androstenedione. In concluzie, aportul zilnic dietetic de B la un minim de 10 mg de B per zi scade nivelul estradiol si creste nivelul de testosteron(Naghii et al., 2010). Aceasta reglare asigura o protectie hormon-dependenta impotriva cancerului de san.

Elementele majore in preventia cancerului de san, chemopreventie si chimioterapie cu B include:

1. Pentru preventie, trebuie urmata o dieta bogata in B (in jur de 20 mg de B pe zi) si o balanta adecvata de 4:1 intre omega-6 si omega-3 2. In chemopreventie, BA si CF sunt inamicii principali impotriva cancerului de san. Bazat pe evidente experimentale, BA induce apoptoza atat in celulele de melanoma cat si in celulele de cancer de san MDA231 si inhiba cresterea liniilor de celule de cancer de san, cum ar fi celulele ZR-75-1. CF are efecte inhibitorii asupra celulelor de cancer de san MDA-MB-231. Mai mult de atat, el creste nivelul de calcitriol in sange, ca urmare crescand astfel nivelul de protectie impotriva dezvoltarii cancerului de san. 3. In chemoterapie, Bortezomibul este un nou targhet in terapia canceroasa, fiind aprobat de catre FDA. El demonstreaza activitati anti-proliferative, pro-apoptotice, anti-angiogenice si anti-tumorale in cateva modele de cancer, incluzand cancerul de san.

CAPITOLUL II. Fructoboratul de calciu ca supliment de hrana

2.1 Compozitia moleculara a fructoboratului de calciu


Fructoboratul de Calciu (CF), are compozitia chimica Ca[(C6H10O6)2B]24H2O. Produsul a fost izolat din plante , dar poate sa fie produs si prin sinteza chimica[Milicovich, 1998; Milicovich et al., 2009].
O HO OH O OH HO O O
2

OH Ca 2+

OH

O B

OH

OH O O O B Ca2+ O O OH

HO

HO

OH

Figure 1 Structura chimica a alfa-D-fructofuranozo-boratul de calciu(a) si beta-D-fructofuranozo-boratul de calciu(b) Cercetari stiintifice in vitro asupra CF arata cateva activitati biologice ale CF , proprietati cu potential terapeutic[Scorei si Rotaru, 2011]: anti-inflamatorii, anti-osteoporoza, antioxidante, si antitumorale. CF contracareaza de asemenea efectele distrugatoare ale deficientei de vitamina D, datorita corelatiei intre aportul de CF si nivelele serice de vitamina D3. Alt studiu a aratat imbunatatiri in metabolismul vitaminei D3 dupa suplimentarea cu B[Hunt et al., 1994].

2.2 Aportul dietetic de CF


B este parte din dieta umana normala. Sub conditii fiziologice, si in absenta interactiunii cu bio-molecule, B exista ca acid boric (B(OH)3 ori anionul borat (B(OH)4 ).B este capabil sa interactioneze cu molecule biologic importante, incluzand polizaharide, piridoxina, riboflavin, acidul dehidroascorbic, si nucleotidele piridinice. Se leaga puternic de furanoid cis-diols, care include erithritan, riboza, si apioza; apioza este prezenta de-a lungul peretilor celulari ai plantelor vasculare. Chimia unica a B permite sa reactioneze cu multi alti metaboliti si enzime, si prin urmare, B poate sa fie capabil sa modifice metabolismul mineral si energetic la oameni si la animale.

2.3 Fructoboratul in tesuturi


Se estimeaza ca , continutul total de B in corpul uman variaza de la 3 pana 20 mg, cu cele mai inalte concentratii gasite in oase, unghiile de la maini, unghiile de la picioare, si par(4.3 pana la 17.9 ppm). B se acumuleaza in oase, dar nu si in tesuturile moi.

2.4 Aportul mediu de fructoborat[Scorei si Rotaru, 2011]


Rainey et al. a specificat ca exista variatii foarte largi in aporturile de B in cadrul populatiei adulte din USA, mergand chiar pana la 9 mg/persoana/zi[Rainey et al., 1999]. Aporturile de B au fost estimate ca fiind cuprinse intre 1.17-2.42 mg/zi pentru barbati si 0.96-1.94 mg/zi pentru femei. Academia Nationala de Stiinte/Institutul de Medicina(NAS/IOM) a estimat ca luand in consideratie toate sursele de B, aportul de B trebuie sa fie in jur de 5 mg/persoana/zi.

2.5 Studiile toxicologice ale Fructoboratului


Doza medie letala(LD50) pentru CF este de 18.75 g/kg(0.525 g B elementar) versus 2.6 g/kg pentru acidul boric(0.462 g B elementar), asa cum a fost determinat de Perry scientific Inc. in studiul 00-1066(PSI-JUD-3), din 5 Februarie 2001.

CAPITOLUL III. Fructoboratul de calciu (FC) ca potential medicament 3.1. Activitatea anti-inflamatorie a B
Actiunile anti-inflamatorii ale B au fost atribuite variatelor mecanisme. Acestea includ supresia proteazelor serinice eliberate de catre celulele albe sanguine activate de inflamatie, inhibitia sintezei de leucotriene, reducerea speciilor reactive de oxigen generate in timpul ciclului respirator al neutrofilelor, si supresia activitatii celulei T si a concentratiilor de anticorp[Hunt, 1998].

3.2 CF si procesele antiinflamatorii


Studiile in vitro arata ca CF are efecte profunde asupra celulelor PMN raportate la concentratia lui[Scorei R et al., 2007].Prin urmare, tratamentul cu CF a PMN stimulate de n-formil-metionil-leucil- fenilalanina(f MLP) pentru 24 de ore, a rezultat intr-o scadere a ciclului respirator , intr-o maniera dependenta de doza. Scaderea nivelului speciilor reactive de oxigen (ROS) a fost evidenta chiar cand s-au utilizat doze netoxice( de exemplu scaderea cu 50% cand se utilizeaza 450microM CF), care subliniaza faptul ca CF este un consumator de ion superoxid si poate sa aiba efecte antiinflamatorii. Hunt a propus un rol esential al B ca reglator al ciclului respirator prin supresia serin proteazelor eliberate de leucocitele activate de inflamatie, inhibitia sintezei de leucotriene, reducerea ROS generat in timpul ciclului respirator neutrofilic si supresia activitatii celulei T si a concentratiilor de anticorpi[Hunt, 1998]. Investigatiile efectelor CF, la nivel intracelular ai anionilor superoxid in celulele PMN nestimulate intareste idea unei activitati antioxidante exercitate de catre CF, el fiind un consumator de anioni superoxizi.

3.3 CF si stressul oxidativ


Existe date care sa sustina ipoteza conform careia B dietetic ajuta in controlul procesului inflamator normal servind ca semnal supresiv care subregleaza activitatile enzimatice specific la situsul de inflamatie care sunt tipic crescute in timpul inflamatiei[Ketriz et al., 1997].Studiile realizate pe B au aratat ca boratul protejeaza pielea si faciliteaza vindecarea ranilor profunde prin actiunea sa asupra catorva componente ale matricei extracelulare a tesutului conjunctiv. Exista dovezi care sa sustina ipoteza ca B dietetic ajuta la controlul procesului inflamator normal servind ca un semnal supresiv care subregleaza activitati enzimatice specific la situsul de inflamatie care sunt tipic crescute in timpul inflamatiei.

3.4 CF si Osteoporoza
CF poate sa influenteze densitatea osoasa la animalele cu deficienta de vitamina D . B a fost aratat a imbunatati duritatea osoasa la porci[Amstrong et al., 2001] si sobolani[Dupre et al., 1994]).Rezultatele arata o crestere dependenta de doza in densitatea osoasa asa cum este masurata de testul DEXA. Aceste rezultate sugereaza ca suplimentarea cu B previne o hipocalcemie severa a deficientei de vitamina D3 printr-o cale metabolic alternativa ; inca putin este cunoscut despre asimilarea Ca[Nielsen, 2004].CF a fost de asemenea demonstrat ca, contracareaza efectele daunatoare ale deficientei dietetic de vitamina D.

3.5 CF, Osteoartrita si durerea


Referindu-ne la artrita, os si sanatatea articulara, presupunem ca CF ar putea sa inhibe activitatea enzimei colagenaze. Aceste enzime(colagenazele) sunt generate in mod natural in biochimia umana si catabolizeaza colagenul.Efectul lor la batrani contribuie la flaciditatea pielii, articulatii mai fragile, deteriorare osoasa si vasculara. CF a fost initial considerat a avea un efect benefic asupra metabolismului lipidic [Milicovich et al., 2009] . Intr-un trial clinic recent[WHO, 2010], Scorei si colab. au aratat ca in caz de OA asociat cu dislipidemia, CF ar putea sa asigure un prognostic favorabil pentru bolile cardiovasculare[Scorei et al., 2011]. Ca o consecinta, suplimentarea dietetic cu CF asigura o imbunatatire rapida a calitatii vietii indivizilor suferinzi de OA si dislipidemie. Aportul zilnic pentru preventia osteoporozei si OA este in jur de 3.5 mg B pe zi[Milicovich et al., 2009].

3.6 CF si cancerul de san


CF este un produs natural din plante (poate fi produs si prin sinteza chimica) si este eficient in preventia si tratamentele(ca adjuvant) osteoporozei si osteoartritei. CF a demonstrat efecte inhibitorii asupra celulelor canceroase de san MDA-MB-231 de asemenea si intra in celula(cel mai probabil) printr-un mecanism de co-transport printr-un transportor de zahar[Scorei et al., 2008]. In interiorul celulelor CF actioneaza ca un antioxidant si induce supraexpresia proteinelor legate de apoptoza si a apoptozei. Scorei si colab., intrun studiu recent au demonstrat ca CF si BA au inhibat proliferarea celulelor canceroase de san MDA-MB-231 intr-o maniera dependenta de doza[Scorei et al., 2008].

3.7 Fructoboratul si Terapia de Captare Neutronica 10B(10BNCT)- o viziune pentru viitor


10

BNCT a fost propusa iniial ca un mijloc de a distruge selectiv celulele canceroase, fara a afecta celulele normale
10

[Locher, 1936]. In prezent

BNCT folosete un numr de 10B-compusi care se concentreaz preferenial n celulele tumorale [Rolf et al., 2005] .
10

Zona tumorala este apoi iradiata de un fascicul de neutroni, neutronii interac ionand cu atomul de energetici(particule radioactive alfa) si nuclee de Li, mpreun cu energia cinetic i -radiaii:
7

B i rezulta atomi de Heliu extrem de

10 5

B + 0 n1

[ B] He+ Li + g - radiation.(2.4MeV )
11 5 4 2 7 3

BNCT modern, actual, este o combinatie de chemo si radioterapie si este utilizat in tratamentul glioamelor de grad mare. Pentru ca BNCT sa fie utila therapeutic, chimicale cu 10B- trebuie sa demonstreze cateva proprietati specifice: 1) 2) 3) o buna solubilitate in apa pentru a fi administrat intravenos, toxicitate scazuta, inalta selectivitate pentru celulele tumorale 4) acumulare in concentratii mari in celulele canceroase.

CAPITOLUL 4. Osteoartrita. Generalitati


Osteoartrita este cea mai frecventa afectiune articulara si reprezinta un grup heterogen de conditii patologice cu modificari histopatologice si radiologice comune. Este o boala degenerativa care apare prin distrugerea biochimica a cartilajului articular din articulatiile sinoviale. Desi osteoartrita este considerate a fi consecinta greutatii excesive si a fisurilor cartilajului, modificarile inflamatorii nespecifice secundare afecteaza de asemeni articulatiile. Istoric osteoartrita a fost impartita in primara si secundara.

4.1. Patogenia artritei degenerative (osteoartritei).


Cauzele ,trauma, infectia, si si trauma factori de risc pentru repetitiva artrita factori sunt: virsta genetici, inaintata, istoric obezitatea, de artrita sexul feminin ocupationala inflamatorie

,afectiuni neuromusculare si metabolice. Suprafata articulara normala a articulatiilor sinoviale consta din cartilaj hialin compus din condrocite, inconjurate de matrice extracelulara care include diferite macromolecule, cele mai importante fiind proteoglicanii si colagenul.

4.2 Semne si simptome in osteoartrita:


Osteoartrita primara apare mai ales la nivelul miinii, la articulatiile interfalangiene distale, proximale si primele metacarpofalangiene . De asemeni debutul la unele persoane poate avea loc la articulatia genunchiului, soldului, regiunea cervicala sau lombara joasa. Durerea profunda, sub forma de crampe, articulara la activitatile fizice este primul simptom. De asemeni reducerea miscarilor si crepitantele sunt frecvent prezente. Malaliniamentul articulatiei poate fi vizibil. Se pot palpa osteofitele la articulatiile interfalangiene distale, caracteristice la femei. Modificarile inflamatorii sunt tipic absente sau slab pronuntate.

4.3. Subseturi ale osteoartritei primare


Unele boli sunt categorii sau subseturi ale osteoartritei primare. Acestea include osteoartrita primara generalizata, osteoartrita eroziva inflamatorie si condromalacia petelei.

CAPITOLUL 5 Boala cardiaca ischemica si angina pectorala stabile. Generalitati 5.1. Efectele ischemiei.
Oxigenarea necorespunzatoare indusa de ateroscleroza coronariana poate produce perturbari tranzitorii ale functiilor mecanice, biochimice si electrice ale miocardului. Dezvoltarea brusca a ischemieie severe, asa cum se intampla in ocluzia totala sau subtotala este asociata cu pierderea aproape instantanee a contractiei si relaxarii musculare normale. Perfuzia relativ redusa a subendocardului produce ischemie mai

intensa a acestei portiuni a peretelui. Ischemia unor arii mai largi ale ventriculului va produce insuficienta ventriculara stanga tranzitorie si, daca muschii papilari sunt implicati, insuficienta mitrala poate complica acest eveniment. Atunci cand evenimentele ischemice sunt tranzitorii, ele pot fi asociate cu angina pectorala; daca sunt prelungite, ele pot determina necroza si cicatrizare miocardica cu sau fara tablou clinic de infarct miocardic acut.

5.2. Angina pectorala


Clasificarea Anginei de catre Societatea Canadiana de Boli Cardiovasculare(Braunwald Eet al., 1994): Clasa I - Angina apare doar dupa un efort intens, rapid sau prelungit. Activitatea fizica obisnuita nu provoaca angina Clasa II - Usoara limitare a activitatii zilnice. Angina apare la urcarea rapida a scarilor, urcarea plantelor, mersul dupa masa, in frig, in vant, in conditii de stress emotional. Clasa III - Limitare importanta a activitatii fizice obisnuite. Angina apare dupa parcurgerea unei distante de 1-2 strazi sau dupa urcarea unei scari la viteza normala. Clasa IV-Imposibilitatea de a desfasura o activitate fizica fara discomfort. Simptomele anginei pot sa fie prezente si in repaos

PARTEA a-II-a: CERECETRI PROPRII

I. OBIECTIVE 1.1 Studiul in vitro al efectului fructoboratului asupra granulocitelor neutrofilice umane stimulate fMLP (N-formyl-methionine-leucine-phenylalanine),
n acest studiu preclinic am cercetat aciunea fructoboratului de calciu (FC), care are o structur chimic similar unor forme naturale de B ce se gasesc in plantele comestibile(Hu et al., 1997), asupra unor neutrofile stimulate , n raport cu rolul sau antioxidant (Scorei et al., 2005). FC este un supliment nutritiv pe baza de B, stabil, netoxic, solubil n ap, cunoscut ca si agent care reduce durerea i inflamaia asociata cu osteoartrita, cunoscut de asemenea pentru mbuntirea absorbiei de calciu in metabolism, creterea nivelului de vitamina D, estrogen si testosteron, precum si implicarea sa in metabolismul prostatei i creterea nivelurilor de SOD.

1.2 Analiza efectului in vitro al tratamentului cu fructoboratului asupra poductiei de mediatori ai inflamatiei de catre macrofagele RAW 264.7 stmulate LPS
n acest studiu experimental am examinat efectele FC asupra produciei unor mediatori inflamatori folosind celule macrofage RAW 264.7 de murine stimulate LPS ca si model celular. Astfel au fost evaluate modificrile induse de FC n intervalul de doz de 0,2 - 1 mM la eliberarea de citokine, cum ar fi TNF-, IL-1 i IL-6, nivelul de expresie proteica COX-2 i la producia de NO.

1.3 Evaluarea efectului fructoboratului pilot

asupra inflamatiei sistemice

si a markerilor

dislipidemici la pacienti de varsta mijlocie, diagnosticati cu osteoartrita primara ,un studiu


Multe experimente epidemiologice si controlate, realizate atat pe animale cat i pe oameni au furnizat dovezi pentru utilizarea B ca si tratament sigur si eficace pentru anumite forme de osteoartrita (OA) . Prin examinarea relaiei dintre aportul de B i prevalena OA la nivel mondial, cercetatorii au descoperit c n zonele n care aportul de bor este de 1 mg sau mai putin pe zi, incidenta estimata a artritei este cuprinsa ntre 20 i 70%. n schimb, n zonele n care aportul de B este de obicei de 3-10 mg pe zi, procentul de artrita este mai mic, variind de la zero la doar 10%. Aceasta constatare remarcabila constituie o dovada irefutabila a faptului c aportul abundent de B din dieta poate conferi o protec ie puternic mpotriva dezvoltrii OA. Un studiu analitic a artat c, concentra ia de B este mai mic la capetele femurului, oase i lichidul sinovial al pacienilor cu OA, comparativ cu pacienii fr OA. Mai mult dect att, chirurgii au observat c oasele pacienilor care au folosit suplimentarea cu B au fost mai greu de taiat dect cele ale pacienilor care nu au folosit aceste suplimente . Dovada cea mai convingtoare pentru utilizarea B n cazul pacienilor cu OA provine dintr-un studiu placebo dublu-orb asupra suplimentarii cu B realizat n Australia care raporta ca suplimentarea cu B poate ameliora simptomele pentru persoanele cu OA i artrita reumatoida. Studiile experimentale pe obolanii cu artrita au condus la o ipotez n curs de dezvoltare care sugereaz c B reduce riscul de boli inflamatorii prin reglarea enzimelor raspunsului inflamator i are un efect imunomodulator benefic la obolanii cu artrita . Studii recente s-au concentrat pe asocierea dintre OA primar i dislipidemie (Naghi et al., 2010)]. Mul i cercettori au observat c bolile cardiovasculare (BCV) i OA coexista frecvent la pacieni; n consecin, a fost emisa ipoteza ca boala vasculara poate juca un rol patogen in OA, ac ionand n parte prin intermediul cilor metabolice lipidice . Defini iile pentru dislipidemie, dupa cum sunt definite la instructiunile Programului National pentru Educarea Colesterolului (NCEP), includ colesterolul total (TC) 200 mg/dL, lipoproteinele cu densitate mic (LDL) colesterolul 130 mg/dL, trigliceridele 150 mg/dL, lipoproteinele cu densitate mare (HDL), colesterolul < 40 mg/dL si raportul TC/HDL 6.5. Studii anterioare au demonstrat o asociere ntre evolutia OA, dislipidemie i inflamaie, m surat prin nivelurile markerilor sistemici. Proteina C reactiva (PCR), unul dintre cei mai utili markeri de inflama ie sistemic, a fost recent identificata drept marker al OA cu semnifica ie clinic . Nivelurile PCR sunt in mod moderat ridicate pentru pacientii cu OA, comparativ cu pacientii fara OA . Nivelurile PCR au o mare importanta clinic, cu valori de referin sub 0,5 mg/dl la pacienii cu OA . Nivelurile crescute au fost asociate cu evolutia bolii, precum i cu agravarea clinica, ca si r spuns nespecific la inflamaii i infecii. Fructoboratul de calciu (FC) este folosit ca terapie non-farmacologica recent pentru tratamentul osteoartritei . FC este un complex de calciu, fructoz i B i se g sete n mod natural in fructe, legume, ierburi proaspete i uscate i vin. Aceast form de B nu este numai una sigura, ci i bio-disponibila n comparaie cu alte forme comerciale de B. Formula sa structural este Ca[(C6H10O6)2B]24H2O, identica cu cea a unui produs natural . S-a realizat un studiu pilot accesibil pacientilor, scris de N. Miljkovic si colegii sai de la Clinica de Ortopedie de la Universitatea din Novi Sad, Novi Sad, Iugoslavia. Scopul studiului a fost s investigheze efectele FC asupra simptomelor de OA. Studiul a inclus 20 de pacieni cu forme u oare, medii sau severe ale OA. Dou criterii de evaluare au fost utilizate: WOMAC (Western Ontario McMaster University Osteoarthritis Index) i criteriul Newnham. Dup administrarea FC, rezultatele au fost destul de impresionante; durerea a fost puternic diminuat , rigiditatea articulatiilor a disprut, iar mobilitatea i flexibilitatea au fost mbuntite . Investigaiile noastre anterioare au fost rezumate n dou revieweri care au demonstrat o proprietate anti-inflamatorie a FC pe culturi celulare. n plus, am emis ipoteza ca FC ar putea avea dublu rol, att ca agent anti-inflamatoriu cat si anti-oxidant, cu efect modificator asupra metabolismului lipidic . Acest studiu investigheaz dac FC poate ameliora simptomele OA n subiectii selectati. Oamenii de stiinta au emis ipoteza ca FC poate avea un rol n diminuarea durerii cauzate de inflamaie, rigiditatii articulare i alte tipuri de disconfort asociate cu OA . Deoarece disconfortul cauzat de OA este adesea invariabil in ceea ce priveste inflamarea articulatiilor, acest studiu abordeaza efectul FC asupra nivelurilor markerilor sangvini inflamatorii cum ar fi PCR, fibrinogen (FBR), i asupra coeficientului de sedimentare a eritrocitelor (VSH) i asupra markerilor metabolismului lipidic, deoarece s-a sugerat c borul este implicat n ambele mecanisme . Atunci cnd se analizeaza markerii inflamatori, intervalul de timp de 2 sptmni pentru suplimentarea dietei cu FC, a fost suficient de indelungat pentru a confirma rezultatele noastre anterioare obinute in vitro. Deoarece caracteristic general a efectului placebo are un debut u or ntrziat i o durat relativ scurt (intre 2 si 6 s pt mni dupa cum se citeaza n literatura de specialitate), un interval de timp de dou sptmni a

fost ales pentru acest studiu pentru a observa cu mai mult precizie eficacitatea pe termen scurt a FC. Acest studiu pilot este doar o punte pentru un viitor studiu de cercetare mai complex n ceea ce privete efectele FC asupra simptomelor OA.

1.4 Evaluarea efectului resveratrolului combinat cu fructoborat la pacientii cu Angina Pectorala Stabila, un studiu pilot
Obiectivul acestui studiu pilot a fost determinarea efectelor clinice si biologice ale unei suplimentari a dietei pacientilor cu angina pectorala stabila, timp de 60 de zile cu resveratrol, fructoborat de calciu, ori combinatia lor . Studiul dublu-orb , randomizat, a fost condus pe 3 grupe de subiecti. De-a lungul studiului au fost urmariti : biomarkerii inflamatori(proteina C reactiva inalt senzitiva), markeri ai functionarii ventriculului stang(NT-proBNP) si markerii lipidici(colesterolul total , LDL-colesterolul , HDL-colesterolul, trigliceridele), calitatea vietii evaluata prin angina CCS class, numarul de atacuri anginoase pe saptamana, si chestionarul de angina Seattle.137 de subiecti au fost evaluati, din ei, 87 au fost randomizati in 3 grupuri . Evolutia pacientilor a fost urmarita la 30 de zile si respective 60 de zile de la inceperea studiului . Nu au fost raportate nici un fel de efecte adverse semnificative. Tulburarea cardiaca ischemica aterosclerotica este o problema majora de sanatate a lumii moderne. Ateroscleroza este un process complex, multifactorial. Inflamatia este un factor major in intierea, progresia si complicatiile acute ale placii de ateroscleroza. S-au studiat evaluarile terapeutice ale inflamatiei subclinice implicate in ateroscleroza, si Resveratrolul a fost in central cercetarii. Resveratrolul, un polifenol fitoalexin, are diverse actiuni fiziologice si biochimice, incluzand proprietati estrogenice, antiplachetare si antiinflamatorii.[2]Actiunile biologice ale resveratrolului, care s-ar putea dovedi utile in corectia riscului cardiovascular, sunt in principal legate de efectul sau direct antioxidant prin neutralizarea radicalilor liberi si inhibitia oxidarii LDL. Resveratrolul este un agent antiinflamator potent. El poate sa suprime activarea NFkB care este strans legata de inflamatie si de expresia unor citokine proinflamatorii cum ar fi TNF, IL-1, IL-6, Il-8, ca de asemenea si de factorii intracelulari care mediaza inflamatia cum ar fi iNOS, COX-2, 5-LOX si 15-LOX. Resveratrolul inhiba in vitro activitatea cicloxigenazei si lipooxigenazei. El actioneaza de asemenea ca un antagonist sau agonist estrogenic, depinzand de tipul celular, si de izoforma de receptor estrogenic(ERalfa ori ER beta) precum si de prezenta estrogenului endogen. Efectele biologice ale resveratrolului au fost demonstrate pe culturile celulare la doze inalte, biodisponibilitatea scazuta in vivo limitand rezultatele studiilor pe pacienti. Resveratrolul imbunatateste starea de sanatate a organismului si incetineste progresia bolii in modele variate. Cateva studii au demonstrat ca dietele Mediteraneene, care sunt bogate in resveratrol, sunt asociate cu un risc semnificativ redus de boala cardiovasculara. Resveratrolul a aratat efecte protective cardiovasculare semnificative in modelele de infarct miocardic, hipertensiunea sistemica si pulmonara si diabetul de tip II.Cateva mecanisme cardioprotective au fost identificate incluzand actiunile antioxidante, antiinflamatorii si antifibrotice. Fiecare dintre aceste actiuni este considerata ca are abilitatea sa atenueze patofiziologia remodelarii structurale cardiace care rezulta din infarctul miocardic acut. Atat in modelele cornice cat si in cele acute, resveratrolul atenueaza injuria de reperfuzie ischemica miocardica, ateroscleroza si reduce aritmiile ventriculare(35). Scaderea in biodisponibilitatea in vivo este cauzata de metabolismul rapid si eliminarea si este un mare dezavantaj pentru resveratrol. Studiile recente au aratat o stabilizare a resveratrolului prin compusi naturali ai B Compusii B sunt cunoscuti a avea o varietate de activitati biologice. B exercita actiuni inhibitorii asupra diferitelor enzime , si in particular asupra sintetazelor endoperoxide prostaglandinice COX1 si COX2. Scopul acestui studiu este evaluarea efectelor pe termen scurt ale Resveratrolului combinat cu Fructoboratul de Calciu asupra statusului clinic si biologic la pacientii diagnosticati cu angina pectorala stabila.

2. MATERIAL SI METODA 2.1 Studiile preclinice Reactivi


Fructoboratul de calciu a fost sintetizat n conformitate cu brevetul de inventie al lui Miljkovic. Puritatea FC a fost verificat prin rezonan magnetic nuclear i prin cromatografie lichid de nalt performan iar rezultatele indica o puritate analitic de 99,9%. Toti reactivii utilizati pentru sinteza sa; acidul boric, acetona, CaCO3 i fructoza au fost achiziionati de la Sigma Chemicals, USA. Lipopolysaccharides (LPS) a fost cumparat de asemenea de la aceeasi companie (Sigma Chemicals, USA ) .Anticorpul primar pentru COX-2 a fost achiziionat de la Millipore.

Izolarea neutrofilelor
Proaspetele granulocite neutrofile umane (PMN) au fost obinute de la donatorii sanatosi. Sngele venos a fost recoltat n seringi heparinizate. Celulele PMN au fost separate prin centrifugarea n conformitate cu Boyum (23). Restul de celule roii din snge au fost eliminate prin liza hipotonica. Neutrofilele purificate au fost splate i resuspendate n DMEM iar celulele au fost numrate ntr-un hemocitometru. Analiza morfologic a artat c 90% din celule au fost PMN. Celulele au fost tratate cu fructoborat de calciu (FC), clorur de calciu (CC) i borat de sodiu (SB), n intervalul 450 - 22 500 m M timp de 24 de ore.

Celulele macrophage RAW 264.7


Celulele macrofage RAW 264.7 murine au fost achizitionate de la ATCC (American Type Culture Collection), USA . Celulele au fost cultivate la o densitate iniial de 2,5 x 105 cells/cm2 n placi cu godeuri pentru cultura de tesut , in mediu de cultura Dulbecco Eagle modificat, suplimentat cu ser fetal bovin 10%, antibiotic (100 U / ml de penicilin i 100 g/ml de streptomicin) i meninut ntr-o atmosfer umidifiata cu 5% CO2 la 37 C. Ele au fost activate timp de 24 de ore cu 1 g / ml LPS (Sigma-Aldrich Co), n absena sau prezena continu a FC adaug la mediul de cultur in concentraii de 0,2 mM, 0,45 mM i 1mM.

Testele de viabilitate celulara


Testul de viabilitate al PMN a fost efectuat prin analiza colorimetrca MTT. Colorarea cu tetrazoliu 3-(4, 5-dimetiltiazolil-2)-2, 5bromur de difeniltetrazoliu) este redusa la un produs colorat de activitatea dehidrogenazelor dependente de NADH- i aceasta indic nivelul de metabolism energetic din celule. Celulele PMN au fost tratate n 24 de placi cu godeuri i incubate cu 0,5 ml / godeu al MTT (1 mg / ml) timp de 3 ore la 37 C. Dup acest timp formazanul a fost eliberat din celulele cu dimetilsulfoxid. Viabilitatea celular fost evaluate prin m surarea absorbanei, la 550 nm. Viabilitatea celular a macrofagelor RAW 264.7 a fost evaluat prin expunere la diferite tratamente pentru perioada specificat de timp. Celulele RAW 264.7 au fost incubate cu 1mg/ml solu ie MTT la 37 C timp de 2 ore. Coloratia galbena [3-(4, 5-dimetiltiazol-2-yl)-2, bromur de 5-difeniltetrazoliu] (MTT) este redusa la granule insolubile de formazan violet prin intermediul celulelor active metabolic. Precipitatul de formazan a fost dizolvat n dimetilsulfoxid, iar dup 10 min de agitare lenta, absorbana a fost nregistrat la 550 nm.

Observarea apoptozei in celulele PMN


Celulele apoptotice au fost observate prin intermediul colorarii annexinului V / iodurii de propidium, care permite distincia ntre apoptoza si necroza. Celulele viabile nu leag Annexina V-FITC sau iodura de propidium (PI). Una dintre caracteristicile timpurii in initierea procesului de apoptoza, este deteriorarea membranei celulare, cu translocarea fosfatidil serinei (PS) din interiorul catre exteriorul membranei celulare. Annexina V are afinitate crescuta pentru PS, asociindu-se cu ea in celulele care elibereaza aceasta molecula in procesul incipient al iducerii apoptozei celulare. Celle Viable, care nu au intrat in procesul de apoptoza , au membrana intacta si nu vor permite patrunderea PI in celula. Mai trziu, n timpul procesului apoptotic in vitro, membrana devine poroasa i PI poate sa patrunda in celula, asociindu-se cu ADN-ul din nucleu si este vizibil sub forma de fluorescen roie.

Verificarea ciclurilor respiratorii


Speciile reactive de oxigen(ROS) au fost cuantificate prin m surarea chemiluminescenei luminol dependent la 37 C, Celulele au fost stimulate cu 1 M de formilmetionil-leucil-fenilalanin (fMLP), i generarea de ROS a fost m surat prin integrarea calculelor fotonice timp de 30 de minute dup adugarea agonistilor. Solventul de control, dimetilsulfoxid (DMSO), nu a stimulat producia de ROS.

Testul de superoxid dismutaza (SOD)


Analiza activitii SOD a fost efectuata prin metoda descris de Paoletti i Mocali (24), care const din secvena de reacie pur chimica ce genereaz superoxidul din oxigenul molecular, n prezena EDTA, clorur de mangan (II), i mercaptoetanol. Oxidarea NAD(P)H (urmrita prin diminuarea absorbanei la 340 nm) este legat de disponibilitatea anionilor de superoxid n mediu. Valorile de A340 nregistrate pentru probele cu activitatea SOD vor scdea progresiv, n funcie de cantitatea de enzim din amestecul de analiza. Schimbarea procentului in cadrul activitatii enzimei a fost calculat cu datele de la testul celulelor tratate i de control. Neutrofilele umane au fost tratate timp de 24 de ore cu fructoborat de calciu, spalate cu PBS, resuspendate n PBS i lizate prin sonicare.

Modificrile nivelului de anion superoxid intracellular


Orice modificare a nivelului de anion superoxid intracelular a fost determinat de capacitatea anionului superoxid de a reduce sarurile tetrazoliului nitro-blue (NBT) la depozite intracelulare negru-albastre. Pe scurt, neutrofilele umane au fost incubate cu diferite concentra ii de FC i 0,3 mg / ml NBT. Dup 2 ore, mediul de cultura a fost eliminat iar celulele au fost splate cu solutie salina cu tampon fosfat i lizate astfel nct NBT redus sa se dizolve n tamponul de liz iar absorbana optica a fost masurata la 520 nm folosindu-se un cititor microplac .

Compoziia citotoxicitatii
Linia celulara a macrofagelor de murine RAW 264.7 a fost de obicei crescuta, tratata i evaluata n vederea detectrii scurgerilor de lactat dehidrogenaza (LDH) din citoplasma celulelor deteriorate. Pe scurt, dup 24 ore de tratamente diferite, cu LPS CF, mediile de cultur au fost recuperate i utilizate pentru a masura pierderea de viabilitatea celular i eliberarea de LDH folosindu-se o trusa toxicologica de testare (TOX-7, Sigma-Aldrich Co) in vitro, n conformitate cu instruciunile productorului.

Msurarea nitritului
Nivelurile de nitrit din mediile de cultur au fost determinate folosindu-se reacia Griess. Pe scurt, o cantitate de 50 l de mediu de cultur celular a fost amestecata cu 100 l de reactiv Griess [volume egale de sulfanilamid in procent de 1% (w/v) la acid fosforic in procent de 5% (v/v) i de naftilen-diamina-HCl in procent de 0,1% (w/v)] i incubata la temperatura camerei timp de 10 min. Absorbana a fost apoi masurata la 520 nm. Mediile de cultur proaspete au fost folosite ca proba de control pentru toate experimentele. Nivelurile de nitrii din mostre au fost determinate folosindu-se o curba standard de nitrit de sodiu.

Testul ELISA pe baza de citokine


Nivelurile de TNF-, IL-1 i IL-6 au fost determinate folosindu-se truse ELISA, achiziionate de la Pierce Biotehnologie Inc, cu respectarea instruciunilor productorului. Aceste teste au fost efectuate folosindu-se supernatanul rezultat prin centrifugarea mediilor de cultur colectate la sfr itul timpului de tratare a celulelor.

Western Blotting pentru Expresia proteica COX-2


Celulele au fost tripsinizate, cltite de dou ori cu PBS i apoi lizate prin sonicare. Totalul de celule lizate ce conine 25 g de proteine, dupa cum s-a determinat prin metoda Bradford (12), au fost separate prin electroforez n gel de poliacrilamida in prezenta de sodium dodecil sulfat (SDS-PAGE; poliacrilamid 10%), i apoi transferat pe membranele de nitroceluloz. Pentru detectarea proteinei COX-2 s-a folosit un kit de Imunodetectie cromogenic WesternBreeze Western Blot (Invitrogen).

Metode statistice
Cel puin trei experimente au fost efectuate n trei exemplare pentru fiecare condiie experimental. Datele sunt exprimate ca medie SEM. Diferenele statistice au fost analizate cu ajutorul lui Students t-test sau analiza de varian atunci cnd a fost cazul.

Pentru evaluarea statistic a datelor obinute, s-au efectuat testele de compara ie multiple Bonferroni ANOVA ntr-o singura direcie. Toate valorile sunt exprimate ca mijloace SEM. Analiza statistic a fost realizat cu ajutorul software-ului Prism (GraphPad, San Diego, CA).

2.2. Studiile clinice 2.2.1. Evaluarea efectului fructoboratului de calciu asupra inflamatiei sistemice markerilor dislipidemici la pacienti primara Design de studiu i selecia pacienilor
Studiul a fost placebo controlat , randomizat, dublu-orb, cu patru grupuri de subieci. Recrutarea pacientilor a avut loc din 10 martie 2009 pana la data de 30 august 2009 la Clinica Medicala II a Spitalului de Urgen Craiova, Romnia, cu pacienti alesi din comunitatea locala.

si a

de varsta mijlocie, diagnosticati

cu osteoartrita

Caracteristicile pacieniilor
Numrul total de pacieni nscrii a fost de 116 . Nu toi subiecii nregistrati au fost inclusi n populatia cu intenie de tratament (ITT). Aceast populaie ITT a fost definita drept orice subiect care a primit produsul i care a avut parte de evaluari ulterioare. Patruzeci i patru de persoane care nu au ndeplinit criteriile de includere sau au refuzat s participe nu au fost luate n considerare pentru analiza ITT. Astfel, numrul total de subieci care au fost inclusi in analiza ITT a fost de 72. Acesti 72 de pacienti au fost impartiti in 4 grupe (19 n grupa 1, 18 in grupa 2, 17 n Grupa 3 i 18 n grupul placebo), dar 12 dintre ei nu au respectat protocolul complet.

Tabel 1. Caracteristicile demografice de baza ale pacientilor care au terminat cu success studiul

Grupuri de pacienti Caracteristici Numer de pacienti pe grup Gen(M:F) Varsta medie (SD), ani. Mediul de provenienta (rural: urban) Aportul dietetic de bor zilnic (mg/zi) Borul suplimentat cu CF (mg bor/zi) Pacienti cu dislipidemieb (%), no. Pacienti cu inflamatiec (%), no. Placeboa 15 3:12 67.6 (5.5) 15:0 2.2 (0.7) 0 11 (73.3) 14 (93.3) Grup 1 15 3:12 68.2 (6.6) 15:0 2.1 (0.8) 1.5 14 (93.3) 12 (80) Grup 2 15 7:8 59.8 (8.8) 9:6 1.9 (0.5) 3.0 10 (66.6) 8 (53.3) Grup 3 15 4:11 64.8 (10) 12:3 2.0 (0.4) 6.0 12 (80) 11 (73.3)

a
b c

Placebo i s-a administrat 113 mg fructoza Pacienti cu LDL>130 si Colesterol>200

Pacienti cu CRP>0.5

Criteriile de includere a participantiilor


Au fost inclusi barbati si femei care nu sunt insarcinate ,cu varsta cuprinsa ntre 40 i 85 de ani, cu OA primar la cel puin un genunchi. Acest fapt a fost demonstrat la un examen radiologic, care a fost efectuat n ultimele 3 luni.

Criteriile de excludere a participantiilor


Subiecii cu probleme de digestie, cu febr i/sau sub tratament cu antibiotice, cu intoleran la fructoz i cei care iau orice analgezice i/sau vitamina B6 si aspirina au fost exclu i din studiu.

Vizite de studiu i administrare


Studiul a folosit un supliment alimentar comercial marc FruiteX-B , nregistrat de ctre Compania FutureCeuticals din Statele Unite ale Americii. FruiteX-B a fost dovedit stiintific ca fiind identic cu cele care apar in mod natural pe baza de plante bor-carbohidrati, FC . Cele patru grupuri de subiecti sunt descrise dup cum urmeaz: Grupa 1: 28,5 mg FC (1,5 bor mg / zi) de dou ori pe zi; Grupa 2: 56.5 mg FC (3,0 bor mg / zi) de dou ori pe zi; Grupa 3: 113 mg FC (6,0 bor mg / zi) de dou ori pe zi; Grupa Placebo: 120 mg Placebo de dou ori pe zi. Materialul Placebo s-a bazat doar pe fructoz .

Durata tratamentului a fost de dou s pt mni. Doua capsule pe zi au fost administrate pe cale oral n timpul meselor.

Parametrii biochimici
Parametrii biochimici de baz, cum ar fi profilul lipidic (total, HDL-i colesterolul LDL) i markerii inflamatori (PCR) au fost analizati n ser utiliznd procedurile standard biochimice.

Evaluarea siguranei pacientilor


Trei numere de telefon de urgen au fost date subiectilor pentru a menine contactul n timpul studiului, n cazul n care au avut orice reacii adverse sau alte probleme legate de studiu.

Analizele statistice
FC sau efectul placebo a fost evaluat printr-o analiza bloc randomizata a varianei, cu dou sensuri. Software-ul Microsoft Excel a fost utilizat pentru analiza statistic. Semnificaia statistic a fost definit la nivelul de 95% (p < 0.05). Rezultatele sunt exprimate ca medie devia ii standard (DS).

2.2.2 Efectele Resveratrolului combinat cu Fructoboratul de Ca la pacientii cu Angina Pectorala Stabila Designul de studiu si selectia pacientilor
Studiul a fost randomizat, dublu orb realizat pe 3 grupe de subiecti.Recrutarea pacientilor a avut loc din octombrie 2009 pana in decembrie 2010 la Centrul de Cardiologie Craiova, Romania.

Caracteristicile pacientilor
Numrul total de pacieni inregistrati a fost de 166. Nu toi subiecii inregistrati au fost inclusi n intenia de tratament (ITT). Aceast populaie ITT a fost definita ca fiind toti subiecii care au primit produsul i care au avut parte de o evaluare ulterioara. Cincizeci de persoane nu au ndeplinit criteriile de includere sau au refuzat s participe i ca atare nu au fost luate n considerare pentru analiza ITT. Astfel, numrul total de subieci care au fost inclusi in analiza ITT a fost de 116. Acesti 116 pacieni au fost impartiti in 4 grupe (29 subieci n fiecare grup) i toti au ndeplinit protocol complet. Din numrul total de pacieni inclu i n studiu (n = 166), numai 116 au definitivat perioada de 60 zile de tratament. Tabelul 1 Caracteristicile demografice de baza ale pacientilor care au terminat cu success studiul

Caracteristici Varsta- medie, (SD) Barbat/Femeie Istoric de MI (%) Istoric de PCI ori de CABG (%) Istoric de hipertensiune (%) Istoric de DM (%) Istoric de PAD (%)
mellitus, PAD boala arterial periferica.

Grupul 1 64.9 (5.8) 17/12 41.37 13.79 100 44.82 20.68

Grupul 2 66.3 (5.5) 18/11 41.37 17.24 96.55 41.37 20.68

Grupul 3 63.7 (6.2) 18/11 48.27 13.79 93.1 44.82 17.24

Control 64.2 (7.1) 18/11 44.82 13.79 96.55 41.37 17.24

Legend: SD deviatie standard, MI infarctul miocardic, PCI interventie percutana coronara, CABG by-pass coronarian, DM diabetul

Criteriile de includere ale participantilor


Criteriile de includere au fost: pacientii de sex masculin sau feminin cu varsta peste 18 ani, diagnosticati cu angina pectorala(Clasa II-IV, Societatea Canadiana de Cardiologie), conditie clinica stabila pentru cel putin o luna, aflati pe tratament stabil standard pentru angina pectorala( in luna anterioara studiului.

Criteriile de excludere ale participantilor


Criteriile de excludere au fost: pacienti necooperanti cu incapacitate legala ori incapacitate legala limitata, femei gravide sau care alapteaza, participant aflati in alt studiu in acelasi timp ori in ultimile 30 de zile de la inceperea studiului, cu spitalizare recenta( mai putin de 3 luni) pentru angina instabila, infarct miocardic ori reascularizare coronariana, cunoscuti cu abuz de alcool sau de droguri, cunoscuti cu insuficienta moderata sau severa a ficatului(scorul Child-Pugh >7), ori cunoscuti cu insuficienta renala severa( creatinina serica>220 micromoli/L) ori cunoscuti cu anemie(Hb<11g/L), cunoscuti cu o boala inflamatorie cronica.

Tabelul 2 Terapia concomitenta a pacientilor care au finalizat cu succes studiul( cifrele exprima numarul de pacienti)

Medicatie Betablocant ACEI/ARB Blocant al canalului de calciu Nitrat Statina Alte medicamente care scad nivelul de lipide Antiplachetare Acenocumarol

Grupul 1 27 23 8 12 18 5 23 6

Grupul 2 26 24 10 14 16 7 21 7

Grupul 3 28 22 7 11 21 4 25 4

Control 26 23 5 12 20 6 25 3

Legenda: ACEI - inhibitor al enzimei de conversie a angiotensinei, ARB - blocant al receptorului de angiotensina.

Vizitele de studiu si administrarea


Pacientii au fost randomizati in 3 grupuri de tratament, si medicatia a fost alocata dublu-orb: -Grupul1- pacienti care au primit Resveratrol 20 mg/zi -Grupul 2-pacienti care au primit Resveratrol 20 mg/zi si Fruitex B 112mg/zi - Grupul3- pacienti care au primit Fruitex B 112mg/zi.

Examinarea pacientilor a fost facuta in cadrul a 3 vizite: la includere, la o luna si la 2 luni. Evaluarea pacientilor a inclus: -Examen clinic -EKG cu 12 derivatii -Testele de laborator:HLG complete, sodium, potassium seric, GOT, GPT, glucoza plasmatica, lipidiograma completa, proteina C reactiva cu sensibilitate inalta(hs-CRP), NT-proBNP. -Chestionarul pentru angina Seattle ( numai vizita 1 si 3).

Parametrii biochimici
Parametrii biochimici de baza cum ar fi profilul lipidic( colesterol total, HDL-colesterol si LDL-colesterol, trigliceride) si markeri inflamatori(protein C reactiva inalt sensibila), au fost analizate in serum prin proceduri standard biochimice, utilizand analizatorul automatic Cobas Integra 400 Plus automatic analyzer si kituri(Roche , Switzerland).NT-proBNP a fost determinat utilizand analizatorul Cobas h232 si testele(Roche).

Calitatea vietii
Rezultatele secundare au fost clasa angina CCS asa cum este evaluat de care medic in timpul interviului pacientului, numarul mediu de atacuri anginoase pe saptamana, si scorurile chestionarului Seattle Angina Questionnaire obtinute la includerea in studiu si la finalul celor 60 de zile de vizita. Chestionarele au fost completate de catre pacienti ori cu ajutorul unei rude sau cuiva apropiat.

Evaluarea de siguranta
2 numere de telefon de urgenta au fost date pacientilor pentru a tine legatura pe toata durata studiului, in cazul in care ei ar prezenta vreo un efect advers ori ar avea vreo intrebare in legatura cu studiul.

Analizele statistice
Analizele statistice au fost realizate cu ajutorul SPSS 15.0 pentru Windows. Testul student a fost utilizat pentru a analiza diferentele dintre valorile medii.

5. REZULTATE 3.1 Efectele in vitro ale Fructoboratului de Calciu asupra granulocitelor neutrofilice umane
Tratamentul neutrofilelor polimorfonucleare umane cu doze diferite de FC a fost monitorizat cu microscopie cu contrast de faz (fig. 1).

control

450 mM

3,150 mM

22,500 mM

Fig.1. Aspectul morfologic al celulelor de PMN tratate timp de 24 de ore, cu diferite concentraii de fructoborat de calciu, evaluat prin microscopia optic cu contrast de faz (100) Expunerea de celule PMN la FC are ca rezultat modificri morfologice dependente de doz ale celulelor. Efectele citotoxice cele mai evidente au fost observate la concentraia maxim utilizata in studiu, 22500 m M. Nu s-au observat diferene atunci cnd au fost examinate neutrofilele CC i SB tratate. Am constatat c FC a exercitat cele mai intense efecte citotoxice, ntr-o manier dependent de doz, mai evident la doze ntre 450 m M i 22,500 m M FC. Tabelul 1: Citotoxicitatea de expunere a celulelor PMN (24 h, 37 C), la diferite concentraii de fructoborat de calciu, borat de sodiu i clorur de calciu

Tratament mM Fructoborat de calciu

Absorbanta la 550 nm Borat de sodiu Clorura de calciu

0 450 1,350 2,250 3,150 22,500

0.375 0.003 0.364 0 0.341 0.001 0.304 0.001 0.230 0 0.146 0

0.416 0.004 0.411 0 0.413 0.008 0.404 0.004 0.409 0.004 0.399 0.005

0.385 0.004 0.377 0.003 0.392 0.007 0.389 0.007 0.371 0.002 0.335 0.004

Am observat prezenta unor celule apoptotice n experimentul de control, dup 24 de ore de cultur. Tratamentul celulelor PMN cu 3150 m M FC a indus vacuolizarea citoplasmei, contracia n dimensiune i pierderea integritii membranei celulare, o caracteristic clasica a celulelor necrotice sau tardiv apoptotice. Celulele desprinse si-au pierdut ata amentul fa de substrat i n cele din urm au plutit n mediul de cultur. Rezultatele obinute n studiul nostru sugereaza ca tratamentul cu FC inhib n mod semnificativ generaia speciilor reactive de oxigen (ROS), ntr-o manier dependent de doz. n raport cu experimentul de control, nivelul ROS a sc zut cu 50%, 78,5%, 87,2% i 92,9% ca urmare a tratamentului celulelor PMN cu 450 m M, 1350 m M, 2 250 m M, 3 150 i respectiv 22 500 m M FC. Tratamentul celulelor cu acelea i doze de SB are efecte mai mici inhibitorii asupra ciclului respirator. Astfel, n ceea ce privete controlul, intensitatea ciclurilor respiratorii a celulelor PMN stimulate fMLP a sc zut cu 27,7% i 66,9%, ca urmare a tratamentului celulelor cu borat 450 m M i respectiv 22,500 m M. n concentraii variind de la 450 la 3.150 m M, Ca2+ ionii au artat o influen uoar sau chiar deloc asupra acestei funcii a celulelor PMN. Cu toate acestea, creterea concentraiei de CC pn la 22,500 m M a determinat o scdere a ciclurilor respiratorii cu 53,3%.

3.2 Efectele in vitro ale Fructoboratului de Calciu asupra productiei de mediatori ai inflamatiei de catre macrofagele RAW 264.7 stimulate LPS
ntr-o prim etap, viabilitatea celular dup diferite tratamente a fost studiata folosindu-se att testele MTT cat i LDH. Aa cum se arat la Fig. 1, tratamentul timp de 24 ore cu FC a dus la modificri minore n viabilitatea celular a macrofagelor nestimulate.

Fig. 1. Efectele tratamentului cu FC n intervalul de dozare de 0.2-1 mM asupra viabilitatii celulare a macrofagelor RAW 264.7 nestimulate cat si stimulate (1g/ml LPS). Datele reprezint media SEM din cele patru experimente (fiecare concentraie de FC a fost testata n trei exemplare). *: p<0.05 comparativ cu celulele netratate (NT); **: p<0.01 comparativ cu celulele netratate (NT). Astfel, viabilitatea celular a crescut doar cu 4,2% i 5,2% n cazul tratamentului macrofagelor cu FC 0.2mM i respectiv FC 0.45mM. Dimpotriv, tratamentul cu celule cu 1 mM FC a sc zut viabilitatea celulelor macrofage cu 3,7%. Tratamentul LPS a indus o reducere de aproximativ 11% a viabilitatii celulare. n plus, FC nu a schimbat viabilitatea macrofagelor activate LPS. Pe de alt parte, testul LDH pentru mediul de cultura nu a aratat diferente semnificative ntre macrofagele nestimulate si cele stimulate LPS expuse pn la 1 mM de FC (Fig. 2).

Fig. 2. Evaluarea efectelor citotoxice ale FC asupra liniei celulare de macrofage RAW 264.7 (nestimulate i stimulate cu 1g/ml LPS), prin testul LDH. Datele reprezint media SEM a celor patru experimente (fiecare concentraie de FC a fost testata n trei exemplare). Studiile noastre au dezvluit o inhibare dependent de doz a eliberarii mature de IL-1b cu creterea dozelor de FC. Nivelul de IL-1 indus de LPS a sc zut cu 7% i 27%, dup expunerea la o cantitate de 0,45 mM i, respectiv, 1 mM de FC (Fig. 3).

Fig. 3. Efectele tratamentelor cu dozele de FC in cre tere asupra eliberarii de IL-1b matur prin intermediul macrofagelor RAW 264.7 stimulate LPS. Datele reprezint media SEM a celor patru experimente (fiecare concentraie de FC a fost testata n trei exemplare). **: p<0.01 comparativ cu productia de citokine stimulate LPS; ***: p<0.001 comparativ cu productia de citokine stimulate LPS; : p<0.001 comparativ cu producia de citokine spontana.

3.3. Evaluarea efectului Fructoboratului de Calciu asupra inflamatiei sistemice markerilor dislipidemici la pacienti primara de varsta mijlocie, diagnosticati

si a

cu osteoartrita

Biomarkerii
Pentru Grupul 1 (a se vedea tabelul 2), au existat sc deri semnificative ale nivelurilor de RES pe parcursul intervalului de timp de dou s pt mni fa de valoarea iniial (-10.25%, p < 0.05). n acela i timp, nivelul VSH al grupului placebo a crescut (36.36%, p < 0.05). Tabel 2. Masuratorile variabile ale eficientei markerilor inflamatori din sange pentru grupul ITT dupa 2 saptamani de suplimentare cu CF

Grupuri de pacienti Variabila , masuratoare ESR, pa Baseline, medie (SD) Final, medie (SD) Modificare, (95% CI) % modificare de la nivelul de baza FBR, pa Baseline, medie (SD) Final, medie (SD) modificare, (95% CI) % modificare de la nivelul de baza CRP, pa Baseline, medie (SD) Final, medie(SD) Placebo 0.00058 19.8 (3.2) 27 (4.4) 7.2 36.36 0.04553 365 (20) 380 (19) 15 4.10 0.00540 0.73 (0.12) Grup 1 0.02893 19.5 (3.5) 17.5 (2.7) -2 -10.25 0.00058 364 (10) 314 (14) -50 -13.73 0.02453 0.78 (0.2) 0.31 Grup 2 0.37639 18.5 (6.4) 16.3 (5.9) -2.2 -11.9 0.35822 340 (29) 333 (16) -7 -2.05 0.06964 0.75 (0.2) 0.55 Grup 3 0.07280 18.9 (2,3) 17.3 (3.1) -1.6 -8.5 0.36227 358 (15) 343 (15) -15 -4.18 0.11227 0.57 (0.19)

Modificare, (95% CI) % modificare de la nivelul de baseline

0.77 (0.07) 0.04 5.47

(0.02) -0.47 -60.25

(0.24) -0.2 -26.66

0.47 (0.17) -0.1 -17.54

Semnificatia statistica a baseline

Markeri dislipidemici
n timpul perioadei scurte de studiu, nici trigliceridele si nici colesterolul HDL nu s-au schimbat n mod semnificativ fa de valoarea iniial n toate grupurile (p > 0.05). Constatrile in privinta lipidelor (a se vedea tabelul 3) au fost neconvingatoare in privinta faptului ca borul a avut vreun efect real fiziologic semnificativ asupra dislipidemiei. Chiar si in grupurile 3 i 4 combinate, B nu are vreun efect semnificativ asupra colesterolului sau colesterolui LDL. Numai n Grupul 1, s-a obinut un motiv important i acela a fost din fericire o mica deviaie standard in acest grup. Pe baza a doar dou m surtori (la nceput i la sfr it), variabilitatea a indicat faptul ca grupurile 3 i 4 au o constatare mai previzibila.

Tabel 3.
Masuratorile markerilor dislipidemici sanguine pentru grupul ITT dupa 2 saptamani de suplimentare cu CF

Grupuri de pacienti Variabila, masuratoare Trigliceride , pa Nivel de baza, medie (SD) Final, medie(SD) Modificare, (95% CI) % modificare de la nivelul de baza Colesterol, pa Nivel de baza, medie (SD) Final, medie (SD) Modificare, (95% CI) % modificare de la nivelul de baza Placebo 0.36767 121 (11) 130 (15) 9 7.5 0.16336 222 (13) 234 (10) 12 5.4 Grup 1 0.42201 137 (15) 128 (16) -9 -6.5 0.01378 244 (10) 222 (9) -22 -9.01 Gup 2 0.09214 188 (15) 145 (22) -43 -22.87 0.14875 230 (69) 224 (45) -6 -2.6 Grup 3 0.30010 141 (13) 138 (12) -3 -2.1 0.27139 260 (78) 255 (70) -5 -1.92

HDL-colesterol, pa Nivel de baza, medie (SD) Final, medie (SD) Modificare, (95% CI) % modificare de la nivelul de baza LDL-colesterol, pa Nivel de baza, medie (SD) Final, medie (SD) Modificare, (95% CI) % modificare de la nivelul de baza
a

0.19320 47 (8) 51 (4) 4 8.51 0.10529 150 (9) 160 (8) 10 6.66

0.15895 53 (3) 54 (4) 1 -3.77 0.00555 164 (6) 144 (6) -20 -12.19

0.38799 49 (7) 50 (6) 1 2.04 0.42315 143 (7) 144 (10) 1 0.69

0.11081 55 (11) 58 (13) 3 5.45 0.15522 175 (20) 170 (16) -5 -2.85

Semnificatia statistica de la nivelul de baza

3.4.

Efectele Resveratrolului combinat cu Fructoboratul de Ca la pacientii cu Angina Pectorala Stabila

Proteina C reactiva de nalt sensibilitate


A existat o scdere semnificativ a hs-PCR n toate grupurile, n ambele vizite la zile 30 i 60 de zile (vezi tabelul 3). Aceast sc dere a fost mai mare pentru Grupa 3 (doar fructoborat de calciu sub forma de Fruitex-B), urmat de grupul 2 care a primit resveratrol n asociere cu fructoborat de calciu. S-a observat c, dup 30 de zile Grupul 3 a avut cea mai mare sc dere (22%), urmat de grupul 1 i grupul 2 (aproape nesemnificativa). Dupa 2 luni (60 zile), grupul 2 a depit grupul 1 (30,3% fa de 24,6%), insa grupul 3 a avut n continuare cea mai mare scadere (39,7%). Diferenele fa de valoarea iniial, la fiecare grup, precum i diferenele dintre fiecare grup comparativ cu controlul, au fost semnificative statistic.

Tabelul 3. Evolutia hs-CRP(mg/L) in cele 3 grupuri

La includere Grupul 1 6.9 2.5

Luna 1 5.7 1.9 (-17.3%)

Luna 2 5.2 1.7 (-24.6%)

pa trend 0.040

Grupul 2 Grupul 3 Control

6.6 2.6 6.8 1.9 6.6 2.4

6.2 2.5 (-6%) 5.3 2.5 (-22%) 6.2 2.1 (-6%)

4.6 1.8 (-30.3%) 4.1 1.5 (-39.7%) 5.9 2.6 (-10.6%)

0.030 0.007 -

Comparativ cu grupul de control Tabelul 4 prezint evoluia NT-proBNP n cele trei grupuri. NT-proBNP a fost redus n mod semnificativ de resveratrol (Grupul 1) (cu

NT-proBNP 59,7% la 60 de zile) i de fructoboratul de calciu (Grupul 3) (cu 52,6% la 60 de zile). Asocierea lor a fost cea mai eficienta (Grupul 2), inducnd o scdere de 65,5% (p = 0,04, comparativ cu controlul). Trendul descendent pentru grupul 2 este cel mai mare, dup prima lun i la sfritul studiului (dup 60 de zile). Tabel 4 Evolutia NT-proBNP (pg/mL)

Includere Grupul 1 Grupul 2 Grupul 3 Control 674 192 662 238 684 151 671 218

Luna 1 552 232 (-18.1%) 498 147 (-24.7%) 531 165 (-22.3%) 582 197 (-13.2%)

Luna 2 271 137 (-59.7%) 228 84 (-65.5%) 324 102 (-52.6%) 514 207 (-23.3%)

pa trend 0.03 0.04 0.01 -

Comparativ cu grupul de control

Markeri lipidici
Profilul lipidic (vezi tabelul 5) a avut o evolu ie favorabil, n toate grupurile. Colesterolul total, colesterol LDL i trigliceridele au sczut, n timp ce colesterolul HDL a crescut. Acest efect a fost semnificativ statistic mai ales pentru Grupul 3 (numai fructoboratul de calciu). Cu toate acestea, rezultatele obinute nu au fost n ntregime concludente. Modificaril markerilor lipidici sunt sub 10%. Merit s menion m c n timpul studiului toi pacienii au continuat tratamentul cu statine urmat de ei, medicamentul utilizat pentru scderea nivelului de colesterol. Acest medicament ar fi putut avea o influen asupra rezultatelor obinute. Dei Grupul 3 pare a fi avut cele mai bune valori, conine numr de subiecti care au primit statina. Nu au existat reacii adverse raportate.

cel mai mare

Tabelul 5. Evolutia profilului lipidic(mg/dl)

Includere Colesterolul total Grup 1 Grup 2 Grup 3 Control LDL colesterolul Grup 1 Grup 2 Grup 3 Control HDL colesterolul Grup 1 Grup 2 Grup 3 Control 53.2 25 52.3 45 50.1 20 51.8 23 123.2 63 118.5 57 122.6 46 121.2 61 176.5 89 167.5 95 172.5 75 169.4 85

Luna 1 171.1 97 165.2 89 166.8 77 166.3 91

Luna 2 164.3 79 (-6.9%) 163.7 71 (-2.2%) 162.2 69 (-5.9%) 164.8 82 (-2.7%)

pa trend 0.04 ns 0.03 -

118.4 59 115.2 54 115.1 49 118.7 57

115.3 57 (-6.4%) 113.2 56 (-4.4%) 111.2 55 (-9.2%) 116.6 52 (-3.7)

0.03 ns 0.02 -

52.8 27 51.9 27 51.3 23 51.2 32

54.1 33 (1.6%) 52.8 35 (0.9%) 52.7 26 (5.1%) 51.6 29

ns ns 0.04 -

(-0.3%) Trigliceride Grup 1 Grup 2 Grup 3 Control 134.1 64 127.1 72 137.6 54 132.4 69 131.2 72 127.8 67 135.8 62 130.4 81 128.8 58 (-3.9%) 125.7 68 (-1.1%) 132.7 64 (-3.5%) 129.8 72 (-1.9%)
a

0.04 ns 0.04 -

Comparativ cu grupul de control

Calitatea vietii
A existat o imbunatatire a calitatii vietii pacientilor pentru toate grupurile. Tabelele 6, 7 i 8 reflect sc derea n mod semnificativ a numrului de episoade de angina pe sptmn i ale consumului de nitroglicerin, creterea scorurilor SAQ i mbuntirea n clasa anginei la toate grupurile. Tabelul 6. Numarul de episoade de angina si consumul de nitroglicerina pe saptamana

Includere Episoade anginoase/saptamana Grup 1 Grup 2 Grup 3 Control 4.2 4.4 4.5 4.2

Luna 1 3.3 3.2 3.5 3.8

Luna 2 2.1 (-50%) 1.8 (-59%) 2.3 (-48.8%) 3.2 (-23.8%)

pa trend 0.030 0.003 0.040 -

Consumul de nitroglicerina (tablete ori pufuri/saptamana) Grup 1 3.2 2.3 1.4 0.009

(-56.2%) Grup 2 Grup 3 Control 3.4 3.1 3.4 2.1 2.4 2.8 1.1 (-67.6%) 1.4 (-54.8%) 2.4 (-29.4%)
a

0.004 0.010 -

Comparativ cu grupul de control

Tabelul 7. Rezultatele Seattle Angina Questionnaire

Grup 1 Baseline Limitarea miscarilor Stabilitatea anginei Frecventa anginei Satisfactia la tratament Perceptia bolii Scorul pe scala vizuala p < 0.001, Wilcoxon Signed Ranks 33.4 63.2 52.1 74.5 67.5 78.1 48.6 69.4 46.7 81.2 52.2 Luna 2 64.3

Grup 2 Baseline 50.5 44.2 46.5 68.4 32.1 64.5 Luna 2 66.4 86.5 73.1 81.3 54.4 77.1

Grup 3 Baseline 53.4 47.3 46.8 66.2 34.7 61.8 Luna 2 64.4 82.6 70.2 78.3 55.6 75.6

Control Baseline Luna 2 55.3 49.3 47.2 69.1 34.1 62.4 59.1 61.2 59.4 73.2 41.2 68.1

Table 8 Clasa de angina CCS

Grup 1

Grup 2

Grup 3

Control Luna 2 2 10 16 1

Baseline Luna 2 Baseline Luna 2 Baseline Luna 2 Baseline Clasa I Clasa II Clasa III Clasa IV 0 8 19 2 4 13 10 1 0 9 19 3 5 11 12 1 0 10 17 2 7 13 8 1 0 9 18 2

p < 0.001, Wilcoxon Signed Ranks 4. CONCLUZII GENERALE

1.

Borul este un nutrient esenial pentru anumite organisme, n special plantele vasculare i diatomee. Rolul borului n ciclul de via al plantelor este bine documentat, dar se stiu putine lucruri despre homeostazia si functia borului din celulele animale.

2.

Aciunile borului pot fi corelate cu faptul c acidul boric formeaza diesteri ciclici cu diolii sau polioli corespunztori de la mai multe dintre substanele chimice g site n organism, cum ar fi carbohidrati (zaharuri i polizaharide), nucleotide (cum ar fi adenozin monofosfatul i dinucleotid adenin niacinamida) i vitamine (cum ar fi acidul ascorbic, piridoxina si riboflavina). Esterii cei mai stabili sunt cei n care acidul boric formeaza puntea de legtur ntre dou molecule de carbohidrai, de exemplu, fructoz -bor-fructoz. Astfel de complexe de bor solubile se g sesc n mod natural n seva floemului i in nectarurile din plante. Polizaharidele care conin bor n legturi similare se g sesc n pereii celulelor plantelor, sub form de pectine.

3.

n prezent, dou ipoteze au fost avansate care incearca sa explice funcia biochimica a borului la animale, inclusiv la om. Prima este faptul c borul joac un rol n functiile membranei celulare care influeneaz rspunsul la aciunea hormonilor, semnalizarea transmembranei i miscarii transmembranare a ionilor. S-a demonstrat pe modele animale ca borul influeneaza transportul de calciu extracelular i eliberarea de calciu intracelular n trombocitele activate de trombin. Acesta influeneaz, de asemenea, reactii redox implicate n transportul membranei celulare la plante. O a doua ipotez este c borul actioneaza ca si reglator metabolic n mai multe sisteme enzimatice. Borul poate juca un rol important in reglarea ciclurilor respiratorii, prin mecanismul ce implica formarea speciilor reactive de oxigen, prin care celulele albe din sange distrug microorganismele. Dac borul regleaza intr-adevar ciclurile respiratorii, acesta i asum rolul de antioxidant de noua generatie, prevenind unele dintre daunele colaterale care pot aparea atunci cand speciile reactive de oxigen reacioneaz cu esuturile nconjurtoare.

4.

Studiile noastre in vitro arat c fructoboratul de calciu are efecte marcante asupra celulelor PMN umane in funcie de concentraia lui. Astfel, tratamentul cu FC al PMN cu stimulare fMLP, timp de 24 de ore, a condus la scderea ciclurilor respiratorii, ntr-o manier dependent de doz . Faptul c scderea nivelului ROS are loc chiar n cazul dozelor netoxice de FC (de exemplu, cu 50% n cazul dozei de 450 m M FC) intrete concluzia c FC scade intensitatea puseului respirator deci are un efect anti-inflamator. Aceste date trebuie interpretate innd seama de observaiile anterioare c stimularea neutrofilelor cu fMLP are ca rezultat o eliberare crescut de anion superoxid i o cretere a nivelului apoptozei (32). Este posibil ca FC s inhibe activarea complexului enzimatic NADPH-oxidaza, care reduce n mod direct oxigenul molecular pentru a genera anionul

superoxid, care este ulterior transformat n alti intermediari reactivi. De menionat c aceast actiune este datorat FC si nu ionilor de Ca2+ sau restului borat din compoziia lui. De fapt, Granfeldt et al. (33) au artat c o cretere a [Ca2+] mediata prin legare a fMLF de receptorul sau face parte dintr-o cascada de semnalizare care activeaza oxidaza localizata in membrana plasmatica. La acest moment este dificil de propus un mecanism prin care FC inhib funcia NADPH a oxidazei deoarece acest complex enzimatic legat prin membrana este continut att de membrana integrala cat i de proteinele citosolice si este supus unui control deosebit de complicat. O mai bun nelegere a mecanismelor folosite de fructoboratul de calciu pentru a inhiba oxidaza Investigarea aciunii FC asupra nivelului intracelular al anionilor superoxid n cazul celulelor PMN nestimulate ntrete ideea activitii antioxidante a FC(19) conform creia FC este un saprofit pentru anionii superoxid. 5. Dismutaza superoxid (SOD) protejeaza con inutul PMN mpotriva activitatii oxidante prin distrugerea anionilor superoxid (O2 ), SOD reduce att stresul oxidativ cat i activarea mediatorilor de rspuns inflamator (35). n studiul nostru am pus n eviden faptul c in cazul dozei citotoxice de FC nivelul anionilor superoxid este sc zut datorit creterii activitii SOD. Activitatea scazuta a dismutazei superoxid din celulele PMN poate explica micile discordane intre datele privind nivelul anionilor O2 si activitatea SOD. Aceste date sugereaz c apoptoza celular a celulelor PMN si citotoxicitatea indus de FC nu sunt mediate de eliberare de superoxid. Sunt necesare studii mai ample pentru a determina mecanismul exact de actiune antioxidanta a fructoboratului de calciu, care poate permite o mai bun nelegere a mecanismului acestui supliment nutritiv. 6. Acest studiu a demonstrat ca tratamentul cu FC al macrofagelor RAW 264.7 stimulate LPS a indus o reglare in sens ascendent a nivelului de proteine TNF- n mediul de cultur, nu a produs nicio modificare semnificativ a nivelului expresiei proteice COX2 induse LPS i o scdere a produciei de NO precum i la eliberarea de IL-1 i IL-6. Dei putem trage concluzia c FC ar putea afecta productia de macrofage a mediatorilor inflamatori, aceste studii trebuie s fie completate cu cercetari suplimentare cu scopul de a stabili dac tratamentul cu FC poate fi benefic pentru suprimarea produciei de citokine pro-inflamatorii i pe fondul progresiei maladiilor cauzate de endotoxina. De asemenea, intentionam sa elucidam mecanismul efectelor FC si eficacitatea acestuia ca agent anti-inflamatoriu, comparativ cu medicamentele cu aciune anti-inflamatoare bine stabilita. 7. Trecera la studii clinice privind fructoboratul de calciu a aratat sugereaza ca pe termen scurt suplimentarea FC (numai 15 zile) poate creste calitatea vietii pentru pacientii cu OA, cu un prognostic favorabil pentru stadiile inflamatorii. Importan a acestui studiu este legat de aciunile benefice ale FC asupra inflamaiei sistemic i perturbarii metabolismului lipidic pentru persoanele n vrst care altfel ar putea avea un prognostic nefavorabil n bolile cardiovasculare. Acest studiu prezint rezultatele preliminare care necesit o experimentare ulterioara. O perioad mai lung de suplimentare este necesar pentru a stabili dac FC este un agent anti-inflamator eficient. 8. n ceea ce privete studiu clinic privitor la efectele cuplate ale fructoboratului si resveratrolului, rezultatele au fost semnificative statistic pentru fructoboratul de calciu (Grupul 3) i numai pariale n cazul resveratrolului. n amestec, cei doi compui nu au promovat rezultate bune. Cu toate acestea, tendinele duc la efecte benefice. Tendina observat a fost spre o sc dere a colesterolului total, a colesterolui LDL i a trigliceridelor i o cretere a colesterolului HDL. Schimbrile observate au un procent scazut, sub 10, dar acestea ar putea fi foarte importante pentru c orice scdere, orict de mica ar putea parea, de exemplu, 1 mg de colesterol, va diminua riscul. Pentru date cat mai precise i mai exacte, este necesar o perioad mai lung pentru investigaii. 9. n ceea ce privete inflamaia sistemic m surat prin PCR hs, rezultatele obinute sunt expuse dup cum urmeaz. Ambele substane, resveratrol i fructoboratul de calciu (marca inregistrata Fruitex-B), au un efect benefic, mai ales acesta din urm, cu reducerea semnificativ a nivelului de PCR hs. Problema este c n asociere (resveratrol i Fruitex-B), efectul este mai mic dect strict n cazul fructoboratului de calciu. O explicaie ar putea fi particularitatea grupului 2 de pacieni. Aa cum se observ, la grupul 2 scaderea PCR hs iniiala (dup 30 de zile) este foarte mica, doar 6%, n comparaie cu alte grupuri. Apoi, dup alte 30 de zile, nivelul PCR hs a scazut brusc de la aproximativ 24% (total 30,3% dupa 2 luni). Deci, teoretic, dac am fi continuat studiul pentru nc o lun sau dou, am fi avut curbe separate. 10. Nivelurile crescute de NT-proBNP previzioneaza o mortalitate ridicata in randul pacientilor cu insuficienta cardiaca si sindroame coronariene acute [27]. NT-BNP la pacienii cu insuficien cardiac ischemic este un indicator pentru evolutia bolii pe termen lung, independent de vrst, fracia de ejecie a ventriculului stng i de factorii de risc convenionali. Dup cum s-a menionat, NT-proBNP este un indicator al funciei ventriculare. [28]

11. Conform rezultatelor obinute, sc derea observat este destul de mare (65,5% n grupul 2), dar, n lipsa unui grup placebo, este dificil de prezentat i de asemenea este greu sa avem certitudinea c un tratament de dou luni cu resveratrol i fructoborat de calciu are efecte atat de importante asupra funciei ventriculului stng. Aici efectul este consistent, ceea ce pare a fi un efect sinergic. 12. n ceea ce privete acest studiu, rezultatele au fost semnificative statistic pentru fructoboratul de calciu (Grupul 3) i numai pariale n cazul resveratrolului. n amestec, cei doi compu i nu au promovat rezultate bune. Cu toate acestea, tendinele duc la efecte benefice. Tendina observat a fost spre o sc dere a colesterolului total, a colesterolui LDL i a trigliceridelor i o cretere a colesterolului HDL. Schimbrile observate au un procent scazut, sub 10, dar acestea ar putea fi foarte importante pentru c orice scdere, orict de mica ar putea parea, de exemplu, 1 mg de colesterol, va diminua riscul. Pentru date cat mai precise i mai exacte, este necesar o perioad mai lung pentru investigaii.

BIBLIOGRAFIE1. Amstrong TA, Spears JVV, Crenshaw TD, Nielsen FH. Boron supplementation of a semipurified diet for weanling pigs improves feed efficiency and bone strength characteristics and alters plasma lipid metabolites. J Nutr. 2000;130(10):2575 2581. 2. Armstrong, B. & Doll, R. (1975). Environmental factors and cancer incidence and mortality in different countries with special reference to dietary practices. International Journal of Cancer, Vol. 15, pp. 617625. 3. BarrancoWT, Eckhert CD. Boric acid inhibits human prostate cancer cell proliferation. Cancer Lett. 2004;216(1):2129. 4. Barranco, W.T. & Eckhert, C.D. (2006). Cellular changes in boric acid treated DU145 prostate cancer cells. British Journal of Cancer, Vol. 94, pp. 884- 890. 5. Barranco, W.T.; Hudak, P. & Eckhert, C.D. (2007). Evaluation of ecological and In vitro effects of boron on prostate cancer risk (United States). Cancer Cause Control, Vol. 18, pp. 71-77. 5. Barranco, W.T.; Kim, H.T; Stella Jr., S.L. & Eckhert, C.D. (2009). Boric acid inhibits stored Ca 2+ release in DU-145prostate cancer cells. Cell Biology and Toxicology, Vol. 25, pp. 309-320. 6. Bemd, G.J. & Chang, G.T. (2002). Vitamin D and vitamin D analogs in cancer treatment. Current Drug Targets, Vol. 3, 8594. 7. Bolanos, L, Lukaszewski K, Bonilla I, Blevins D.Why boron? Plant Physiol Biochem. 2004;42:907912.

8 Braunwald E, Mark DB, Jones RH, et al:Unstable Angina: Diagnosis and Management .Clinical Practice Guideline No.10(amended).AHCPR Publication No.94-0602. Rockville, MD, Agency for Health Care Policy and Research and the National Health, Lung and Blood Institute, Public Health Service, U.S. Department of Health and Human Services, 1994). 9. Buras, R.; Schumaker, L.M. & Davoodi, F. (1994). Vitamin D receptors in breast cancer cells. Breast Cancer Research and Treatment, Vol. 31, pp. 191202. 9. Castellsague, X.; Bosch, X.F. & Munoz, N. (2002). Environmental cofactors in

HPV carcinogenesis. Virus Research, Vol. 89, pp. 191-199. 10. Caygill, C.P. & Hill, M.J. (1995). Fish, n-3 fatty acids and human colorectal and breast cancer mortality. European Journal of Cancer Prevention, Vol. 4, No. 4, pp. 329-332. 11. Caygill, C.P.; Charlett, A. & Hill, M.J. (1996). Fat, fish, fish oil and cancer. British Journal of Cancer, Vol. 74, No.1, 159-164. 12. Colston, K.W.; Berger, U. & Coombes, R.C. (1989). Possible role for vitamin D in controlling breast cancer cell proliferation. Lancet, Vol. 1, pp. 185191. 13. Colston, K.W. & Hansen, C.M. (2002). Mechanisms implicated in the growth regulatory effects of vitamin D in breast cancer, Endocrine Related Cancer, Vol. 9, pp. 4559. 14. Coughlin JR, Nielsen FH. Advances in boron essentiality research: symposium summary. In: M Abdulla, M Bost, S Gamon, P Arnaud, and G Chazot (Eds.), New aspects of trace elements research, pp. 3341. London: Smith-Gordon, 1999. 15. Criste RD, Grossu DV, Ciurascu C, Scorei R, Mitrut M. Investigations on the effect of the supplemental Vetabor, boron-enriched protein concentrate, added to broiler diets on breast meat fatty acids profile. In: 17th European symposium on the quality of poultry meat and 11th European symposium on the quality of eggs and egg product, May 2326, 2005, pp. 165169. The Netherlands: Doorwerth, 2005a. 16. Criste RD, Grossu DV, Scorei R, Duca RC, Mitrut M, Ciurascu C. New investigations on the effect of the dietary boron on broilers and layers: boron and food quality. In: 4th international symposium, biology and nutrition of farms animals-towardsintegration in the European research area, Bucharest, Romania, September 30, 2005b. 17. Deckere, E.A. (1999). Possible beneficial effect of fish and fish n-3 polyunsaturated fatty acids in breast and colorectal cancer. European Journal of Cancer Prevention, Vol. 8, No. 3, pp. 213-221. 18. DevirianTA, Volpe SL. The physiological effects of dietary boron. Crit Rev Food Sci Nutr. 2003;43(2):219231. 19. Dimitrakakis, C.; Zava, D.; Marinopoulos, S.; Tsigginou, A.; Antsaklis, A. & Glaser, R. (2010). Low salivary testosterone levels in patients with breast cancer BMC. Cancer, Vol. 10, pp. 547. 20. Dumitru MD, Miljkovic D, Scorei RI et al (2010) FT-IR and Raman spectroscopic analysis of a calcium fructoborate sample. Physics AUC 20:113119 21. Dupre JN, Keenan MJ, Hegsted M, Brudevold AM. Effects of dietary boron in rats fed a vitamin D-deficient diet. Environ Health Perspect. 1994;102(7):5558. 22. Espey, D.K.; Wu, X.C.; Swan, J.; Wiggins, C.; Jim, A.M.; Ward, E.; Wingo, P.A.; Howe, H.L.; Ries, L.A.G.; Miller, B.A.; Jemal, A.; Ahmed, F.; Cobb, N.; Kaur, J.S.; Edwards, B.K. (2007). Annual report to the nation on the status of cancer, 1975-2004, featuring cancer in American indians and Alaska natives. Cancer, Vol. 110, pp. 2119- 2152. 23. Fang W, Wu P, Hu R, Huang Z. Environmental Se-Mo-B deficiency and its possible effects on crops and Keshan-Beck disease (KBD) in the Chousang area, Yao County, Shaanxi Province, China. Environ Geochem Health. 2003;25(2):267 280.

24. Frantzen F, Grimsrud K, Heggli D-E et al (1995) Proteinboronic acid conjugates and their binding to low-molecular--mass cis-diols and glycated hemoglobin. J Chromatogr B Biomed Appl 670:3745 25. Freedman, D. M.; Looker, A. C.; Chang, S.C. & Graubard B. I. (2007). Prospective Study of Serum Vitamin D and Cancer Mortality in the United States. Journal of the National Cancer Institute, Vol. 99, pp. 1594160 26. Gallardo-Williams, M.T.; Maronpot, R.R.; Wine, R.N.; Brunssen, S.H. & Chapin, R.E. (2003). Inhibition of the enzymatic activity of prostatespecific antigen by boric acid and 3-nitrophenyl boronic acid. The Prostate, Vol. 54, pp. 44-49. 27. Gann, P.H.; Hennekens, C.H.; Ma, J.;Longcope, C. & Stampfer, M.J. (1996). Prospective study of sex hormone levels and risk of prostate cancer. Journal of the National Cancer Institute, Vol. 88, pp. 1116-1126. 28. Garland, F.C.; Garland, C.F.;Gorham, E.D. & Young, J.F. (1990). Geographic variation in breast cancer mortality in the United States: a hypothesis involving exposure to solar radiation. Preventive Medicine, Vol. 19, pp. 614622. 29. Garland, C.F.; Garland, F.C. & Gorham, E.D. (2006). The role of vitamin D in cancer prevention. American Journal of Public Health, Vol. 96, pp. 252261. 30. Garland, C. F.; Grant, W. B.; Mohr, S.B.; Gorham, E.D. & Garland, F.C. (2007). What is the Dose-Response Relationship between Vitamin D and Cancer Risk? Nutrition Reviews, Vol. 65, No. 8, pp. S91-S95. 31. Ghivercea V, Grecu D, Lichiardopol C, Maria R. Tratamentul osteoporozei cu fructoborat de calciu. Revista de Ortopedie si Traumatologie (Bucuresti). 2004;14(12):7582. 32. Gissel, T.; Rejnmark, L.; Mosekilde, L. & Vestergaard, P. (2008). Intake of vitamin D and risk of breast cancerA meta-analysis. Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 111, No. 3-5, pp. 195-199. 33. Gonzalez, A.; Peters, U.; Lampe, J.W. & White, E. (2007). Boron intake and prostate cancer risk. Cancer Causes & Control, Vol. 18, pp. 1131-1140. 34. Gorustovich AA, Steimetz T, Nielsen FH, Guglielmotti MB. A histomorphometric study of alveolar bone healing in rats fed a boron-deficient diet. Anat Rec: Adv Integrative Anatomy Evol Biol. 2008a;291(4):441447. 35. Gorustovich AA, Steimetz T, Nielsen FH, Guglielmotti MB. A histomorphometric study of alveolar bone modeling and remodeling in mice fed a boron-deficient diet. Arch Oral Biol. 2008b;53(7):677682. 36. Greenlee, R.T.; Murray, T.; Bolden, S. & Wingo, P.A. (2000). Cancer statistics, 2000. CA Cancer Journal of Clinicians, 50, pp. 7-33. 37. Hamilton EI, Minski MJ. Abundance of the chemical elements in mans diet and possible relations with environmental factors. Sci Total Environ. 1973;1:375394. 38. Hunter, D.J. & Willett, W.C. (1996). Dietary factors. In: Diseases of the Breast. Lippincott-Raven, Philadelphia, PA, 201212.

39. Hunter, D.J.; Spiegelman, D.; Adami, H.O.; Beeson, L.; van den Brandt, P.A.; Folsom, A.R.; Fraser, G.E.; Goldbohm, R.A.; Graham, S. & Howe, G.R. (1996). Cohort studies of fat intake and the risk of breast cancer a pooled analysis. The New England Journal of Medicine, Vol. 334, pp. 356361. 40. Harris, J.R.; Lippman, M.E.; Veronesi, U. & Willett, W. (1992). Breast cancer. The New England Journal of Medicine, Vol. 327, pp. 319-328. 41. Havercroft JM,Ward NI. Boron and other elements in relation to rheumatoid arthritis. In:BMomcilovic (Eds.), Trace elements inman and animals-7, pp. 8.28.3. Zagreb: IMI, 1991 42. Hegsted, M.; Keenan, M.J.; Siver, F. & Wozniak, P. (1991). Effect of boron on vitamin D deficient rats. Biological Trace Elements Research, Vol. 28, pp. 243-255. 43. Hofling, M.; Hirschberg, A.L.; Skoog, L.; Tani, E.; Hagerstrom, T. & von Schoultz, B. (2007). Testosterone inhibits estrogen/progestogeninduced breast cell proliferation in postmenopausal women. Menopause, Vol. 14, No. 2, pp. 183-190. 44. Holak W (1971a) Atomic absorption determination of boron in foods. J Assoc Off Anal Chem 54:11381139 45. Holak W (1971b) Collaborative study of the determination of boric acid in foods by atomic absorption spectrophotometry. J Assoc Off Anal Chem 55:890891 46. Holmes, M.D.; Hunter, D.J. & Colditz, G.A. (1999). Association of dietary intake of fat and fatty acids with risk of breast cancer. Journal of the American Medical Association, Vol. 281, pp. 914-920. 47. Hu H, Penn SC, Lebrilla CB, Brown P. Isolation and characterization of soluble boron complexes in higher plants (The mechanism of phloem mobility of boron). Plant Physiol. 1997;113(2):649655 48. Hunt, C.D. (1998). Regulation of enzymatic activity: one possible role of dietary boron in higher animals and humans. Biological Trace Element Researche, Vol. 66, pp. 205-225. 49. Hunt CD, Meacham SL. Aluminum, boron, calcium, copper, iron, magnesium, manganese, molybdenum, phosphorus, potassium, sodium, and zinc: concentrations in common western foods and estimated daily intakes by infants; toddlers; and male and female adolescents, adults, and seniors in the United States. J Am Diet Assoc. 2001;101(9):10581060. 50. Hunt CD, Herbel JL, Idso JP (1994) Dietary boron modifies the effects of vitamin D, nutrition on indices of energy substrate utilization and mineral metabolism in the chick. J Bone Miner Res 9:171 182 60. Ingraham, B.A.; Bragdon, B. & Nohe A. (2008). Molecular basis of the potential of vitamin D to prevent cancer. Current Medical Research and Opinion, Vol. 24, No. 1, pp. 139149. 61. Korkmaz, M.; Uzgo, E.; Bakirdere, S.; Aydin, F. & Ataman, Y. (2007). Effects of dietary boron on cervical cytopathology and on micronucleus frequency in exfoliated buccal cells. Environmental Toxicology, Vol. 22, pp. 17-25. 62. Kelsey, J.L. (1979). A review of the epidemiology of human breast cancer. Epidemiologic Reviews, Vol. 1, pp. 74-109.

63. Kettritz R, Falk RJ, Jennette JC et al (1977)Neutrophil superoxide release is required for spontaneous and fMLP-mediated but not for TNF alfa-mediated apoptosis. J Am Soc Nephrol 8:1091-1100. 64. Longnecker, M.P.; Berllin, J.A.; Orza, M.J. & Chalmers, T.C. (1988). A metaanalysis of alcohol consumption in relation to breast cancer risk. Journal of the American Medical Association, Vol. 260, No. 5, pp. 652-6. 65. Loomis WD, Durst RM (1992) Chemistry and biology of boron. Biofactors 3:229239 66. MacLean, C.H.; Newberry, S.J.; Mojica, W.A.; Khanna, P.; Issa, A.M.; Suttorp, M.J.; Lim, Y.W.; Traina, S.B.; Hilton, L. & Garland, R. (2006). Effects of omega-3 fatty acids on cancer risk: a systematic review. Journal of the American Medical Association, Vol. 295, No. 4, pp. 403-415. 67. Mahabir, S.; Spitz, M.R.; Barrera, S.L.; Dong, Y.Q.; Eastham, C. & Forman, M.R. (2008). Dietary boron and hormone replacement therapy as risk factors for lung cancer in women. American Journal of Epidemiology, Vol. 167, pp. 1070 1080. 68. Maskarinec, G.; Murphy, S.; Shumay, D.M. & Kakai, H. (2001). Dietary changes among cancer survivors. European Journal of Cancer Care, Vol. 10, No. 1, pp. 1220. 69. Matsunaga T, Nagata T (1995) In vivo 11B NMR observation of plant tissue. Anal Sci 11:889892 70. McTiernan, A.; Rajan, K.B.; Tworoger, S.S.; Irwin, M.; Bernstein, L.; Baumgartner, R.; Gilliland, F.; Stanczyk, F.Z.; 71. Yasui, Y. & Ballard-Barbash, R. (2003). Adiposity and Sex Hormones in Postmenopausal Breast Cancer Survivors. Journal of Clinical Oncology, Vol. 21, No. 10, pp. 1961-1966. 72. Meacham, S.L.; Elwell, K.E.; Ziegler, S. & Carper, S.W. (2007). In: Advances in Plant and Animal Boron Nutrition, F. Xu, (Ed.), pp. 299306, Springer: New York. 73. Mehta, R.G. & Mehta, R.R. (2002). Vitamin D and cancer. Journal of Nutritional Biochemistry, Vol. 13, pp. 252264. 74. Miljkovic D, Scorei IR, CimpoiasuV et al (2009) Calcium fructoborate: plant-based dietary boron forhuman nutrition. J Diet Suppl 6:211226 75. Miljkovic D. Boron carbohydrates complexes and uses thereof. October 8, 1998, U.S. Patent 5962049. 76. Miljkovic D, Miljkovic N, McCarty MF. Up-regulatory impact of boron on vitamin D function-does it reflect inhibition of 24-hydroxylase? Med Hypotheses. 2004;63(6):10541056. 77. Naghii, M.R. & Samman, S. (1997). The effect of boron supplementation on its urinary excretion and selected cardiovascular risk factors in healthy male subjects. Biological Trace Element Research, Vol. 56, pp. 27386. 78. Naghii, M.R.; Mofid, M.; Asgari, A.R.; Hedayati, M. & Daneshpour M-S. (2010). Comparative effects of daily and weekly boron supplementation on plasma steroid hormones and pro-inflammatory cytokines. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology, [Epub ahead of print].

79. Nathan C, Xie QW(1994)Nitric oxide syntheses. Roles, tolls, and controls.Cell 78:915-918). 80.Newnham RE. Agricultural practices affect arthritis. Nutr Health. 1991;7(2):89100. 81. Newnham RE. Essentiality of boron for healthy bones and joints. Environ Health Perspect. 1994;102(Suppl. 7):8385. 82. Nielsen, F.H.; Hunt, C.D.; Mullen, L.M. & Hunt, J.R. (1987). Effect of dietary boron on mineral, estrogen, and testosterone metabolism in postmenopausal women. FASEB Journal, Vol. 1, pp. 3947. 83. Nielsen, F.H. (2000). The emergence of boron as nutritionally important throughout the life cycle. Nutrition, Vol. 16, pp. 512-514. 84. Nielsen, F.H. (2004). Dietary fat composition modifies the effect of boron on bone characteristics and plasma lipids in rats. Biofactors, Vol. 20, No. 3, pp. 1 -71. 85. Nielsen, F.H. & Penland, J.G. (2006). Boron deprivation alters rat behavior and brain mineral composition differently when fish oil instead of safflower oil is the diet fat source. Neuroscience and Nutrition, Vol. 9, No.1-2, pp. 105-12. 86. Nielsen, F.H. (2008). Is boron nutritionally relevant? Nutrition Reviews , Vol. 66, pp. 183-191. 87. Nielsen, F.H. (2009). Boron deprivation decreases liver S adenosylmethionine and spermidine and increases plasma homocysteine and cysteine in rats. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology, Vol. 23, pp. 204-213. 88. Nielsen FH. Evidence for the nutritional essentiality of boron. J Trace Elem Exp Med.1996;9:215229. 89. Nielsen, F.H. (2000). The emergence of boron as nutritionally important throughout the life cycle. Nutrition, Vol. 16, pp. 512-514 90. Nielsen FH. Dietary fat composition modifies the effect of boron on bone characteristics and plasma lipids in rats. Biofactors. 2004a;20:161 170. 91. Nielsen FH. The alteration of magnesium calcium and phosphorus metabolism by dietarymagnesium deprivation in postmenopausal women is not affected by dietary boron deprivation. Magnes Res. 2004b;17(3):197210. 92. Nielsen FH. Is boron nutritionally relevant? Nutr Rev. 2008;66(4):183191. 93. Nielsen FH, Hunt CD, Mullen LM, Hunt JR. Effect of dietary boron on mineral, estrogen, and testosterone metabolism in postmenopausal women. FASEB J. 1987;1(5):394397. 94. Nielsen FH, Stoecker B. Dietary boron and fish oil have desirable effects on vertebral micro-architecture and strength. FASEB J. 2006;20:A651. 95. Nielsen FH, Stoecker BJ, Penland JG. Boron as a dietary factor for bone microarchitecture and central nervous system function. In: F Xu, HE Goldbach, PH Brown, 96. RH Bell, T. Fujiwara, CD Hunt, S. Goldberg, and L Shi (Eds.), Advances in plant and animal nutrition, pp. 277290. Dordrecht, The Netherlands: Springer, 2007. 97. Nielsen FH(2003)Does boron have an essential function similar to an omega-3 fatty acid function? In:Anke, M, Muller R, Schafer U, Stoeppler M(eds) 21st Workshop on Macro and Trace elements, Friedrich Schiller University, Jena, Germany, October 18-19. Schubert, Leipzig , pp 1238-1250)

98. Park M, Li Q, ShcheynikovN, ZengW,Muallem S.NaBC1 is a ubiquitous electrogenic Na+-coupled borate transporter essential for cellular boron homeostasis and cell growth and proliferation. Mol Cell. 2004;16:331341. 99. Parkin, D.M.; Muir, C.S.; Whelan, S.L.; Gao, Y.T. & Ferlay, J.J. (1993). In: Cancer Incidence in Five Continents, J. Powell, (Ed), Vol. VI, Lyon, France International Agency for Research on Cancer. 100. Peng X, Lingxia Z, Schrauzer GN, Xiong G. Selenium, boron, germaniumdeficiency in the etiology of Kashin-Beck disease. Biol Trace Elem Res. 2000;77:193 197. 101. Penland JG. Dietary boron, brain function, and cognitive performance. Environ Health Perspect. 1994;102(Suppl. 7):6572. 102. Penland JG. The importance of boron nutrition for brain and psychological function. Biol Trace Elem Res. 1998;66:299317. 103. Pike, A.C.W.; Brzozowski, A.M.; Hubbard, E.R.; Bonn, T.; Thorsell, A.G.; Engstrm, O.; Ljunggren, J.; Gustafsson, J.A. Probst-Hensch, N.M.; Pike, M.C.; McKean-Cowdin, R.; Stanczyk, F.Z.; KolonelL.N. & Henderson B.E. (2000). Ethnic differences in post-menopausal plasmaoestrogen levels: high oestrone levels in Japanese-American women despite low weight. British Journal of Cancer, Vol. 82, No. 11, pp. 18671870. 104. Mats-Carlquist, M. (1999). Structure of the ligand-binding domain of estrogen receptor beta in the presence of a partial agonist and a full antagonist. EMBO Journal, Vol. 18, pp. 4608-4618. 105. Pietrzkowski, Z. (oct.7, 2010). Compositions and methods related to calcitriol. US patent 0256076A1 106. Pujol, P.; Galtier-Dereure, F. & Bringer, J. (1997). Obesity and breast cancer risk. Human Reproduction, Vol. 12, No. 1, pp. 116-125 107. Rainey CJ, Nyquist LA, Christensen RE, Strong PL, Culver BD, Coughlin JR. Daily boron intake from the American diet. J Am Diet Assoc. 1999;99(30):335340. 108. Ralston NVC, Hunt CD. Diadenosine phosphate and S-adenosylmethionine: novel boron binding biomolecules detected by capillary electrophoresis. Biochimica et Biophysica. Acta. 2001;1527:2030. 109. Ridker PM, Rifai N, Rose L et al(2009) Comparison of C-reactive protein and low-densitylipoprotein cholesterol levels in the prediction of first cardiovascular events. N Engl J Med 347:1557-1565 110. Richold M. Boron exposure from consumer products. Biol Trace Elem Res. 1998;66: 121129. 111. Rose, D.P. & Connolly, J.M. (1993). Effects of dietary omega-3 fatty acids on human breast cancer growth and metastases in nude mice. Journal of the National Cancer Institute, Vol. 85, No. 21, pp. 1743-1747 112. Rotaru P, Scorei R, Hr bor A et al (2010) Thermal analysis of a calcium fructoborate sample. Thermochim Acta 506:81 113. Saadatian, E.M.; Norat, T.; Goudable, J. & Riboli, E. (2004). Biomarkers of dietary fatty acid intake and the risk of breast cancer: a metaanalysis. International Journal of Cancer, Vol. 111, No. 4, 584-591. 114. Sayli, B.S.; Tuccar, E. & Ellan, A.H. (2001). An assessment of fertility and infertility in boron-exposed Turkish subpopulations, Part 3: Evaluation of fertility

among sibs and in borate families. Biological Trace Element Research, Vol. 81, pp. 255-267. 115.Schabath, M.B.; Wu, X.; Vassilopoulou-Sellin, R.; Vaporciyan, A.A. & Spitz, M.R. (2004). Hormone replacement therapy and lung cancer risk. A case-control analysis clinical. Cancer Research, Vol. 10, pp. 113-123. 116. Scorei R, CimpoiasuVM, Iordachescu D. In vitro evaluation of the anti-oxidant activity of fructoborate. Biol Trace Elem Res. 2005;107(2):127134. 117. Scorei R, Ciubar R, Ciofrangeanu C,Mitran V, Campean A, Iordachescu D. In vitro effect of calcium fructoborate on fMPL-stimulated human neutrophile granulocytes. Biol Trace Elem Res. 2007;118:2737. 118. Scorei R, Ciubar R, Ciofrangeanu C,Mitran V, Campean A, Iordachescu D. Comparative effects of boric acid and calcium fructoborate on breast cancer cells. Biol Trace Elem Res. 2008;122(3):197205. 119. Scorei, R. & Popa, R. (2010). Boron-containing compounds as preventive and chemotherapeutic agents for cancer. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry, 10, pp. 346351. 120. Scorei, R. & Rotaru, P. (2011). Calcium fructoborate-potential anti inflammatory agent. Biological Trace Element Research, DOI: 10.1007/s12011 011-8972-6. 121. Scorei RI (2011) Calcium fructoborate: plant-based dietary boron as potential medicine for cancer therapy. Front Biosci S3(1):205215 122. Sheng MH, Taper LJ, Veit H, Qian H, Ritchey SJ, Lau KH. Dietary boron supplementation enhanced the action of estrogen, but not that of parathyroid hormone, to improve trabecular bone quality in ovariectomized rats. Biol Trace Elem Res. 2001, Summer;82(13):109123. 123. Simard, A.; Vobecky, J. & Vobecky, J.S. (1991). Vitamin D deficiency and cancer of the breast: an unprovocative ecological hypothesis. Canadian Journal of Public Health, Vol. 82, pp. 300303. 124. Spector TD, Hart DJ, Nandra D, Doyle et al(2005)Low-level increases in serum C-reactive protein are present in early osteoartrithis of the knee and predict progressive disease. Arthritis Rheum 40(4):723-727) 125. Spiegelman, D.; Colditz, G.A.; Hunter, D. & Hertzmark, E. (1994). Validation of the Gail et al: model for predicting individual breast cancer risk. Journal of the National Cancer Institute, Vol. 86, pp. 600-607. 126. Simsek, A.; Velioglu, S.Y.; Coskun, L.A. & Sayli, B.S. (2003). Boron concentrations in selected foods from borate-producing regions in Turkey. Journal of the Science Food and Agriculture, Vol. 83, pp. 586-592 127. Stoll, B.A. (1998). Teenage obesity in relation to breast cancer risk. International Journal of Obesity Related Metabolism Disorders, Vol. 22, pp. 1035-1040. 128. Stoppler, H.; Koval, D. & Schlegel, R. (1996). The serine protease inhibitors TLCK and TPCK inhibit the in vitro immortalization of primary human keratinocytes by HPV-18 DNA. Oncogene, Vol. 13, pp. 1545-1548 129. Tagawa T, Kono K, Dote T, Usuda K, Nishiura H, Koizumi C, Saito M, Nakaya H, Nagaie H. Pharmacokinetics and effects after intravenous administration of highdose boron to rat. Int Arch Occup Environ Health. 2000;73(Suppl.):98100.

130. Tate SS, Meister A (1978) Serine-borate complex as a transition-state inhibitor of y-glutamy transpeptidase. Proc Natl Acad Sci USA 75:48064809 131. Tominaga, S. & Kuroishi, T. (1999). Epidemiology and prevention of Breast Cancer in the 21 st century. Breast Cancer, Vol. 6, No. 4, pp. 283-288. 132. Tangpricha, V.; Flanagan, J.N.; Whitlatch, L.W.; Tseng, C.C.; Chen, T.C.; Holt, P.R.; Lipkin, M.S. & Holick, M.F. (2001). 25Hydroxyvitamin D1alpha-hydroxylase in normal and malignant colon tissue, Lancet, Vol. 357, pp. 1673 1674. 133. Ursin, G.; Pike, M.C.; Preston-Martin, S.; dAblaing, G. & Peters, R.K. (1996). Sexual, reproductive and other risk factors for adenocarcinoma of the cervix: results from a population-based case control study (California, United States). Cancer Causes and Control, Vol. 7, pp. 391-401. 134. Vogel, V.G. (2000). Breast Cancer Prevention: A Review of Current Evidence. CA Cancer Journal of Clinicians, Vol. 50, pp. 156-170. 135. Wagner C, Curotto CF, Diez RP, Bara EJ. Experimental and theoretical studies of calcium fructoborate. Biol Trace Elem Res. 2008;122:64 72. 136. World Health Organization(2010)International clinical trials registry platform search portal.Identifier ISRCTN46679573. A double-blind, placebo-controlled pilot study to evaluate calcium fructoborate effect on systemic inflammation and dyslipidemia markers in middle-aged people with primary osteoarthritis.World Health Organization, Geneva ) , 137. Warington K. The effect of boric acid and borax on the broad bean and certain other plants. Ann Botany. 1923;37(4):629672. 138. World Health Organization. Boron. In: Trace elements in human nutrition and health, pp. 175179. Geneva: World Health Organization, 1996. 139. Woods WG (1996) Review of possible boron speciation relating to its essentiality. J Trace Elem Exp Med 9:153163 140. Xu C, Schauder S, Potier N, Van Dorsselaer IA, Pelczer I, Bassler BL, Hughson FM. Structural identification of a bacterial quorum-sensing signal containing boron. Nature. 2002;415(6871):545549. 141. Yan C, Winton MI, Zhang ZF, Rainey C, Marshall J, De Kernion JB, Eckhert CD. Dietary boron intake and prostate cancer risk. Oncol Rep. 2004;11(4):887892. 142. Yamaki S (1995) Physiology and metabolism of fruit development: biochemistry of sugar metabolism and compartmentation in fruits. Acta Hort 398:109120 143. Ylitalo, N.; Sorensen, P.; Josefsson, A.; Frisch, M.; Sparen, P.; Ponten, J.; Gyllensten, U.; Melbye, M. & Adami, H.O. (1999). Smoking and oral contraceptives as risk factors for cervical carcinoma in situ. International Journal of Cancer, Vol. 81, pp. 357-365. 144. Yoshimura K, Mayazaki Y, Sawada S et al (1996) B- NMR studies on complexation of borate with linear and crosslinked polysaccharides. J Chem Soc Faraday Trans 92:651656 145. Zhao Q, Unrine J, Dourson M. Replacing the default values of 10 with data, derived values: a comparison of two different data-derived uncertainty factors for boron. Hum Ecol Risk Assess. 1999;5(5):973983. 146. Zittermann A. Vitamin D in preventive medicine: are we ignoring the evidence? Brit J Nutr. 2003;89(5):552572. 147. Zehnder, D.; Bland, R.; Williams, M.C.; McNinch, R.W.; Howie, A.J.; Stewart, P.M. & Hewison, M. (2001). Extrarenal expression of 25-hydroxyvitamin

D(3)1alphahydroxylase. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, Vol. 86, pp.888894. 148. Zittle CA (1951) Reaction of borate with substances of biological interest. Adv Enzymol 12:493527 149. G.L. Locher: Biological effects and therapeutic possibilities of neutrons, Am J Roentgenol Radium Ther Nucl Med 36, 113 (1936). 150. F. Rolf, J.A. Barth, M. Coderre, H. V. Graa and T. E. Blue : Boron Neutron Capture Therapy of Cancer: Current Status and Future Prospects. Clin Cancer Res 11(11), 3987-4002(2005). 151. G.I. Bell, T. Kayano, J.B. Buse, C.F. Burant, J. Takeda, D. Lin, H. Fukumoto and S. Seino: Molecular biology of mammalian glucose transporters. Diabetes Care 13, 198208(1990). 152. G. Boudry, C.I. Cheeseman and M.H. Perdue. Psychological stress impairs Na_-dependent glucose absorption and increases GLUT2 expression in the rat jejunal brush-border membrane. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 292, R862R867( 2007). 153. V. Douard and R. P. Ferraris: Regulation of the fructose transporter GLUT5 in health and disease. Am J Physiol Endocrinol Metab 295, E227E237( 2008). 154. J. Payne, F. Maher, I. Simpson, L. Mattice and P. Davies: Glucose transporter Glut 5 expression in microglial cells. Glia 21, 327 331(1997). 155. F. Nualart, A. Godoy and K. Reinicke: Expression of the hexose transporters GLUT1 and GLUT2 during the early development of the human brain. Brain Res 824, 97104(1999). 156. V.A. Funari, V.L. Herrera, D. Freeman and D.R. Tolan: Genes required for fructose metabolism are expressed in Purkinje cells in the cerebellum. Brain Res Mol Brain Res 142: 115122,(2005). 157. G.J. Mantych, D.E. James and S.U. Devaskar: Jejunal/kidney glucose transporter isoform (Glut-5) is expressed in the human blood-brain barrier. Endocrinology 132, 3540( 1993). 158. H.J. Shu, K. Isenberg, R.J. Cormier, A. Benz and C.F. Zorumski: Expression of fructose sensitive glucose transporter in the brains of fructose-fed rats. Neuroscience 140, 889895(2006). 159. C.F. Burant, J. Takeda, E. Brot-Laroche, G.I. Bell and N.O. Davidson: Fructose transporter in human spermatozoa and small intestine is GLUT5. J Biol Chem 267, 1452314526(1992). 160. J. Chesney: 6-Phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase and tumor cell glycolysis. Curr Opin Clin Nutr Metab Care 9, 535 539(2006). 161. S.P Zamora-Leon, D.W. Golde, I.I. Concha, C.I. Rivas, F. Delgado-Lopez, J. Baselga, F. Nualart and J.C. Vera: Expression of the fructose transporter GLUT5 in human breast cancer. Proc Natl Acad Sci USA 93, 18471852( 1996). 162. K.K. Chan, J.Y. Chan, K.K. Chung and K.P Fung: Inhibition of cell proliferation in human breast tumor cells by antisense oligonucleotides against facilitative glucose transporter 5. J Cell Biochem 93, 11341142(2004). 163. A. Godoy, V. Ulloa, F. Rodriguez, K. Reinicke, A.J. Yanez, L. Garcia Mde, R.A. Medina, M. Carrasco, S. Barberis, T. Castro, F. Martinez, X. Koch, J.C. Vera, M.T. Poblete, C.D. Figueroa, B. Peruzzo, F. Perez and F. Nualart: Differential subcellular distribution of glucose transporters GLUT1-6 and GLUT9 in human cancer: ultrastructural localization of GLUT1 and GLUT5 in breast tumor tissues. J Cell Physiol 207, 614627( 2006).