Gentica bacteriana: Mutacin

Paula Tapia Toledo1

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Estudiante de biologa

INTRODUCCION Las bacterias son microorganismos con una capacidad extraordinaria de adaptacin a diferentes condiciones ambientales. Para comprender la esencia de esta capacidad es importante conocer sus bases genticas, es decir, como est organizada la informacin gentica, como realizan y regulan su expresin y que mecanismos de variacin gnica poseen (Betancor et. al.1994) Una de las capacidad de adaptarse a distintas condiciones es la que se conoce como MUTACION, la cual es un cambio heredable en la secuencia de bases de los cidos nucledos que constituyen el genoma de un organismo; sta se produce en condiciones naturales con baja frecuencia y se deben fundamentalmente a errores en los procesos de replicacin del ADN (Betancor et. al.1994). Algunas mutaciones pueden conferir al mutante una ventaja frente a la cepa que le dio origen, bajo ciertas condiciones ambientales, de manera que la progenie de dicha clula mutante es capaz de superar el crecimiento de la cepa original y sustituirla. Este es el caso de las mutaciones que confieren resistencia a los antibiticos, en las que el mutante resistente se seleccionar en un ambiente en el que las bacterias estn expuestas al antibitico en cuestin (Betancor et. al.1994) Existen diferentes tcnicas que facilitan el aislamiento de mutantes, siendo la ms usada el de rplica en placa. Sin embargo, todos los mtodos deben necesariamente incluir una determinada presin selectiva, manifestada por un agente seleccionador, que es aquel que permitir la seleccin de la mutante y la inhibicin o muerte de las clulas silvestres o salvajes. Este agente seleccionador se refiere directamente a la propiedad mutada. Por ejemplo, se si desea seleccionar mutantes resistentes a tetraciclina, el medio de cultivo debe incluir una concentracin apropiada de este antibitico, el cual inhibir a las clulas susceptibles y permitir el desarrollo de las mutantes resistentes (H. Bello et. al. 1995). Objetivos: Identificacin de mutantes en la especie E.coli midiendo el crecimiento bacteriano. Evaluar la resistencia y/o susceptibilidad a antibiticos en bacterias de E.coli Analizar la capacidad inhibitoria de los antibiticos que impiden el crecimiento de E. coli.

MATERIALES Y METODOLOGIA De una muestra lquida de E. coli se tomaron 2 a 3 gotas y se diluyeron en 2 ml de agua esterilizada. Luego se procedi con una trula, al sembrado en una placa con agar Tripticasa, ala cual se le depositan sobre la superficie 6 antibiticos (Ampicilina (10mcg), Rifampicina (30mcg), Tetraciclina (30mcg), Cloxacilina (30mgc), Kanamicina (20mgc), Ac. Nalidixico (30mgc)), dispuestos separadamente unos de los otros. Esto es lo que se conoce como antibiograma. Esta placa corresponde a la cepa salvaje en presencia de antibiticos. Del cultivo original sin dilucin de E. coli se siembra una placa de cultivo que contiene agar McConkey ms el antibitico Rifampicina (30 mcg). Ambas placas se dejaron incubar por 48 horas a 37C. A la semana siguiente se aprecian los resultados del antibiograma de la cepa mutada, en la placa de cultivo con agar McConkey ms el antibitico Rifampicina. Si en este cultivo se obtiene el crecimiento de colonias, se prueba que son bacterias mutantes. De sta se saca una pequea muestra y se diluye en 2 ml de agua esterilizada hasta que esta se vuelva ligeramente turbia. La muestra se siembra nuevamente en un cultivo de agar Tripticasa con antibiticos distintos para determinar si se ha producido algn cambio en las propiedades de resistencia y susceptibilidad de las bacterias a causa de la mutacin de la especie. Posteriormente se deja incubar por 24 horas a 37C. Finalmente se procede a comparar los resultados que arroja este segundo antibiograma con el cultivo de la cepa salvaje (primer antibiograma), en presencia de antibiticos para analizar las diferencias de susceptibilidad o resistencia. Para ello se midi los radios y dimetros del halo inhibitorio en ambas placas con antibiticos. RESULTADOS a.- Cultivo de cepa salvaje Agar Tripticasa: Tabla1: Halos inhibitorios presentados por los 6 antibiticos. Primer antibiograma, cepa salvaje. Antibitico c. Nalidixico Rifampicina Ampicilina Cloxacilina Kanamicina Tetraciclina Dimetro del halo inhibitorio 1,4 cm 0,8 cm 0,0 cm 0,0 cm 0,0 cm 0,0 cm

Del cultivo de la cepa salvaje de E.coli en agar Tripticasa con antibiticos ya mencionados,se obtuvo que 2 de 6 antibiticos inhibieran el crecimiento de las bacterias. Las mediciones del halo inhibitorio se ejemplifican en la tabla adjunta. b.- Cultivo de agar MacConkey+Rifampicina : En cultivo de E. coli se obtuvieron de 2 colonias mutantes. Separadas una colonia de la otra, en puntos equidistantes del borde de la placa. Para la comprobacin de que estas colonias bacterianas mutantes pertenecan a la especie E. coli se procedi a realizar una tincin de Gram, la cual mostro como resultado positivo la presencia de esta especie observada al microscopio.

A: 100X Figura 1. Observacin de bacterianas correspondientes a E. coli mutadas. Analizadas con la tcnica de Gram. c.- Cultivo en Agar Tripticasa bacterias mutantes (resistentes a Rifampicina): Tabla 2: Halos de inhibicin presentados en el segundo antibiograma con mutantes resistentes a Rifampicina. Antibitico Ac. Nalidixico Rifampicina Ampicilina Cloxacilina Kanamicina Tetraciclina Dimetro del halo inhibitorio 3 cm 0,0 cm 0,0 cm 0,6 cm 0,0 cm 0,0 cm

En la tabla 2, se presentan halos casi inexistentes y menores, ya que la cepa se volvi ms resistente a los antibiticos. Hay una excepcin a la regla que es el halo presentado por Cloxacilina, que fue mayor que en la cepa salvaje DISCUSION Con el cultivo de E.coli en antibiograma se establece que la especie presenta susceptibilidad ante ciertos antibiticos tales Ac. nalidixico (30mgc) y rifampicina (30mcg), por lo tanto estos antibiticos actan sobre las bacterias inhibiendo crecimiento lo cual altera sus procesos metablicos (Lorena Tobella compers). Esta inhibicin est representada por la presencia de un halo inhibitorio, sector que es capaz de recorrer el antibitico impidiendo que las bacterias crezcan. Ms hacia la periferia del halo existe una menor concentracin del antibitico, as cuando la concentracin del antibitico ya sea nula (se termine el halo), las bacterias puedan crecer (M. Martnez et. al. 2003). Las bacterias mutantes que crecieron del cultivo con Rifampicina, fueron el resultado de variaciones genticas de la especie, que crearon mecanismos de resistencia para los efectos del antibitico. Pero este mecanismo (mutacin), ocurre al azar, antes de aplicar el antibitico en la muestra entregada de E. coli. con el experimento de Rifampicina se seleccion y dejo crecer solo las bacterias mutadas. Al crecer 3 colonias mutadas, se puede decir que las bacterias mutadas de E. coli obtienen la propiedad de resistir el efecto del antibitico, por lo cual la propiedad de resistir se mantiene en un nuevo cultivo de colonias mutantes (segundo antibiograma).Por el contrario, las bacterias mutantes en el segundo antibiograma, en cual fue sensible a Ac. Nalidixico y Cloxacilina y resistente a los dems antibiticos. En este caso se debi esperar que solo fuera sensible a Ac.Nalidixico, la razn por la cual fue sensible a cloxacilina se debi netamente a un mal manejo metodolgico. por la cantidad de bacterias cultivadas, por lo tanto un error de procedimiento metodolgico. As las bacterias mutantes mantienen las propiedad de susceptibilidad de las bacterias originales de la especie, excepto la Rifampicina que selecciona (agente seleccionador), las mutantes. CONCLUSION Como conclusin las bacterias tienen la capacidad de generar mutaciones para poder perpetuar en cierta medida su especie, pues la mutante le otorga una caracterstica especial a la bacteria que la hace por ejemplo resiste a ciertos antibiticos. Dichas mutantes pueden ser de manera espontnea o inducida, en el primer caso son menos frecuentes, ya que generan de manera espontnea el cambio en los pares de bases del ADN, que les otorga la posibilidad de generar alguna propiedad diferente. Sin embargo, como estas se dividen a gran velocidad y en cortos periodos de tiempo, podemos identificar la presencia de bacterias mutantes con exmenes simples como un antibiograma (M. Mandigan, 2009). Los antibiogramas nos muestran si es que la cepa bacteriana que estamos usando es resistente o susceptible a los antibiticos que apliquemos, en el caso de ser sensible se va a generar un halo de inhibicin alrededor del disco del antibitico, el tamao del radio de ese halo tambin es

importante, pues de esta forma podemos ver si es que la bacteria que estamos usando necesita ms o menos cantidad de antibitico para alcanzar la concentracin mnima de inhibicin (C.M.I.), siendo este mtodo solo cualitativo (estimacin, no cuantificacin). En el caso de la resistencia, es fcilmente observable, pues se ve la presencia de bacterias alrededor de todo el disco del antibitico (M. Madigan, 2009)

BIBLIOGRAFIA -Bello, H., Bergeret, I., Gonzales, G., Henrriquez, M., Herrera, R., Klempan ,A., Kummerlin ,R., Mondaca, M.A., Saez ,E., Smith ,C., & R,Zemelman. 1995. Apuntes de microbiologa, parte 1. Universidad de Concepcin. Facultad de ciencias biolgicas. Departamento de microbiologa. 138pp.

-Betancor, L.,Gadea, M., & K, Flores.1994. Gentica Bacteriana. Temas de bacteriologa y virologa medica. 79pp. -Madigan Michael, Martinko John, Dunlap Paul, Clark David. 2009. Brock Biologa de los microorganismos. Pearson Educacin. Madrid. Espaa. 1259pp

-Martnez P. Miguel, Domnguez Y. Mariana, Andrews G. Edilia. 2003. Manual de Bacteriologa. Facultad Cs. Biolgicas, Dpto. Microbiologa, Universidad de Concepcin. 1 Edicin. Impresin Talleres de la Direccin de Docencia, Concepcin, Chile. 130pp.