La adhesin bacteriana al hidrogel convencional y nuevos materiales de hidrogel de silicona para lentes de contacto

Resumen Antecedentes A medida que la adhesin bacteriana a las lentes de contacto pueden contribuir a la patognesis de la queratitis, el objetivo de nuestro estudio fue investigar en la adhesin in vitro de bacterias clnicamente relevantes para hidrogel convencional (estndar HEMA) y lentes de contacto de hidrogel de silicona utilizando un ensayo de ATP bioluminiscente. Mtodos Cuatro tipos de lentes de contacto no gastado (Etafilcon A, Galyfilcon A, Balafilcon A, lotrafilcon B) se incubaron con Staphylococcus epidermidis (dos cepas diferentes) y Pseudomonas aeruginosa en suspensin en solucin salina tamponada con fosfato (PBS). Las lentes se colocan con la superficie posterior hacia arriba y se incubaron en la suspensin bacteriana durante 4 horas a 37 C. Unin de la bacteria se midi y estudi por bioluminiscente ensayo ATP. Seis de reproducir los experimentos se realizaron para cada lente y la tensin. Adhesin resultados de todas las especies de las bacterias a los lentes de contacto estndar HEMA (Etafilcon A) se encontr que era significativamente menor que la de los tres tipos de lentes de contacto de hidrogel de silicona e, mientras que Lotrafilcon material B mostr el mayor nivel de unin de la bacteria. Las diferencias entre especies en el nivel global de la adhesin a los diferentes tipos de lentes de contacto se observaron. La adhesin de P. aeruginosa fue tpicamente de al menos 20 veces mayor que la observada con las dos cepas de S. epidermidis. Conclusiones: Lentes de contacto de hidrogel convencionales exhiben una adhesin significativamente menor bacteriana in vitro que las de silicona de hidrogel e. Esto podra ser debido a la mayor hidrofobicidad, sino tambin a la transmisin de oxgeno mayor de lentes de hidrogel de silicona. Palabras clave queratitis. Las lentes de contacto. La adhesin bacteriana. La bioluminiscencia. hidrogel de silicona Introduccin Staphylococcus epidermidis y Pseudomonas aeruginosa son los principales agentes causantes de la queratitis infecciosa en pacientes que usan lentes de

contacto. La adhesin de estas bacterias para lentes de contacto puede contribuir a la patognesis de la infeccin, y puede ser influenciada por las propiedades superficiales de lentes. Silicone - lentes de contacto de hidrogel apareci por primera vez comercialmente en 1998 y han mostrado un gran crecimiento desde entonces, con unas ventas aproximadas de $ 150 millones en 2003 [1]. Inicialmente desarrollado para el mercado de uso prolongado, los profesionales han adoptado el uso de tales materiales para su uso tanto en el desgaste durante la noche y al da. Sin embargo, las propiedades fsicas, qumicas y estructurales de las lentes de contacto de hidrogel de silicona variar [2], que explica por qu la adhesin bacteriana es diferente segn el tipo de lente de contacto estudiado. La incorporacin de silicona en los polmeros de hidrogel da como resultado la desventaja de hidrofilia disminuida, y tericamente podra aumentar la adhesin bacteriana. Por lo tanto, se decidi a comparar tres lentes de contacto de hidrogel e silicona y, como referencia, una lente de contacto de hidrogel convencional. En la prctica, estas lentes de contacto de hidrogel de silicona se utilizan para el uso diario, aadiendo el riesgo de proporcionar bacterias durante la manipulacin, algunos de ellos pueden producir un polisacrido extracelular, un biofilm llamado limo [3, 4]. La matriz de limo no slo mejora la adhesin bacteriana, pero tambin se ocupa de la virulencia. Se estudi la productora de limo cepa Staphylococcus epidermidis y Staphylococcus epidermidis y cepas de Pseudomonas aeruginosa aisladas de queratitis bacteriana en pacientes portadores de lentes de contacto blandas. El ensayo de ATP bioluminiscente es un mtodo indirecto para medir la adhesin bacteriana. El nmero de bacterias adherentes se deriva de la cantidad de ATP medida despus de la lisis celular. ATP es la tecla "combustible" molcula para muchos tipos de clulas, incluyendo bacterias, y cada tipo de clula viable se ha informado que contienen una cantidad razonable de ATP. Recuento bacteriano, otro mtodo de cuantificacin de las bacterias adherentes, no se puede detectar y contar bacterias viables pero no cultivables, que estn siempre presentes en cualquier biofilm [5, 6]. Por otra parte, la bioluminiscencia puede detectar todas las bacterias que viven tanto si son o no cultivable [7]. El propsito del presente estudio era comparar as la adherencia de las tres principales cepas bacterianas clnicas para hidrogel convencional y nuevos materiales de hidrogel de silicona para lentes de contacto, utilizacin de un procedimiento fiable y preciso, el ensayo de ATP bioluminiscente.

Materiales y mtodos Las lentes de contacto Noventa y seis lentes de contacto estriles, no usados se utilizaron durante todo el estudio. Cuatro tipos fueron utilizados: convencionales, lentes de contacto de hidrogel (Etafilcon A, Acuvue 2, Vistakon) e hidrogel de silicona lentes de contacto (Galyfilcon A, Acuvue Advance, Vistakon; Balafilcon A, Purevision, Bausch & Lomb, Lotrafilcon B, O2Optix, Ciba Vision) . Microorganismos El departamento de microbiologa del Hospital Edouard Herriot (estafilococos Centro Nacional de Referencia, Lyon, Francia) proporcion un aislamiento clnico de Staphylococcus epidermidis (N890074), ya se ha informado y se describe completamente por nuestro equipo [7-10]. Esta cepa fue aislada de lquido cefalorraqudeo infectado despus de una complicacin derivacin ventrculo en un nio con hidrocefalia, y es capaz de producir una gran cantidad de limo. Mediante el uso de amplificacin de la reaccin en cadena de polimerasa, hemos verificado previamente que esta cepa lleva a la adhesin intercelular (ica) locus que se sabe que codifican la produccin de antgenos de S. epidermidis mediar la adherencia a biomateriales y tambin entre las clulas bacterianas [8]. Esta cepa se llama "cepa 1" en el presente estudio. "La cepa 2", epidermidis aureus, fue proporcionada por el departamento de microbiologa de la National XV-XX Hospital (Pars, Francia) y "cepa 3", Pseudomonas aeruginosa por el departamento de microbiologa del Hospital Pellegrin (Burdeos, Francia). Ambos fueron aisladas de queratitis microbiana en usuarios de lentes de contacto. Para preparar suspensiones bacterianas para los ensayos de adhesin, un matraz de 100 ml de caldo de soja tripticasa se inocul con una sola colonia del organismo requiere de los cultivos iniciadores (en placas de agar almacenadas a 4 C). El matraz se incub a 37 C en una plataforma de agitacin orbital (150 rpm) durante 14 horas. El cultivo se decant en dos tubos de centrfuga de 50-ml y se centrifug a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se descart el sobrenadante, y cada sedimento celular se resuspendi en 50 ml de solucin salina tamponada con fosfato estril (PBS). Las clulas se lavaron dos veces ms, a continuacin, los pellets se combinaron y se volvieron a suspender hasta un volumen final de 50 ml en PBS. Concentracin bacteriana se ajust espectrofotomtricamente a un inculo alta de 2 108 unidades formadoras de colonias (UFC) por mililitro (ml) en una solucin estril de 0.08 M de buffer fosfato (pH 7,8) solucin salina (tampn PBS).

Las lentes se incubaron en la suspensin bacteriana durante 4 horas a 37 C, con agitacin continua (150 rpm). Se colocaron en los pocillos con superficie posterior superior. Las lentes tambin se incubaron en PBS estril como un control. Despus de la incubacin, las lentes se retiraron a pocillos frescos y se enjuagaron tres veces en un PBS 0,08 M (pH 7,8) solucin para eliminar las bacterias no unidas. Unin de la bacteria fue entonces medido y estudiado por bioluminiscente ensayo de ATP. Seis experimentos se realizaron por la lente y por cepa (y el control) (4 4 6); todos los experimentos fueron enmascarados y aleatorio, y las mediciones de ATP se llevaron a cabo con la prueba ciega. Bioluminiscencia La adherencia bacteriana a los polmeros se evalu mediante un mtodo derivado de la propuesta por Ludwicka et al. [11]. Las lentes de contacto se empaparon en 500 l de ebullicin tampn Tris-acetato (25 mM, pH 7,78 que contena 0,5% (v / v) Twee 80 y EDTA 2 mM) durante 1 minuto para extraer adenosil trifosfato bacteriana (ATP) y evitar su degradacin mediante enzims. Un control en blanco (sin lente) se prepar al mismo tiempo. Despus de 1 minuto, las muestras se enfriaron en hielo, se centrifug y el sobrenadante se almacen a -80 C. Para la medicin de ATP, 160 l de sobrenadante se mezclaron con 40 l de reactivo (ATP Juego de supervisin HS, ref 266-111 de Bio Thema). Dos segundos despus de la mezcla, la luz emitida por el sistema luciferina-luciferasa ATP se midi con un luminmetro (OptoComp I, MGM Instrumento, Hamden, CT, EE.UU.); emisin de luz es proporcional a la concentracin de ATP, en relacin directa con la concentracin bacteriana. Para establecer la cantidad de ATP bacteriano presente en cada muestra, 10 l de una solucin estndar de ATP (107 M) se aadi al medio, a continuacin, aumentar la emisin de luz se midi. La cantidad de ATP se calcula a partir de la relacin I / (I + I0), donde y (I I0 +) son las intensidades de luz emitida por bacteriana solo ATP y ATP + bacteriana por adicin de patrn de ATP, respectivamente. Los recuentos se expresaron como pM (10-12 M) de ATP por lente. Mtodo estadstico La media y la desviacin estndar se calcularon. Fueron comparados a nivel mundial con un no-paramtrico de un factor de prueba de anlisis de varianza, la prueba de Kruskal-Wallis (SPSS para Windows, versin 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.). Entonces la U de Mann-Whitney no paramtrico de prueba se utiliz para comparar pares de materiales. Un valor de p de menos de 0,05 se consider estadsticamente significativo.

Resultados La cantidad de ATP por lente, relacionado con el nmero de bacterias unidas, se midi y representado en las Figs. 1, 2 y 3. Para todas las cepas probadas, material de hidrogel convencional (Etafilcon A) unido el menor nmero de bacterias, mientras que los de hidrogel de silicona e Lotrafilcon material B mostr el mayor nivel de unin de la bacteria. Balafilcon A y Galyfilcon A mostraron niveles intermedios de unin bacteriana, dependiendo de la cepa bacteriana estudiada. El total de Kruskal-Wallis mostr que la diferencia entre los cuatro grupos fue estadsticamente significativa (p = 0,001 con la cepa 1, p = 0,0002 con la cepa 2, p = 0,002 con la cepa 3). Los resultados de la comparacin entre los 4 tipos de biomateriales de lentes de contacto, hechos con una Mann Whitney no paramtrica = prueba, se muestran en la Tabla 1. El patrn de adhesin, consistente a travs de todas las cepas, sin embargo, mostraron grandes diferencias en los niveles de adhesin de lnea de base entre las cepas. Por lo tanto, la adhesin primaria de P. aeruginosa fue tpicamente de al menos 20 veces mayor por la lente que el observado con los dos cepas de S. epidermidis (Figs. 1, 2, y 3).

Tabla 1 significacin de las diferencias entre los tipos de lentes de contacto de acuerdo con la prueba de Mann-Whitney no paramtrico. Discusin La bioluminiscencia [12] es un mtodo simple y rpido para evaluar el nmero de bacterias adheridas a las superficies [11]. Se proporciona un ensayo muy sensible para la ATP, con un lmite de deteccin tan bajo como 10-16 moles, de 100 a 10.000 veces ms sensible que espectrofotometra [13, 14], es decir Por lo tanto, la bioluminiscencia parece mucho ms preciso que el recuento bacteriano. Segn muchos autores, la correlacin entre la concentracin de ATP y el nmero de clulas bacterianas es bastante satisfactoria, y la sensibilidad del mtodo, que requiere solamente cantidades muy pequeas de reactivos, hace que sea rentable [15]. Por lo general, el nmero de UFC se calcula a partir de la cantidad de ATP a travs de una curva de regresin lineal usando los valores logartmicos de ATP y CFU [15], y la cuantificacin de ATP celular corresponde a una valoracin de la actividad celular [11, 16]. Sin embargo, dentro de un biofilm, no todas las bacterias tienen la actividad metablica mismo, puesto que el metabolismo bacteriano se cualitativamente modificada cuando las bacterias se fijan [5]. Las bacterias situadas en las capas ms profundas de la biopelcula

expresadas reduccin de la actividad metablica [5]. Por esa razn, los resultados se expresaron como pM de ATP por lente en lugar de CFU por lente. S. epidermidis y Pseudomonas aeruginosa son los microorganismos ms comunes implicados en la queratitis bacteriana en usuarios de lentes de contacto [17-19]. Aqu, el nivel de adherencia vari con la especie de bacteria. De hecho, la adhesin de P. aeruginosa despus de 4 horas era siempre por lo menos 20 veces mayor que para S. epidermidis, cualquiera que sea el tipo de lentes de contacto estudiado. Este patrn se ha informado anteriormente [20, 21]. En efecto, la etapa de enjuagado retira tpicamente aproximadamente ms del 90% de las clulas de S. epidermidis, un porcentaje ms alto que el de P. aeruginosa [22]. Debido a su naturaleza, las adhesinas producidas por S. epidermidis puede no ser capaz de superar las fuerzas electrostticas de repulsin en el mismo grado como las adhesinas de P. aeruginosa. Adems, se ha demostrado que la adhesin primaria de P. aeruginosa se produce ms rpidamente que la de S. epidermidis [22]. Nuestros resultados podran haber mostrado una menor diferencia entre los niveles de P. aeruginosa y S. epidermidis de adhesin si el tiempo de incubacin haba pasado ms de 4 horas. En efecto, se puede hipotetizar que, despus de un perodo de tiempo ms largo, la colonizacin del biomaterial lente podra ser similar para cualquiera de las cepas utilizado. Variabilidad de las cepas no es el nico factor determinante de la adhesin bacteriana a las lentes de contacto. Las propiedades de los materiales de lentes de contacto tambin influenciado adhesin. Las diferencias entre los materiales de las lentes de hidrogel de silicona e hidrogeles convencionales son considerables, y puede dividirse en general en las diferencias entre los ropiedades a granel y los atribuibles a la superficie. Sus principales caractersticas se resumen en la Tabla 2. Las diferencias entre la adhesin bacteriana se deben principalmente a las propiedades superficiales. tabla 2 Caractersticas de los materiales comunes de lentes de contacto de hidrogel y los materiales de lente de hidrogel de silicona Etafilcon A pertenece a los materiales de hidrogel convencionales. Para este objetivo, el contenido de agua es ms alta y la transmisibilidad de oxgeno ms bajo (Tabla 2). En los materiales de hidrogel de silicona, caucho de silicona se combina con monmeros de hidrogel convencionales. El componente de silicona de estos materiales de lentes proporciona la ventaja de una permeabilidad al oxgeno muy alta, mientras que el componente de hidrogel facilita el transporte de la flexibilidad, la capacidad de humectacin y fluido, el cual movimiento de la lente SIDA, pero tiene la desventaja de hidrofilicidad disminuido [23].

El proceso de combinacin de monmeros convencionales de hidrogel de silicona result ser un enorme desafo, y que ha tomado ms de 20 aos de aporte considerable intelectual y los recursos financieros para crear estos materiales y diseos, explicando por qu el proceso a veces se mantiene en secreto. Material de CIBA Vision O2Optix, lotrafilcon B, emplea un co-continua estructura molecular bifsica o de dos canales, en el que las fases persisten desde la parte frontal a la superficie posterior de la lente [24]. Material de Bausch & Lomb PureVision, Balafilcon A, es una combinacin homognea de la polidimetilsiloxano monmero que contiene silicona (un derivado de carbamato de vinilo de TRIS) co-polimerizar con el hidrogel hidrfilo monmero N-vinil-pirrolidona (NVP). Materiales Vistakon de Acuvue Advance, Galyfilcon A, es el ms nuevo de los tres materiales, y muy poco se ha publicado hasta la fecha de su composicin [25]. Es el primero de los llamados "segunda generacin" hidrogeles de silicona-[26]. La adhesin bacteriana a un biomaterial se afirma que dependen de la hidrofobicidad o hidrofilicidad del biomaterial, y por lo tanto del tipo de polmero utilizado para la construccin de la lente de contacto. La mayora de los autores han concluido que la hidrofobicidad es un factor importante para promover la unin bacteriana [3, 27-29]. Est directamente relacionado con el contenido de agua y el ngulo de contacto de agua de los biomateriales [23]. Adems, la adhesin se conoce para disminuir con el contenido de agua de las lentes de contacto [20]. Este ltimo hallazgo perfectamente de acuerdo con los presentes resultados. Etafilcon A presenta el mayor contenido de agua (58%) entre las cuatro lentes de contacto estudiadas y el ms bajo de unin bacteriana, mientras que lo contrario es cierto para Lotrafilcon B (Tabla 2). Sin embargo, mucho esfuerzo se ha dedicado inicialmente a la prestacin de hidrogel de silicona superficies ms hidrfilos, para reducir la sensacin de sequedad, para aumentar la humectabilidad de la superficie de los materiales y reducir la deposicin de lpidos, y para permitir el movimiento buena lente. Las superficies de las lentes O2Optix Lotrafilcon (B) se modifica permanentemente en una cmara de plasma de gas reactivo para crear un ultra fino permanente, (25 nm), superficie hidrfila continua [24, 30]. Lentes PureVision (Balafilcon A) se tratan superficialmente en una cmara de plasma de gas reactivo que transforma los componentes de silicona en la superficie de las lentes hidrfilas compuestos de silicato en [31]. Glassy, isla-como, discontinuo silicato de "islas" nmero [31], y la hidrofilia de estas reas "puentes" el balafilcon hidrofbico subyacente de un biomaterial.

Anlisis de las superficies tanto PureVision y O2Optix ha demostrado que estos tratamientos de superficie han sido slo parcialmente eficaz en enmascarar de silicona, con las lentes de silicona que tienen significativamente ms expuestos en la superficie de las lentes convencionales, y una superficie ms hidrfoba [32, 33]. Estas reas hidrofbicas podra fcilmente pero parcialmente explicar por qu la adhesin bacteriana difiere entre estos biomateriales. Adems, los tratamientos superficiales de Purevision convertido en una parte integral de la lente, y no son los revestimientos de superficie como O2Optix que pueden ser fcilmente "pelado" lejos del material de base durante el manejo y la limpieza diarios o durante los experimentos in vitro. En esta situacin, las reas ms hidrfobos estn expuestos, y quiz de este fenmeno parcial "stripping" tambin ocurri durante nuestro proceso de lente, lo que puede explicar por qu la adherencia bacteriana fue siempre mayor en lentes de contacto O2Optix en nuestro estudio. Sin embargo, no estudiamos el aspecto de la superficie de contacto despus de nuestro proceso. No hay datos todava existe en la cantidad de silicona expuesto sobre la superficie Advance. En efecto, el material de Acuvue Advance (Galyfilcon A) es el primero no tratada en la superficie de hidrogel de silicona, usando un agente humectante interno (Hydraclear ) diseado para proporcionar una capa hidrfila en la superficie del material que "protectores" la silicona, lo que reduce el grado de hidrofobicidad se observa tpicamente en la superficie de siloxano-hidrogeles. Detalles sobre el material adelantado son escasos hasta ahora. Una hiptesis adicional original para explicar las diferencias en la adhesin bacteriana es que la transmisibilidad de oxgeno directamente lente podra promover la unin de las bacterias. En efecto, el oxgeno es necesario para el crecimiento de las bacterias aerbicas y por lo tanto la adhesin y la formacin de biopelculas. Adems, en el interior de una biopelcula, la reduccin del transporte de oxgeno en las capas ms profundas explica la reduccin de la actividad metablica [5, 34, 35], lo que sugiere la importancia de la disponibilidad de oxgeno. Recientemente se ha demostrado que el ultrasonido fue capaz de aumentar la tasa de crecimiento de planctnicas Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli y las clulas adheridas a las superficies [36]. Se plante la hiptesis de que el ultrasonido aumenta la velocidad de transporte de oxgeno y nutrientes a las clulas. Por lo tanto, se podra hipotetizar que la ms alta es la transmisibilidad de oxgeno de las lentes de contacto, mayor es la adhesin bacteriana. Material de transmisibilidad de oxgeno no puede tener ningn impacto en la unin bacteriana a la superficie frontal de la lente, como todas las superficies delantera de la lente estn expuestos al nivel de oxgeno atmosfrico mismo. Pero esto es completamente diferente de la superficie posterior de la lente, la superficie en

contacto con la superficie ocular. Por este lado, el oxgeno se suministra o bien por las lgrimas o a travs de la lente de contacto, que es, precisamente, dependiente de la transmisibilidad de oxgeno lente. Aunque esta hiptesis concuerda perfectamente con nuestros resultados (Tabla 2), tenemos que tener en cuenta que nuestros resultados se han obtenido slo in vitro. En efecto, en los seres humanos, las consecuencias de una transmisibilidad de oxgeno ms bajo en los cambios epiteliales debido a la hipoxia son mayores que el grado de adhesin bacteriana. Lente inducida por hipoxia crea un entorno que resulta en un epitelio ms susceptibles a la adherencia bacteriana y la queratitis por consiguiente. Esta declaracin ha sido demostrada no slo en modelos animales [37], sino tambin en los seres humanos [38]. Sin embargo, la adhesin de P. aeruginosa a las clulas exfoliadas de la superficie de la crnea de los portadores de lentes de contacto blandas con baja permeabilidad al oxgeno era mayor que para aquellos con alta permeabilidad al oxgeno. Algunos informes epidemiolgicos indican que hay una mayor incidencia de queratitis en usuarios que duermen con las lentes de contacto en comparacin con aquellos que usan lentes slo durante sus horas de vigilia (hipoxia corneal inferior) [39]. La adhesin bacteriana a lentes de contacto est fuertemente relacionada con la produccin de biofilm. Por lo tanto, para algunas superficies de las lentes de contacto que son ms resistentes a la adhesin bacteriana, el nmero de queratitis bacteriana relacionada con lentes de contacto puede disminuir [40]. Sobre la base de nuestros resultados, se podra especular que las lentes de contacto estndar HEMA reducira el riesgo de infeccin corneal. Nuestro estudio fue, sin embargo, llev a cabo en lentes de contacto sin usar propiedades cuya superficie no necesariamente reflejan aquellos de los lentes de contacto in situ. Los resultados son contradictorios en la literatura. En efecto, despus de un desgaste continuo, sobre todo durante la primera semana, se ha demostrado que las propiedades de superficie cambia, lo que resulta en un aumento de la humectabilidad debido a depsitos de lpidos y protenas, lo que disminuye el riesgo de adherencia bacteriana para uso continuo de lentes de hidrogel de silicona-[41]. Pero tambin se ha demostrado que la P. aeruginosa tienden a adherirse a las lentes de contacto ms desgastada que las lentes no usados [42]. Sin embargo, es muy difcil de reproducir experimentalmente las propiedades superficiales de lentes usados como, entre otras razones, la composicin de la biopelcula es siempre cambiante. Aunque la importancia clnica de los resultados in vitro nuestro est pendiente de confirmacin, este tipo de estudios in vitro sigue siendo esencial para analizar y comprender los mecanismos bacterianos de adherencia y de encontrar nuevas formas de prevenirlos.