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INTRODUCTION

Les cocci Gram positif occupent en pathologie humaine une place importante par leur nombre et la gravit des infections quils provoquent. Ce sont des espces bactriennes constitues par des cellules de forme arrondie (cocci ou coques) immobiles, Gram positif, arobie anarobie facultative, dont limportance mdicale est trs grande. Nous distinguons : - Les Staphylocoques appartenant au genre Staphylococcus - Les Streptocoques appartenant au genre Streptococcus - Les Entrocoques Les Staphylocoques sont responsables chez lhomme dinfections qui peuvent tre localises et de propagation directe en atteignant essentiellement le revtement cutan. Elles peuvent aussi diffuser par voie sanguine en prenant un caractre septicmique avec un polymorphisme symptomatique extrme. La plupart des Streptocoques sont des commensaux habituels des cavits naturelles ou des tguments. Mais certaines espces peuvent devenir pathognes dans certaines circonstances et tre responsables dinfections streptococciques svres. Les entrocoques sont des commensaux du tube digestif, responsables dinfections urinaires et dendocardites. Les plus frquemment isols sont Enterococcus faecalis et moindre degr Enterococcus faecium. La frquence et la gravit de ces infections traduisent des difficults de prise en charge, lies non seulement lidentification de ces bactries mais galement lmergence et la propagation de souches multirsistantes. Lutilisation rationnelle des antibiotiques en clinique humaine devrait ncessairement passer par ltude in vitro de la sensibilit des bactries pathognes aux diffrentes molcules antibiotiques. Ceci permettra aux cliniciens davoir le choix dune antibiothrapie de premire intention adapte aux donnes pidmiologiques locales. Pour ce faire, diffrentes mthodes dtude in vitro de la sensibilit sont actuellement disponibles dans le commerce. Cependant ces mthodes se sont avres trs coteuses pour beaucoup de structures sanitaires de nos pays en voie de dveloppement dont les revenues faibles ne permettent pas laccs ces techniques.

En vue de pallier les contraintes de ces mthodes, des micromthodes dtude de la sensibilit, simples, fiables et peu onreuses ont t mises au point lunit de recherche et de biotechnologie microbienne du laboratoire de bactriologie et virologie de lhpital Aristide Le Dantec : les plaques micro-CSB Sensibilit. Lefficacit et la fiabilit de ces microplaques ont t dmontres et valides par des tudes antrieures [5, 19, 32,45]. Nanmoins ces plaques sont toujours un dlai de lecture de 24h. Dans un souci davoir une bonne lecture des microplaques de sensibilit en un intervalle de temps court, lobjectif de notre travail tait de : Dterminer grce ltude de la croissance linoculum adquat pour une bonne tude de la sensibilit des cocci gram positif avec les plaques micro-CSB Sensibilit Dterminer le dlai ncessaire de lecture des plaques de sensibilit. Ainsi aprs un bref rappel bibliographique, nous aurons tudier le temps dincubation des micro-plaques de Sensibilit-CSB en fonction des diffrents inocula avant de valider la mthode par le critre de linarit

I- RAPPEL SUR LES STAPHYLOCOQUES I-1- DEFINITION Les staphylocoques sont des cocci Gram positif, immobiles, asporuls et habituellement non capsuls. La plupart des espces sont aro-anaerobies facultatives, catalase positive, lexception de S.saccharolyticus et S. aureus subsp. anaerobius. Ce sont des germes dpourvus doxydase en dehors de S.lentus, S.sciuri et S.caseolyticus. I-2- HISTORIQUE [36] Les staphylocoques ont t identifis par dminents microbiologistes linstar de Koch, Pasteur, Ogston et Rosenbach. En 1878, Koch souligne le rle pathogne des bactries se prsentant sous forme de cocci gram positif. Ces cocci seront ensuite isols puis identifis dun pus par Louis Pasteur en 1880. Ils seront baptiss en 1883 par Ogston sous le nom de staphylocoques, du latin <<staphylla>> ou grappe et <<coccus >> ou grain. En 1884, ils sont classs en fonction de la pigmentation des colonies par Rosenbach en S.aureus du latin << orange >> et S.albus, du latin << blanche >>. I-3- TAXONOMIE ET CLASSIFICATION Les staphylocoques appartiennent la famille des micrococcaceae qui comprend quatre genres qui diffrent par la composition en base de leur ADN G+ C (mol %) - Micrococcus - Staphylococcus - Stomatococcus - Planococcus Les espces appartenant ces genres possdent une catalase et se dveloppent en arobie. Les cocci Gram positif en amas qui se dveloppent uniquement en arobiose sont dnomms Peptococcus [42]

Le genre Micrococcus Comprend les microcoques qui sont galement des htes normaux de la peau et des muqueuses de lhomme et par consquent souvent prsents dans les prlvements. Ce sont presque toujours des contaminants quil importe de distinguer des staphylocoques. Le genre Staphylococcus Plus de 30 espces de staphylocoques ont t identifies dont la plupart sont trouves seulement chez les mammifres infrieurs [48] Leur classification a subi depuis 30 ans dincessants changements aboutissants une meilleure prcision grce la prise en compte non seulement des classiques caractres morphologiques, physiologiques et mtaboliques mais aussi de certains caractres gntiques, antigniques et cologiques. Il existe malheureusement non pas une seule mais plusieurs classifications, quil est cependant utile de connatre en pratique [23]. - classification de Baird-Parker Elle ne reconnat que trois espces bien dtermines : S.aureus, S.epidermidis et S.saprophyticus. Mais beaucoup de souches de staphylocoques demeurent inclassables. Les espces S.epidermidis et S.saprophyticus comprennent chacune 4 biotypes. - classification de Kloss et Schleifer Ces auteurs distinguent dix espces dans le genre Staphylococcus. Certaines dentre elles sont bien individualises ; dautres sont regroupes sur la base de caractres communs. Malgr cette division du genre, la pratique montre quil reste 15% de souches inclassables. - subdivision des souches de staphylococcus aureus en fonction de lorigine animale. Espce ubiquitaire, S.aureus sest cependant adapt diverses niches cologiques et des biotypes ont t dcrits chez les diffrentes espces animales. Rcemment Hajek et Marsalek ont propos une subdivision en 4 biotypes A, B, C et D.

Les biotypes E et F initialement dcrits ont t regroups dans une espce : S.intermedius. Deux autres espces ont t rcemment identifies : S.hyicus et S.sciuri. Mais rcemment la famille des Micrococacceae a t dmantele et lespce S.aureus nest plus regroupe avec dautres genres bactriens. En 1998, 41taxons incluant 35 espces et 7 sous espces ont t dcrits [23] S.aureus exprime des caractres qui le diffrencient des autres staphylocoques : il possde notamment une coagulase et est souvent pathogne. On loppose classiquement aux autres staphylocoques non producteurs de coagulase et plus rarement responsables dinfections. Le genre Stomatococcus Comprend Stomatococcus nucilaginosus qui fait partie de la flore buccale. Le genre Planococcus Comprend des bactries du milieu marin. I-4- HABITAT [22, 42] Il sagit de germes trs rpandus dans la nature (air, eau, sol). Les staphylocoques en particulier les espces Staphylococcus aureus et Staphylococcus epidermidis, font partie de la flore normale de nombreux individus qui sont des <<porteurs asymptomatiques>>. Cependant ces souches peuvent tre lorigine dauto-infections ou contaminer dautres individus. Les staphylocoques peuvent tre trouvs particulirement dans les fosses nasales antrieures. Les staphylocoques sont fragiles et vivent ltat commensal au niveau des tguments ou des muqueuses de lhomme ou des animaux. Certains groupes sont rencontrs dans le sol, dans lair et dans leau. Leur prsence normale au niveau cutanomuqueux explique quils peuvent contaminer frquemment des prlvements et constituer des souillures.

I-5- CARACTERES BACTERIOLOGIQUES I-5-1- Caractres morphologiques Dans le pus S.aureus se prsente sous laspect de cocci en petit amas, en diplocoques ou en trs courtes chanettes (3 5 lments), mesurant 0,8 1m, positivement colors au Gram. Sur les cultures en milieu solide il se dispose en <<grappe de raisin >>, alors quen milieu liquide il est isol en diplocoques. Il est immobile, non sporul et ne possde pas de capsule visible au microscope optique sauf de trs rares souches (souches Smith) [23] I-5-2- caractres culturaux Staphylococcus aureus est un germe arobi-anaerobie facultatif. Il croit abondamment sur milieu glos (colonies de 1 2 mm de diamtre) ; certaines souches produisent un pigment jaune orang, mais cette production est irrgulire [42], car certaines donnent des colonies blanches ; le caractre pigmentaire nest pas propre lespce. La culture est obtenue en 18 24 heures 37 C (culture possible entre 10 et 45 C) sur milieux ordinaires. S.aureus pousse en prsence de fortes concentrations salines (milieu slectif de chapman 75% de Nacl). Le pH optimal est de 7,0 7,5. Certains facteurs de croissance sont indispensables (vitamine B1, acide nicotinique) [42] En bouillon ordinaire, la culture est rapide et les staphylocoques se multiplient en quelques heures, formant un trouble homogne ou un dpt. Il ny a pas de production de pigment en milieu liquide. Sur glose ordinaire, les colonies sont lisses, rondes, bombes et leur diamtre est de 1mm. A +4 C, les staphylocoques conservent leur vitalit pendant 3 mois dans le pus, pendant 1 an sur glose, ils sont dtruits 58 C au bout de 60mn. Leur croissance est inhibe par les andrognes et la progestrone. Staphylococcus aureus possde un quipement enzymatique permettant de mtaboliser de nombreux substrats (glucides, lipides, protides). [22]

Il existe des colonies naines de S. aureus provenant de milieux contenant certains sels minraux (chlorure de lithium ou de baryum), certains colorants (violet de gentiane, acrydine orange), certains antibiotiques (methicilline, aminoside) ou provenant de prlvements de patients mis sous antibiotiques. Ces souches retrouvent gnralement leurs caractres culturaux normaux aprs une ou deux subcultures. [33] Les caractres culturaux, physiologiques et mtaboliques des espces de staphylocoques ont t donns dans les tableaux I et II Tableau I : Classification des staphylocoques (daprs Baird.Parker, 1974) [47]
S. aureus Coagulase Acidification arobie du mannitol Acidification anarobie du mannitol Production d - toxine Nuclase thermostable Exigence en biotine Acide ribitol teichoque parital Acide glycrol teichoque parital Protine A paritale Sensibilit la novobiocine + + + + + + + S S. epidermidis d + + S S. saprophyticus d NT + + R

Lgende : + : 90p.100 ou plus de souches positives ;- : 90p.100 ou plus de souches ngatives ; d : moins de 50p.100 de souches positives ou ngatives ; NT : non teste ; S : sensible ; R : rsistant.

Tableau II : Classification simplifie des staphylocoques cutans dorigine [47] humaine (daprs Kloos et Schleifer 1975)
Croissance anarobie en thioglycate

Diamtres des colonies (5j>5mm)

Hmolyse (rythocytes de buf

Xylose/Arabinose

Staphylococcus

Novobiocine (R 1,6g/ml)

lysostaphine (R 50 g/ml)

Rduction du nitrate

Phosphatase

Saccharose

Mlzitose

Coagulase

Galactose

Trhalose

Turanose

Mannitol + + +-

Mannose

Fructose

Maltose

Lactose

aureus saprophyticus epidermidis haemolyticus

+ + (+)

+ +/ + C

+ + +

(+) - (+)

+ + +

+ (-) + (-)

+ -

+ -

+ + + -+

+ (+) V

(+) (+) -

+ (-)

+ + + +

(+) (+) (+) -+

+ + + +

+ + +

(+) + V V

(-) -

+ -

Lgende : + positif ; faible ; - : ngatif ; V : variable ; ces signes indiquent une frquence de 90 100p.100 ; entre () ils indiquent une frquence de 70 89 p.100 ; C : gradient avec de grosses colonies. Dans lensemble, S. epidermidis a un mtabolisme beaucoup plus faible que S. aureus.

Xylitol

Ribose

I-5-3- Caractres biochimiques L'tude des diffrents caractres biochimiques et mtaboliques des souches de staphylocoques a permis le dveloppement de galeries d'identification rapides et efficaces, permettant de dfinir les diffrents profils biochimiques de souches appartenant une mme espce [28]. I-5-3-1- Caractres gnraux Les staphylocoques possdent une catalase l'exception de S. aureus sous espce anarobius que l'on retrouve exclusivement chez les moutons [28, 30] et qui est une souche anarobie stricte. Ce sont des germes dpourvus d'oxydase en dehors de S. lentus, S. sciuri et S. caseolyticus [28, 24]. I-5-3-2- Production d'Urase [29] Les bactries hydrolysent toute l'ure mais seules celles ayant une urase constitutive, c'est dire dont la synthse est indpendante de la prsence du substrat, vont arriver alcaliniser le milieu, entranant le virage de l'indicateur color L'urase est galement une enzyme inductible. La recherche de l'urase repose sur la libration d'ions ammonium qui alcalinisent le milieu, entranant le virage du rouge de phnol du jaune au rouge cerise. I-5-3-3- Production d'actone [29] Les micro-organismes produisent lors de leur mtabolisme, de nombreux produits de dgradation qui comme dans le cas ci-prsent peuvent tre recherchs. L'actone en langage courant, ou hydroxy-3-butanone ou encore dans la nomenclature ancienne actyl-mthyl-carbinol (AMC) est un produit de dgradation du glucose au cours de la fermentation 2-3 butylne glycolique en passant par l'actolactate et le diactyl. Elle peut galement tre obtenue par condensation de deux molcules de pyruvate. Il existe entre autres, la mthode conventionnelle de Voges-Proskauer miniaturise ou non, incorpore aux mthodes biochimiques didentification des staphylocoques disponibles dans le commerce.

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I-5-3-4- Production de dcarboxylases [29] La production de l'ornithine dcarboxylase (ODC) concerne essentiellement l'espce S. lugdunensis et secondairement certaines souches de S. epidermidis dont l'enzyme a cependant une activit retarde. Les dcarboxylases sont des enzymes qui sont actives pH acide ; le milieu d'tude sera donc acidifi par la fermentation du glucose puis ralcalinis par l'action des dcarboxylases sur le substrat qui est un acide amin. Les dcarboxylases scindent les acides amins avec formation de l'amine correspondante et libration de dioxyde de carbone selon la raction suivante : Les enzymes recherches le plus souvent sont : - l'ornithine dcarboxylase (ODC) - l'arginine dihydrolase (ADH) - la lysine dcarboxylase (LDC) I-5-3-5- Production de la bta-galactosidase [29] La -galactosidase est une enzyme bactrienne inductible, existant un niveau de base dans le milieu intracellulaire, capable de scinder la molcule de lactose en sucres simples que sont le glucose et le galactose aprs avoir travers la paroi cellulaire sous l'action de la bta-galactosidase permase. Le terme ONPG hydrolase est plus propos que celui de bta-galactosidase dans la mesure o il prcise que le substrat utilis est lONPG et non le lactose. En effet ; il existe des germes qui reconnaissent lONPG du cot du nitro-2-phnol et non de celui du bta-galactotosidase. Ces germes ont donc une activit ONPG hydrolase tout en ne fermentant pas le lactose. Le test l'ONPG est une technique relativement simple, base sur l'action directe de l'enzyme sur une molcule chromogne pouvant tre l'ortho- nitrophnyl-bta-Dgalactopyranoside, ou le 2-naphtol-bta-D-galactopyranoside. Ceux-ci sont utiliss comme substrats et librent respectivement l'orthonitrophnol jaune et le bta-naphtol qui se combine au sel de Fast blue B en solution dans le 2-mthoxythanol pour donner une coloration rouge pourpre. I-5-3-6- Rduction des Nitrates La rduction des nitrates et des nitrites constitue un des caractres taxonomiques importants chez les staphylocoques lors de leur identification. Ce test permet d'tudier la raction de rduction des nitrates en nitrites sous l'action du nitrate rductase produite par certains staphylocoques.

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La raction sera mise en vidence par l'addition d'acide sulfanilique et d'alphanaphtylamine qui rvlent la prsence de l'ammoniaque libre I-5-3-7- Utilisation des hydrates de carbone Les glucides sont utiliss de trois manires diffrentes par les staphylocoques : soit aprs conversion par l'action disomrases, soit aprs hydrolyse en sucres simples ou directement, s'ils sont fournis sous une forme simple (glucose, fructose) [33]. L'assimilation tudie surtout par la voie fermentaire mais galement par la voie oxydative se traduit presque toujours par l'accumulation de drivs acides quelle que soit la voie de dgradation.

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II- STREPTOCOQUES ET ENTEROCOQUES II-1- DEFINITION Ce sont des cocci gram positif ; les cellules peuvent tre ovodes, sphriques ou rarement allonges en btonnets, et se divisent en un seul plan pour former des paires ou plus souvent des chanettes. Ils sont dpourvus de cytochrome et de catalase. Le contenu en (G + C) est compris entre 33 et 42. [42] II-2- HISTORIQUE [21, 17, 2, 41] Le nom Streptococcus (streptus : flexible ; coccus : grain) fut pour la premire fois attribu par BILBROTH et EHRLICH des coques formant des chanettes observes dans les prlvements provenant de blessures infectes. PASTEUR, CHAMBERLAND et ROUX (1881) rendirent compte d'une infection septicmique obtenue chez les lapins inoculs avec de la salive humaine. FAHLEISEN (1883) dcrivit une coque similaire comme agent de l'rysiple. Le nom de Streptococcus pyogenes fut donn par ROSENBACH (1884) des coques groupes en chanettes et isoles de lsions suppuratives chez l'homme. NOCARD et MOLLEREAU (1887) dcouvrirent le "Streptococcus de la mammite de Nocard" qui ensuite fut appel Streptococcus agalactiae. LANCEFIELD, en 1933 dcrivit les groupes srologiques de A F. Les souches de rfrence de streptocoques du groupe B taient dorigine bovine. Les infections nonatales dues ce groupe ont t plus rcemment signales en 1962 par REITEL et collaborateurs et par WAHL et collaborateurs en 1964 par EICKHOFF et coll. SCHULTZ dcrivit les streptocoques isols de lsions de pneumonie et de gourme chez les chevaux. SCHLEIFER ralisa la sparation des deux genres Streptococcus et Enterococcus en 1984. Les infections streptocoques qui autrefois taient considres comme propres aux pays froids et humides sont maintenant frquentes en zone tropicale particulirement en Afrique de l'Ouest. Pour ce qui est du Sngal, les premiers travaux ont t dcrits avec les infections streptocoques hmolytiques du groupe A.

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D'autres suivirent et permirent de dmontrer que ces affections occupaient la deuxime place des statistiques cardiologiques de villes africaines. II-3- CLASSIFICATION Il nexiste pas de critre unique qui permette de classer en pratique les diffrentes espces du genre Streptococcus. La classification fait appel ltude de plusieurs types de caractres bactriologiques. [42] Selon leur pouvoir hmolytique, on distingue : - des souches hmolytiques : hmolyse incomplte - des souches hmolytiques : hmolyse complte - des souches non hmolytiques () : pas dhmolyse. Ce critre ancien na plus aujourdhui quune valeur dorientation. Selon lquipement antignique : classification de Lancefield (1933). Elle sappuie sur des critres immunologiques qui permettent de dtecter des antignes spcifiques de groupe. La plupart des espces de streptocoques, notamment bta hmolytiques, possdent dans leur paroi un polysaccharide C dont la composition et les proprits antigniques permettent de dfinir des groupes srologiques. La classification de Lancefield distingue 20 groupes srologiques (dsigns par des lettres de A M et de K W). [42] Certaines espces dpourvues de polyoside C sont souvent des souches non hmolytiques ou donnant une hmolyse dite viridans. Elles sont dites non groupables . [42] La technique de Lancefield comprend une extraction du polyoside C partir dune suspension de la souche par lacide chlorhydrique chaud ou par lacide nitrique ou la formamide. Selon les caractres biochimiques qui permettent dindividualiser des espces dans le genre Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus bovis, etc

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Les critres de la taxonomie molculaire ont permis de dfinir des groupes gnomiques et dindividualiser de nouvelles espces. Le squenage dun fragment de lARN 16 S conduit reconnatre 6 groupes : - les pyognes (groupes A, B et C), - les streptocoques oraux ou viridans en 3 groupes, - les streptocoques du groupe D, - les streptocoques non classs. [42] Une classification encore largement accepte, base sur des tests srologiques et biochimiques reconnat quatre divisions principales : - Streptocoques pyognes (habituellement hmolytiques possdant un antigne polyosidique de groupe), - Entrocoques (rsistant 6,5 p.100 de Cl), - Streptocoques lactiques (isols principalement des produits laitiers), - Streptocoques viridans (dpourvus dantigne de groupe). [25] II-4- HABITAT Les streptocoques appartenant la famille des Streptococcaceae sont retrouvs l'tat commensal sur la peau et les muqueuses [49]. Ce sont des germes ubiquitaires. Les Streptocoques du groupe D sont retrouvs dans l'intestin et ceux du groupe B dans les voies gnitales. Dans la bouche on a les streptocoques non groupables appels salivarius, sanguis, mitis, mutans ; qui donnent des dextranes jouant un rle dans les caries dentaires. II-5- CARACTERES BACTERIOLOGIQUES II-5-1- Caractres morphologiques [30, 49] Ils se prsentent sous forme de coques ovodes ou sphriques Gram positif et groupes en chanette. Les chanettes rsultent de la non sparation des paires de coques en division et se prsentent comme une succession de diplocoques. Par contre, la formation de chanettes est de rigueur dans les milieux artificiels et dans les exsudats purulents des lsions ouvertes. Les Streptocoques des groupes A, C, G caractriss par de longues chanettes donnent sur milieux liquides une culture en dpt.

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Les autres donnent un trouble homogne du bouillon et se prsentent alors sous la forme de diplocoques (S. pneumoniae) ou de courtes chanes (streptocoques du groupe B, S. bovis). Le phnomne de capsulation peut tre observ avec les streptocoques du groupe A et surtout du groupe C dans la phase exponentielle de croissance. Dans les cultures ges les coques deviennent Gram ngatif. Les streptocoques dficients prsentent des anomalies morphologiques constantes lors de l'isolement. D'une manire gnrale, les streptocoques du groupe A sont constitus de cellules bien arrondies. Ceux du groupe D ont une forme de ballon de rugby Streptococcus pneumoniae possde un aspect en flamme de bougie. II-5-2- Caractres culturaux [5, 6, 30] Les streptocoques peuvent pousser sur des milieux usuels mais nanmoins, ils ont des exigences nutritives trs complexes. Tous les streptocoques sont aro-anarobies. Ce sont des germes trs fragiles. La temprature idale de croissance est comprise entre 20 et 42C avec un optimum 3537C. II-5-2-1- Culture sur milieux usuels La plupart des streptocoques poussent sur ces milieux et ralise sur glose nutritive des colonies trs fines transparentes disperses la surface en grain de semoule avec une couleur lgrement bleute. Cette culture tant difficile, il est prfrable de la raliser sur milieux enrichis. II-5-2-2- Culture sur milieux enrichis Certaines substances sont habituellement utilises pour enrichir les milieux. Ce sont les peptones, les extraits de viande ou infusion de cur-cervelle, le sang, le srum et / ou l'ascite.

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Les milieux peuvent se prsenter soit sous forme liquide, soit sous forme solide. Milieux liquides d'enrichissement [30] Les Streptocoques supportent trs mal les milieux glucoss. En effet le glucose par voie fermentative donne de l'acide lactique avec un abaissement du pH qui rend le milieu hostile. C'est la raison pour laquelle on utilise le bouillon glucos tamponn (B.G.T.). On peut galement utiliser le bouillon streptosel. Les Streptocoques donnent soit un trouble homogne avec ou sans dpt (groupe B, D), soit une pousse granulaire avec sdimentation rapide, le surnageant pouvant tre limpide ou lgrement trouble (A, C, G). Milieux solides d'isolement [5, 30] Les milieux les plus gnralement utiliss sont les gloses enrichies au sang (sang de mouton ou de cheval). Ces milieux permettent de voir la capacit des streptocoques lyser les hmaties. On peut observer une pousse des streptocoques 24 heures aprs incubation l'tuve sous une atmosphre enrichie en CO2. L'aspect de la zone d'hmolyse et sa dimension sont fonction de l'hmolysine labore par la souche, du sang utilis mais galement du milieu. Sur ces milieux enrichis, on distingue diffrents types d'hmolyse. Hmolyse bta C'est une hmolyse complte. Les hmaties sont compltement lyses sur un diamtre d'environ 3 4 mm autour des colonies. Cette hmolyse s'observe en gnral avec les streptocoques des groupes A, C, G double et quelque fois quadruple celle de la zone en question. Les streptocoques du groupe B quant eux prsentent une zone d'hmolyse trs petite et par consquent pas claire.

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Hmolyse alpha Elle est incomplte. Les globules rouges ne sont que partiellement lyss sur un diamtre d'environ 1 2 mm. Cette hmolyse peut quelque fois tre accompagne d'un verdissement du milieu. On parle alors d'une hmolyse alpha viridans. Le mcanisme de cette coloration est mal connu. Hmolyse gamma ou absence d'hmolyse Il n'existe aucune trace d'hmolyse. On utilise plus couramment le terme streptocoque non hmolytique. S. salivarius et S. milleri prsentent une telle hmolyse. II-5-3- Caractres biochimiques [49] II-5-3-1- Absence de catalase Elle permet d'tablir un diagnostic diffrentiel entre Streptococcus d'une part et Staphylococcus et Micrococcus d'autre part. L'absence de catalase constitue alors un caractre clef d'orientation vers les streptocoques. II-5-3-2- Sensibilit la bacitracine [42] Ce test a t trs critiqu car cest une preuve mal standardise : la charge des disques nest pas toujours prcise par les fabricants : la densit de linoculum varie ; le diamtre de la zone dinhibition considr comme significatif nest pas toujours le mme. Si lon retient toute zone dinhibition quel quen soit le diamtre, la presque totalit des Streptocoques du groupe A est sensible la bacitracine. On utilise des disques de bacitracine 0,04 UI. Cette dose est suffisante pour provoquer sur une culture de Streptococcus pyogenes sur glose au sang, une zone dinhibition. Les Streptocoques viridans peuvent galement tre inhibs par la bacitracine.

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II-5-3-3- Le groupage antignique Il se fait laide dun antisrum monovalent dirig contre lantigne spcifique du groupe A. Plusieurs techniques existent : - la technique de LANCEFIELD, (cf. II.3. classification) - la prcipitation en milieu glos par contre immunolectrophorse, - limmunofluorescence directe, - la coagglutination de staphylocoques ou de particules de latex sensibilises par des anticorps spcifiques (actuellement la plus utilise).

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III- LA CROISSANCE BACTERIENNE III-1- DEFINITION La croissance est laugmentation ordonne de la somme de tous les composants dun organisme. Ainsi, laugmentation de la taille lorsquune cellule absorbe leau ou libre un lipide ou un polysaccharide nest pas la croissance relle. La multiplication des cellules est une consquence de la croissance ; dans les organismes unicellulaires, la croissance conduit une augmentation du nombre dindividus composant une population ou une culture. [26]. La division bactrienne est le corollaire habituel mais non oblig de la croissance. [50] III-2- LA COURBE ET LES PHASES DE CROISSANCE Si un milieu liquide non renouvel est ensemenc avec des cellules bactriennes prleves dune culture dj sature et le nombre de cellules viables par millilitre dtermin rgulirement, une courbe du type de celle de la figure ci-dessous, est habituellement obtenue [26]. La courbe peut tre segmente en 7 phases reprsentes par les chiffres 1 7.

Figure1 Les 7 phases de la cintique de croissance dune population bactrienne. Daprs Buchanan (1919). [8] - La phase de latence (1) Elle reprsente la priode o les cellules ayant puises les mtabolites et les enzymes de leur environnement initial, sadaptent leur nouvel environnement.

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Les enzymes et les intermdiaires sont forms et saccumulent jusqu ce quils soient prsents des concentrations permettant une reprise de la croissance. Elle peut tre supprime en incubant le milieu avec des bactries prleves pendant la phase exponentielle de croissance. - La phase dacclration (2) au cours de laquelle, le taux de croissance saccrot rgulirement. [50] - La phase exponentielle (3) Les cellules sont en quilibre. Le nouveau matriel de la cellule est synthtis un taux constant, mais ce matriel est galement catalys, et la masse augmente de faon exponentielle. Ceci continue jusqu ce que lun des deux phnomnes suivants se produisent : un ou plusieurs des nutriments spuisent dans le milieu, ou, que des produits mtaboliques toxiques saccumulent et inhibent la croissance. Le taux de croissance devient constant et atteint sa valeur maximale. [26,50]. - La phase de ralentissement (4), lie lpuisement du facteur limitant. La valeur de diminue progressivement. [22,50] : taux de croissance - La phase stationnaire (5), lie lpuisement de laliment, laccumulation de produits toxiques ou la constitution dun quilibre ionique dfavorable. [22] - La phase de dcroissance (6) au cours de laquelle la masse bactrienne dcrot et le taux de croissance prend des valeurs ngatives. Cette phase de dcroissance correspond une mort et une lyse progressive des bactries en prsence des dchets du mtabolisme accumuls pendant la croissance. [50] - La phase de mortalit logarithmique (7), durant cette phase le taux de mortalit par organisme reste constant. NB. Les bactries peuvent tre maintenues dans la phase exponentielle en les transfrant plusieurs reprises dans le milieu frais de composition identique. Deux dispositifs automatiques ont t invents pour suivre ce processus automatiquement : le chemostat et le turbidostat. [26]

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III-3- FACTEURS INFLUENCANT LA CROISSANCE De nombreux facteurs physiologiques affectent la croissance de la cellule bactrienne et incluent la concentration en ions hydrogne de son environnement, la temprature, lhumidit et le potentiel doxydo-rduction [40]. a) La temprature Suivant leur comportement lgard de la temprature, on distingue classiquement des micro-organismes msophiles (lchelle de temprature est comprise entre 20 et 45C). Les bactries pathognes pour lhomme font partie des msophiles et ont un optimum aux environs de 37C ; toutefois certaines espces comme Listeria monocytogenes peuvent se dvelopper + 4C. Cependant certaines bactries ne se comportent quoccasionnellement comme des parasites des organismes suprieurs (infections bactries opportunistes), et leurs conditions confrent une adaptation soit des tempratures infrieures 30C (bactries psychrophiles), soit des tempratures de lordre de 40 45C (bactries thermophiles). [35] La temprature, paramtre slectif pour la croissance des bactries, conditionne la prolifration exclusive de certaines espces dans un biotype donn. [35] Les tempratures leves sont incompatibles avec la multiplication et mme la survie des bactries, la chaleur sche au poupinel 180 C pendant 30 minutes et la chaleur humide par lautoclave 120C pendant 30 60 minutes servent pour la strilisation. [23] b) Le pH Les bactries sont gnralement tolrantes des variations de pH entre 6 et 9, grce la rgulation exerce par leur membrane lencontre des ions H+. [14] Les bactries fermentant lure et productrices dammoniaque tolrent des pH trs alcalins. [23] Dans les cultures en milieux non tamponns, les alcalins librs partir notamment des ractions de dcarboxylation des acides amins ou les acides librs par dgradation des carbohydrates peuvent modifier le pH dans des conditions telles que le milieu devient toxique pour les bactries.

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c) La pression osmotique Les bactries sont assez tolrantes vis--vis des variations des concentrations ioniques ; laffinit de certaines espces pathognes pour la salinit est utilise pour la ralisation de milieux slectifs (staphylocoques, vibrion cholrique). On dcrit des bactries halophiles exigeant plus de 2% de Cl pour cultiver tel Vibrio para haemolyticus. d) Les pressions partielles doxygne Les bactries peuvent tre groupes dans trois catgories selon leurs exigences en oxygne : - Les arobies strictes ou obligatoires sont celles qui se dveloppent en prsence doxygne. - Les anarobies strictes ou obligatoires se dveloppent seulement en labsence doxygne. - Les aro-anarobies facultatives sont des bactries qui se dveloppent aussi bien en conditions arobiques quanarobiques. Dans ce groupe, figurent la plupart des bactries dintrt mdical. e) Les radiations [22] Les bactries sont sensibles aux rayons UV, aux rayons RX, la lumire. f) Les substances antibactriennes Les antiseptiques, les antibiotiques sopposent la croissance des bactries et sont utiliss pour les dtruire. Toutefois, certaines substances sont des inhibiteurs slectifs de certains micro-organismes et on les ajoute dans les milieux pour favoriser lectivement la multiplication de bactries insensibles. III-4- TECHNIQUES DE MESURE DE LA CROISSANCE BACTERIENNE La croissance bactrienne peut tre apprcie en estimant, en fonction du temps, les variations de la masse bactrienne ou, plus souvent, du nombre de cellules. [50] Des concentrations microbiennes peuvent tre mesures en termes de concentration en cellules (le nombre de cellules viables par unit de volume de culture) ou de la concentration de biomasse (poids sec de cellules par unit de volume). Ces

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deux paramtres ne sont pas toujours quivalents, parce que le poids sec moyen de la cellule change diffrentes tapes de lvolution dune culture. Ils ne sont pas non plus dimportance gale. [26] Deux types de mthodes sont utiliss pour mesurer la croissance bactrienne : - les mthodes de numration, - les mthodes quantitatives. Mthode de numration [22, 26, 27 ,50] Deux mthodes principales peuvent tre utilises : - numration totale : elle consiste dnombrer au microscope ou avec des compteurs spciaux les individus viables ou non. Les cellules mortes ne peuvent pas tre distingues de celles en vie. Seules les suspensions denses peuvent tre comptes (>107 cellules par ml), mais des chantillons peuvent tre concentrs par centrifugation ou filtration pour augmenter la sensibilit ; - numration des cellules viables : on compte les colonies bactriennes apparues sur ou dans un milieu de culture glos convenable, inocul par une aliquote dune suspension bactrienne homogne et suffisamment dilue. Sur un milieu appropri, chaque unit viable crot et forme une colonie. Chaque colonie pouvant tre compte sappelle une unit formant colonies (UFC), et le nombre dUFC est li au nombre de bactries viables dans le milieu. Cette mthode est plus facile et de trs grande sensibilit, mais elle ncessite beaucoup de dilutions et de botes. Mthodes quantitatives [22, 26, 27, 50] Plusieurs mthodes sont envisageables, parmi lesquelles : - la mesure directe de la masse bactrienne : en principe, la biomasse peut tre mesure directement en dterminant le poids sec dune culture microbienne. Les bactries sont laves, sches et peses. Cest une mthode longue qui ncessite une grande quantit de cellules pour que les peses soient assez prcises. Mais cest la mthode de rfrence (1mg de poids sec correspond quelques milliards de corps bactriens). - la mesure de lactivit enzymatique : mesure du pH, mesure de la consommation doxygne. Ces mthodes sont peu prcises.

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- le dosage de lazote bactrien : cette mthode a les mmes applications que la mthode gravimtrique. - la mesure de la densit optique : ici on admet que labsorption lumineuse est proportionnelle la masse des microbes. Elle est rapide et prcise, mais sa sensibilit est modre, car il faut une teneur dau moins 107 bactries/ml pour obtenir une densit optique mesurable. Elle est fortement entache derreurs en cas de suspensions bactriennes non homognes. Tableau III : Exemple de comptage de cellules viables Dilution Non dilu 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 Dnombrement sur bote* Trop trouble 510 72 6 1

* Chaque dnombrement est effectu sur 3 botes [26].

III-5- CONDITIONS DE CROISSANCE DES STAPHYLOCOQUES ET DES STREPTOCOQUES III-5-1- Les staphylocoques Les staphylocoques cultivent sur des milieux contenant 5% de chlorure de sodium et certaines espces tolrent jusqu 10 et mme 15%. Les staphylocoques fermentent les sucres en produisant abondamment de lacide lactique. Ils puisent lnergie indispensable leur mtabolisme par respiration, ils possdent en effet une chane de transport lectronique adapte et en particulier des cytochromes et dautres chromoprotines porphyriniques. Staphylococcus aureus est auxotrophe vis--vis de la thiamine qui agit comme un facteur de croissance. Cest une molcule organique indispensable la croissance et qui nest pas synthtise par lorganisme.

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Les tempratures minimales et maximales de dveloppement sont respectivement de 6 8C et de 45C. Il se multiplie facilement des pH compris entre 4,0 et 9,8 mme sil affectionne plutt les pH lgrement acides. Il se dveloppe dans des milieux dont lAw est de 0,86. III-5-2- Les streptocoques La majorit des souches de Streptocoque est capable de crotre en prsence de 40% de bile mais incapable de cultiver 45C ou pH 9,6. La temprature idale de croissance est de 36C 2, le pH est de 7. Une culture est facilement obtenue sur glose au sang et les colonies, de petite taille, sont parfois pigmentes en jaune ou en orange ; lhmolyse est variable.

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IV- RAPPEL SUR LES ANTIBIOTIQUES ET LETUDE DE LA SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES IV-1- Les antibiotiques [10, 13, 20, 18, 34, 37, 38,46] IV-1-1- Dfinition dun antibiotique Les antibiotiques sont des substances chimiques ou hmi synthtiques labores par des micro-organismes et qui ont le pouvoir de sopposer la multiplication de bactries en les dtruisant ou en inhibant leur multiplication. Pour tre efficace, lantibiotique doit satisfaire aux trois conditions suivantes : - pntration lintrieur de la bactrie ; - intervention au niveau dune cible lintrieur de cette bactrie ; - lantibiotique ne doit pas tre inactiv par des enzymes pouvant tre synthtises par cette bactrie. Laction de lantibiotique sur la bactrie se traduit par : des modifications de la croissance : dans ce cas lantibiotique est bactriostatique. des modifications de la capacit de survie : dans ce cas lantibiotique est bactricide. IV-1-2- Mcanisme daction des antibiotiques IV-1-2-1- Action sur la paroi bactrienne Les antibiotiques agissant par ce mcanisme extracellulaire ne le sont que sur les germes en croissance. Les cellules qui sont au repos ne sont pas perturbes par laction de ces molcules. Les antibiotiques bloquent la synthse de la paroi, la cellule sallonge sans faire de paroi (cloison) et explose sous leffet de la pression osmotique interne. Si on ajoute un stabilisant osmotique, on obtient un protoplaste. Exemple : la pnicilline, les cphalosporines.

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IV-1-2-2- Action sur la membrane des cellules Les antibiotiques bloquent la synthse du peptidoglycane qui est un constituant de la paroi des bactries. Elles inhibent les transpeptidases et carboxypeptidases qui sont essentielles la synthse de la paroi. IV-1-2-3- Action sur lADN Les sulfamides par exemple sont des analogues structurels de molcules biologiques. La cellule va les reconnatre, les insrer dans son mtabolisme, bloquant ainsi les voies mtaboliques. Ceci provoque une inhibition de la synthse des bases nucliques indispensables la synthse de lADN. IV-1-2-4- Action sur le ribosome bactrien Approximativement, la moiti des antibiotiques utiliss en thrapeutique ont pour cible le ribosome bactrien, organite cellulaire responsable de la synthse des protines. Ces antibiotiques se rpartissent en plusieurs classes, de nature chimique et dactions diffrentes. La plupart interagissent avec lARN ribosomique. - Les aminoglycosides ou aminosides se fixent sur les sous unit 3OS et 50S des ribosomes, empchant ainsi la traduction de lARNm. - Les phnicols bloquent la formation de la liaison peptidique. Ils se fixent sur la sous unit 50S du ribosome bactrien (50 Svedberg) mais pas sur celle des ribosomes eucaryotiques. - Les cyclines, en se fixant sur la sous unit (30S), bloquent llongation de la chane polypeptidique. - Les macrolides agissent sur la partie (50S) du ribosome et bloquent llongation de la chane polypeptidique. IV-1-3- Classification des antibiotiques IV-1-3-1- Les -lactamines Leur structure chimique comprend un cycle -lactame responsable de lactivit antibactrienne. On distingue trois familles principales : - Les pnicillines - Les cphalosporines - Les monobactams

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Les pnicillines Dans cette famille on distingue : - Les pnicillines naturelles (les groupes G et V) - Les pnicillines du groupe M. (oxacilline) - Les aminopnicillines (ampicilline, Amoxicilline) - Les carboxypnicillines (carbnicilline, ticarcilline) - Les acyl ureidopnicillines (piperacilline, mezlocilline) - Les amidino-pnicillines (pivmcillinam)

Les cphalosporines Elles sont constitues de 4 gnrations : - Cphalosporines de 1re gnration (Cfatolatine, Cfactrile, Cfadroxil, Cfradine). - Cphalosporines de 2me gnration (Cfuroxime, Cfamendole, Cfoxitine) - Cphalosporines de 3me gnration (Cftriaxone, latomoxef, Cfotaxime) - Cphalosporines de 4me gnration (Cfpine, Cefpirome, Cfozoprane) Les monobactams LAztreonam appartient cette sous famille. IV-1-3-2- Les aminosides Ce sont des antibiotiques bactricides large spectre possdant une structure aminoglycosidique. Les aminosides sont diviss en 3 grands groupes : - Aminosides de 1re gnration : Streptomycine, Kanamycine, Nomycine - Aminosides de 2me gnration : Amikacine, Gentamicine, Tobramycine - Aminosides de 3me gnration : Ntilmicine

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IV-1-3-3- Macrolides, Lincosamides, Streptogramines (MLS) Les MLS ont un spectre limit comprenant les bactries Gram positif, les cocci Gram ngatif, les mycoplasmes et les bacilles ngatifs anarobies. - Macrolides (Erythromycine, Olandromycine, Josamycine) - Lincosamides (Lincomycine, Clindamycine) - Streptogramines ou Synergistine (Pristinamycine, Virginiamycine). IV-1-3-4- Les cyclines Les principaux produits sont : les ttracyclines, doxycyclines, minocyclines. Les ttracyclines ont une activit antibiotique large, seulement bactriostatique. IV-1-3-5- Les phnicols Ce sont des bactriostatiques large spectre, drivs de lacide dichloro-actique. Nous distinguerons le chloramphnicol, le thiamphnicol. IV-1-3-6- Les quinolones On peut les diviser en deux groupes : Les anciens qui ne sont pratiquement actifs que sur les bacilles Gram ngatif, principalement les entrobactries et ne sont indiqus que dans le traitement des infections urinaires (acide nalidixique, acide piromidique, flumquine). Les produits plus rcents ont une grande activit par leur spectre large et leur pharmacocintique (Ciprofloxacine, pfloxacine, norfloxacine). IV-1-3-7-Les polypeptides Ce sont des antibiotiques bactriostatiques (polymyxine).

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IV-2- METHODES DETUDE DE LA SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES Diffrentes techniques dvaluation de lactivit des antibiotiques peuvent tre mises en uvre au laboratoire de bactriologie. IV-2-1- Mthode de diffusion : antibiogramme standard [1, 7, 9, 3, 11, 12,46] Les disques dantibiotique sont dposs la surface de la glose pralablement ensemence avec une suspension de bactries en phase exponentielle de croissance. Lantibiotique imprgnant le disque va diffuser dans la glose, la concentration diminue au fur et mesure que lon sloigne du disque (gradient de concentration). Aprs incubation du milieu de culture (18 heures 37 C), on constate que chaque disque est entour dune zone dinhibition de la croissance bactrienne : la multiplication bactrienne a une concentration suprieure ou gale la CMI La CMI est la concentration minimale dantibiotiques inhibant en 18 heures 24 heures la multiplication des bactries (bactriostase). Pour chaque antibiotique, on mesure le diamtre dinhibition de la croissance bactrienne et on en dduit la valeur approche de la CMI. En effet, pour un antibiotique donn, une relation existe entre le diamtre dinhibition et la CMI, celle-ci tant tablie par des tudes comparatives portant sur un grand nombre despces diffrentes. En fonction de la CMI, on classera la souche en 3 catgories : - Rsistante lorsque la CMI de lantibiotique est trop leve pour tre atteinte in vivo sans atteindre les doses toxiques, - Sensible, lorsque la CMI est infrieure la concentration obtenue aprs administration dune dose thrapeutique, - Intermdiaire si la CMI se situe entre ces deux extrmes. Leffet inhibiteur est obtenu soit par une forte concentration de lantibiotique au niveau du sige de linfection, soit par une administration par voie gnrale avec des doses leves.

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Standardisation [11] La fiabilit des rsultats dun antibiogramme est influence par de nombreux paramtres qui doivent tre rigoureusement contrls. La standardisation est rgie par des documents manant de lOrganisation Mondiale de la Sant (OMS) et des divers Comits Nationaux. Selon les pays, il peut exister des variations techniques et il est important de respecter une technique identique celle utilise pour ltablissement des courbes de concordance. IV-2-2 E-test (epsilonmeter-test) [4, 5, 18, 19, 31, 44] Le E-test est une technique de dtermination de la CMI fonde sur lutilisation de bandelettes imprgnes dun gradient exponentiel prdfini de lantibiotique tester couvrant une zone continue de 0,016 256mg/l ou 0,002 32mg/l en fonction des molcules. Les bandelettes sont des supports inertes, hydrophobes de 5mm de large et de 80mm de long. Elles sont appliques sur la surface dune glose pralablement ensemence avec la souche tudier. Aprs incubation, linhibition de la croissance bactrienne se traduit par la prsence dune ellipse dont le point dintersection avec la bandelette dfinit la CMI. Une chelle de lecture imprime sur la face suprieure de la bandelette permet une lecture rapide. IV-2-3- Les Micro mthodes dtude in vitro de la sensibilit [4, 5, 18, 19, 31,44] Les appareils utiliss par cette mthode fonctionnent schmatiquement selon deux principes : - Ils miment les tests conventionnels dtude de la sensibilit ; - Ils comparent la croissance dun tmoin celle observe en prsence dune ou de plusieurs concentrations dantibiotiques laide dun indice propre chaque machine. Dans tous les cas, lantibiogramme reste un test permettant de collecter en routine des donnes sur laptitude de bactries crotre en prsence dantibiotiques dans des conditions prcises de milieu, dinoculum et de temps.

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Mthode utilisant deux concentrations critiques Les concentrations en antibiotiques quil est possible dobtenir dans lorganisme se dfinissent par une zone des taux thrapeutiques dlimite par deux valeurs critiques exprimes en g/ml. - La concentration critique infrieure (CCI) correspond au taux sanguin moyen obtenu aux posologies habituelles. - La concentration critique suprieure (CCS) correspond au taux sanguin maximal obtenu par ladministration de fortes doses. Certains systmes utilisent ces concentrations critiques pour ltude de la sensibilit aux antibiotiques. Ces mthodes sont lorigine des premiers appareils automatiques. Avec elles, on peut interprter directement les rsultats de lantibiogramme. En effet, lorsque la croissance est tudie par mesure dune activit enzymatique, on utilise les concentrations critiques suprieure et infrieure fixes par les Comits Nationaux dAntibiogramme. Le rsultat obtenu est logique : - La croissance en prsence de la plus forte concentration dantibiotique est le fait de souches rsistantes ; - La croissance en prsence de la plus faible concentration seulement est caractristique des souches intermdiaires ; - Linhibition de la croissance aux deux concentrations dantibiotiques est spcifique des souches sensibles. La croissance est dcele par photomtrie et / ou nphlomtrie. La lecture se fait lil nu pour certaines mthodes. Il existe diffrents systmes, les plus utiliss sont les systmes ABAC, ATB-API et les CSB. Seules les bactries non exigeantes et croissance rapide peuvent tre tudies par ces mthodes. Mthode utilisant une concentration critique Ces mthodes tudient la croissance de la bactrie en prsence dune seule concentration dantibiotique adapte pour discriminer les bactries sensibles des rsistantes. Cette concentration nest pas lie aux concentrations critiques. Linoculum bactrien est de 106 bactries /ml.

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Systme effectuant une analyse cintique de la croissance : Lanalyse cintique de la croissance bactrienne a t la base du premier systme dantibiogramme automatique qui a t commercialis. Le principe du fonctionnement ne diffre cependant pas fondamentalement des systmes utilisant une concentration. Ces systmes donnent des rponses prcoces et permettent quelquefois lestimation de la CMI. - Soit en utilisant plusieurs concentrations dantibiotiques - Soit en utilisant un calcul spcifique (propre chaque fabricant). Dilution en bouillon : Les mthodes de dilution en bouillon MH pour la dtermination de la CMI peuvent tre ralises en plaques de microtitration. Cette micro mthode est plus adapte pour la pratique de lantibiogramme grce une automatisation possible. Les systmes pour lantibiogramme ont trouv leur place dans les laboratoires de microbiologie. Leurs performances sont comparables celles des technologies conventionnelles. Certains permettent aussi lobtention rapide de rsultats, ce qui assure aux biologistes un suivi plus fiable de leurs patients. Avantages et inconvnients Avantages Ces micro mthodes dtude de la sensibilit prsentent plusieurs avantages. Les valuations rcentes des divers systmes dantibiogramme automatiques montrent que la concordance avec la CMI (mthode de rfrence) existe dans plus de 85%des cas. Ce pourcentage de concordance peut varier selon le systme. Ces miro mthodes ont permis de rduire (en tout cas pour certains) les dlais de rponse. Inconvnients Les micro mthodes prsentent nanmoins des inconvnients : - Seules les bactries non exigeantes et croissance rapide peuvent tre tudies par ces mthodes ; - Aucun systme actuellement disponible ne mrite au sens strict le qualificatif dautomatique, cest dire ne ralise de faon automatique lensemble des phases de la dtermination de la sensibilit dune souche bactrienne aux antibiotiques ; - Le nombre dantibiotique test par antibiogramme est limit par le nombre de cupules des plaques. -

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V- PROCEDURES DE VALIDATION ET DEFINITIONS DE QUELQUES PARAMETRES DE VALIDATION [17] La dfinition des critres de qualit destins valider une technique de dosage a fait lobjet du travail dun groupe dexperts. Sur la base des donnes exprimentales provenant de lapplication du protocole de validation de techniques et de lexploitation des rsultats de diffrents programmes de contrle de qualit intra et inter laboratoires, des limites acceptables sont proposes. Ces limites sont destines juger de la qualit dune technique de dosage et la valider en fonction de sa reproductibilit et de sa justesse. Pour chaque analyste, sont rapports le domaine de mesure, les valeurs applicables titre indicatif, les trois niveaux de concentration des prparations de contrle utiliser pour lvaluation ainsi que lintervalle des valeurs dans lequel elles peuvent tre choisies et les limites de rptabilit et de reproductibilit exprimes en termes de CV en pourcentage. Le respect des rgles dassurance qualit des laboratoires oblige la validation des techniques en pralable et le justifier. Il sagit dun pr-requis indispensable dans le cadre de laccrditation des laboratoires. Cette opration seffectue en deux tapes : lvaluation des performances de la technique suivie de leur validation pour vrifier leur conformit des normes. Ces exigences sont rglementaires, mais le rfrentiel permettant de dfinir les qualits souhaitables dune technique danalyse nexiste pas. Le guide de bonne excution des analyses de biologie mdicale indique que cest aux biologistes quincombe le choix des mthodes optimises utilises dans un grand nombre de laboratoires et recommandes par les socits scientifiques nationales ou internationales de biologie ou dans le cas chant valides par lui-mme condition quelles permettent, dans la mesure du possible, le transfert des rsultats et que des procdures opratoires doivent tre techniquement valides afin dassurer la qualit des rsultats. La commission de validation de techniques de la SFBC avait propos en 1986 un protocole de validation accompagn de normes dacceptabilit tablies pour une vingtaine danalystes. Ce protocole a t largement utilis et a permis un dialogue fructueux entre les diffrents partenaires de la biologie mdicale : biologistes entre eux, biologistes et industriels, biologistes et cliniciens, biologistes et partenaires administratifs. Il est apparu trs vite que le nombre danalystes dcrits dans ce document tait insuffisant. Cest pourquoi les initiateurs du premier projet ont souhait rassembler un groupe de travail, sous lgide de la SFBC, pour ractualiser et proposer des critres de validation dans un domaine plus tendu. Ce document permet la dfinition des normes dacceptabilit (limites de reproductibilit, de justesse et exactitude pour une centaine danalystes et des niveaux de concentration pertinents choisis pour correspondre le plus souvent des niveaux de dcision mdicale diffrents.

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Les paramtres de la validation sont : - linarit et domaine dutilisation ; - droite de rgression; - limite de dtection ; - prcision ; - exactitude ; - sensibilit. V-1- LINEARITE OU DOMAINE DANALYSE Evaluation de la limite haute et basse de la relation linaire existant entre la concentration de lanalyste observ et la dilution effectue. La linarit dune mthode analytique est sa capacit donner des rsultats directement proportionnels la concentration de lanalyste dans les chantillons. Ces caractristiques sont dtermines en appliquant la mthode une srie dchantillons dont les concentrations en analyste couvrent tout le domaine dutilisation propos. Il faut analyser chaque dilution en triple, rpter lessai, le cas chant, dans dautres conditions de temps. V-2- LIMITE DE DETECTION Cest la plus petite quantit ou concentration qui peut tre distingue, avec une probabilit connue, dun blanc de la raction ralis dans les mmes conditions. Elle est gale k fois lcart type de prcision, mesur sur le blanc. Si le nombre de valeur = 30, la valeur de 3 est retenue pour k. LD = S x k

LD = limite de dtection S = cart-type K = facteur dpendant du nombre de mesures effectues

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V-3- PRECISIONS Cest le degr daccord entre les rsultats obtenus lors dessais diffrents. Elle est mesure par la dispersion des rsultats individuels de part et dautre de la moyenne et elle est gnralement reprsente par lcart-type ou par le coefficient de variation calcul aprs avoir appliqu la mthode complte de faon rpte un certain nombre dchantillons identiques sur le mme lot homogne du produit analyser. V-4- DROITE DE REGRESSION La droite de rgression est la droite qui minimise la somme des carrs des carts entre les valeurs observes et les valeurs thoriques. Elle est aussi appele la droite des moindres carrs. Pour faire la prdiction, il sagit simplement de substituer la valeur donne x dans lquation de rgression et de calculer la valeur de y. Lquation est donne par la formule : y= axi+ b o a et b sont des constantes pouvant tre calcul partir des formules suivantes :

N xy (x) (y) a= N x - (x)

y b = N - a

x N

Le coefficient de corrlation sera une mesure de la corrlation entre deux sries de donnes. Il nous permettra destimer la fiabilit de notre droite.

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La valeur du coefficient de corrlation reflte une bonne linarit entre les deux variables x et y qui ont permis de calculer cette dernire par la formule suivante :

N xy ( x) ( y) r= N x - ( x) N y - ( y)

r = coefficient de corrlation

a = pente de la droite N = nombre de paires (x ; y) utilises pour calculer la droite de concordance ; n = concentration inocula ;

; ;

xi = donnes observes b = ordonne lorigine

C = concordance des caractres

V-5- SPECIFICITE Cest laptitude dune mthode mesurer la concertation de lanalyste sans interfrence de la part des autres constituants de lchantillon. La slectivit (ou labsence de la slectivit) peut sexprimer par lerreur systmatique constate dans les rsultats obtenus avec lanalyste en prsence des concentrations escomptes des autres constituants, par comparaison des rsultats obtenus en labsence de ces substances. V-6- SENSIBILITE Cest laptitude de la mthode dtecter de petites variations de concentration. Elle est reprsente par la pente de la courbe dtalonnage. On doit viter de donner ce terme un sens plus gnral englobant la limite de dtection et/ou de dosage.

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V-7- EXACTITUDE ET JUSTESSE Evaluation de lexactitude dune mthode B par rapport une mthode A reconnue pour sa fiabilit (technique de rfrence), avec des spcimens de contrle. Lexactitude dune mthode est le degr de concordance entre les rsultats obtenus et la vraie valeur de la grandeur mesure. Remarque Toutes ces caractristiques ne sont pas toujours applicables toutes les mthodes dessai ni tous les produits analyser. Dans tous les cas, chacune des caractristiques de performance applicable la mthode analytique doit faire lobjet dune valuation fonde sur des donnes exprimentales.

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I- MATERIELS ET MILIEUX I-1- MATERIELS I-1-1-Cadre dtude Ce travail a t effectu lunit de recherche et de biotechnologie microbienne du laboratoire de bactriologie virologie de lhpital Aristide Le Dantec et au laboratoire de bactriologie virologie fondamentale et applique de lUCAD II. I-1-2-Souches bactriennes Cette tude a port uniquement sur des souches qui ont dj t identifies et conserves au laboratoire, dont La souche de rfrence Staphylococcus aureus ATCC29213 et des souches de contrle : - Une souche de Staphylococcus epidermidis - Une souche de Streptococcus pyogenes ou Streptocoque du groupe A - Une souche dEnterococcus faecalis ou Streptocoque du groupe D I-1-3-Matriel pour lidentification Botes de ptri en matire plastique Pipettes pasteur Bec bunsen Etuve Anse calibre Microscope optique Micropipettes Microplaques Embouts striles Becher rempli deau de javel Lames porte-objet Lamelles Four micro-ondes Agitateur magntique Papier buvard Dessicateur sous vide air renouvel

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I-1-4- Matriel pour ltude de la croissance Etuve capable de maintenir une temprature de 36 2 C Botes de ptri en matire plastique Embouts striles Micropipettes Autoclave Bain-marie Spectrophotomtre Appareillage pour le comptage des colonies muni dun systme dclairage Densitomtre I-1-5- Matriels pour ltude de la sensibilit Botes de ptri Ecouvillons striles Tubes hmolyse Eau physiologique strile Pince Microplaques Disques dantibiotiques : Erythromycine Chloramphnicol Ciprofloxacine Doxycycline Amikacine Amoxicilline Pnicilline G Ttracycline

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I-1-6- Matriel pour la conservation des souches Tubes nunc Portoirs Tubes striles vis Anse de platine I-2- MILIEUX Glose Mueller Hinton Glose Chapman Glose au sang Bouillon trypticase soja Bouillon glucos tamponn (BGT) I-3- CONTROLE DE QUALITE DES TESTS EFFECTUES Chaque lot de milieu prpar est soumis un contrle de strilit et defficacit sur le plan bactriologique. I-3-1- Contrle de strilit des milieux denrichissement et disolement - Milieux liquides Un millilitre de chaque milieu prpar est mis dans un tube hmolyse strile qui est incub ltuve 37 C pendant 24h 48h. Les milieux sont considrs striles en labsence de trouble et de virage de lindicateur. - Milieux solides Chaque bote contenant de la glose prpare est place ltuve 37 Pendant 24h 48h. Les milieux sont considrs striles en labsence dapparition de colonies ou de virage de lindicateur color.

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I-3-2- Contrle de qualit des microplaques de sensibilit - Strilit Avant son utilisation, le milieu dtude de la sensibilit est incub sans inoculum pendant 24h 37 C. Le milieu est considr comme strile sil y a absence de virage de lindicateur color (rouge de phnol). - Efficacit Elle se traduit par la capacit du milieu changer de coloration aprs test avec la souche de rfrence (S.aureus ATCC29213) I-3-3- Contrle des appareils - Ltuve La temprature de ltuve tait toujours 37 C. - Le densitomtre Avant tout mesure, lappareil devait tre talonn avec de leau distill. I-3-4- Contrle des paramtres dynamiques La temprature de travail tait maintenue 37 C aussi bien pour lincubation de linoculum que des milieux ensemencs mais galement des microplaques de sensibilit dj ensemences. Le pH de chaque milieu tait vrifi et il correspondait aux normes attendues pour le milieu en question. Le contrle du pH se faisait aprs la prparation de chaque lot de milieu. Il tait ralis laide dun pH-mtre.

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II- METHODES II-1- IDENTIFICATION Les souches que nous avons utilis taient des souches dj identifies et conserves -20 C. Nous avons procd une identification sommaire de ces bactries tudier. II-1-1- Identification des souches de Staphylococcus aureus ATCC 29213 et de Stahylococcus epidermidis Les souches ont t isoles sur de la glose Chapman et incubes ltuve 37C pendant 24h. - Examen macroscopique Aprs incubation, Staphylococcus aureus a donn sur la glose Chapman des colonies luisantes et bombes plus ou moins pigmentes en jaune or do lappellation de Staphylococcus aureus ou staphylocoque dor. Staphylococcus epidermidis a donn sur Chapman des colonies opaques lisses, jaunes ou blanches. - Examen microscopique A partir dune colonie nous avons confectionn un frottis que nous avons ensuite color au Gram. Lexamen microscopique lobjectif 100 avec immersion, montrait des coques Gram positif parfois regroup en amas ou en grappes de raisin. Pour Staphylococcus epidermidis nous avons observ des diplocoques Gram positifs en amas ou grappes de raisin . - Test la catalase . Principe

Leau oxygne produite par certaines dshydrognases de la chane respiratoire est toxique pour la bactrie. Cest la catalase qui va permettre la dtoxification de cette eau oxygne.

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La catalase dcompose leau oxygne en eau et en oxygne qui se dgage. Catalase 2 H2O2 . Technique 2H2O + O2

Ce test a consist dposer sur une lame une goutte deau oxygne mettre en contact une colonie isole. . Lecture

Catalase positive : apparition de bulles doxygne Catalase ngative : laspect reste inchang . Rsultat

Staphylococcus aureus a montr une catalase positive, pareil rsultat pour Staphylococcus epidermidis. II-1-2- Identification de Streptococcus pyogenes et dEnterococcus Faecalis Dans le but dobtenir des colonies isoles, les souches ont t ensemences sur de la glose au sang, puis incubes ltuve 37 C sous CO2 pendant 24h. - Examen macroscopique Le streptocoque du groupe A a prsent de petites colonies transparentes entoures dune zone dhmolyse . Enterococcus faecalis ou Streptocoque du groupe D a prsent de petites colonies translucides. - Examen microscopique Nous avons confectionn un frottis partir dune colonie que nous avons color au Gram. Lobservation microscopique lobjectif 100 immersion des streptocoques montrait des cocci Gram positif regroups en chanettes plus ou moins longues, immobiles non sporuls, non capsuls. Pour Enterococcus faecalis nous avons observ des cocci Gram positif.

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- Test la catalase (idem pour les staphylocoques) Le streptocoque du groupe A ne possdait pas de catalase. Il en a t de mme pour Enterococcus faecalis. - La coagulase Ce test met en vidence la coagulase libre dans le milieu de culture. Parmi les cocci Gram positif, seules les souches de Staphylococcus aureus provoquent une coagulation du plasma de lapin. Technique Elle consistait prparer un inoculum partir dune souche isole sur Chapman puis on ajoutait du srum de lapin. Lincubation se faisait 37 C ltuve pendant 3h.24h Lecture Coagulase positif : le milieu prend en masse Coagulase ngatif : le milieu ne prend pas en masse Rsultat Streptococcus pyogenes tait coagulase ngative, de mme que Enterococcus faecalis.

- Test dagglutination par pastorex Streptococcus Principe Cest un test dagglutination antigne- anticorps. Il permet de dterminer les groupes des streptocoques. Technique Dans un tube hmolyse, nous mettions 400l du liquide dextraction puis une colonie, le tout tait incub 37 C pendant 10mm puis typ par les latex antistreptocoques A, B, C, D, G, F en plus des tmoins. Ainsi nous avons pu dterminer le groupe du streptocoque.

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Rsultat Pour streptocoque pyognes, lantigne A a agglutin avec le latex antistreptocoque A. Pour Enterococcus faecalis, lantigne D a agglutin avec le latex antistreptocoque D. II-2- DETERMINATION DE LINOCULUM PAR LETUDE DE LA CROISSANCE II-2-1- Les Staphylocoques - Prparation de linoculum A partir de colonies isoles sur de la glose Chapman (1 2 colonies), nous avons prpar une suspension bactrienne dans du bouillon glucose tamponn (10ml) puis incub pendant 3 heures. A partir de t0 nous avons prlev toutes les 30mn 1,5ml de la suspension bactrienne dont nous avons dtermin la concentration par le dnombrement bactrien sur boite de ptri, et ce pendant 3heures de temps. Au total, nous avions sept (7) points tudier : t0, t1=30mn, t2=1h, t3= 1h30, t4=2h, t5=2h30, t6=3h - Dnombrement bactrien sur botes de ptri Principe La technique de la mesure de la croissance dune population bactrienne par dnombrement sur bote de ptri consiste ensemencer des intervalles de temps rguliers des botes de ptri par une dilution approprie dun chantillon de la suspension bactrienne : la dilution est calcule pour obtenir entre 30 et 300 colonies sur chaque boite, ces deux bornes tant considres comme donnant le moins derreurs sur dnombrement final. Cette tape est suivie dune culture de 24h 48h 37 C au terme de laquelle les colonies sont dnombres. Les intervalles de temps entre les prlvements (toutes les 30mn) ont t choisis pour avoir un maximum de points dans la phase exponentielle de la croissance.

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Technique Nous avons effectu la technique de lensemencement par talement qui se faisait comme suit : A chaque espace de temps 100l de suspension taient prlevs et dilus une concentration convenable dans 900l deau physiologique. Les derniers 100l taient directement dposs sur la glose MH, puis disperss grce un taleur strile. Lorsque la glose devenait sche, les botes taient places ltuve pendant 24h 37 C. Pour chaque inoculum nous ensemencions 2 botes de ptri. Expression des rsultats Les rsultats sont obtenus en faisant la moyenne du dnombrement de chaque boite de ptri exprims en UFC/ml.

II-2-2- Les Streptocoques - Prparation de linoculum A partir de colonies isoles sur de la glose au sang ordinaire (1 2 colonies), nous avons prpar une suspension bactrienne dans du bouillon trypticase soja ( 10ml) que nous avons incub pendant 5 heures. - Dnombrement bactrien A partir de t0 nous avons prlev toutes les heures 1,5ml de la suspension bactrienne dont nous avons dtermin la concentration par le dnombrement bactrien sur bote de ptri, et ce pendant 5h de temps. Au total nous avions 6 points tudier : t0, t1=1h, t2=2h, t3=3h, t4=4h, t5=5h. Pour les streptocoques lensemencement seffectuait par talement des 100 derniers l sur de la glose au sang. - Rsultat du dnombrement Les rsultats taient obtenus en faisant la moyenne du dnombrement de chaque bote exprims en UFC/ml.

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II-3- ETUDE DE LA SENSIBILITE AVEC LES MICROPLAQUES Avec les inocula prlevs aux diffrents intervalles de temps nous avons ensemenc les plaques de sensibilit. Ainsi 5 plaques ont t ensemences pour la souche de Staphylococcus aureus, 5 pour Staphylococcus epidermidis, 4 pour Streptococcus pyogenes, et 4 pour Enterococcus faecalis. Nous les incubions 37 C et, nous avons pu procder la lecture des plaques toutes les 4 heures pendant 12 heures puis aprs 24 heures et prvoir le temps au bout duquel nous avons obtenu une meilleure sensibilit des souches aux antibiotiques tests. a) Principe Ltude de la sensibilit aux antibiotiques consistait ajouter au milieu (inoculum) deux concentrations critiques dun antibiotique donn. Aprs une incubation ltuve 37 C, la croissance bactrienne tait dcele grce au virage de lindicateur color (rouge de phnol). b) Mode opratoire Prparation des plaques Prparation des solutions dantibiotiques : Solution de stock Principe Il est bas sur la prparation dune solution mre 200 fois plus concentre que la concentration critique suprieure de lantibiotique dans le solvant considr. Pour la prparation, les masses peser dpendent de lactivit des antibiotiques. Lactivit dun antibiotique est la quantit de principe actif en g contenu dans 1mg de produit.

V (ml) X C (mg/ml) Quantit peser (mg) = Activit (g/mg)

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Solution de travail : CCS : Concentration critique suprieure La solution mre contient la quantit requise de produit pour obtenir, par une dilution au 1/100me avec le diluant appropri et une dilution ultrieure au 1/2 par le milieu utilis dans la cupule, la CCS. CCI : Concentration critique infrieure Elle a t obtenue pour chaque antibiotique en faisant une dilution de la CCS. Pour les antibiotiques choisis, les concentrations prparer sont rpertories dans les tableaux suivants : Pour les antibiotiques choisis, les concentrations prparer sont rpertories dans le tableau suivant :

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Tableau IV : Prparation des solutions dantibiotiques pour ltude de la sensibilit des Staphylocoques et Streptocoques
Antibiotiques CCI (g/ml) 0,25 1 0,5 16 4 CCS Conc Vol Masse (g/ml) SM g/l SM (ml) peser (mg) 16 3,2 1 3,2 2 1 32 32 16 32 0 ,4 2 6,4 6,4 3,2 6,4 1 1 1 1 1 1 0,4 2 6,4 6,4 3,2 6,4 Solvants diluants Eau distille Eau distille Eau distille Eau distille Eau distille Mthanoleau distille Tampon phosphate 0,1 M (pH6) eau distille Dilutions CCS / CCI 1/64 1/8 1/8 Cons ST CCS (g/ml) 32 4 8 64 64 32 64 Cons ST CCI (g/ml) 0,5 2 2 32 8 16 8 Vol dshydrater l 80 80 80 80 80 80 80

Pnicilline G Ciprofloxacine Erythromycine Doxycycline Amikacine

Chloramphnicol 8 Amoxicilline 4

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Dshydratation des plaques Aprs rinage leau savonneuse, les plaques sont trempes dans lalcool 70C pendant 24 heures. Les plaques sont ensuite sches et strilises au four micro-onde. Ce sont 80 l du double de la CCS dun antibiotique donn et 80 l de la CCI qui sont distribues dans les cupules suprieures et infrieures ou opposes. Les plaques sont ensuite portes ltuve pendant 24 heures 37C. Les plaques dshydrates et munies dun support ont t scelles dans des sachets striles avec un dessiccateur et gardes labri de la poussire Etude de la sensibilit Prparation du milieu dtude : Nous avons prpar un bouillon AM3 (Antibiotic Medium 3) La formule par litre : Glucose : 1g Rouge de phnol : 20ml Eau distille p : 1000ml pH 7,4 0,2 Le bouillon contenant le glucose a t autoclav 120 C pendant 15mn. Le rouge de phnol a t ajout au milieu autoclav aprs t strilis par filtration. Linoculum Du fait du faible taux de linoculum aux temps T0 et T1, nous avons prfr travailler partir de T2=1h de croissance. Nous avons prlev chaque intervalle de temps 20l du bouillon en culture. Ce dernier a t dilu dans 2ml de bouillon AM3 . Inoculation de la plaque 80l de linoculum sont distribus dans chaque cupule. Les plaques sont ensuite portes ltuve pendant 24h 37 C. Nous avons recouvert la plaque de papier buvard imbib deau pour viter la dshydratation du milieu. NB : Les 2 dernires cupules de la plaque sont les tmoins contrles (TC) .Elles ne contiennent aucun antibiotique. Dans la premire cupule nous avions mis 80l de linoculum et dans la dernire 80l du bouillon.

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Ainsi aprs incubation, le tmoin positif (premire cupule) va virer : jaune et le tmoin ngatif garde la couleur du bouillon (rouge) Lecture Il sagira de vrifier la croissance ou labsence de croissance dans les cupules. Cette croissance nous a permis de catgoriser les souches sensibles, intermdiaires ou rsistantes. Bactrie sensible : absence de virage dans les 2 cupules (CCS et CCI rouges) Bactrie rsistante : virage au jaune dans les 2 cupules Bactrie intermdiaire : virage seulement au niveau de la CCI, la CCS reste rouge. Les rsultats des plaques sont valids par les tmoins positif et ngatif. II-4- ETUDE COMPARATIVE AVEC LANTIBIOGRAMME STANDARD OU DIFFUSION EN MILIEU GELOSE Principe Lantibiogramme a pour but de dterminer la concentration minimale inhibitrice (CMI) dune souche bactrienne vis--vis de divers antibiotiques. Le rsultat pratique est la classification du microorganisme dans la catgorie sensible (S), intermdiaire (I) ou rsistant (R) chaque antibiotique. Technique Des disques de papier buvard imprgn des antibiotiques tester sont dposs la surface du milieu glos, pralablement ensemenc avec une culture pure de la souche tudier. Aprs incubation, les disques sentourent de zones dinhibition circulaires correspondant une absence de culture. Lorsque la technique est parfaitement standardise, les diamtres des zones dinhibition dpendent uniquement de la sensibilit du germe. Pour chaque antibiotique, on mesure le diamtre dinhibition de la croissance bactrienne et on en dduit le profil de sensibilit de la souche tudie.

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Milieu utilis Glose Mueller Hinton Ensemencement Nous avons dilu linoculum au 1/100me avant de lensemencer par couvillonnage. Incubation A 37 C Lecture Aprs 24h dincubation Rsultats La zone dinhibition est mesure par le diamtre en mm. Si le diamtre mesur est infrieur au diamtre correspondant la concentration critique suprieure la souche est Rsistante. Si le diamtre mesur est suprieur au diamtre correspondant la concentration critique infrieure, la souche est Sensible. Si le diamtre mesur est compris entre les diamtres correspondant aux deux concentrations critiques, la souche est de sensibilit intermdiaire. Interprtation des rsultats Nous avons compar les profils de sensibilit en plaques avec ceux de lantibiogramme standard, afin de dterminer linoculum qui donne en plaques un profil de sensibilit proche de celui obtenu avec lantibiogramme standard et ceci dans un intervalle de temps trs court.

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I- ETUDE DE LA SENSIBILITE EN FONCTION DE LINOCULUM ET DU TEMPS DINCUBATION DE LA MICROPLAQUE CSB I-1- STAPHYLOCOCCUS AUREUS a) Rsultat du dnombrement Les rsultats du dnombrement ont permis de dterminer la taille de linoculum, ils sont rpertoris dans le tableau Tableau V : Dnombrement de Staphylococcus aureus Temps (min) 0 30 60 90 120 150 180 N (UFC/ml) 4,8 104 4,8 104 5.7 105 2.2 106 2.3 107 8.8 108 1.11 1010

Nous avons observ entre T0 et T1=30mn une absence de croissance de la bactrie, cette priode correspondait donc au temps de latence de la bactrie. A T2=60mn, elle commenait se multiplier de faon exponentielle jusqu T6=180mn. b) Rsultat des plaques de sensibilit micro- CSB Staph Les plaques ensemences chaque intervalle de temps comme dcrit dans le protocole ont donn, aprs lecture toutes les 4heures dincubation, les rsultats suivants.

En raison de la faiblesse de la taille de linoculum aux temps gaux T0 et T1=30mn, nous avons prfr dmarrer ltude de la sensibilit partir de T2=60mn.

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Tableau VI : Profil de sensibilit de Staphylococcus aureus avec linoculum de 5,7105 UFC/ml

Temps dincubation de la plaque en Heure ANTIBIOTIQUES CCI PNICILLINE G rouge A CCI AMOXICILLINE rouge A CCI ERYTHROMYCINE rouge A CCI DOXYCICLINE rouge A CCI CHLORAMPHENICOL rouge A CCI AMIKACINE rouge A CCI CIPROFLOXACINE rouge A CP TEMOIN CONTROL rouge rouge jaune rouge jaune rouge jaune rouge CN CP CCS rouge CCI jaune I CN CP CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI jaune I CN CP CCS rouge CCI jaune I CCS rouge CCI CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI jaune I CCS CCI rouge S CCS rouge CCI jaune I CN CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI CCS rouge CCI CCS CCI rouge S CCS CCI rouge S CCS CCI rouge S CCS CCI rouge S CCS rouge CCI jaune I CCS rouge CCS rouge CCS rouge CCS rouge CCS rouge CCS rouge

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rouge rouge S

rouge rouge S

rouge rouge S

rouge rouge S

rouge rouge S

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Lgende : CCI : concentration critique infrieure CCS : concentration critique suprieure TC : contrle positif : couleur jaune Contrle ngatif : couleur rouge CCI et CCS : rouge : bactrie sensible (S) CCI et CCS : jaune : bactrie rsistante (R) CCI jaune et CCS rouge : bactrie intermdiaire (I) CCI rouge et CCS jaune ; CCI rouge et CCS rouge : Aberrant (A)

Ds les premires 4 heures, une lecture correcte ntait pas possible, mme pour les tmoins. Mais aprs 8 heures dincubation de la microplaque, nous avons obtenu des rsultats qui nous difiaient sur le profil de sensibilit de lespce. Elle a t sensible tous les antibiotiques tests sauf au chloramphnicol et la Ciprofloxacine pour lesquels nous avons not un rsultat intermdiaire.

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Tableau VII : Profil de sensibilit de Staphylococcus aureus avec linoculum de 2,2106 UFC/ml
Temps dincubation de la plaque en heure ANTIBIOTIQUES CCI PNICILLINE G rouge A CCI AMOXICILLINE rouge A CCI ERYTHROMYCINE rouge A CCI DOXYCICLINE rouge A CCI CHLORAMPHENICOL rouge A CCI AMIKACINE rouge A CCI CIPROFLOXACINE rouge A CP TEMOIN CONTROL rouge rouge jaune rouge jaune rouge jaune rouge CN CP CCS rouge CCI jaune I CN CP CCS rouge CCI rouge S CCS CCI CCS rouge CCI jaune I CCS CCI CCS rouge CCI rouge S CCS CCI CCS rouge CCI rouge S CCS CCI CCS rouge CCI rouge S CCS CCI CCS rouge CCI rouge S CCS CCI CCS CCI CCS rouge CCI rouge S CCS rouge S CCS rouge S CCS rouge S CCS rouge I CCS rouge S CCS rouge I CN CP CCI jaune I CN CCI rouge CCI jaune I CCS rouge S CCS rouge CCI rouge CCI rouge S CCS rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCS rouge CCS rouge

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rouge rouge S

rouge rouge

rouge rouge

rouge rouge

rouge jaune

rouge rouge

rouge jaune

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Lgende : TC : contrle positif : couleur jaune Contrle ngatif : couleur rouge CCI et CCS : rouge : bactrie sensible (S) CCI et CCS : jaune : bactrie rsistante (R) CCI jaune et CCS rouge : bactrie intermdiaire (I) CCI rouge et CCS jaune ; CCI rouge et CCS rouge : rsultat Aberrant (A)

Aprs 4 heures dincubation, aucune lecture ntait possible. Mais ds 8 heures dincubation de la microplaque nous avons obtenu un profil de sensibilit similaire celui de linoculum prcdent.

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Tableau VIII : Profil de sensibilit de Staphylococcus aureus avec linoculum de 2,3107 UFC/ml
Temps dincubation de la plaque en heure ANTIBIOTIQUES CCI PNICILLINE G rouge A CCI AMOXICILLINE rouge A CCI ERYTHROMYCINE rouge A CCI DOXYCICLINE rouge A CCI CHLORAMPHENICOL rouge A CCI AMIKACINE rouge A CCI CIPROFLOXACINE rouge A CP TEMOIN CONTROL rouge rouge jaune rouge jaune rouge jaune rouge CN CP CCS rouge CCI rouge S CN CP CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CN CP CCS rouge CCI rouge A CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CN CCS rouge CCI rouge S CCS jaune CCI rouge A CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS jaune CCI rouge A CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS jaune CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCS rouge

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Lgende TC : contrle positif : couleur jaune Contrle ngatif : couleur rouge CCI et CCS : rouge : bactrie sensible (S) CCI et CCS : jaune : bactrie rsistante (R) CCI jaune et CCS rouge : bactrie intermdiaire (I) CCI rouge et CCS jaune ; CCI rouge et CCS rouge : Aberrant (A)

Ds les premires 4 heures dincubation, aucune lecture ntait possible. Mais aprs 8 heures dincubation de la microplaque, nous avons obtenu des rsultats qui nous difiaient sur le profil de sensibilit de lespce. Contrairement aux deux premiers inocula, la souche est devenue sensible la Ciprofloxacine, mais un rsultat incohrent a t not avec le chloramphnicol.

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Tableau IX : Profil de sensibilit de Staphylococcus aureus avec linoculum de 8,8108 UFC/ml

Temps dincubation de la plaque en heure ANTIBIOTIQUES CCI PNICILLINE G rouge A CCI AMOXICILLINE rouge A CCI ERYTHROMYCINE rouge A CCI DOXYCICLINE rouge A CCI CHLORAMPHENICOL rouge A CCI AMIKACINE rouge A CCI CIPROFLOXACINE rouge A CP TEMOIN CONTROL rouge rouge jaune rouge jaune rouge jaune rouge CN CP CCS rouge CCI rouge S CN CP CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CN CP CCS rouge CCI jaune I CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CN CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI jaune I CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI jaune I CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCS rouge

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Lgende : TC : contrle positif : couleur jaune Contrle ngatif : couleur rouge CCI et CCS : rouge : bactrie sensible (S) CCI et CCS : jaune : bactrie rsistante (R) CCI jaune et CCS rouge : bactrie intermdiaire (I) CCI rouge et CCS jaune ; CCI rouge et CCS rouge : Aberrant (A)

Une lecture cohrente tait toujours impossible 4 heures. Mais aprs 8 heures dincubation de la microplaque, nous avons obtenu des rsultats qui nous difiaient sur le profil de sensibilit de lespce. Elle a t sensible aux antibiotiques tests mais un rsultat intermdiaire au chloramphnicol a t not.

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Tableau X : Profil de sensibilit de Staphylococcus aureus avec linoculum de 1,111010UFC/ml

Temps dincubation de la plaque en heure ANTIBIOTIQUES CCI PNICILLINE G rouge A CCI AMOXICILLINE rouge A CCI ERYTHROMYCINE rouge A CCI DOXYCICLINE rouge A CCI CHLORAMPHENICOL rouge A CCI AMIKACINE rouge A CCI CIPROFLOXACINE rouge A CP TEMOIN CONTROL rouge rouge jaune rouge jaune rouge jaune rouge CN CP CCS rouge CCI rouge S CN CP CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CN CP CCS rouge CCI jaune I CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CN CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI jaune I CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI jaune I CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge

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CCS rouge

CCI rouge S

CCS rouge

CCI rouge S

CCS rouge

CCI rouge S

CCS rouge

CCS rouge

CCI rouge S

CCS rouge

CCI rouge S

CCS rouge

CCS rouge

CCI rouge S

CCS rouge

CCS rouge

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Lgende : TC : contrle positif : couleur jaune Contrle ngatif : couleur rouge CCI et CCS : rouge : bactrie sensible (S) CCI et CCS : jaune : bactrie rsistante (R) CCI jaune et CCS rouge : bactrie intermdiaire (I) CCI rouge et CCS jaune ; CCI rouge et CCS rouge : Aberrant (A)

Ds les premires 4 heures dincubation, une lecture correcte tait impossible. Mais aprs 8 heures dincubation de la microplaque, nous avons obtenu un rsultat identique celui de linoculum prcdent alors que la population bactrienne a augment.

Tableau XI : Profil de sensibilit de Staphylococcus aureus avec la mthode de diffusion en milieu glos et le E-test Ces rsultats nous ont servi de rfrence. En les comparant avec ceux de la micro mthode, nous avons pu interprter ces derniers en fonction de la concordance de leurs rsultats.

Antibiotiques Pnicilline G Amoxicilline Erythromycine Doxycicline Chloramphnicol Amikacine Ciprofloxacine

Staphylococcus aureus S S S S S S S

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Conditions dinterprtation des rsultats de la microplaque de sensibilit Micro-CSB [46] Les conditions dinterprtation des rsultats de la plaque taient les suivantes : 99,9 % : excellent rsultat 99 % : trs bon rsultat 90 % : bon rsultat 80 % : rsultat acceptable, < 80 % : rsultat inacceptable.

Etant donn que les bons rsultats ont t obtenus ds 8 heures dincubation, nous avons jug intressant de les comparer pour tous les inocula au profil de rfrence.

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Tableau XII : Concordance des rsultats de la micro mthode avec ceux de lantibiogramme standard.

Inocula en UFC/ml 5,7105 Concordance par rapport au profil de rfrence en % 71 2,2106 71 2,3107 86 8,8108 86 1,11010 86

Ce diagramme montre que de faibles inocula (5,7105 et 2,2106 UFC/ml) ne permettaient pas dapprcier la sensibilit de S.aureus par rapport ces antibiotiques. Par contre, les meilleurs profils ont t obtenus avec des inocula plus levs.

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I-2- STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS a) Rsultats du dnombrement Tableau XIII: Dnombrement de Staphylococcus epidermidis

Temps (min) 0 30 60 90 120 150 180

N (UFC/ml) 2,97 104 3 4 104 104

8,5 104 2,7 106 7,3 106 4,1 107

Entre T0 et T1 nous avons observ presque une absence de croissance de la bactrie. Puis elle a commenc croitre faiblement. Contrairement S.aureus la croissance de S.epidermidis tait beaucoup plus lente. b) Rsultat des plaques de sensibilit micro- CSB Staph Les rsultats obtenus aprs lecture toutes les 4 heures nous ont permis de dresser les tableaux suivants en fonction des diffrents inocula.

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Tableau XIV: Profil de sensibilit de Staphylococcus epidermidis avec linoculum de 4104 UFC/ml
Temps dincubation de la plaque en heure ANTIBIOTIQUES CCI PNICILLINE G rouge A CCI AMOXICILLINE rouge A CCI ERYTHROMYCINE rouge A CCI DOXYCICLINE rouge A CCI CHLORAMPHENICOL rouge A CCI AMIKACINE rouge A CCI CIPROFLOXACINE rouge A CP TEMOIN CONTROL rouge rouge jaune rouge jaune rouge jaune rouge CN CP CCS rouge CCI jaune I CN CP CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI jaune I CN CP CCS rouge CCI jaune I CCS rouge CCI CCS rouge CCI jaune I CCS rouge CCI jaune I CCS CCI rouge S CCS rouge CCI jaune I CN CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI jaune I CCS rouge CCI jaune I CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI CCS rouge CCI CCS CCI rouge S CCS CCI rouge S CCS CCI rouge S CCS rouge CCI jaune I CCS rouge CCS rouge CCS rouge CCS rouge CCS rouge

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rouge rouge S

rouge rouge S

rouge rouge S

rouge rouge S

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Lgende : CCI : concentration critique infrieure CCS : concentration critique suprieure TC : contrle positif : couleur jaune Contrle ngatif : couleur rouge CCI et CCS : rouge : bactrie sensible (S) CCI et CCS : jaune : bactrie rsistante (R) CCI jaune et CCS rouge : bactrie intermdiaire (I) CCI rouge et CCS jaune ; CCI rouge et CCS rouge : Aberrant (A)

A 4 heures, une lecture correcte ntait pas possible. Mais aprs 8 heures dincubation de la microplaque, lespce a t sensible aux antibiotiques tests sauf la Doxycicline, au chloramphnicol et la Ciprofloxacine pour lesquels elle a t intermdiaire.

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Tableau XV : Profil de sensibilit de Staphylococcus epidermidis avec linoculum de 8,5104 UFC/ml

Temps dincubation de la plaque en heure ANTIBIOTIQUES CCI PNICILLINE G rouge A CCI AMOXICILLINE rouge A CCI ERYTHROMYCINE rouge A CCI DOXYCICLINE rouge A CCI CHLORAMPHENICOL rouge A CCI AMIKACINE rouge A CCI CIPROFLOXACINE rouge A CP TEMOIN CONTROL rouge rouge jaune rouge jaune rouge jaune rouge CN CP CCS rouge CCI jaune I CN CP CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI jaune I CN CP CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI jaune I CN CCS rouge CCI jaune I CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI jaune I CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI jaune I CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCS rouge

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Lgende : TC : contrle positif : couleur jaune Contrle ngatif : couleur rouge CCI et CCS : rouge : bactrie sensible (S) CCI et CCS : jaune : bactrie rsistante (R) CCI jaune et CCS rouge : bactrie intermdiaire (I) CCI rouge et CCS jaune ; CCI rouge et CCS rouge: rsultat Aberrant (A)

Ds les premires 4 heures dincubation, aucune lecture ntait possible, mme pour les tmoins. Mais ds 8 heures dincubation de la microplaque nous avons obtenu des rsultats qui nous difiaient sur le profil de sensibilit de lespce. Elle a t sensible aux antibiotiques utiliss lexception de la Doxycicline et de la Ciprofloxacine pour lesquelles nous avons not un rsultat intermdiaire.

72

Tableau XVI : Profil de sensibilit de Staphylococcus epidermidis avec linoculum de 2,7106 UFC/ml
Temps dincubation de la plaque en heure ANTIBIOTIQUES CCI PNICILLINE G rouge A CCI AMOXICILLINE rouge A CCI ERYTHROMYCINE rouge A CCI DOXYCICLINE rouge A CCI CHLORAMPHENICOL rouge A CCI AMIKACINE rouge A CCI CIPROFLOXACINE rouge A CP TEMOIN CONTROL rouge rouge jaune rouge jaune rouge jaune rouge CN CP CCS rouge CCI rouge S CN CP CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CN CP CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CN CCS rouge CCI jaune I CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI jaune I CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI jaune I CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCS rouge

12

24

73

Lgende : TC : contrle positif : couleur jaune Contrle ngatif : couleur rouge CCI et CCS : rouge : bactrie sensible (S) CCI et CCS : jaune : bactrie rsistante (R) CCI jaune et CCS rouge : bactrie intermdiaire (I) CCI rouge et CCS jaune ; CCI rouge et CCS rouge : Aberrant (A)

Une lecture cohrente tait toujours impossible 4 heures dincubation. Mais aprs 8 heures dincubation de la microplaque, nous avons obtenu des rsultats qui nous difiaient sur le profil de sensibilit de lespce : sensible aux antibiotiques tests sauf la Doxycicline pour laquelle elle a t intermdiaire.

74

Tableau XVII : Profil de sensibilit de Staphylococcus epidermidis avec linoculum de 7,3 x106 UFC/ml
Temps dincubation de la plaque en heure ANTIBIOTIQUES CCI PNICILLINE G rouge A CCI AMOXICILLINE CCS CCI rouge S CCI rouge S CCS rouge CCI jaune I CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CN rouge CCI rouge S CP jaune CN rouge CP jaune CCS rouge CCI rouge S CN rouge CP jaune CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CN rouge CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCS rouge CCI jaune I CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI jaune I CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCS rouge

12

24

rouge rouge A CCI CCS rouge A CCI rouge

ERYTHROMYCINE

DOXYCICLINE

rouge A CCI

CHLORAMPHENICOL

rouge A CCI

AMIKACINE

rouge A CCI

CIPROFLOXACINE

rouge A CP

TEMOIN CONTROL rouge

75

Lgende : TC : contrle positif : couleur jaune Contrle ngatif : couleur rouge CCI et CCS : rouge : bactrie sensible (S) CCI et CCS : jaune : bactrie rsistante (R) CCI jaune et CCS rouge : bactrie intermdiaire (I) CCI rouge et CCS jaune ; CCI rouge et CCS rouge: Aberrant (A)

Aprs 4 heures dincubation, une lecture correcte ntait pas possible. Mais ds 8 heures dincubation de la microplaque, nous avons obtenu un profil de sensibilit similaire linoculum prcdent.

76

Tableau XVIII : Profil de sensibilit de Staphylococcus epidermidis avec linoculum de 4,1107 UFC/ml
Temps dincubation de la plaque en heure ANTIBIOTIQUES CCI PNICILLINE G rouge A CCI AMOXICILLINE rouge A CCI ERYTHROMYCINE rouge A CCI DOXYCICLINE rouge A CCI CHLORAMPHENICOL rouge A CCI AMIKACINE rouge A CCI CIPROFLOXACINE rouge A CP TEMOIN CONTROL rouge rouge jaune rouge jaune rouge jaune rouge CN CP CCS CCI rouge rouge S CN CP CCS CCI CCS CCI CCS CCI CCS CCI CCS CCI CCS CCI CCS rouge S CCS rouge S CCS rouge S CCS rouge I CCS rouge S CCS rouge S CCS rouge CCI rouge S CN CP CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CN CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI jaune I CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI jaune I CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCS rouge

12

24

rouge rouge

rouge rouge

rouge rouge

rouge jaune

rouge rouge

rouge rouge

77

Lgende : TC : contrle positif : couleur jaune Contrle ngatif : couleur rouge CCI et CCS : rouge : bactrie sensible (S) CCI et CCS : jaune : bactrie rsistante (R) CCI jaune et CCS rouge : bactrie intermdiaire (I) CCI rouge et CCS jaune ; CCI rouge et CCS rouge: Aberrant (A)

Ds les premires 4heures dincubation, aucune lecture ntait pas possible. Mais aprs 8 heures dincubation de la microplaque, nous avons obtenu le mme rsultat que pour les deux inocula prcdents, alors que la population bactrienne a considrablement augment.

Tableau XIX : Profil de sensibilit de Staphylococcus epidermidis avec la mthode de diffusion en milieu glos et le E-test

Antibiotiques Pnicilline G Amoxicilline Erythromycine Doxycicline Chloramphnicol Amikacine Ciprofloxacine

Staphylococcus epidermidis S S S S S S S

78

Avec ces rsultats qui nous ont servi de rfrence, nous avons fait une comparaison avec ceux de la micro mthode. Ainsi nous avons interprt ces derniers en fonction de la concordance de leurs rsultats.

Tableau XX : Concordance des rsultats de la micro mthode avec ceux de lantibiogramme standard.

Inocula en UFC/ml 4104 Concordance par rapport au profil de rfrence en % 57 8,5104 71 2,7106 86 7,3106 86 4,1107 86

Ce diagramme rvle que les inocula de 4104 et de 8,5104 UFC/ml ne permettaient pas dapprcier la sensibilit de S. epidermidis par rapport ces antibiotiques. Par contre, de meilleurs rsultats ont t obtenus avec des inocula plus levs.

79

I-3- Streptococcus pyogenes a) Rsultats du dnombrement Daprs des expriences antrieures [47], nous avons constat que les streptocoques croissaient plus lentement que les staphylocoques ; aussi avons-nous choisi daugmenter les intervalles de mesure. Les mesures taient effectues toutes les heures et ceci pendant cinq heures de temps

Tableau XXI : Dnombrement de Streptococcus pyogenes

Temps (min) 0 60 120 180 240 300

N (UFC/ml) 3,5 104 4 104 7,2 105 8,9 106 2,06 107 1,55 108

Comparer aux deux espces prcdentes la croissance de S.pyogenes tait beaucoup plus lente. b) Rsultat des plaques de sensibilit micro- CSB Strepto Comme nous lavons not dans le protocole, 4 plaques de S.pyogenes ont t incubes ltuve et la lecture a t faite toutes les 4 heures. Ceci nous a permis davoir les rsultats rpertoris dans les tableaux suivants.

80

Tableau XXII : Profil de sensibilit de Sreptococcus pyogenes avec un inoculum de 7,2105 UFC/ml
Temps dincubation de la plaque en heure ANTIBIOTIQUES CCI PNICILLINE G rouge A CCI AMOXICILLINE rouge A CCI ERYTHROMYCINE rouge A CCI DOXYCICLINE rouge A CCI rouge A CCI AMIKACINE rouge A CCI CIPROFLOXACINE rouge A CP TEMOIN CONTROL rouge rouge jaune rouge jaune rouge jaune rouge CN CP CCS rouge CCI jaune I CN CP CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI jaune I CN CP CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI CCS rouge CCI jaune R CCS rouge CCI CCS rouge CCI rouge S CCS jaune CCI jaune R CCS CCI rouge S CCS CCI rouge S CCI rouge S CCI rouge S CCS rouge CCI jaune I CN CCS rouge CCS rouge CCS rouge CCS rouge CCS rouge CCI CCS CCI rouge S CCS jaune CCI jaune R CCS rouge CCS jaune CCS rouge

12

24

rouge rouge S

rouge rouge S rouge rouge S CCI CCS rouge rouge S CCI CCS rouge rouge S

CHLORAMPHENICOL

81

Lgende : CCI : concentration critique infrieure CCS : concentration critique suprieure TC : contrle positif : couleur jaune Contrle ngatif : couleur rouge CCI et CCS : rouge : bactrie sensible (S) CCI et CCS : jaune : bactrie rsistante (R) CCI jaune et CCS rouge : bactrie intermdiaire (I) CCI rouge et CCS jaune ; CCI et CCS rouge: Aberrant (A)

Une lecture cohrente tait impossible 4 heures, mme pour les tmoins. Mais aprs 8 heures dincubation de la microplaque, nous avons obtenu des rsultats qui nous difiaient sur le profil de sensibilit de lespce. En effet lespce a t sensible aux antibiotiques tests sauf pour deux : intermdiaire la Ciprofloxacine et rsistante lAmoxicilline.

82

Tableau XXIII : Profil de sensibilit de Streptococcus pyogenes avec linoculum de 8,9106 UFC/m
Temps dincubation de la plaque en heure ANTIBIOTIQUES CCI PNICILLINE G rouge CCS rouge A CCS rouge A CCS rouge A CCI DOXYCICLINE rouge CCS rouge A CCS rouge A CCS rouge A CCS rouge A CP TEMOIN CONTROL rouge rouge jaune rouge jaune rouge jaune rouge CN CP CCI rouge S CCI rouge S CCI rouge S CCI jaune I CN CP CCS rouge CCI jaune I CN CP CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI jaune I CN CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCI jaune R CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCS jaune CCI jaune R CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS jaune CCI jaune R CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS jaune CCS rouge

12

24

CCI AMOXICILLINE rouge

CCI ERYTHROMYCINE rouge

CCI CHLORAMPHENICOL rouge

CCI AMIKACINE rouge CCI CIPROFLOXACINE rouge

83

Lgende : TC : contrle positif : couleur jaune Contrle ngatif : couleur rouge CCI et CCS : rouge : bactrie sensible (S) CCI et CCS : jaune : bactrie rsistante (R) CCI jaune et CCS rouge : bactrie intermdiaire (I) CCI rouge et CCS jaune ; CCI et CCS rouge : rsultat Aberrant (A)

A 4 heures dincubation, une lecture correcte ntait pas possible. Mais aprs 8 heures dincubation de la microplaque nous avons obtenu un profil de sensibilit similaire linoculum prcdent malgr laugmentation de la taille de linoculum.

84

Tableau XXIV : Profil de sensibilit de Streptococcus pyogenes avec linoculum de 2,06107UFC/ml

Temps dincubation de la plaque en heure ANTIBIOTIQUES CCI PNICILLINE G rouge A CCI AMOXICILLINE rouge A CCI ERYTHROMYCINE rouge A CCI DOXYCICLINE rouge A CCI CHLORAMPHENICOL rouge A CCI AMIKACINE rouge A CCI CIPROFLOXACINE rouge A CP TEMOIN CONTROL rouge rouge jaune rouge jaune rouge jaune rouge CN CP CCS rouge CCI rouge S CN CP CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CN CP CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CN CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCS rouge CCI jaune R CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCI rouge S CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS jaune CCI jaune CCS rouge CCI rouge S CCS jaune R CCS rouge CCI jaune R CCI rouge S CCS rouge CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS jaune CCS rouge

12

24

85

Lgende : TC : contrle positif : couleur jaune Contrle ngatif : couleur rouge CCI et CCS : rouge : bactrie sensible (S) CCI et CCS : jaune : bactrie rsistante (R) CCI jaune et CCS rouge : bactrie intermdiaire (I) CCI rouge et CCS jaune ; CCI et CCS rouge : Aberrant (A)

Ds les premires 4 heures dincubation, une lecture correcte ntait pas possible. Mais aprs 8 heures dincubation de la microplaque, nous avons obtenu les rsultats suivants : lespce a t sensible aux antibiotiques utiliss sauf lAmoxicilline qui a rencontr une rsistante.

86

Tableau XXV : Profil de sensibilit de Streptococcus pyogenes avec linoculum de 1,55 108 UFC/ml
Temps dincubation de la plaque en heure ANTIBIOTIQUES CCI PNICILLINE G rouge A CCI AMOXICILLINE rouge A CCI ERYTHROMYCINE rouge A CCI DOXYCICLINE rouge A CCI
CHLORAMPHENICOL

12

24

CCS rouge

CCI rouge S

CCS rouge

CCI rouge S

CCS rouge

CCI rouge S

CCS rouge

CCS rouge

CCI jaune R

CCS jaune

CCI jaune R

CCS jaune

CCI jaune R

CCS jaune

CCS rouge

CCI rouge S

CCS rouge

CCI rouge S

CCS rouge

CCI rouge S

CCS rouge

CCS rouge

CCI rouge S

CCS rouge

CCI rouge S

CCS rouge

CCI rouge S

CCS rouge

CCS rouge A

CCI rouge S

CCS rouge

CCI rouge S

CCS rouge

CCI rouge S

CCS rouge

rouge

CCI AMIKACINE rouge A CCI CIPROFLOXACINE rouge A CP TEMOIN CONTROL rouge

CCS rouge CCS rouge

CCI rouge S CCI rouge S

CCS rouge CCS rouge

CCI rouge S CCI rouge S

CCS rouge CCS rouge

CCI rouge S CCI rouge S

CCS rouge CCS rouge

CN rouge

CP jaune

CN rouge

CP jaune

CN rouge

CP jaune

CN rouge

87

Lgende : TC : contrle positif : couleur jaune Contrle ngatif : couleur rouge CCI et CCS : rouge : bactrie sensible (S) CCI et CCS : jaune : bactrie rsistante (R) CCI jaune et CCS rouge : bactrie intermdiaire (I) CCI rouge et CCS jaune ; CCI et CCS rouge : Aberrant (A)

Nous avons not un profil de sensibilit semblable linoculum prcdent malgr laugmentation de la population bactrienne.

Tableau XXVI : Profil de sensibilit de Streptococcus pyogenes avec la mthode de diffusion en milieu glos et le E-test

Antibiotiques Pnicilline G Amoxicilline Erythromycine Doxycicline Chloramphnicol Amikacine Ciprofloxacine

Streptococcus pyogenes S S S S S S S

Ces rsultats nous ont servi de rfrence. Ainsi nous avons pu les comparer avec ceux de la micro mthode pour pouvoir interprter ces derniers en fonction de la concordance de leurs rsultats.

88

Tableau XXVII: Concordance des rsultats de la micro mthode avec ceux de lantibiogramme standard.

Inocula en UFC/ml 7,2105 Concordance par rapport au profil de rfrence en % 71 8,9106 71 2,06107 1,55108 86 86

Ce diagramme montre que les meilleurs profils ont t obtenus avec les inocula de 2107 et de 1,5108 UFC/ml. Par contre les inocula de 7,2105 et de 8,9106 UFC/ml ne permettaient pas dapprcier la sensibilit de S. pyogenes aux antibiotiques. En somme la sensibilit tait acceptable aux inocula de 2,06107 et de 1,55108 UFC/ml avec une concordance de 86%.Mais aux inocula de 7,2105 et de 8,9106 UFC/ml la sensibilit ntait pas acceptable.

89

I-4- Enterococcus faecalis a) Rsultats du dnombrement Tableau XXVIII : Dnombrement dEnterococcus faecalis

Temps (min) 0 60 120 180 240 300

N (UFC/ml) 2,8 105 3,4 105 2,01 106 2,6 107 3,07 108 7,5 109

Par rapport la croissance de S. pyogenes, nous avons constat que celle dEnterococcus faecalis tait beaucoup plus rapide.

b) Rsultat des plaques de sensibilit micro- CSB Strepto Aprs lecture toutes les 4 heures, nous avons pu obtenir les rsultats qui ont t regroups dans les tableaux suivants.

90

Tableau XXIX : Profil de sensibilit dEnterococcus faecalis avec un inoculum de 2,01106 UFC/ml
Temps dincubation de la plaque en heure ANTIBIOTIQUES CCI PNICILLINE G rouge A CCI AMOXICILLINE rouge A CCI ERYTHROMYCINE rouge A CCI DOXYCICLINE rouge A CCI CHLORAMPHENICOL rouge A CCI AMIKACINE rouge A CCI CIPROFLOXACINE rouge A CP TEMOIN CONTROL rouge rouge jaune rouge jaune rouge jaune rouge CN CP CCS rouge CCI rouge S CN CP CCS rouge CCI jaune I CCS rouge CCI CCS rouge CCI jaune R CCS rouge CCI jaune I CCS CCI rouge S CN CP CN CCS rouge CCI rouge S CCS jaune CCI jaune R CCS rouge CCI jaune I CCS rouge CCS rouge CCI jaune R CCS rouge CCI CCS rouge CCI jaune R CCS jaune CCI jaune R CCS CCI rouge S CCS jaune CCI jaune R CCS rouge CCS jaune CCS rouge CCI rouge S CCS jaune CCI jaune R CCS jaune CCI jaune R CCS rouge CCS rouge CCI CCS CCI rouge S CCS jaune CCI jaune R CCS jaune CCS jaune CCS rouge

12

24

rouge rouge S

rouge rouge S

rouge rouge S

91

Lgende : CCI : concentration critique infrieure CCS : concentration critique suprieure TC : contrle positif : couleur jaune Contrle ngatif : couleur rouge CCI et CCS : rouge : bactrie sensible (S) CCI et CCS : jaune : bactrie rsistante (R) CCI jaune et CCS rouge : bactrie intermdiaire (I) CCI rouge et CCS jaune ; CCI et CCS rouge : Aberrant (A)

Ds les premires 4heures, une lecture correcte ntait pas possible. Mais aprs 8 heures dincubation de la microplaque, nous avons obtenu des rsultats qui nous difiaient sur le profil de sensibilit de lespce. Elle a t sensible la pnicilline G, rsistante lrythromycine et au chloramphnicol, intermdiaire lAmikacine. Par contre nous avons not quelques discordances pour certains antibiotiques : la souche tait rsistante lAmoxicilline et sensible la Doxycicline et la Ciprofloxacine.

92

Tableau XXX : Profil de sensibilit dEnterococcus faecalis avec linoculum de 2,6107 UFC/ml
Temps dincubation de la plaque en heure ANTIBIOTIQUES CCI PNICILLINE G rouge A CCI AMOXICILLINE rouge A CCI ERYTHROMYCINE rouge A CCI DOXYCICLINE rouge A CCI CHLORAMPHENICOL rouge A CCI AMIKACINE rouge A CCI CIPROFLOXACINE rouge A CP TEMOIN CONTROL rouge rouge jaune rouge jaune rouge jaune rouge CN CP CCS rouge CCI jaune I CN CP CCS rouge CCI jaune I CCS rouge CCI jaune I CN CP CCS rouge CCI jaune R CCS rouge CCI jaune I CCS rouge CCI jaune I CN CCS rouge CCI rouge S CCS jaune CCI jaune R CCS rouge CCI jaune I CCS rouge CCS rouge CCI jaune R CCS rouge CCI rouge S CCS jaune CCI jaune R CCS rouge CCS rouge CCI jaune R CCS jaune CCI jaune R CCS rouge CCI rouge S CCS jaune CCS rouge CCI rouge S CCS jaune CCI jaune R CCS jaune CCI jaune R CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS jaune CCI jaune R CCS jaune CCS rouge CCI rouge S CCS jaune CCS rouge

12

24

93

Lgende : TC : contrle positif : couleur jaune Contrle ngatif : couleur rouge CCI et CCS : rouge : bactrie sensible (S) CCI et CCS : jaune : bactrie rsistante (R) CCI jaune et CCS rouge : bactrie intermdiaire (I) CCI rouge et CCS jaune ; CCI et CCS rouge : rsultat Aberrant (A)

A 4 heures dincubation, aucune lecture ntait possible. Mais aprs 8 heures dincubation de la microplaque nous avons obtenu des rsultats qui nous difiaient sur le profil de sensibilit de lespce : sensible la pnicilline G, rsistante lrythromycine et au chloramphnicol, intermdiaire lAmikacine et la Ciprofloxacine. Mais nous avons remarqu quelques discordances par rapport certains antibiotiques : lespce a t rsistante lAmoxicilline et sensible la Doxycicline.

94

Tableau XXXI : Profil de sensibilit dEnterococcus faecalis avec linoculum de 3108UFC/ml

Temps dincubation de la plaque en heure ANTIBIOTIQUES CCI PNICILLINE G rouge A CCI AMOXICILLINE rouge A CCI ERYTHROMYCINE rouge A CCI DOXYCICLINE rouge A CCI CHLORAMPHENICOL rouge A CCI AMIKACINE rouge A CCI CIPROFLOXACINE rouge A CP TEMOIN CONTROL rouge rouge jaune rouge jaune rouge jaune rouge CN CP CCS rouge CCI jaune I CN CP CCS rouge CCI jaune I CCS rouge CCI jaune I CN CP CCS rouge CCI jaune R CCS rouge CCI jaune I CCS rouge CCI jaune I CN CCS rouge CCI jaune I CCS jaune CCI jaune R CCS rouge CCI jaune I CCS rouge CCS rouge CCI jaune R CCS rouge CCI jaune I CCS jaune CCI jaune R CCS rouge CCS rouge CCI jaune R CCS jaune CCI jaune R CCS rouge CCI jaune I CCS jaune CCS rouge CCI rouge S CCS jaune CCI jaune R CCS jaune CCI jaune R CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS jaune CCI jaune R CCS jaune CCS rouge CCI rouge S CCS jaune CCS rouge

12

24

95

Lgende : TC : contrle positif : couleur jaune Contrle ngatif : couleur rouge CCI et CCS : rouge : bactrie sensible (S) CCI et CCS : jaune : bactrie rsistante (R) CCI jaune et CCS rouge : bactrie intermdiaire (I) CCI rouge et CCS jaune : Aberrant (A)

Une lecture cohrente tait toujours impossible 4 heures. Mais aprs 8 heures dincubation de la microplaque, nous avons obtenu un profil de sensibilit identifiable au profil de rfrence sauf pour lAmoxicilline pour laquelle espce a t rsistante.

96

Tableau XXXII : Profil de sensibilit dEnterococcus faecalis avec linoculum de 7,5109 UFC/ml
Temps dincubation de la plaque en heure ANTIBIOTIQUES CCI PNICILLINE G rouge A CCI AMOXICILLINE rouge A CCI ERYTHROMYCINE rouge A CCI DOXYCICLINE rouge A CCI CHLORAMPHENICOL rouge A CCI AMIKACINE rouge A CCI CIPROFLOXACINE rouge A CP TEMOIN CONTROL rouge rouge jaune rouge jaune rouge jaune rouge CN CP CCS rouge CCI jaune I CN CP CCS rouge CCI jaune I CCS rouge CCI jaune I CN CP CCS rouge CCI jaune R CCS rouge CCI jaune I CCS rouge CCI jaune I CN CCS rouge CCI jaune I CCS jaune CCI jaune R CCS rouge CCI jaune I CCS rouge CCS rouge CCI jaune R CCS rouge CCI jaune I CCS jaune CCI jaune R CCS rouge CCS rouge CCI jaune R CCS jaune CCI jaune R CCS rouge CCI jaune I CCS jaune CCS rouge CCI rouge S CCS jaune CCI jaune R CCS jaune CCI jaune R CCS rouge CCS rouge CCI rouge S CCS jaune CCI jaune R CCS jaune CCS rouge CCI rouge S CCS jaune CCS rouge

12

24

97

Lgende : TC : contrle positif : couleur jaune Contrle ngatif : couleur rouge CCI et CCS : rouge : bactrie sensible (S) CCI et CCS : jaune : bactrie rsistante (R) CCI jaune et CCS rouge : bactrie intermdiaire (I) CCI rouge et CCS jaune ; CCI et CCS rouge : Aberrant (A)

A 4 heures dincubation, une lecture correcte ntait pas possible. Mais aprs 8 heures dincubation de la microplaque, nous avons obtenu des rsultats similaires linoculum prcdent. Tableau XXXIII : Profil de sensibilit dEnterococcus faecalis

Antibiotiques Pnicilline G Amoxicilline Erythromycine Doxycicline Chloramphnicol Amikacine Ciprofloxacine

Enterococcus faecalis S S R I R I I

Avec ces rsultats pris comme rfrence, nous avons fait comparaison avec ceux de la micro mthode. Ainsi nous avons interprt ces derniers en fonction de la concordance de leurs rsultats.

98

Tableau XXXIV : Concordance des rsultats de la micro mthode avec ceux de lantibiogramme standard.

Inocula en UFC/ml 2,01106 2,6107 Concordance par rapport au profil de rfrence en % 57 71 3,07108 7,5109 86 86

Ce diagramme montre que de faibles inocula ne permettaient pas dapprcier la sensibilit dEnterococcus faecalis par rapport aux antibiotiques. Cependant les inocula de 3,07108 et de 7,5109 UFC/ml nous ont permis dobtenir de bons profils.

99

II- VALIDATION DE LA METHODE Etant donn que les meilleurs rsultats ont t obtenu aprs 8h dincubation des microplaques de sensibilit CSB et du fait de notre objectif fix savoir rduire le dlai de lecture des plaques, nous avons explor lors de la validation, les rsultats obtenus au bout de 8h dincubation. II-1- TRAAGE DE LA DROITE DE REGRESSION La droite de rgression est la droite qui minimise la somme des carrs des carts entre les valeurs observes et les valeurs thoriques. Pour prdire cela, il suffit de substituer la valeur de x dans lquation de la droite de rgression et de calculer la valeur de y. Expression des rsultats : traage de la droite de concordance : Pour ce faire nous avons dtermin la droite la plus reprsentative de lensemble dont lquation est de type y= axi + b - o a et b sont des constantes pouvant etre calcules partir des formules suivantes :

N xy (x) (y) a= N x - (x) y x N a N

b=

- x et y sont des variables Ce qui nous a permis de calculer le coefficient de corrlation r, par cette formule : N xy ( x) ( y) r= N x - ( x) N y - ( y)

100

r = coefficient de corrlation ; xi = donnes observes a = pente de la droite ; b = ordonne lorigine N = nombre de paires (x ; y) utilises pour calculer la droite de concordance n = concentration inoculum ; C = concordance du profil de sensibilit par rapport lantibiogramme Standard

Critres dinterprtation de r r = 0,2 0,4 : Corrlation faible ou quasi absence de corrlation. r = 0,4 0,6 : Corrlation moyenne. r = 0,6 0,8 : Bonne corrlation. r = 0,8 : Corrlation leve. r = 1 o -1 : Corrlation parfaite

101

II-1-1- Stapylococcus aureus En appliquant ces formules, nous avons pu dresser le tableau suivant et par consquent tracer la droite de rgression. Tableau XXXV: Rsultats de S. aureus la 8me heure dincubation des microplaques CSB staph. Concentrations inocula (UFC/ml) Concordance des caractres (%) x = log [n] y =C y a b r 5,7.104 2,2.105 2,3.106 8,8.107 1,11.109

71 4,75 0,71 0,72

71 5,34 0,71 0,74

86

86

86 9.04 0,86 0,89

6,36 7,94 0,86 0,86 0,78 0,85 0,0385 0,5424 0,83

Figure 2 : Droite de rgression de S. aureus

1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0

y'= 0,0385x + 0,5424 2 R = 0,7024

y= C

4 x=log(n)

10

La droite de rgression montre une bonne corrlation entre la taille de linoculum et la concordance du profil de sensibilit avec un coefficient de corrlation r = 0,83 et une quation de droite de type y= 0,0385x+0,5424. Cette corrlation est positive avec une valeur de a>0.

102

II-1-2- Staphylococcus epidermidis Avec ces formules, nous avons pu dresser le tableau suivant et tracer la droite de rgression. Tableau XXXVI : Rsultats de S. epidermidis la 8me heure dincubation des microplaques CSB staph. Concentrations inocula (UFC/ml) 4.104 Concordance des caractres (%) x = log [n] y=C y a b r 57 4,6 0,57 0,63 8,5.104 71 4,92 0,71 0,66 2,7.106 86 6,43 0,86 0,80 0,0916 0,215 0,90 7,3.106 4,1.107 86 6,86 0,86 0,84 86 7,61 0,86 0,91

Figure 3: Droite de rgression de S.epidermidis

1 0,9 0,8 0,7 0,6

y' = 0,0916x + 0,215 R2 = 0,8159

y= C

0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

0 1 2 3 4 5 6 7 8

x=log(n)

La valeur du coefficient de corrlation reflte une excellente corrlation entre les variables savoir la taille de linoculum et la concordance du profil de sensibilit. La valeur de la pente (a) tmoigne de la positivit de la corrlation.

103

II-1-3- Streptococcus pyogenes Ces formules nous ont permis de dresser ce tableau et par consquent de tracer la droite de rgression. Tableau XXXVII : Rsultats de S. pyogenes la 8me heure dincubation de la microplaque CSB strepto. Concentrations inocula (UFC/ml) 7,2.105 8,9.106 2,06.107 1,55.108

Concordance des caractres (%) 71 X = log [n] 5,85 y =C 0,71 y 0,70 a b r

71 6,94 0,71 0,77

86 7,31 0,86 0,80 0,072 0,275 0,80

86 8,19 0,86 0,86

Figure 4 : Droite de rgression de S.pyogenes

1 0,9 0,8 0,7 0,6 y= C 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 2 4 x=log(n) 6 8 10 y' = 0,0721x + 0,2748 R = 0,6517
2

La valeur du coefficient de corrlation traduit la bonne corrlation des 2 paramtres tudis, avec une quation de droite de type y= 0, 0721x+ 0,2748 et une pente positive.

104

II-1-4- Enterococcus feacalis Ainsi avec ces formules nous, avons pu dresser ce tableau et tracer la droite de rgression. Tableau XXXVIII : Rsultats dEnterococcus faecalis a la 8me heure dincubation de la microplaque CSB Concentrations inocula (UFC/ml) 2,01.106 2,6.107 71 7,41 0,71 0,70 3.7108 86 8,48 0,86 0,79 0,084 0,0732 0,92 7,5.109 86 9,87 0,86 0,90

Concordance des caractres (%) 57 x = log [n] 6,3 y =C 0,57 y 0,60 a b r

Figure 5 : Droite de rgression de E.faecalis

1 0,8
y= C

y' = 0,0844x + 0,0732 2 R = 0,8533

0,6 0,4 0,2 0 0 2 4 6

x=log(n)

10

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La corrlation entre les 2 paramtres que sont la taille de linoculum et la concordance du profil de sensibilit est excellente et positive.

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Pour lensemble des souches tudies avec la micro mthode CSB, nous avons observ une bonne corrlation entre la taille de linoculum et les bons profils de sensibilit. Le but de notre travail tait de rduire le dlai de lecture de la sensibilit de ces souches avec la micro mthode CSB- sensibilit Ce qui a t possible avec un dlai qui est pass de 24 h 8 h. Nous avons trouv intressant de comparer les rsultats de cette mthode avec ceux dautres mthodes savoir le E-test ou la mthode de diffusion en milieu glos pour jauger son efficacit et sa fiabilit. 1- Les souches bactriennes Notre travail a port sur des souches pralablement identifies puis bien conserves -20C ou -70C. Il tait important de nous assurer quil sagissait bien des espces bactriennes tudier, do la ncessit davoir fait une identification sommaire de ces bactries. Ceci nous a permis dviter les souillures qui risquaient de fausser nos rsultats. 2- Effet inoculum par ltude de la croissance La technique de dnombrement sur bote de petri est simple et fiable, de mise en uvre facile et utilise dans divers travaux antrieurs [15]. Et il est ncessaire de noter que leffet inoculum a fait lobjet de plusieurs tudes antrieures savoir celles de Sow Mame Fatou et de Diao Magatte. Cest pourquoi nous avons jug ncessaire de ne pas nous appesantir sur ltude de la croissance par la mthode de dnombrement. 3- Etude de la sensibilit avec les microplaques CSB-Sensibilit 3-1- Inoculum bactrien La prparation de linoculum bactrien constitue une tape importante dans ltude de la sensibilit des germes aux antibiotiques. Le choix de travailler sur une souche pure et jeune tait impratif et de standardiser la concentration finale de linoculum car comme la montr Niasse M F., il y a une variation importante de la sensibilit en fonction de linoculum.

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Le milieu dtude de la sensibilit doit rpondre certaines conditions pour donner des rsultats fiables. Notre choix a port sur le bouillon AM3.Le glucose, constituant essentiel du milieu est un sucre utilis pour la plupart des bactries. Son utilisation par les microorganismes conduit la production dacide. Cette production a t mise en vidence par un indicateur color le rouge de phnol. Il a permis une lecture facile avec un virage franc (du rouge au jaune) en cas de croissance bactrienne. La zone de virage du rouge de phnol doit correspondre aux variations du pH du milieu de 6,8 8,4.

3-2- Les antibiotiques Les antibiotiques choisis doivent tre stables et actifs au cours des tests. Les concentrations critiques retenues pour ce ont permis une catgorisation clinique en sensible, intermdiaire et rsistante. Les concentrations critiques utilises sont celles tires du logiciel whonet V. Les poudres sont conserves selon les directives du fabricant, elles restent stables jusqu leur date de premption. Quand aux solutions mres, elles ont t conserves -20C pour une conservation court terme. Les recommandations de conservation cette temprature sont pour une priode de 6 semaines, pour lampicilline et lamoxicilline, de 6mois pour les autres antibiotiques ; et -70C pour une longue conservation. 3-3- Temps dincubation des microplaques CSB-Sensibilit Les plaques de sensibilit micro-CSB Staph et microCSB Strepto ont t valides par des tudes de stabilit, defficacit et de reproductibilit avant leur utilisation. Les Staphylocoques Pour tous les inocula, la lecture aprs 4h dincubation na rien donn. Ce ntait quau bout de 8h dincubation de ces plaques que nous avons pu faire une lecture correcte de la sensibilit de ces germes.

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Avec les inocula de 2,3107, 8,8108 et 1,11010 UFC/ml les pourcentages de concordance des rsultats du profil de sensibilit obtenus taient de 86% pour lespce de Staphylococcus aureus. Ceci en comparaison avec le profil de sensibilit de la mthode de diffusion en milieu glos ou le E-test, nous pouvons dire que ltude de la sensibilit de S.aureus tait acceptable aprs 8h dincubation. Cependant nous avons not quelques discordances des rsultats des plaques avec certains antibiotiques. En effet lespce tait intermdiaire au chloramphnicol et la ciprofloxacine pour les inocula de 5,7105et de 2,2106 UFC/ml alors que le profil de sensibilit de la mthode de diffusion en milieu glos et le E-test rvlait une espce sensible. Mais pour les derniers inocula o la population bactrienne a augment, lespce tait devenue sensible la ciprofloxacine. Nous avons not aussi des rsultats aberrants avec une plaque de sensibilit (le chloramphnicol avec une CCI rouge et une CCS jaune). Pour lespce de Staphylococcus epidermidis, les pourcentages de concordance des rsultats obtenus aux inocula de 2,7106, 7,3106 et 4,1107 UFC/ml taient de 86%. Mais nous avons eu des discordances avec les antibiotiques suivants : la Doxycicline, le chloramphnicol et la ciprofloxacine pour lesquels lespce a t intermdiaire. En somme nous pouvons dire que ltude de la sensibilit par la micromthode malgr les faibles discordances notes, permettait une bonne lecture de la sensibilit de S.epidermidis aprs 8h dincubation. Toutes ces discordances pourraient tre expliques par la prsence dions dans le milieu utilis et aux conditions de conservation des solutions mres dantibiotiques. La prparation des solutions de travail est trs difficile et ncessite beaucoup de calculs pour obtenir la CCI et CCS et les dilutions adquates ; ceci pourrait etre sources derreurs de calcul. Certains substrats ou enzymes prsents dans les milieux CSB peuvent induire des mutations. Les Streptocoques Les pourcentages de concordance des rsultats du profil de sensibilit de lespce de Streptococcus pyogenes en comparaison avec la mthode de diffusion en milieu glos et le E-test obtenus aux inocula de 2,06107 et de 1,55108 UFC/ml taient de 86% ; malgr la discordance note avec lamoxicilline pour qui lespce tait rsistante alors quavec la mthode de diffusion en milieu glos et le E-test lespce tait sensible.

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De mme avec Enterococcus faecalis les pourcentages de concordance des rsultats obtenus aux inocula de 3,07108 et de 7,5109 taient de 86%. Nous avons aussi not une discordance : lespce tait rsistante lamoxicilline. Comme pour les Staphylocoques, toutes ces discordances ont la mme explication. Durant nos manipulations, nous avons remarqu que les cupules des plaques de sensibilit qui taient jaunes aprs une incubation de 8h ont vir (du jaune au rose) avec un dpt au fond de la cupule aprs 24h dincubation. Nous pourrons penser que les germes aprs une rsistance aux antibiotiques, ils sont finis par alcaliser le milieu. 4- Validation Pour valider notre mthode nous avons travaill sur la droite de rgression et le coefficient de corrlation. La droite de rgression permet davoir la droite la plus reprsentative de lensemble des points. La valeur du coefficient de corrlation reflte une bonne linarit entre les deux variables x et y. En se basant sur la valeur des pentes (a) trouves pour les diffrentes droites, nous pouvons dire que la corrlation tait positive entre les paramtres tudis. S.aureus a = 0,0385 S.epidermidis a = 0,0916 S.pyogenes a =0,072 E.faecalis a =0,084 La valeur des coefficients de corrlation trouve permettait de dire que les corrlations taient parfaites. Elle permettait galement de conclure que la relation entre les deux variables tait bien linaire dans la mesure o le coefficient de corrlation r est proche de 1 S.aureus r =0,83 S.epidermidis r =0,90 S.pyogenes r =0,80 E.faecalis r =0,92 En pratique ltablissement de courbes de concordance prsente ses propres exigences et difficults.

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Lorsque les donnes ne sont pas parfaitement alignes, a ne signifie pas que la droite trouve est rejeter. La prise de donnes nest jamais faite dans des conditions idales. Nous devons considrer que des facteurs sont hors de notre contrle, prcision de lappareil de mesure, temprature, etc., qui influence les rsultats obtenus. Par consquent nous pouvons conclure, compte tenu des valeurs obtenues, que la mthode tait fiable et valide.

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Les infections bactriennes dues aux Staphylocoques et aux Streptocoques, si diverses dans leurs manifestations cliniques sont parmi les plus frquentes. Les Staphylocoques sont des commensaux ubiquitaires de la peau et des muqueuses et sont aussi responsables dinfections svres locales systmiques. Les Streptocoques sont frquemment isole des infections de la sphre ORL et cutanes. Les entrocoques sont prsent un peu partout dans lorganisme et principalement au niveau du tractus intestinal. Lexistence de souches multi rsistantes et lapparition de nouvelles rsistances posent de srieux problmes pour le choix du traitement des infections causes par ces germes. Aussi, la ralisation pralable dun antibiogramme savre dune grande importance avant tout traitement antibiotique. De nombreuses mthodes dtude in vitro de la sensibilit sont en effet actuellement disponibles (diffusion en milieu glos, le E-test, systme effectuant une analyse cintique de la croissance, dilution en bouillon), mais sont le plus souvent trop onreuses pour les structures sanitaires de nos pays en voie de dveloppement. Cest dans ce contexte que des tudes ont t menes au laboratoire de bactriologie-virologie de lhpital Aristide Le Dantec depuis quelques annes et ont permis la mise au point de micro mthodes dtude de la sensibilit des bactries : les micro-CSB Sensibilit. Ces mthodes utilisent un indicateur color (le rouge de phnol) pour dtecter la croissance des bactries assimilant le glucose contenue dans les cupules des microplaques et ce, en prsence de deux concentrations : une concentration critique suprieure (CCS) et une concentration critique infrieure (CCI). Les plaques taient incubes pendant 24h et la lecture tait faite toutes les 4heures pour dceler une croissance bactrienne grce au virage de lindicateur color. Ceci avait permis de classer la souche dans les catgories : - Sensible : si la croissance est inhibe aux deux concentrations critiques - Rsistante : sil y a eu croissance bactrienne aux deux concentrations critiques de lantibiotique - Intermdiaire : sil y a eu croissance au niveau de la concentration critique infrieure et une inhibition de cette croissance avec la concentration critique suprieure.

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Des travaux antrieurs ont montr lefficacit et la fiabilit de ces microplaques. De plus, elles sont nettement de moindre cot par rapport aux autres mthodes. Mais elles taient toujours un dlai de lecture de 24h. Afin de contribuer la rduction du temps dincubation, nous avons propos une technique donnant de bons rsultats de sensibilit et ce par variation de la taille de linoculum. Cette tude a eu lieu Dakar entre octobre 2007 et juin 2008. Elle a port sur quatre souches : - Staphylococcus aureus ATCC2913 - Staphylococcus epidermidis - Streptococcus pyogenes - Enterococcus faecalis Nous avons tudi la croissance par la mthode du dnombrement sur bote de ptri et test le comportement de ces quatre souches vis--vis de sept antibiotiques : - La pnicilline G - Lamoxicilline - Lerythromycine - La doxycycline - Lamikacine - Le chloramphnicol - La ciprofloxacine Les rsultats de notre tude du profil de sensibilit ont t compars ceux de lantibiogramme standard ou diffusion en milieu glos et ceux du E-test, afin de prouver la fiabilit des rsultats de notre micro mthode. Ltude a montr que la sensibilit de ces germes pourrait tre dtermine avec la micro mthode CSB seulement aprs 8heures dincubation et avec de bons rsultats.

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Nanmoins elle aurait pu tre plus exhaustive avec une phase devaluation et cela fera lobjet dautres recherches par : - lutilisation dun grand nombre de souches - La ralisation de la mme tude pour les autres types de micro-CSB Sensibilit : Enterobactries, Bacilles gram ngatif non fermentaires Une troite collaboration entre pharmaciens, cliniciens et biologistes, la diffusion et lchange dinformations ainsi que la confrontation des rsultats sont indispensables pour un choix judicieux des traitements antibiotiques, ce qui permettrait de limiter lmergence et la diffusion des souches multirsistantes et de prciser les molcules les plus actives.

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