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OFICINA ESPAOLA DE PATENTES Y MARCAS

11 Nmero de publicacin: 51 Int. Cl.:

2 266 214

ESPAA

C07D 209/40 (2006.01) C07D 209/80 (2006.01) C07D 471/04 (2006.01) C07D 241/36 (2006.01) C07D 487/04 (2006.01) A61K 31/40 (2006.01) A61K 31/435 (2006.01) A61K 31/495 (2006.01) A61P 25/00 (2006.01) TRADUCCIN DE PATENTE EUROPEA T3

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86 Nmero de solicitud europea: 01946852 .9 86 Fecha de presentacin : 23.01.2001 87 Nmero de publicacin de la solicitud: 1255734 87 Fecha de publicacin de la solicitud: 13.11.2002

54 Ttulo: Derivados de isatina con actividad neurotrca.

30 Prioridad: 24.01.2000 DK 2000 00106

73 Titular/es: NEUROSEARCH A/S

Pederstrupvej 93 2750 Ballerup, DK

45 Fecha de publicacin de la mencin BOPI:

72 Inventor/es: Gronborg, Mette;

01.03.2007

Peters, Dan y Moller, Arne

45 Fecha de la publicacin del folleto de la patente:

74 Agente: Garca-Cabrerizo y del Santo, Pedro

01.03.2007

ES 2 266 214 T3

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicacin en el Boletn europeo de patentes, de
la mencin de concesin de la patente europea, cualquier persona podr oponerse ante la Ocina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposicin deber formularse por escrito y estar motivada; slo se considerar como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposicin (art. 99.1 del Convenio sobre concesin de Patentes Europeas).
Venta de fascculos: Ocina Espaola de Patentes y Marcas. P de la Castellana, 75 28071 Madrid

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DESCRIPCIN Derivados de isatina con actividad neurotrca.
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Campo de la invencin La presente invencin se reere a nuevos derivados de isatina, a composiciones farmacuticas que comprenden los derivados de isatina de la invencin, a mtodos para preparar los derivados de isatina de la invencin, y a su uso en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas y para la regeneracin o prevencin de la degeneracin de neuronas lesionadas y daadas. Antecedentes de la tcnica

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Los factores de crecimiento (o factores neurotrcos) promueven la diferenciacin, crecimiento y supervivencia de numerosas neuronas del sistema nervioso central y perifrico durante el desarrollo y la edad adulta. Se han identicado las caractersticas moleculares, regulacin y mecanismo de transduccin de seales para varios factores neurotrcos. Lo ms teraputicamente prometedor de estas molculas son el factor de crecimiento nervioso (NGF), el factor neurotrco derivado de cerebro (BNDF), el factor neurotrco ciliar (CNTF), el factor de crecimiento de broblastos bsico (bFGF), el factor de crecimiento similar a la insulina I (IGF-I), y el factor neurotrco derivado de la lnea celular glial (GDNF). Los datos disponibles sugieren que los factores neurotrcos sern tiles en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson y esclerosis lateral amiotrca. Otros factores neurotrcos adicionales han mostrado efectos beneciosos en modelos animales de lesin del nervio perifrico y neuropata inducida por toxinas [CNS Drugs 1994 2 (6)465-478]. Diversos estudios con ratas predicen que ciertos compuestos que imitan o mejoran la funcin del NGF pueden salvar neuronas colinrgicas septales y aliviar la falta de memoria benigna y el deterioro de la memoria en la demencia senil [Science 1994 264 772-774].

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Estudios recientes han demostrado que el NGF tiene un efecto neuroprotector en las neuronas del hipocampo despus de isquemia cerebral, lo que pronostica un papel teraputico potencial para NGF en el tratamiento de la lesin neuronal isqumica cerebral [NeuroReport 1995 6 (4) 669-672].
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Los factores de crecimiento inician su accin biolgica mediante la unin a receptores de supercie celular especcos. La unin del factor de crecimiento a su receptor activa la transduccin de seales intracelulares, lo que conduce a la generacin de diversos segundos mensajeros y a la activacin de cascadas enzimticas, que implican tirosina quinasas y protena quinasa C, y culmina en un efecto biolgico. La ruta de transduccin de seales intracelulares todava no se entiende totalmente. NGF y las neurotronas relacionadas son pptidos grandes, lo que les hace candidatos teraputicos poco probables. Los malos parmetros farmacocinticos (por ejemplo, absorcin oral pobre y vida media corta in vivo), y la administracin a los rganos diana representan los principales problemas.

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Hay una necesidad constante de desarrollar nuevos compuestos que puedan interactuar con los receptores de neurotrona, que muestren propiedades fsico-qumicas diferentes de las de las neutronas. El documento WO 99/49864 describe derivados de indol 2,3-diona-3-oxima para combatir enfermedades y trastornos asociados con la liberacin de aminocidos excitadores.

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El documento WO 98/14447 describe derivados de indol 2,3-diona-3-oxima que pueden antagonizar el efecto de aminocidos excitadores.
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Los documentos WO 96/048495 y WO 96/08494 describen derivados de indol y quinoxalina condensados y derivados de indol-2,3-diona-3-oxima que pueden antagonizar el efecto de los aminocidos excitadores. El documento WO 94/26747 describe antagonistas de AMPA de anillo condensado.

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El documento EP 432 648 A2 describe derivados de isatina activos como antagonistas de aminocidos excitadores. De forma genrica, la frmula general descrita en el documento tambin cubre algunos derivados de 6,7,8,9-tetrahidro1-H-pirrolo[3.2-h]naftaleno-2,3-diona-3-oxima 5-substituidos. Sin embargo, slo se menciona un ejemplo especco, concretamente el compuesto 5-nitro-6,7,8,9-tetrahidro-1-H-pirrolo[3.2-h]naftaleno-2,3-diona-3-oxima. Sumario de la invencin

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De acuerdo con la presente invencin se proporcionan nuevos compuestos neurotrcamente activos. La actividad neurotrca no se ha atribuido a una etapa especca en la interaccin entre NGF y su receptor o en la ruta de transduccin de seales de NGF.
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La actividad neurotrca de los compuestos de la invencin les hace tiles para el tratamiento o la prevencin de diversas enfermedades degenerativas de los nervios, incluyendo enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, y esclerosis lateral amiotrca (ELA), y para el alivio de la falta de memoria benigna y el deterioro de la memoria observado en la demencia senil o con respecto a enfermedades neurodegenerativas.
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Adems, los compuestos de la invencin han demostrado ser tiles para el tratamiento de neuropata y en particular neuropata perifrica provocada, por ejemplo, por anomalas genticas y otras afecciones tales como diabetes, polio, herpes y SIDA, y ms especialmente neuropata y neuropata perifrica padecida por la mayora de pacientes con cncer despus o durante quimioterapia.
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Los compuestos de la presente invencin se consideran particularmente tiles para el tratamiento de lesiones traumticas de nervios perifricos, la mdula, y/o la mdula espinal, y en el tratamiento de isquemia cerebral, por ejemplo lesin neuronal isqumica despus de paro cardaco, apopleja, o lesin cerebral post-asxia en recin nacidos, o despus de casi ahogarse.
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En su primer aspecto la invencin proporciona nuevos derivados de isatina representados por la frmula general formula (IV)
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o una sal farmacuticamente aceptable de los mismos, en la que,

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R1 , R2 y R5 son como se denen ms adelante.

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En otro aspecto, la invencin proporciona composiciones farmacuticas que comprenden una cantidad teraputicamente ecaz de un compuesto de la invencin junto con al menos un vehculo o diluyente farmacuticamente aceptable. En un tercer aspecto, la invencin se reere al uso de un compuesto de la invencin para la fabricacin de un medicamento para el tratamiento o alivio de una enfermedad o un trastorno o una afeccin de un mamfero, incluyendo un ser humano, siendo la enfermedad o trastorno o afeccin responsable de la actividad de un agente neurotrco. Otros objetos de la invencin sern evidentes para el especialista en la tcnica a partir de la siguiente descripcin detallada y ejemplos.

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Descripcin detallada de la invencin Nuevos Compuestos Neurotrcos

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En su primer aspecto, la invencin proporciona nuevos derivados de isatina de frmula general (IV):

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en la que R1 representa hidrgeno o un grupo alquilo;
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R2 representa hidrgeno, un grupo alquilo, un grupo acilo, o un grupo isoxazolilo, pudiendo estar el grupo isoxazolilo opcionalmente sustituido con uno o ms sustituyentes seleccionados entre el grupo constituido por alquilo o alcoxi; y R5 representa un grupo fenilo sustituido en la posicin 4 con halgeno, CF3 , NO2 , amino, alquilo o alcoxi.

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En una realizacin ms preferida, los derivados de isatina de frmula general (IV) son 5-(4-Clorofenil)-6,7,8,9-tetrahidro-1-H-pirrolo[3.2-h]naftaleno-2,3-diona-3-oxima;
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o una sal farmacuticamente aceptable de los mismos. Denicin de Sustituyentes En el contexto de de esta invencin, halgeno representa un tomo de or, cloro, bromo o yodo.

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En el contexto de esta invencin, un grupo alquilo designa una cadena de hidrocarburo lineal o ramicada saturada univalente. La cadena de hidrocarburo contiene de uno a dieciocho tomos de carbono (alquilo C118 ), se preere ms de uno a seis tomos de carbono (alquilo C16 ; alquilo inferior), incluyendo pentilo, isopentilo, neopentilo, pentilo terciario, hexilo e isohexilo. En una realizacin preferida, alquilo representa un grupo alquilo C14 , incluyendo butilo, isobutilo, butilo secundario, y butilo terciario. En una realizacin preferida de esta invencin, alquilo representa un grupo alquilo C13 , que puede ser en particular metilo, etilo, propilo o isopropilo. En el contexto de esta invencin, un grupo alcoxi designa un grupo alquil-O-, donde alquilo es como se ha denido anteriormente.

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En el contexto de esta invencin, un grupo acilo designa un grupo carboxi (-COOH) o un grupo alquilcarbonilo (alquil-CO-), donde alquilo es como se ha denido anteriormente. Los ejemplos de grupos acilo preferidos de la invencin incluyen carboxi, acetilo, y propionilo.
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En el contexto de esta invencin, un grupo amino puede ser un grupo amino primario (-NH2 ), secundario (-NHalquilo), o terciario (-N(alquil)2 ), es decir, puede sustituirse una vez o dos veces con un grupo alquilo como se ha denido anteriormente. Ismeros Estricos

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Los compuestos qumicos de la presente invencin pueden existir en las formas (+) y (-) as como en las formas racmicas. Los racematos de estos ismeros y los propios ismeros individuales estn dentro del alcance de la presente invencin.
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Las formas racmicas pueden resolverse en las antpodas pticas mediante mtodos y tcnicas conocidos. Una forma de separar las sales diastereomricas es mediante el uso de un cido pticamente activo, y la liberacin del compuesto amina pticamente activo por tratamiento con una base. Otro mtodo para resolver racematos en las antpodas pticas se basa en la cromatografa sobre una matriz activa ptica. De esta forma, los compuestos racmicos de la presente invencin pueden resolverse en sus antpodas pticas, por ejemplo, mediante cristalizacin fraccionada de, por ejemplo, sales d- o I- (tartratos, mandelatos o alcanforsulfonato). Los compuestos qumicos de la presente invencin tambin pueden resolverse mediante la formacin de amidas diastereomricas mediante la reaccin de los compuestos qumicos de la presente invencin con un cido carboxlico activado pticamente activo tal como el derivado de (+) o (-) fenilalanina, (+) o (-) fenilglicina, (+) o (-) cido canfnico o mediante la formacin de carbamatos diastereomricos por la reaccin del compuesto qumico de la presente invencin con un cloroformiato pticamente activo o similar. En la tcnica se conocen mtodos adicionales para resolver los ismeros pticos. Tales mtodos incluyen los descritos por Jaques J, Collet A, & Wilen S en Enantiomers, Racemates, and Resolutions, John Wiley y Sons, Nueva York (1981). Tambin se pueden preparar compuestos con actividad ptica a partir de materiales de partida con actividad ptica. Sales Farmacuticamente Aceptables

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El compuesto qumico de la invencin puede proporcionarse en cualquier forma adecuada para la administracin deseada. Las formas adecuadas incluyen sales farmacuticamente (es decir, siolgicamente) aceptables, y formas pre- o profrmaco del compuesto qumico de la invencin.
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Los ejemplos de sales de adicin farmacuticamente aceptables incluyen, sin limitacin, las sales de adicin de cidos no txicas, inorgnicas y orgnicas tales como el clorhidrato derivado del cido clorhdrico, el bromhidrato derivado del cido bromhdrico, el nitrato derivado del cido ntrico, el perclorato derivado del cido perclrico, el fosfato derivado del cido fosfrico, el sulfato derivado del cido sulfrico, el formiato derivado del cido frmico, el acetato derivado del cido actico, el aconato derivado del cido acontico, el ascorbato derivado del cido ascrbico, el bencenosulfonato derivado del cido bencenosulfnico, el benzoato derivado del cido benzoico, el cinnamato derivado del cido cinnmico, el citrato derivado del cido ctrico, el embonato derivado del cido embnico, el enantato derivado del cido enntico, el fumarato derivado del cido fumrico, el glutamato derivado del cido glutmico, el glicolato derivado del cido gliclico, el lactato derivado del cido lctico, el maleato derivado del cido maleico, el malonato derivado del cido malnico, el mandelato derivado del cido mandlico, el metanosulfonato derivado del cido metano sulfnico, el naftaleno-2-sulfonato derivado del cido naftaleno-2-sulfnico, el ftalato derivado del cido ftlico, el salicilato derivado del cido saliclico, el sorbato derivado del cido srbico, el estearato derivado del cido esterico, el succinato derivado del cido succnico, el tartrato derivado del cido tartrico, el tolueno-p-sulfonato derivado del cido p-tolueno sulfnico, y similares. Tales sales pueden formarse por procedimientos bien conocidos y descritos en la tcnica. Otros cidos tales como cido oxlico, que pueden no considerarse farmacuticamente aceptables, pueden ser tiles en la preparacin de sales tiles como intermedios en la obtencin de un compuesto qumico de la invencin y su sal de adicin de cidos farmacuticamente aceptable.
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Las sales de metal de un compuesto qumico de la invencin incluyen sales de metales alcalinos, tales como la sal sdica de un compuesto qumico de la invencin que contiene un grupo carboxi.
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En el contexto de esta invencin, las sales onio de los compuestos que contienen N tambin se consideran sales farmacuticamente aceptables. Las sales onio preferidas incluyen las sales alquil-onio, las sales cicloalquil-onio, y las sales cicloalquilalquil-onio. El compuesto qumico de la invencin puede proporcionarse en formas disolubles o indisolubles junto con disolventes farmacuticamente aceptables tales como agua, etanol, y similares. Las formas disolubles tambin pueden incluir formas hidratadas tales como el monohidrato, el dihidrato, el hemihidrato, el trihidrato, el tetrahidrato, y similares. En general, las formas disolubles se consideran equivalentes a formas indisolubles para los propsitos de esta invencin. Compuestos Marcados

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Los compuestos de la invencin pueden usarse en su forma marcada o no marcada. En el contexto de esta invencin, marcar se reere a la unin de un marcador al compuesto de inters que permitir una deteccin cuantitativa fcil de dicho compuesto.
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Los compuestos marcados de la invencin pueden ser tiles como herramientas de diagnstico, radio-indicadores, o agentes de control en diversos mtodos de diagnstico, y para la formacin de imgenes de receptores in vivo. En el compuesto marcado, se han cambiado uno o ms tomos en un istopo del tomo natural. Los compuestos marcados incluyen, aunque sin limitacin, 2 H (deuterio), 3 H (tritio), 13 C, 14 C, 131 I, 125 I, 123 I y 18 F.

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En una realizacin preferida, el mtodo de deteccin fsica se selecciona entre PET, SPECT; MRS, MRI, CAT o combinaciones de los mismos. Mtodos de Preparacin
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Los derivados de isatina de la invencin pueden prepararse por mtodos convencionales para sntesis qumica, por ejemplo los descritos en los ejemplos de trabajo. Los materiales de partida para los procesos descritos en la presente solicitud se conocen o pueden prepararse fcilmente por mtodos convencionales a partir de agentes qumicos disponibles en el mercado.
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Los productos nales de las reacciones descritas en este documento pueden aislarse por tcnicas convencionales, por ejemplo por extraccin, cristalizacin, destilacin, cromatografa, etc. Composiciones farmacuticas
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En otro aspecto, la invencin proporciona nuevas composiciones farmacuticas que comprenden una cantidad teraputicamente ecaz del compuesto qumico de la invencin.
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Aunque puede administrarse un compuesto qumico de la invencin para uso en terapia en forma del compuesto qumico de partida, se preere introducir el ingrediente activo, opcionalmente en forma de una sal siolgicamente aceptable, en una composicin farmacutica junto con uno o ms adyuvantes, excipientes, vehculos, tampones, diluyentes, y/u otros auxiliares farmacuticos habituales.
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En una realizacin preferida, la invencin proporciona composiciones farmacuticas que comprenden el compuesto qumico de la invencin, o una sal o derivado farmacuticamente aceptable del mismo, junto con uno o ms vehculos farmacuticamente aceptables para los mismos y, opcionalmente, otros ingredientes teraputicos y/o prolcticos. El vehculo o vehculos deben ser aceptables en el sentido de ser compatibles con los dems ingredientes de la formulacin y no perjudiciales para el receptor de los mismos. Las composiciones farmacuticas de la invencin pueden ser aquellas adecuadas para administracin oral, rectal, bronquial, nasal, tpica (incluyendo bucal y sub-lingual), transdrmica, vaginal o parenteral (incluyendo inyeccin o infusin cutnea, subcutnea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, intraarterial, intracerebral, intraocular), o aquellas en una forma adecuada para administracin por inhalacin o insuacin, incluyendo administracin de polvos y lquidos en aerosol, o por sistemas de liberacin sostenida. Los ejemplos adecuados de sistemas de liberacin sostenida incluyen matrices semipermeables de polmeros hidrfobos slidos que contienen el compuesto de la invencin, pudiendo estar las matrices en forma de artculos con forma, por ejemplo pelculas o microcpsulas. De esta forma, el compuesto qumico de la invencin, junto con un adyuvante, vehculo, o diluyente convencional, puede tomar la forma de composiciones farmacuticas y dosicaciones unitarias de las mismas. Tales formas incluyen slidos, y en particular comprimidos, cpsulas cargadas, polvo y formas de grnulos, y lquidos, en particular soluciones acuosas o no acuosas, suspensiones, emulsiones, elixires, y cpsulas cargadas con los mismos, todos para uso oral, supositorios para administracin rectal, y soluciones inyectables estriles para uso parenteral. Tales composiciones farmacuticas y formas de dosicacin unitaria de las mismas pueden comprender ingredientes convencionales en proporciones convencionales, con o sin compuestos o principios activos adicionales, y tales formas de dosicacin unitaria pueden contener cualquier cantidad ecaz adecuada del ingrediente activo en proporcin al intervalo de dosicacin diario deseado a emplear. El compuesto qumico de la presente invencin puede administrase en una amplia variedad de formas de dosicacin oral y parenteral. Ser obvio para los especialistas en la tcnica que las siguientes formas de dosicacin pueden comprender, como componente activo, un compuesto qumico de la invencin o una sal farmacuticamente aceptable de un compuesto qumico de la invencin. Para preparar composiciones farmacuticas a partir de un compuesto qumico de la presente invencin, los vehculos farmacuticamente aceptables pueden ser slidos o lquidos. Las preparaciones en forma slida incluyen polvos, comprimidos, pldoras, cpsulas, obleas, supositorios y grnulos dispersables. Un vehculo slido puede ser una o ms sustancias que tambin pueden actuar como diluyentes, agentes aromatizantes, solubilizantes, lubricantes, agentes de suspensin, aglutinantes, conservantes, agentes de disgregacin de comprimidos, o un material de encapsulacin. En polvos, el vehculo es un slido dividido namente que est en una mezcla con el componente activo dividido namente.
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En comprimidos, el componente activo est mezclado con el vehculo que tiene la capacidad de unin necesaria en proporciones adecuadas y est compactado en la forma y tamao deseados. Los polvos y comprimidos contienen preferiblemente del cinco o diez a aproximadamente el setenta por ciento del compuesto activo. Son vehculos adecuados carbonato de magnesio, estearato de magnesio, talco, azcar, lactosa, pectina, dextrina, almidn, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboximatilcelulosa sdica, una cera de bajo punto de fusin, manteca de cacao y similares. El trmino preparacin pretende incluir la formulacin del compuesto activo con material de encapsulacin como vehculo proporcionando una cpsula en la que el componente activo, con o sin vehculos, est rodeado por un vehculo, que de esta forma est en asociacin con el mismo. Asimismo, se incluyen obleas y grageas. Pueden usarse comprimidos, polvos, cpsulas, pldoras, obleas y grageas como formas slidas adecuadas para administracin oral. Para preparar supositorios, primero se funde una cera de bajo punto de fusin, tal como una mezcla de glicrido de cido graso o manteca de cacao y el componente activo se dispersa de forma homognea en su interior, como por agitacin. Despus, la mezcla homognea fundida se vierte en moldes de tamao conveniente, se deja enfriar y de esta forma solidicar.

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Las composiciones adecuadas para administracin vaginal pueden prepararse en forma de supositorios vaginales, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o pulverizadores que contienen adems del ingrediente activo, vehculos que se consideran apropiados en la tcnica.
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Las preparaciones lquidas incluyen soluciones, suspensiones, y emulsiones, por ejemplo, soluciones acuosas o soluciones acuosas de propilenglicol. Por ejemplo, pueden formularse preparaciones lquidas para inyeccin parenteral en forma de soluciones en solucin acuosa de polietilenglicol. De esta forma, el compuesto qumico de acuerdo con la presente invencin puede formularse para administracin parenteral (por ejemplo, por inyeccin, por ejemplo inyeccin en embolada o infusin continua) y puede presentarse en forma de dosis unitarias en ampollas, jeringas precargadas, infusin de volumen pequeo o en recipientes de mltiples dosis con un conservante aadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones, o emulsiones en vehculos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulacin tales como agentes
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de suspensin, estabilizacin y/o dispersantes. Como alternativa, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo, puede obtenerse por aislamiento asptico del slido estril o por liolizacin de la solucin, para la constitucin con un vehculo adecuado, por ejemplo agua estril sin pirgenos, antes de su uso.
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Las soluciones acuosas adecuadas para uso oral pueden prepararse disolviendo el componente activo en agua y aadiendo agentes colorantes, aromatizantes, estabilizantes y espesantes adecuados, segn se desee. Las suspensiones acuosas adecuadas para uso oral pueden prepararse dispersando el componente activo dividido namente en agua con material viscoso, tal como gomas naturales o sintticas, resinas, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sdica, u otros agentes de suspensin bien conocidos. Tambin se incluyen preparaciones de forma slida que se pretenden convertir, poco antes de su uso, en preparaciones de forma lquida para la administracin oral. Tales formas lquidas incluyen soluciones, suspensiones, y emulsiones. Estas preparaciones pueden contener, adems del componente activo, colorantes, aromatizantes, estabilizantes, tampones, edulcorantes articiales y naturales, dispersantes, espesantes, agentes de solubilizacin, y similares. Para la administracin tpica a la epidermis, el compuesto qumico de la invencin puede formularse en forma de pomadas, cremas o lociones, o como un parche transdrmico. Por ejemplo, las pomadas y cremas pueden formularse con una base acuosa u oleosa con la adicin de agentes espesantes y/o gelicantes adecuados. Las lociones pueden formularse con una base acuosa u oleosa y en general tambin contendrn uno o ms agentes emulsionantes, agentes de estabilizacin, agentes dispersantes, agentes de suspensin, agentes espesantes o agentes colorantes. Las composiciones adecuadas para administracin tpica en la boca incluyen grageas que comprenden el agente activo en una base aromatizada, normalmente sacarosa y goma arbiga o tragacanto; pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte tal como gelatina y glicerina o sacarosa y goma arbiga; y lavados bucales que comprenden el ingrediente activo en un vehculo lquido adecuado. Las soluciones o suspensiones se aplican directamente a la cavidad nasal por medios convencionales, por ejemplo con un cuentagotas, pipeta o pulverizador. Las composiciones pueden proporcionarse de una sola dosis o de mltiples dosis. En el ltimo caso de un cuentagotas o pipeta, esto puede conseguirse por el paciente administrando un volumen predeterminado apropiado de la solucin o suspensin. En el caso de una pulverizacin, esto puede conseguirse, por ejemplo, por medio de una bomba de pulverizacin de atomizacin dosicadora. La administracin al tracto respiratorio tambin puede realizarse por medio de una formulacin en aerosol en la que el ingrediente activo se proporciona en un envase presurizado con un propulsor adecuado tal como clorouorocarbono (CFC), por ejemplo diclorodiuorometano, triclorouorometano o diclorotetrauoroetano, dixido de carbono u otro gas adecuado. El aerosol tambin puede contener convenientemente un tensioactivo tal como lecitina. La dosis del frmaco puede controlarse proporcionando una vlvula dosicadora. Como alternativa, los ingredientes activos pueden proporcionarse en forma de un polvo seco, por ejemplo una mezcla en polvo del compuesto en una base de polvo adecuada tal como lactosa, almidn, derivados de almidn tales como hidroxipropilmetilcelulosa y polivinilpirrolidona (PVP). Convenientemente, el vehculo de polvo formar un gel en la cavidad nasal. La composicin de polvo puede presentarse en forma de dosis unitaria, por ejemplo, en cpsulas o cartuchos de, por ejemplo, gelatina, o blster a partir de los cuales puede administrarse el polvo por medio de un inhalador. En composiciones destinadas para administracin al tracto respiratorio, incluyendo composiciones intranasales, el compuesto generalmente tendr un tamao de partcula pequeo, por ejemplo, del orden de 5 micrmetros o menos. Tal tamao de partcula puede obtenerse por medios conocidos en la tcnica, por ejemplo por micronizacin.

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Cuando se desee, pueden emplearse composiciones adaptadas para administrar la liberacin sostenida del ingrediente activo.
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Las preparaciones farmacuticas estn preferiblemente en formas de dosicacin unitaria. En tales formas, la preparacin se subdivide en dosis unitarias que contienen cantidades apropiadas del componente activo. La forma de dosicacin unitaria puede ser una preparacin envasada, conteniendo el envase cantidades especcas de la preparacin, tales como comprimidos envasados, cpsulas, y polvos en viales o ampollas. Adems, la forma de dosicacin unitaria puede ser en s misma una cpsula, comprimido, oblea, o gragea, o puede ser el nmero apropiado de cualquiera de stas en forma envasada. Son composiciones preferidas comprimidos o cpsulas para administracin oral y lquidos para administracin intravenosa e infusin continua.

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Pueden encontrase ms detallas sobre tcnicas para la formulacin y administracin en la ltima edicin de Remingtons Pharmaceutical Sciences (Maack Publishing Co., Easton, PA). Una dosis teraputicamente ecaz se reere a la cantidad de ingrediente activo que mejora los sntomas o la afeccin. La ecacia y toxicidad teraputica, por ejemplo DE50 y DL50 , pueden determinarse por procedimientos far7

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macolgicos convencionales en cultivos celulares o animales de experimentacin. La relacin de dosis entre efectos teraputicos y txicos es el ndice teraputico y puede expresarse por la relacin DL50 /DE50 . Se preeren composiciones farmacuticas que muestran grandes ndices teraputicos.
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Por supuesto, la dosis administrada debe ajustarse cuidadosamente a la edad, peso y estado del individuo a tratar, as como a la va de administracin, forma y rgimen de dosicacin, y por supuesto, el mdico debe determinar el resultado deseado y la dosicacin exacta. La dosicacin real depende de la naturaleza y gravedad de la enfermedad a tratar y de la va de administracin, y est dentro del juicio del mdico, y puede variar por la valoracin de la dosicacin con respecto a las circunstancias particulares de esta invencin para producir el efecto teraputico deseado. Sin embargo, en la actualidad se considera que composiciones farmacuticas que contienen de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 500 mg de ingrediente activo por dosis individual, preferiblemente of aproximadamente 0,1 a aproximadamente 100 mg, ms preferiblemente de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mg, son adecuadas para tratamientos teraputicos. El ingrediente activo puede administrarse en una o varias dosis al da. En ciertos casos puede obtenerse un resultado satisfactorio a una dosicacin tan baja como 0,01 g/kg i.v. y 0,1 g/kg p.o. En la actualidad se considera que el lmite superior del intervalo de dosicacin es de aproximadamente 10 mg/kg i.v. y 100 mg/kg p.o. Son intervalos preferidos de aproximadamente 0,1 g/kg a aproximadamente 10 mg/kg/da i.v., y de aproximadamente 1 g/kg a aproximadamente 100 mg/kg/da p.o. Actividad Biolgica

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Como se demuestra en los ejemplos de trabajo, los compuestos de la invencin muestran actividad neurotrca. La actividad neurotrca no se ha atribuido a una etapa especca en la interaccin entre NGF y su receptor o en la ruta de transduccin de seales de NGF. La actividad neurotrca de los compuestos de la invencin les hace tiles para el tratamiento o prevencin de diversas enfermedades degenerativas del sistema nervioso. Adems, los compuestos de la invencin se consideran particularmente tiles para el tratamiento de neuropata y, en particular, neuropata perifrica provocada por ejemplo por anomalas genticas y otras afecciones tales como diabetes, polio, herpes y SIDA, y ms especialmente neuropata y neuropata perifrica padecida por la mayora de pacientes con cncer despus o durante quimioterapia. Los compuestos de la presente invencin se consideran particularmente tiles para el tratamiento de lesiones traumticas de nervios perifricos, la mdula, y/o la mdula espinal, y en el tratamiento de isquemia cerebral, por ejemplo lesin neuronal isqumica despus de paro cardaco, apopleja, o lesin cerebral post-asxia en recin nacidos o despus de casi ahogarse. Finalmente los compuestos de la presente invencin se consideran particularmente tiles para aumentar la supervivencia de injertos neuronales.

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Mtodos de Terapia En otro aspecto, la invencin proporciona un uso de un compuesto de la invencin para la fabricacin de un medicamento para el tratamiento o alivio de enfermedades o trastornos o afecciones de cuerpos animales vivos, incluyendo seres humanos, respondiendo las enfermedades, trastornos o afecciones a la actividad de un agente neurotrco. En una realizacin preferida, la enfermedad o trastorno o afeccin responde a la activacin o potenciacin de factor(es) de crecimiento nervioso.
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En otra realizacin preferida, la invencin proporciona un mtodo para el tratamiento de una lesin traumtica de nervios perifricos, la mdula, la mdula espinal, lesin neuronal isqumica cerebral, neuropata, incluyendo neuropata perifrica. En una tercera realizacin preferida, la enfermedad es una enfermedad neurodegenerativa.

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En una realizacin ms preferida, la enfermedad neurodegenerativa es demencia, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrca, o enfermedades neurodegenerativas del ojo, incluyendo prdida de fotorreceptores en la retina en pacientes que padecen degeneracin macular, retinitis pigmentosa, glaucoma, y enfermedades similares.
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En una cuarta realizacin preferida, la invencin proporciona un mtodo para prevenir los cambios degenerativos relacionados con una enfermedad neurodegenerativa.
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En una realizacin ms preferida, la enfermedad neurodegenerativa es lesin neuronal isqumica cerebral, neuropata y especialmente neuropata perifrica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson o esclerosis lateral amiotrca.
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Las enfermedades especcas contempladas de acuerdo con la invencin incluyen enfermedades, trastornos y afecciones dependientes de aminocidos excitadores, y en particular dependientes de glutamato y/o aspartato, como psicosis, anoxia, isquemia, Parkinsonismo, convulsiones, migraas y esclerosis lateral amiotrca (ELA). En la actualidad se considera que los intervalos de dosicacin adecuados son de 0,1 a 1000 miligramos al da, 10-500 miligramos al da, y especialmente 30-100 miligramos al da, dependientes como siempre del modo exacto de administracin, de la forma en que se administra, de la indicacin hacia la que se dirige la administracin, del sujeto implicado y del peso corporal del sujeto implicado, y adems de la preferencia y experiencia del mdico o veterinario a cargo. Breve descripcin de los dibujos La presente invencin se ilustra adems con respecto a los dibujos adjuntos, en los que:

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La Fig. 1 ilustra el efecto en la longitud media de neurita SEM (longitud total de neurita/nmero total de clulas por pocillo) de clulas PC12 despus de dos das de incubacin con o sin el Compuesto G-1 y NGF; la Fig. 2 ilustra el efecto del Compuesto G-1 en el nmero de TH-ir presente en cultivos de VM de rata E14 cultivados durante 7 das en cultivo. En este experimento, se encontr un 81% ms de clulas TH-inmunorreactivas en cultivos tratados con el Compuesto G-1 1 M en comparacin con los cultivos de control no tratados (p<0,016, ensayo de Mann-Whitney), lo que indica que el compuesto tiene un efecto de supervivencia en esta poblacin neuronal en ratas; la Fig. 3 ilustra el efecto del Compuesto G-1 en el nmero de TH-ir en cultivos de corte cultivados in vitro durante 21 das. En este experimento, se encontr un 37% ms de clulas TH-inmunorreactivas en cultivos tratados con el Compuesto G-1 1 M en comparacin con cultivos de control no tratados (p<0,038, ensayo de Mann-Whitney) lo que indica que el compuesto tiene un efecto de supervivencia en esta poblacin neuronal en cerdos; la Fig. 4 (A y B) ilustra el efecto del Compuesto G-1 1-3 M en la fosforilacin inducida por NGF de las ERK y de la quinasa Akt. En estos experimentos se observa la capacidad de las concentraciones M del Compuesto G-1 para potenciar la fosforilacin inducida por NGF de quinasas (las ERK y la quinasa Akt) importante para la transduccin de seales; la Fig. 5 ilustra el efecto del Compuesto G-2 en la lesin del hipocampo despus de 4 minutos de isquemia global transitoria en un modelo de jerbo. El grado de lesin del hipocampo se clasic en uno de cuatro grupos: Grupo 1: sin lesin en la capa CA1 ; Grupo 2: la capa CA1 parcialmente lesionada; Grupo 3: la capa CA1 completamente lesionada; y Grupo 4: lesin en ms de slo la capa CA1 . La puntuacin de la isquemia total se obtuvo como la suma de las puntuaciones en los hemisferios derecho e izquierdo. Se us el ensayo tau de Kendall para la evaluacin estadstica. La mayora (= 80%) de los animales no tratados muestran lesin total en la capa CA1 del hipocampo. En contraste en muchos animales (50%) que reciben el compuesto G-2 despus de la lesin isqumica (2x30 mg/kg ip.), no se observa o slo se observa parcialmente lesin en las neuronas CA1 del hipocampo; y la Fig. 6 ilustra el efecto de una estimulacin de 20 minutos con el Compuesto G-1 3 mM en la fosforilacin de CREB en clulas PC12 no diferenciadas, solas o aadidas junto con una concentracin de NGF subptima (0,1 nM). Se aadi forscolina como control positivo, ya que se sabe que estimula la fosforilacin de CREB mediante el aumento de AMPc intracelular y la activacin de PKA. Se demostr que el Compuesto G-1 estimula la fosforilacin de CREB en comparacin con clulas no estimuladas as como clulas estimuladas con NGF 0,1 nM en puntos temporales de 5 a 20 minutos. (La reivindicacin 1 no incluye los Compuestos G1 y G3)

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Ejemplos La invencin se ilustra adicionalmente adems con respecto a los siguientes ejemplos que no pretenden de forma alguna limitar el alcance de la invencin como se reivindica.
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Ejemplo 1 Ejemplos de Preparacin

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General: Todas las reacciones que implican reactivos o intermedios sensibles al aire se realizaron en atmsfera de nitrgeno y en disolventes anhidros. Se us sulfato de magnesio como agente secante en los procedimientos de tratamiento y los disolventes se evaporaron a presin reducida.
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Mtodo A 5-Bromo-8-nitroisoquinolina
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Se aadi una solucin de nitrato potsico (120 g, 1,2 mol) en cido sulfrico conc. (500 ml) a una mezcla de 5bromoisoquinolina (219,4 g, 1,05 mol) y cido sulfrico conc. (400 ml) a menos de 10C durante 1,5 h. La reaccin se verti sobre hielo (4 l) y se neutraliz mediante la adicin de hidrxido amnico conc. (2 l) y hielo (4 l). Los cristales se ltraron y se secaron al aire. Rendimiento de 216,9 g (82%). P.f. 129-130C. Mtodo B 5-Bromo-N-metil-8-nitro-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina

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Se aadi en porciones 5-bromo-8-nitroisoquinolina (216,9 g, 0,86 mol) durante 10 min a una solucin de dimetilsulfato (750 ml). Se desarroll algo de calor. La mezcla se calent a 100C durante 10 minutos. Precipit metilsulfato de 5-bromo-2-metil-8-nitroquinolinio. La mezcla se enfri sobre hielo y se aadi ter dietlico (1 l). La mezcla bruta se ltr y los cristales se aislaron. La sal se disolvi en cido actico (1,5 l). A la mezcla enfriada con hielo se le aadi: borohidruro sdico (47 g, 1,24 mol) durante 4 horas. La temperatura se mantuvo por debajo de 30C. La mezcla bruta se evapor y se aadi hidrxido sdico (21,1 M). Los cristales se ltraron. Rendimiento 205,2 g (88%). P.f. 8587C. Mtodo C 5-(4-Clorofenil)-N-metil-8-nitro-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina

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Una mezcla de 5-bromo-N-metil-8-nitro-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina (4,07 g, 15 mmol), cido 4-clorofenilbrico (3,5 g, 22,5 mmol), carbonato sdico (8,0 g, 75,5 mmol), 1,2-dimetoxietano (60 ml), agua (30 ml) y tetraquis (trifenilfosna)paladio (0) (0,20 g, 0,17 mmol) se agit a reujo durante 3,5 h. Se aadi agua (50 ml) y la mezcla se extrajo con acetato de etilo (100 ml). La mezcla bruta se recristaliz en etanol (96%). Rendimiento 3,62 g (80%). P.f. 162-163C. 8-Acetilamino-5-(4-clorofenil)-tetrahidro-1,2,3,4-naftaleno

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Se prepar de acuerdo con el mtodo C a partir de 1-acetilamino-4-bromo-5,6,7,8-tetrahidronaftaleno. Rendimiento 62%. P.f. 217-220C. 4-(4-Clorofenil)-nitrobenceno

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Se prepar de acuerdo con el mtodo C a partir de 4-bromonitrobenceno y cido 4-clorofenilbrico. Rendimiento 86%. P.f. 141,6-145, 2C. Mtodo D Sal del cido clorhdrico de 8-Amino-5-(4-clorofenil)-N-metil-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina

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Una mezcla de 5-(4-clorofenil)-N-metil-8-nitro-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina (3,47 g, 11,5 mmol), cido sulfrico (1 ml, 12 mmol), nquel Raney (1 ml, suspensin al 50% en agua) y metanol (150 ml) se agit en una atmsfera de hidrgeno durante 1,5 h. La mezcla bruta se ltr a travs de celite y se evapor. Rendimiento 3,2 g (90%). P.f. 213215C.
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(4-Clorofenil)anilina Se prepar de acuerdo con el mtodo D a partir de 4-(4-clorofenil)-nitrobenceno. El producto se aisl en forma de un aceite. Rendimiento 72%.
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Mtodo F 5-(4-Clorofenil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-1-H-pirrolo[3.2-h]isoquinolina-2,3-diona
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Una mezcla de sal del cido clorhdrico de 8-amino-5-(4-clorofenil)-N-metil-1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina (3,1 g, 10 mmol), cloral (1,5 ml, 15 mmol), sulfato sdico (14 g, 98,6 mmol), clorhidrato de hidroxilamina (2,4 g, 15 mmol) y agua (70 ml) se calent a reujo durante 0,5 h. Se dej que la mezcla alcanzara la temperatura ambiente. Los cristales se ltraron y se lavaron con agua, seguido de recristalizacin en etanol (96%). El intermedio cristalino (2,0 g) se combin con cido metanosulfnico (20 ml) y se calent durante 15 min a 100C. La mezcla bruta se verti sobre hielo y se aadi hidrxido sdico (25 ml, 10 M). El producto cristalino se recristaliz en etanol (96%). Rendimiento 0,54 g (29%). P.f. descomp. 225C.

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5-(4-Clorofenil)-6,7,8,9-tetrahidro-1-H-pirrolo[3.2-h]naftaleno-2,3-diona Se prepar de acuerdo con el mtodo F a partir de 8-amino-5-(4-clorofenil)-N-metil-1,2,3,4-naftaleno. Rendimiento 52%. P.f. 286,9-290,1C.
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5-(4-Clorofenil)isatina Se prepar de acuerdo con el mtodo F a partir de (4-clorofenil)anilina. Rendimiento 26%. P.f. 246,3-251,5C.
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Mtodo G Sal del cido clorhdrico de 5-(4-clorofenil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-1-H-pirrolo[3.2-h]isoquinolina-2,3-diona3-oxima (Compuesto G-1; no incluido en la reivindicacin 1)

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Una mezcla de 5-(4-clorofenil)-8-metil-6,7,8,9-tetrahidro-1-H-pirrolo[3.2-h]isoquinolina-2,3-diona (0,50 g, 1,53 mmol), clorhidrato de hidroxilamina (0,5 g, 7,2 mmol) y etanol (5 ml, 96%) se agit a temperatura ambiente durante 15 minutos. El color cambi de amarillo a rojo y el producto precipit. El producto se ltr y se aislaron 0,44 g (76%). P.f. descomp. 300-305C. Sal del cido clorhdrico de 5-(4-clorofenil)-6,7,8,9-tetrahidro-1-H-pirrolo[3.2-h]naftaleno-2,3-diona-3-oxima (Compuesto G-2) Se prepar de acuerdo con el mtodo G a partir de 5-(4-clorofenil)-6,7,8,9-tetrahidro-1-H-pirrolo[3.2-h]naftaleno2,3-diona. Rendimiento 79%, P.f. descomp. 250C.

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Ejemplo 2 Supervivencia de Clulas PC12 Diferenciadas en Medio sin Suero

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En este experimento se evalu el efecto protector de los compuestos sobre la supervivencia de la lnea celular de feocromocitoma PC12 desprovista de otros factores de supervivencia despus de la diferenciacin de las clulas hasta un fenotipo de tipo neurona. Mtodo

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Se sembraron clulas en placas de 96 pocillos recubiertas con colgeno a una densidad celular de 8.000/cm2 en DMEM con suero de ternero fetal (FCS) al 7,5%, suero de caballo donador (DHS) al 7,5% y NGF 2 nM y se cultivaron durante 6 das. Despus, el medio se cambi a DMEM sin suero suplementado con el compuesto en las concentraciones indicadas. Como control positivo, se incluyeron pocillos paralelos que recibieron DMEM sin suero sin la adicin de vehculo o de NGF 3 nM. Despus de 4 das de incubacin, se evalu la viabilidad celular usando MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfonil)2H-tetrazolio) que se reduce por clulas metablicamente activas. Los datos se expresan como % de la respuesta observada con NGF 3 nM corregida para la actividad de reduccin de MTS residual en cultivos sin suero paralelos (% del control de NGF). Los resultados de este experimento se presentan en la siguiente Tabla 1. TABLA 1

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Efectos de Supervivencia en Clulas PC12 Diferenciadas en Medio Sin Suero (% de NGF 3 nM) Concentracin (M) Compuesto G-1 11,09 1,42 12,78 2,01 28,62 1,77 32,05 3,36 52,60 3,40 60,47 2,26 74,85 4,67 62,08 3,70 63,80 4,09 Compuesto G-2 7,77 1,86 16,58 4,36 17,30 4,43 23,54 1,60 27,63 6,91 33,31 5,22 50,25 4,28 54,83 4,37 74,66 5,70 Compuesto G-3 -0,34 1,59 23,83 3,61 28,20 12,55 30,66 3,83 36,11 3,02 41,53 3,00 49,63 4,67 67,60 5,54 72,23 4,34

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0,1 0,2 0,5 0,75 1 2 5 7,5 10

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La Tabla 1 muestra el efecto de los compuestos Compuesto G-1 (no incluido por la reivindicacin 1), Compuesto G-2 y compuesto G-3 (no incluido por la reivindicacin 1) sobre la supervivencia de clulas PC12 en medio sin suero midiendo la viabilidad como la reduccin de MTS. Estos tres compuestos muestran un rescate dependiente de la dosis de clulas PC12 en medio sin suero. Se observan efectos de supervivencia mximos de los compuestos, que es el 7035% del efecto de NGF 3 nM, a concentraciones entre 5-10 M de los compuestos. Ejemplo 3 Estimulacin de la Extensin de Neuritas en Clulas PC12
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En este experimento se evalu la capacidad de los compuestos para potenciar la extensin de neuritas inducida por NGF en clulas PC12. Mtodo
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Se sembraron clulas PC12 en placas de cultivo tisular recubiertas con colgeno a una densidad celular de 15.000/ cm2 en DMEM con FCS al 7,5%, y DHS al 7,5%. Al da siguiente, se cambi el medio a medio suplementado con el compuesto NS en ausencia o presencia de NGF.
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Dos das despus del cambio del medio, las clulas se jaron en paraformaldehdo al 4% y se tieron los neurolamentos. Las clulas se jaron en placas de cultivo tisular mediante incubacin en paraformaldehdo al 4% en PBS seguido de la permeabilizacin en Triton-X100 al 0,05% en presencia de DHS al 10% para bloquear los sitios de unin no especca. Despus del lavado, las placas se incubaron con anticuerpo anti-neurolamento (NF) (clon RT97) de Boehringer diluido 1:200 en Triton-X100 al 0,05%/DHS al 10% seguido de la incubacin con inmunoglobulina anti-ratn biotinilada RPN1001 (Amersham) diluida 1:200. Las clulas inmunorreactivas a NF se tieron usando el complejo ABC/kit de HRP K0355 (DAKO) y tetraclorhidrato de 3,3-diaminobencidina (DAB) como sustrato. La estimacin del nmero total de clulas por pocillo, as como la longitud total de las neuritas se realiz usando estereologa 2D de forma no sesgada (sistema CAST-Grid conectado a un microscopio Olympus BH-2).

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Los resultados de este experimento se presentan en la Fig. 1. Por esta gura parece ser que el compuesto G-1 solo (1 y 3 m) muestra algn efecto sobre la extensin de neuritas en clulas PC12 y potencia signicativamente la extensin de neuritas inducida por NGF.
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Ejemplo 4 Supervivencia de Neuronas Dopaminrgicas de Rata Embrionaria

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En este experimento se evala el efecto del compuesto G-1 sobre la supervivencia de neuronas dopaminrgicas en cultivos disociados establecidos a partir de mesencfalos ventrales (VM) de rata E14. Mtodo

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Se aislaron cerebros de rata embrionaria (Wistar; E14) en condiciones estriles y se pusieron en solucin de sal equilibrada de Gey fra (GIBCO) con glucosa (6,5 mg/ml). Los mesencfalos ventrales se diseccionaron, se cortaron en pequeos trozos de tejido, se colocaron en medio neurobasal con suplemento B27 y se presionaron suavemente a travs de un ltro Nitex de 80 m. Las clulas se contabilizaron usando un hemocitmetro y se cultivaron en una multiplaca de 6 pocillos a una densidad de aproximadamente 2,0 x 106 clulas/pocillo. Las placas de cultivo se prerecubrieron con poli-D-lisina. Despus de 1 hora, el medio se retir y se aadi medio reciente (1,5 ml/pocillo). Se trat un grupo de cultivos de forma crnica con el compuesto G-1 a una concentracin de 1 M. Los cultivos no tratados sirvieron de controles. El medio se cambi cada dos das y no se usaron antimitticos ni antibiticos en ninguna etapa.

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Despus de 7 das en cultivo, los cultivos se inmunotieron con respecto a tirosina hidroxilasa (TH). En resumen, las clulas se lavaron en solucin salina tamponada con tris 0,05 M (TBS, pH 7,4) que contena Triton X-100 al 1% durante 3x15 minutos y se incubaron con suero bovino fetal al 10% (FBS, Life Technologies) en TBS durante 30 minutos. Despus, las clulas se incubaron durante 24 horas a 4C con anticuerpo monoclonal de ratn anti-TH (Boehringer Mannheim) diluido 1:600 en TBS con FBS al 10%. Despus de aclarar en TBS con Triton X-100 al 1% durante 3x15 minutos, las clulas se incubaron durante 60 minutos con anticuerpo anti-IgG de ratn biotinilado (Amersham) diluido 1:200 en TBS con FBS al 10%. Despus, las clulas se lavaron en TBS con Triton X-100 al 1% (3x15 minutos) y se incubaron durante 60 minutos con estreptavidina-peroxidasa (Dako) diluida 1:200 en TBS con FBS al 10%. Despus de lavar en TBS (3x15 minutos), el anticuerpo unido se visualiz mediante tratamiento con 3,3diaminobencidina al 0,05% (Sigma) en TBS que contena H2 O2 al 0,01%. Las clulas TH-inmunorreactivas (ir) se contabilizaron manualmente.

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Los resultados de estos experimentos se presentan en la Fig. 2. Por esta gura parece ser que se encontr un 81% ms de clulas TH-inmunorreactivas en cultivos tratados con el compuesto G-1 1 M en comparacin con cultivos de control no tratados (p<0,016, ensayo de Mann-Whitney) lo que indica que el compuesto tiene un efecto sobre la supervivencia en esta poblacin neuronal en ratas.
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Ejemplo 5 Supervivencia de Neuronas Dopaminrgicas de Mesencfalos Ventrales de cerdo E28

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En este experimento, se evalu el efecto del compuesto G-1 sobre la supervivencia de neuronas dopaminrgicas en cultivos de cortes organotpicos establecidos a partir de mesencfalos ventrales de cerdo E28. Mtodo

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Se aislaron mesencfalos ventrales (VM) de embriones de cerdo (E28) en condiciones estriles, se cortaron en cortes de 400 m y se pusieron en solucin salina equilibrada de Gey fra (GIBCO) con glucosa (6,5 mg/ml). Estos cortes de tejido se cultivaron mediante el mtodo de cultivo de interfaz, desarrollado originariamente por Stoppini et al. [L. Stoppini, P.A. Buchs, D. Muller. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue; J. Neurosci. Methods 1991 37 173-182]. En resumen, los cortes se pusieron en membranas semiporosas (Millipore, 0,3 m; 4 cortes/membrana) colocadas como insertos en placas de 6 pocillos (Costar) con medio que contiene suero (Gibco GRL). Cada pocillo contena 1 ml de medio (Optimem al 50%, suero de caballo al 25%, solucin salina equilibrada de Hank al 25% (todos de GIBCO)) suplementado con D-glucosa a una concentracin nal de 25 mM. El da 3, el medio se reemplaz por medio denido sin suero (medio neurobasal con suplemento B27 de Life Technologies). Los cultivos se cultivaron en un incubador con CO2 al 5% a 36C durante 21 das, despus de lo cual las secciones se inmunotieron con respecto a TH como se ha descrito en el Ejemplo 4. Se trat un grupo de cultivos de cortes de forma crnica con el compuesto G-1 a una concentracin de 1 M. Los cultivos no tratados sirvieron de controles. El medio se cambi dos veces a la semana y no se usaron antimitticos ni antibiticos en ninguna etapa. La cuanticacin de las neuronas TH-ir se realiz en cortes codicados (para permitir el anlisis mediante experimentos con diseo ciego con respecto a la identidad de la muestra) usando el sistema Olympus C.A.S.T Grid (versin 1.10; Olympus, Albertslund, Dinamarca) constituido por un microscopio Olympus BX50 y una fase de motor de etapa x-y-z realizada mediante un ordenador. Se traz el rea del corte de cultivo y se coloc de forma aleatoria un marco de recuento para marcar la primera rea a muestrear. Despus, el marco se desplaz sistemticamente a travs de las secciones y se contabilizaron las clulas TH-ir. Los resultados de este experimento se presentan en la Fig. 3. Por esta gura parece ser que se encontr el 37% ms de clulas TH-inmunorreactivas en cultivos tratados con el compuesto G-1 1 M en comparacin con los cultivos de control no tratados (p<0,038; ensayo de Mann-Whitney), lo que indica que el compuesto tiene un efecto de supervivencia en esta poblacin neuronal en cerdos. Ejemplo 6

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Transduccin de Seales de NGF en Clulas PC12 En este experimento se evalu el efecto del compuesto G-1 sobre la fosforilacin inducida por NGF de ERK y la quinasa Akt.
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Mtodo Se cultivaron aproximadamente 200.000 clulas PC12 en una placa de 24 pocillos en DMEM con FCS al 7,5% y DHS al 7,5% y se incubaron. Al siguiente da, se aadieron NGF y el Compuesto G-1 a las clulas y se incubaron durante 24 horas, despus de lo cual las clulas se recogieron en un tampn de muestra 2xLaemmli. El lisado celular total se someti a electroforesis en geles de SDS en gradiente del 8-18% que se sometieron a electrotransferencia en membranas de PVDF. Se inmunodetectaron ERK1 y ERK2 fosforiladas usando mAb de ratn anti-fosfo-p44/p42 MAP quinasa E10 (New England Biolabs N 9106) y anticuerpo anti-ratn unido a HRP. La quinasa Akt fosforilada se inmunodetect usando anticuerpo contra Akt (Ser473) fosfoespecco de conejo (New England Biolabs N 9271) y anticuerpo anti-conejo unido a HRP. Las bandas se detectaron mediante quimioluminiscencia usando el sistema ECL (Amersham). Los resultados de este experimento se presentan en las Figs. 4A y 4B. En estas guras, se observa la capacidad de las concentraciones M del compuesto G-1 para potenciar la fosforilacin de quinasas inducida por NGF (las ERK y la quinasa Akt) importantes para la transduccin de seales.

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Ejemplo 7 Isquemia Global Transitoria en Jerbos
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En este experimento, se evalu el efecto neuroprotector del compuesto G-2 en un modelo animal de isquemia global transitoria. Mtodo

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Se anestesiaron jerbos con halotano, se localizaron y se cerraron durante 4 minutos las arterias cartidas derecha e izquierda. Los animales se mantuvieron a la temperatura corporal normal antes y despus de la operacin usando lmparas trmicas. Durante la operacin, los jerbos se pusieron en almohadas trmicas, se control la temperatura corporal y se mantuvo a 37 0,5C. Los animales recibieron 30 mg/kg de compuesto G-2 administrado por va intraperitoneal 15 minutos despus de la lesin isqumica y al da siguiente. Cuatro das despus, los animales se sacricaron, se retiraron los cerebros y se enfriaron a -70C. Despus, los cerebros se seccionaron en secciones de 20 m de espesor de las cuales se seleccionaron 5-7 con tejido de hipocampo y se tieron con hematoxilina-eosina.

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Los resultados de este experimento se presentan en la Fig. 5. El grado de lesin de lesin del hipocampo se clasic en uno de cuatro grupos: Grupo 1: sin lesin en la capa CA1 ;

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Grupo 2: la capa CA1 parcialmente lesionada; Grupo 3: la capa CA1 completamente lesionada; y
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Grupo 4: lesin en ms de slo la capa CA1 . La puntuacin total de isquemia se obtuvo como la suma de las puntuaciones en los hemisferios derecho e izquierdo. Para la evaluacin estadstica se us el ensayo tau de Kendall.

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En esta gura parece ser que la mayora ( 80%) de los animales no tratados muestran una lesin total en la capa CA1 del hipocampo. En contraste, En muchos animales ( 50%) que recibieron el compuesto G-2 despus de la lesin isqumica (2x30 mg/kg ip.), no se observ o slo se observ parcialmente lesin en las neuronas CA1 del hipocampo. Ejemplo 8

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Estimulacin de la Fosforilacin de CREB en Clulas PC12 no Diferenciadas La protena de unin al elemento de respuesta a AMP cclico (CREB) es un factor de transcripcin activado posttraduccionalmente que se ha implicado en numerosas funciones neuronales incluyendo la supervivencia, diferenciacin y neurotransmisin celular. En este experimento, se evalu el efecto del compuesto G-1 sobre la fosforilacin de CREB. Mtodo
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Se cultivaron aproximadamente 7,5 x 105 clulas PC12 por pocillo en placas de 6 pocillos recubiertas con colgeno en DMEM con FCS al 0,75% y DHS al 0,75% y se incubaron durante 48 horas. Despus, las clulas se privaron durante 2 horas en DMEM sin suero antes de la estimulacin con los compuestos indicados durante 5, 10 20 minutos. Las clulas se recogieron en 1 x tampn de muestra calentado (SDS al 2%, Tris 400 mM, pH 8,0, DTT 10 mM y Na3 VO4 0,25 mM) y los lisados celulares se sometieron a electroforesis en geles de SDS en gradiente del 8-18%, que se sometieron a electrotransferencia en membranas de PVDF. La CREB fosforilada se inmunodetect usando anticuerpo anti-fosfo-CREB de conejo (UpState Biotechnology N 06-519) seguido de anticuerpo anti-conejo unido a HRP (Amersham Life Science N NA 634). Las bandas se detectaron mediante quimioluminiscencia usando el sistema ECL (Amersham).

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Los resultados de este experimento se presentan en la Fig. 6. En esta gura, parece ser que el compuesto G-1 estimula la fosforilacin de CREB en comparacin con clulas no estimuladas as como clulas estimuladas con NGF 0,1 nM en puntos temporales de 5 a 20 minutos.
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Se observ un efecto aditivo de NGF y del compuesto G-1 despus de 5 minutos de estimulacin (no mostrado).

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REIVINDICACIONES 1. Un derivado de isatina representado por la frmula general (IV):
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o una sal farmacuticamente aceptable del mismo,

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en la que R1 representa hidrgeno o un grupo alquilo (C118 );

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R2 representa hidrgeno, un grupo alquil (C118 )-, un grupo carboxi (-COOH), un grupo alquilcarbonilo (C118 ) o un grupo isoxazolilo, pudiendo estar el grupo isoxazolilo opcionalmente sustituido con uno o ms sustituyentes seleccionados entre el grupo constituido por alquil (C118 )- o alcoxi (C118 )-; y R5 representa un grupo fenilo sustituido en la posicin 4 con halgeno, CF3 , NO2 , amino, alquil (C118 )- o alcoxi (C118 )-. 2. El derivado de isatina de la reivindicacin 1, en el que R1 representa hidrgeno. 3. El derivado de isatina de las reivindicaciones 1 2, en el que R2 representa hidrgeno.

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4. El derivado de isatina de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que R5 representa 4-clorofenilo. 5. El derivado de isatina de frmula (IV) de la reivindicacin 1, que es 5-(4-clorofenil)-6,7,8,9-tetrahidro-1-Hpirrolo[3.2-h]naftaleno-2,3-diona-3-oxima;

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o una sal farmacuticamente aceptable del mismo. 6. Una composicin farmacutica que comprende una cantidad teraputicamente ecaz de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o una sal farmacuticamente aceptable del mismo, junto con al menos un vehculo o diluyente farmacuticamente aceptable. 7. El uso de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o una sal farmacuticamente aceptable del mismo, para la fabricacin de un medicamento para el tratamiento o alivio de una enfermedad o un trastorno o una afeccin de un mamfero, incluyendo un ser humano, siendo la enfermedad o trastorno o afeccin una lesin traumtica de nervios perifricos, la mdula, la mdula espinal, lesin neuronal isqumica cerebral o neuropata, incluyendo neuropata perifrica. 8. El uso de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o una sal farmacuticamente aceptable del mismo, para la fabricacin de un medicamento para el tratamiento o alivio de una enfermedad o un trastorno o una afeccin de un mamfero, incluyendo un ser humano, siendo la enfermedad una enfermedad neurodegenerativa. 9. El uso de acuerdo con la reivindicacin 8, en el que la enfermedad neurodegenerativa es demencia, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrca, o enfermedades neurodegenerativas del ojo, incluyendo prdida de fotorreceptores en la retina en pacientes que padecen degeneracin macular, retinitis pigmentosa, glaucoma, y enfermedades similares. 10. El uso de un compuesto de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, o una sal farmacuticamente aceptable del mismo, para la fabricacin de un medicamento para prevenir los cambios degenerativos relacionados con una enfermedad neurodegenerativa de un mamfero, incluyendo un ser humano.

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11. El uso de acuerdo con la reivindicacin 10, en el que la enfermedad neurodegenerativa es lesin neuronal isqumica cerebral, neuropata y especialmente neuropata perifrica, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Huntington, enfermedad de Parkinson o esclerosis lateral amiotrca.
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