VALIDACIN DEL PROCESO DE LIFILIZACIN DE LA PROTENA DE 24 kD DEL VIH-1

Anitza Fragas Quintero, Dayam Martn Alfonso, Eva Ortiz Losada, Maria Teresa Prez, Eladio Silva Cabrera Laboratorio de Investigaciones del SIDA (LISIDA)

"

zResumen La protena de 24 kD (P24) de VIH-1 en forma liofilizada es un componente crtico del estuche DAVIH-AgP24. El objetivo de nuestro trabajo fue validar el proceso de liofilizacin, de este componente. Se realizaron tres ciclos del proceso de liofilizacin y en cada uno se tomaron 30 muestras de diferentes puntos de la liofilizadora. Se evaluaron los siguientes parmetros: las caractersticas organolpticas, antes y despus de reconstituida la pastilla, por inspeccin visual; la concentracin de la protena en el ELISA DAVIH AgP24; el por ciento de humedad residual del liofilizado, mediante el mtodo de Karl Fisher, y la hermeticidad, mediante una prueba de sellado para frascos liofilizados cerrados al vaco. El examen de apariencia y reconstitucin del liofilizado se correspondi con las especificaciones de calidad del producto. El coeficiente de variacin en el ELISA, no excedi el 3 % para la concentracin 514 pg/mL de protena 24, y el 10 % para la concentracin 16 pg/mL. La humedad residual fue inferior al 5 % en todas las muestras estudiadas, y el coeficiente de variacin de este parmetro fue menor del 15 % en los tres ciclos. Se comprob la hermeticidad en el 100 % de los bulbos liofilizados. Los resultados obtenidos demostraron la integridad de la protena 24 del VIH-1 en la formulacin liofilizada y la validez de este proceso. Palabras clave: liofilizacin, mtodo de Karl Fisher, protena 24 del VIH-1, validacin de procesos. zAbstract To validate the lyophilization process of HIV-1 protein of 24 kD (P24) used as positive control in the DAVIH-AgP24 kit. Three cycles of the lyophilization process were made and 30 samples were taken from different shelves of the lyophilizer. The following parameters were evaluated: organoleptical characteristics before and after of reconstitute the cake, by visual inspection; protein concentration by DAVIH-AgP24 ELISA method; residual humidity percent of the lyophilized by Karl Fisher titration; hermeticity by the sealed test to the lyophilized flasks closed by vacuum. The shaped test and reconstitution of the lyophilized product were corresponded to the specifications of quality. The variation coefficient was less than 3 % to the 514 pg/mL concentration in ELISA and 10 % to the concentration of 16 pg/mL. Residual humidity was less than 5 % in the whole studied samples and the variation coefficient was less than 15 % in the three cycles. Hermeticity was determinated in the 100 % of the lyophilized bulbs. The obtained results showed the integrity of the HIV-1 P24 protein in lyophilized formulation and the validity of process of lyophilization. Key words: lyophilization, Karl Fisher titration, HIV-1 protein of 24 KD, validation of process. z

Introduccin

El proceso de validacin se ha convertido en un elemento fundamental para el aseguramiento de la

calidad en las producciones farmacuticas /1, 2/, con el cual se persigue demostrar que un proceso de este tipo es consistente, reproducible y que se encuentra bajo control /3/.

Vol. XX, N 3, 2008

65

En sus inicios, la actividad de validacin se enfoc solo en el rango de las operaciones de esterilizacin. Ms tarde, la FDA insisti en la necesidad de validar los procesos y sistemas considerados como crticos /4/. Uno de los procesos considerados como tal dentro de la produccin de los diagnosticadores es la liofilizacin /5/. Este proceso est constituido por dos etapas, la congelacin y el secado (primario y secundario) /6/. La optimizacin de los procesos de liofilizacin requiere de informacin previa sobre los efectos de estas etapas en la descomposicin del producto y la velocidad del secado del producto liofilizado /7, 8/. Una vez que las condiciones ptimas son especificadas, los estudios de validacin aseguran que el proceso sea reproducible, y que se obtenga un producto de alta calidad /9, 10/. La protena de 24 kD (P24) del VIH-1 es un componente crtico del diagnosticador DAVIH-AgP24, sistema ELISA tipo sandwich utilizado en el seguimiento de pacientes seropositivos al VIH-1, y para el monitoreo del tratamiento de pacientes que reciben terapia con drogas antirretrovirales /11/. Esta protena, obtenida a partir de un lisado viral de VIH-1 cepa BRU, se purifica por cromatografa de inmunoafinidad, utilizando anticuerpos monoclonales anti-P24 inmovilizados sobre sefarosa 4B activada en bromuro de ciangeno /2/. En el estuche DAVIH-AgP24, dicha protena se emplea como control positivo del sistema, se presenta en forma liofilizada y despus de reconstituida, se encuentra en una concentracin de 514 pg/mL. El proceso de liofilizacin de la protena de 24 kD del VIH-1 se caracteriza porque la congelacin se realiza fuera del equipo de liofilizacin, de forma manual con nitrgeno lquido, y que los procesos de secado (primario y secundario) ocurren de manera continua, a temperatura y presin constantes. El equipo de liofilizacin tiene una capacidad de 180 bulbos y el ciclo de liofilizacin de este producto tiene un perodo de duracin aproximadamente de 20 h. El objetivo de este trabajo fue validar el proceso de liofilizacin de la protena de 24 kD del VIH-1. z Materiales

36 g/mL (solucin madre) y se mantuvo a -20 C hasta el momento de su uso. Para preparar la solucin para liofilizar en cada corrida, se descongel la solucin madre (4 C) y se tomaron dos alcuotas de 0,5 L que se adicionaron cada una por separado en 8 mL de suero humano negativo (PNO 02 008, CICDC). Estas dos preparaciones se homogenizaron para llegar a un volumen final de 16 mL, y se dispensaron a razn de 0,5 mL por unidad, en 30 bulbos de cristal neutro clase hidroltica II con capacidad para 10 mL, utilizando pipeta automtica de 1 000 L.

Suero Humano Negativo (SHN)

El suero humano negativo a anticuerpos contra VIH-1 y 2, a antgeno de superficie del virus de la hepatitis B, al virus de la hepatitis C y no reactivo a VDRL, se filtr por 0,8, 0,45 y 0,2 m (filtros Nalgene), se aadi tiomersal al 0,01 % como preservante al producto filtrado, y se dispens en 30 bulbos de cristal neutro clase hidroltica II con capacidad para 10 mL, a razn de 0,5 mL, utilizando pipeta automtica de 1 000 L.

Solucin salina fisiolgica

Se prepar una solucin de cloruro de sodio (NaCl) al 0,9 %, la cual se dispens en 30 bulbos de cristal neutro clase hidroltica II con capacidad para 10 mL, a razn de 0,5 mL utilizando pipeta automtica de 1000 L.

Agua desionizada
Se dispensaron, con agua desionizada, 60 bulbos de cristal neutro clase hidroltica II con capacidad para 10 mL, a razn de 0,5 mL, utilizando pipeta automtica de 1 000 L.

Liofilizacin
Se utiliz una liofilizadora (Edwards, Freeze Dyer, Inglaterra), modelo EF-4, con una capacidad de evacuacin de 2 kg de hielo. Con el uso del termmetro y el registrador de presin interno (PIRANI 10), se realizaron lecturas de ambos parmetros a las 6, 10, 16 y 20 h a partir del momento de comenzar cada ciclo de liofilizacin. La liofilizadora fue encendida cuatro horas antes de iniciar el proceso en la cmara del equipo.

y mtodos

Muestras Protena de 24 kD del VIH 1

La P24 se prepar inicialmente en un volumen de 100 L en suero humano negativo (SHN) a razn de

66 Vol. XX, N 3, 2008

El proceso de liofilizacin se realiz en tres ciclos (corridas) cargando la cmara completamente, con una capacidad mxima de 180 bulbos, en los cuales se dispusieron las muestras para liofilizar en las cinco platinas, siguiendo el diseo que se muestra en la figura 1. Tras la dispensacin de las muestras en los bulbos, se procedi a su congelacin con nitrgeno lquido, de forma manual. A los bulbos se les colocaron los tapones de goma atxica,

dimetro 20 mm, en el primer nivel de cierre para facilitar el proceso de secado. Al completarse el ciclo de liofilizacin (20 h), los bulbos con P24, SHN y NaCl se sellaron al vaco dentro de la cmara de la liofilizadora, se retaparon con retapas de sello de aluminio y plstico semiperforado de dimetro 20 mm, con un cdigo de color para cada muestra, segn indica la figura 1, y se mantuvieron entre 2 y 8 oC hasta el momento de su uso.

Fig 1 Disposicin de los bulbos por cada platina de la liofilizadora.

Evaluacin del proceso de liofilizacin Apariencia y reconstitucin

La apariencia de la pastilla y el tiempo de reconstitucin fueron observados despus de cada uno de los tres ciclos de liofilizacin para los bulbos que contenan P24. Este producto liofilizado se reconstituy en 2 mL de sobrenadante de CEM (control negativo del sistema DAVIH-AgP24), a temperatura ambiente y con una ligera agitacin manual del bulbo. Los bulbos reconstituidos fueron

utilizados de forma inmediata en el ensayo para la determinacin de la concentracin de la protena P24.

Determinacin de la concentracin de la protena 24

El ensayo para determinar la concentracin de la P24 se realiz en el sistema DAVIH-AgP24. Se prepararon diluciones seriadas de base 2 de la protena (control positivo) reconstituida en sobrenadante de CEM (control negativo), utilizando las diluciones correspondientes a las concentraciones

Vol. XX, N 3, 2008

67

514 y 16 pg/mL de P24. En cada ensayo se incluyeron dos rplicas de cada concentracin de P24 (514 y 16 pg/mL) y cuatro rplicas del control negativo para ambas concentraciones de P24 probadas. El ensayo se realiz segn las instrucciones del fabricante. La validez del ensayo se demostr cuando la densidad ptica (D.O) del control positivo fue mayor o igual a 1.00, la D.O de los controles negativos (al menos en dos rplicas) fue menor o igual a 0,150 y el lmite de deteccin alcanzado fue menor o igual a 16 pg/mL.

desviacin estndar (DE) y el coeficiente de variacin (CV) correspondientes a las cinco platinas dispuestas por cada ciclo de liofilizacin. El anlisis estadstico en ambos ensayos se realiz utilizando un procedimiento ANOVA con la prueba F de Fisher para la significacin de las medias y varianzas, y la prueba de comparacin de rangos mltiples de DUNCAN, para el anlisis del comportamiento de las medias por posicin y ciclos para = 0,01; utilizando el paquete estadstico del sistema SAS (Microsoft Windows 2005). El porcentaje de hermeticidad se determin mediante la relacin que se muestra a continuacin /15/.

Humedad residual
El porcentaje de humedad residual se determin por el mtodo de Karl Fisher /9, 13/, y para ello fueron seleccionados los bulbos con SHN liofilizado provenientes de los tres ciclos de liofilizacin, siguiendo la disposicin en las platinas propuesta en la figura 1. El nivel de aceptacin para el ensayo fue que el porcentaje de humedad residual no excediera el 5 % /14/.

Resultados y discucin

Hermeticidad de los bulbos

Los bulbos con solucin salina liofilizada (sin retapas) se sumergieron en un bao de agua con 5 C por encima de la temperatura del local. A continuacin se introdujo por el tapn de goma, 1 mL de aire con ayuda de una jeringuilla con aguja de numeracin 23. Esta jeringuilla se retir sin la aguja y se procedi a la observacin de la entrada de agua o burbujas de aire al interior del bulbo como criterio de la hermeticidad. Se realiz una comprobacin de la hermeticidad utilizando 5 bulbos de solucin salina por lote, a los seis meses de haberse realizado las tres corridas de liofilizacin /10/.

Entre los parmetros que fueron medibles en el proceso de liofilizacin se encontraron la temperatura y la presin. La temperatura de la cmara de liofilizacin despus de incorporados los bulbos congelados para comenzar el proceso de secado fue de -75 C, y la presin de 5,8 mbar. Estos parmetros se mantuvieron invariables a las 6, 10, 16 y 20 h en cada uno de los tres ciclos que se realizaron, lo que permiti mantener un margen de seguridad adecuado en el proceso para cada ciclo de liofilizacin

Apariencia y reconstitucin
Para estimar la calidad del producto final, se analiz la apariencia fsica de la pastilla y el tiempo de reconstitucin. Se observ que el producto liofilizado obtenido en los tres ciclos, tras el proceso de liofilizacin para la P24, fue una masa seca y porosa, de estructura homognea, en forma de pastilla de color blanco o ligeramente amarilla, que al reconstituirse totalmente en un tiempo de cuatro segundos se convirti en una solucin transparente de color naranja. En los tres ciclos de liofilizacin el producto obtenido cumpli con las especificaciones de calidad establecidas para el mismo. En el proceso de liofilizacin, la etapa de congelacin fue muy rpida, gracias al uso del nitrgeno lquido, lo

Procesamiento de los datos

En el ensayo para determinar la concentracin de la P24, se calcularon la media (X), la desviacin estndar (DE) y el coeficiente de variacin (CV), correspondientes a las cinco platinas dispuestas en los tres ciclos de liofilizacin, utilizando los valores de DO del control positivo, en las concentraciones de P24 de 514 y 16 pg/mL Para el ensayo de determinacin del porcentaje de humedad residual, se calcularon la media (X), la

68 Vol. XX, N 3, 2008

cual segn Pujol y col. /16/, propici la formacin de cristales ms pequeos y de una estructura ms homognea que favorece las caractersticas fsicas de la pastilla y una apariencia organolptica apropiada.

Concentracin de la protena 24
En la tabla 1 se muestran los valores de las medias (intraplatinas) en las dos concentraciones probadas

en el ELISA. Las diferencias desde el punto de vista estadstico observadas con el test de Duncan no fueron consideradas como significativas, ya que en los tres ciclos de liofilizacin que se estudiaron se cumplieron las especificaciones de calidad establecidas para el ELISA DAVIH-AgP24, y se aceptaron todos los ensayos como vlidos.

TABLA 1. VALORES DE MEDIAS DE DO (INTRAPLATINAS), DESVIACIN ESTNDAR Y COEFICIENTE DE VARIACIN PARA CADA CICLO DE LIOFILIZACIN EN DOS PUNTOS DE CONCENTRACIN DE P24 (514 Y 16 PG/ML)

Leyenda: P1-P5 Platinas 1 a la 5, *Test ANOVA: F514 pg/mL (F (I) =1,00, F(II)=1,83; F(III)=7,48) F16 pg/mL (F (I) =3,74, F(II)=8,9; F(III)=1,62) Test de DUNCAN: Letras diferentes difieren significativamente. En la tabla 2 se muestran los valores de las medias de densidad ptica interplatinas en las dos concentraciones de P24 probadas en el ELISA y, se observ en cada ciclo que el coeficiente de variacin no super el 20 %. Ochoa y col., /17/ plantearon en relacin con la repetibilidad interensayo, que los valores del coeficiente de variacin para el caso de ELISA cuantitativos no deben superar el 20 %, siendo ptimos los inferiores al 10 %. Esto coincide con los resultados obtenidos en el estudio, donde se observ que los valores del CV fueron menores del 20 %, y no exceden del 10 % para estas dos concentraciones de P24. Con el anlisis estadstico se determin que los tres ciclos de liofilizacin fueron homogneos, y que no existieron diferencias entre las platinas.

Vol. XX, N 3, 2008

69

TABLA 2. VALORES DE MEDIAS DE DO (INTERPLATINAS), DESVIACIN ESTNDAR Y COEFICIENTE DE VARIACIN PARA CADA CICLO DE LIOFILIZACIN, EN DOS PUNTOS DE CONCENTRACIN DE P24 (514 Y 16 PG/ML)

Leyenda: X: media

DE: desviacin estndar

CV: coeficiente de variacin

Al comparar las medias de D.O. de la protena sin liofilizar (protena control) y de la protena liofilizada (tabla 3) se obtuvo en los tres ciclos, un coeficiente de variacin menor del 3 % para la concentracin 514 pg/ mL y menor del 12% para 16 pg/mL. Esto demostr que las condiciones propuestas para el proceso de liofilizacin no afectaron la integridad de la P24, pues

no hay prdida de la protena en ninguna de las variantes estudiadas. Algunos autores como Hernndez y col., /18/ y Pujol y col., /16/ tambin han comprobado que los ciclos de liofilizacin de aproximadamente veinte horas no afectaron la actividad biolgica de sus productos liofilizados.

TABLA 3. VALORES DE MEDIAS DE DO DE P24 LIOFILIZADA (X INTERPLATINAS Y LA PROTENA SIN LIOFILIZAR), DESVIACIN ESTNDAR Y COEFICIENTE DE VARIACIN EN DOS PUNTOS DE CONCENTRACIN DE P24 (514 Y 16 PG/ML)

Leyenda: X: media

DE: desviacin estndar

CV: coeficiente de variacin

Humedad residual
El mtodo de Karl Fisher empleado se basa en una titulacin con ayuda de un coulmetro, que es sensible a bajos contenidos de humedad, y permite un anlisis rpido de la muestra /14/. En los tres ciclos de liofilizacin se obtuvo un porcentaje de humedad

residual menor del 5 % para todas las posiciones por platinas probadas, y se obtuvo un CV interplatinas del 12,29 %; 10,10 % y 8,75 %, respectivamente (tabla 4). Para los tres ciclos analizados, el CV fue menor del 20 %, lo que cumple con lo planteado por Ochoa y col. para este tipo de estudio, donde se analiza la repetibilidad de un ensayo /17, 19/.

70 Vol. XX, N 3, 2008

TABLA 4. VALORES DE MEDIAS, DESVIACIN ESTNDAR Y COEFICIENTE DE VARIACIN POR PLATINAS DEL PORCENTAJE DE HUMEDAD RESIDUAL EN CADA CICLO DE LIOFILIZACIN

Leyenda: X: media, DE: desviacin estndar; CV: coeficiente de variacin *Test ANOVA: F(I)=11,85, F(II)=1,57; F(III)=0,350. Test de DUNCAN: Letras diferentes difieren significativamente.

De forma puntual, se observ un CV mayor del 30 % en la platina dos (ciclo II) por aumento de la dispersin en los datos; sin embargo, en las seis posiciones de esta platina se cumpli que el porcentaje de humedad residual fue menor del 5 % /15/. El anlisis estadstico mostr que las diferencias no son significativas. El proceso de liofilizacin logr remover el agua involucrada en la degradacin del producto, o que pudiera afectar su integridad fsica a la hora de formar la pastilla.

utilizaron para su producto final un proceso de sellado similar al nuestro, y lograron obtener, para los cinco ciclos de liofilizacin que propusieron, un producto ptimo, con actividad biolgica y porcentaje de humedad residual aceptables segn sus especificaciones.

Conclusiones

Hermeticidad de los bulbos

Se determin que las condiciones de sellaje al vaco que se utiliz en el proceso de liofilizacin de la P24 resultaron adecuadas. El porcentaje de hermeticidad fue del 100 % en los tres ciclos. Se comprob que la hermeticidad (condiciones de sellaje a vaco), se mantuvo al cabo de seis meses de haberse realizado las tres corridas de liofilizacin, conforme a lo establecido para productos biotecnolgicos liofilizados /1, 20/. Un buen proceso de sellado en los productos liofilizados garantiza la hermeticidad y evita la entrada de humedad al interior del bulbo, lo que atenta con la estabilidad del producto y provoca su degradacin temprana. Pujol y col. /16/

Los resultados obtenidos en cuanto a la apariencia y reconstitucin, concentracin de la protena, el porcentaje de humedad residual y la hermeticidad, parmetros que fueron evaluados en los tres ciclos de liofilizacin, fueron satisfactorios. Se demostr as la integridad de la protena 24 del VIH-1 en la formulacin liofilizada y la validez de este proceso utilizado para la conservacin y estabilidad de la protena 24, utilizada como control positivo en el diagnosticador DAVIH-AgP24.

Bibliografa

1. CECMED. Regulacin 16-2000. Anexo 04. Buenas prcticas de fabricacin de productos farmacuticos. 2000. 2. Fernndez, C.; Moreno, D.; Arias, J.; Granados, J. M. Metodologa para la validacin del llenado asptico en un proceso de liofilizacin. Revista Cubana de Farmacia., vol. 41, No 1, 2007.

Vol. XX, N 3, 2008

71

3. CECMED. Regulacin 41-2007. Validacin de Mtodos analticos. 2007. 4. Cruz, S.; Villoch, A.; Roque, E.; Gmez, J. R. Validacin de procesos en el CENSA. Revista de Salud Animal. vol. 22, No 2, 2000, p. 116-121. 5. CECMED. Regulacin 20-2004. Buenas prcticas para la produccin de diagnosticadores. 2004. 6. Inazu, K.Freeze-drying of proteins. Biopharmacy, 1991, p. 635-650. 7. Pikal, M. J. Freeze-drying of protein, Biopharmacy, 1990a, p. 635-650. 8. Pikal, M. J. The secondary drying stage of freeze-drying: drying kinetics as a function of temperature and chamber pressure. International Journal of Pharmaceutical. vol. 60, 1990 b, p. 203-217. 9. May, J.C. Determination of residual moisture in frezze-died viral vaccines: Karl Fisher, gravimetric and thermogravimetric methodologies. Journal of Biological Standarization, vol. 10, 1982, p. 249-259. 10.Farmacopea de Estados Unidos Mexicanos (FEUM). MGA. Prueba de sellado para frascos con productos liofilizados y sellados al vaco. 1988. 11.Izquierdo, M.; Silva, E.; Daz, H.; Lubin, A.L..; Nibot, C.; Tabares, D. Estudio comparativo de dos sistemas de captura de la protena de 24 kD del virus de inmunodeficiencia humana tipo 1. Biotecnologa Aplicada, vol. 17, 2000, p. 102-104. 12. Ruiz, N.; lvarez, G.; Noa, E. Procedimientos para la obtencin de reactivos biolgicos de los estuches DAVIH-AgP24 y DAVIH-AcP24. VacciMonitor, No. 4, 2003, p. 16-23.

13.Rivera, J., Prez, M. Empleo del sistema potenciomtrico Kart Fischer en el desarrollo y la certificacin de materiales de referencia. Simposio de Metrologa, 25 al 27 de Octubre 2006. 14.Pharmacopea de Estados Unidos de Amrica (USP). 2005. No. XXVIII. 15.Gonzlez, O.; Rosendo, A. Evaluacin y calificacin del proceso de sellado de bulbos en la produccin de medicamentos inyectables. II Taller de Procesos Aspticos en la Industria Biofarmacutica. 2005. (En Libro de Resmenes). 16.Pujol, V.; Sotolongo, J.; Moreira, T. Estudio comparativo del proceso de liofilizacin de la estreptoquinasa recombinante. Biotecnologa Aplicada, vol.11, No.3, 1994, p.250-254. 17.Ochoa, R.; Martnez, J.C.; Ferriol, X.; Margarita, A.; Estrada, E.; Blanco, R.; et al. Sensibilizacin de placas para ensayos inmunoenzimticos con antgenos vacunales. VacciMonitor, vol. 10, No. 4, 2001, p. 14-17. 18.Hernndez, G.; Tusell, Y.; Sotolongo, J.; Toledo, G.; Prez, M.; et al. 2007. Ajustes tecnolgicos al proceso de fabricacin del Omeprazol sdico-40 mg, inyectable liofilizado. Estudio de estabilidad. III Taller de Procesos Aspticos en la Industria Biofarmacutica. (En Libro de Resmenes) 19.International Standard Organization (ISO). Manual of Standards for Diagnostic Test and Vaccines.Principles of Validation of Diagnostic Assays for Infectious Diseases, 5th ed. Part I. Cap I.1.3; 2004: 32-45. 20.Jinsong, L.; Todd, V.; Marlin, V.; Mitch, A.; Paresh, D. A study of the impact of freezin on lyophilization of concentrated formulation with a high fill depth. Pharmaceutical Development and Tecnology, vol, 10, 2005, p. 261-272.

72 Vol. XX, N 3, 2008