UNIVERSITATEA DIN BUCURESTI FACULTATEA DE BIOLOGIE

LUCRARE DE LICENTA

,,

TEHNICI DE BIOLOGIE MOLECULARA IN ANALIZA SI EPIDEMIOLOGIA ENTEROVIRUSURILOR

COORDONATOR: Confereniar Universitar Dr. Marina Nechifor ABSOLVENT : Alexandru Ana-Maria Secia : Biochimie

INDRUMATOR: Cercettor principal III Gabriela Oprian

Cuprins Introducere. pag. 1 Capitolul I : Enterovirusuri 1. ncadrare taxonomica..pag.5 2. Genomul viralpag.7 2.1.Regiunea 5 necodata..pag.8 2.2.Regiunea 3 necodata..pag.8 2.3.Regiunea codata a poliproteinei viralepag.10 3. Proteine viralepag.11 3.1.Proteine structurale.pag.11 3.2.Proteine nestructurale.pag.12 4. Virionul.........................................................................................................pag.16 4.1.Arhitectura virionului.pag.16 4.2.Proprietati fizico-chimicepag.17 4.3.Determinanti antigenicipag.18 5. Receptori celulari.pag.20 6.Multiplicarea virala..pag.23 6.1.Etapele precoce.pag.24 6.2.Sinteza viralapag.25 6.3.Etapele tardive..pag.28 7.Epidemiologiapag.29 7.1.Moduri de transmiterepag.29 7.2.Epidemiologia molecularapag.29

8. Patogeneza.pag.30 Capitolul II :Tehnici de biologie moleculara Reactia de polimerizare n lant(PCR).pag.33 1. Generalitati...pag33 2. Componentele reactiei..pag.34 2.1. 2.2. 2.3. 2.4. 2.5. 2.6. Matrita ADN.pag.34 Primeri oligonucleotidici..pag.35 ADN polimerazele termostabile...pag.35 Deoxinucleotid trifosfai ( dNTP)....pag.37 Tamponul de reacie pag.38 Uleiul mineral..pag.38

3.Detectarea produsilor PCR ..pag.38 3.1.Contaminarea si evitarea contaminarii in reactia PCR.pag.39 3.2. Probleme ce apar in reactiile PCR .pag. 40 3.3.Specificitatea reactieipag.41 3.4. Variante de PCR..pag.41 3.5.Aplicatii ale tehnologiei PCR...pag.43 4.Restrictia enzimaticapag. 44 PARTEA EXPERIMENTALA 1.PCR pentru enterovirusuri non-polio.pag. 48 2.Extractie ARN viral..pag.49 3.Reverstranscriere pentru originea genomica VP1-2Apag.51 4.Reactia PCR pentru regiunea genomica VP1-2Apag.52 5.Electroforeza in gel de agaroza.pag.54 6.Incarcarea ampliconilor in gel si migrarea...pag.56 7.Concluzii...............................................................................................................pag.58

8.Bibliografie pag.59 INTRODUCERE

Enterovirusurile reprezint un gen foarte larg aparinnd familiei Picornaviridae. Virusurile cu ARN de polaritate pozitiv din aceast familie se remarc prin faptul c sunt cele mai mici ribovirusuri cunoscute (picos = mic) si reprezint patogeni importani pentru om i zootehnie. Datorit importanei economice i medicale a picornavirusurilor studiul lor a adus o contribuie substanial la dezvoltarea virusologiei moderne. Apartenena la grupul virusurilor ARN de polaritate pozitiv este justificat de faptul c genomul enterovirusurilor funcioneaz ca ARN mesager i prezint o ARN replicaz dependent de ARN. Numelele generic de enterovirusuri provine de la faptul c majoritatea colonizeaz tractul digestiv. Pe lang infecii uoare sau asimptomatice, cele 66 serotipuri de enterovirusuri umane cunoscute pana in prezent pot provoca i infecii foarte grave cum sunt meningitele aseptice sau miocardita acuta. Clasificarea iniiala a enterovirusurilor s-a bazat pe diferenele antigenice, pe capacitatea de a se replica intr-o anumita linie celular uman sau animal.

CAPITOLUL I

ENTEROVIRUSURI

1.

NCADRARE TAXONOMICA

ETIOLOGIE Enterovirusurile (E.V.) fac parte din familia PICORNAVIRIDAE (pico = foarte mic, RNA =tipul de acid nucleic), con in ARN, sunt icosaedrale, de aproximativ 30 nm diametru i nu au anvelop. Clasificarea enterovirusurilor n mai multe subgrupe se bazeaz pe diferene de patogenitate i gazde, iar divizarea n serotipuri se face prin seroneutralizare:

Virusurile Poliomielitice - (V.P.) Serotipurile 1-3 (tipul 1- Brunhilde; tipul 2 - Lansing; tipul 3 - Leon) cultiv n culturi celulare de primate. Tipul 2 Lansing a fost adaptat la roztoare. Provoac leziuni histopatologice caracteristice prin inoculare direct n SNC la primate.

Virusurile Coxsackie sunt divizate n 2 grupuri: Coxsackie grup A - produc la oricelul inoculat miozita generalizat, cu paralizie flasc i cuprind serotipurile 1-24 (n prezent 23 serotipuri);

Coxsackie grup B - produc miozita focal, cu infecie generalizat n miocard, pancreas, SNC cu paralizie spastic i cuprind serotipurile 1-6;

Virusurile ECHO

Acestea produc efecte citopatice n culturi celulare de primate i cuprind 31 serotipuri recunoscute. Iniial au fost 34 serotipuri, nsa n urma studiilor virusologice sau restrns la 31. Enterovirusuri nou descoperite au fost numerotate 68-72, cu excluderea virusului hepatitic A (enterovirus 72).

2.

GENOMUL VIRAL

Genomul enterovirusurilor este constituit dintr-o molecul de ARN monocatenar, de polaritate pozitiv, avnd aproximativ 7400 de nucleotide. ARN-ul viral, infectat, funcionaz ca ARN mesager n timpul translaiei i ca matri pentru formarea catenei complementare de polaritate negativ n timpul replicrii genomului viral. Extremitatea 3 a genomului este poliadenilat iar extremitatea 5 este legat covalent cu o protein de talie mic ( 22 de aminoacizi ), VPg, cu un rol important se pare n iniierea sintezei ARN-ului. Molecula de ARN prezint o singur faz de citire deschis, ORF (,, open reading frame), ncadrat de dou regiuni necodante. (NC) n 5 i 3 (Rueckert, 1996)

1.1. Regiunea 5 necodant ( 5 NC) n comparaie cu ARN mesageri celulari, regiunea 5NC a enterovirusurilor este neobinuit de lung. Este constituit din aproximativ 750 de nucleotide ( ~ 10% din lugimea total a genomului) i are un grad nalt de conservare n cadrul enterovirusurilor. Aceste caracteristici se datoresc functiilor importante ndeplinite de regiunea 5NC, funcii care depind att de structura sa secundar, ct i de cea primar. Structura sa secundar complex, compus din duble helixuri i bucle, conine dou domenii funcionale diferite implicate n sinteza ARN viral i n iniierea translaiei proteinelor virale. Primele 100 de nucleotide au o structura caracterisic n form de
8

trefl, implicat n replicarea catenei de polaritate pozitiv dar care este indispensabila sintezei catenei de polaritate negativ. n plus, aceast structur sub forma de frunza de trifoi ar putea conine semnale comune att pentru translaie ct i pentru replicarea viral i pare s intervin n supresia translaiei eucariote n favoarea iniierii sintezei de ARN viral prin intermediul interaciilor ARN-proteine. Urmeaza al doilea domeniu funcional, care est necesar n translaia viral i care conine o strucutur numit IRES (,, Internal Ribosome Entry Site, sediul intern de acces la ribosom), implicat n interacia cu proteine celulare. Mecanismul propus pentru enterovirusuri, n care IRES joac un rol important n iniierea intern a sintezei poliproteinei virale (lipsind o structur de tip ,,bonet - ,,cap n extremitatea 5 a genomului ), este diferit de cel de scanare a ribozomilor, specific pentru necesare pentru replicarea genomului viral. ARN mesageri celulari. Recent, a fost demostrat faptul ca IRES este bivalent pentru ca ar conine i secvene cu aciune n cis,

1.2. Regiunea 3 necodant ( 3NC) Regiunea 3NC este de mrime variabil n funcie de tipul de enterovirus, de exemplu de 72 de nt la polivirus sau de 100 nt la coxackievirus B. Prezint dou sau trei domenii distincte (al treila nu est prezent dect la dou din cele cinci grupuri filogenetice ale enterovirusurilor) , desemnate ,,X, ,,Y, ,,Z, cu structuri n ac de pr. Aceast regiune pare s aib un rol primordial n iniierea sintezei ARN de polaritate negativ n timpul replicrii genomului viral, graie structurii sale primare dar i a celei teriare, sub form de pseudo-nod. Proteinele virale i celulare recunosc specific complexul ribonucleoproteic format la originea replicrii de ctre 3NC n procesul de iniiere a sintezei catenei de polaritate negativ. Regiunea 3NC este urmat de o secven poliadenilat codificat genetic, de aproximativ 75 nt, a crei funcie nu este nc foarte bine definit. Aceasta secventa pare s fie implicat n infectivitatea ARN i poate interveni i n procesul de replicare ( Sarnow, 1989 ). 1.3. Regiunea codant a poliproteinei virale Cadrul de lectur deschis (ORF) codific o poliprotein de aproximativ 250 kDa, care este clivat n etape succesive n timpul translaiei de ctre proteaze virale. Se obin astfel 11 proteine virale (Fig. 2). Poliproteina nu a fost niciodat detectat n celulele infectate deoarece est clivat n timpul sintezei sale. Este mprit n 3 regiuni: P1, P2, P3, corespunznd celor trei polipeptide precursoare ale proteinelor virale. Regiunea P1 codific poliproteina P1, precursoare a proteinelor structurale VP1,VP2, VP3 i VP4, care constituie capsida viral. Regiunea P2 i P3 codific poliproteinele P2 i respectiv P3, ca precursoare ale proteinelor nestructurale, implicate n clivarea proteolitic, n replicarea genomului viral precum i n nhibarea funciilor celulare. Poliproteina P2 este precursoarea proteinelor

10

mature 2A, 2B i 2C. Poliproteina P3 este precursoare pentru proteinele mature 3A, 3B, 3C i 3D.

Procesarea poliproteinelor virale (dupa Allan )

3. PROTEINE VIRALE

11

Regiunile P1, P2, P3 ale proteinelor virale

3.1.

Proteine structurale

Regiunea P1, prima din ORF, codific polipeptidul P1 care eate precursor al celor patru proteine mature ale capsidei VP4,VP2, VP3, VP1 (ordinea din P1). Imediat ce P1 este separat de restul poliproteinei de ctre proteinaza viral 2A, ea este la rndul su clivat graie activitii proteazice a proteinei 3CD. Se obin astfel polipeptidele VP0, VP3 i VP1. Si proteina VP0 este clivat ulterior, n timpul asamblrii finale a virionului, pentru a produce proteinele structurale VP4 i VP2. Proteina VP0 rmne totusi prezent, n numr redus (dou molecule per virion), n capsida virionului. O descrire detaliat a acestor proteine este prezentat n paragraful D.1 din capitolul ,,Arhitectura virionului.

12

Proteine mature de capsida ( VP1,VP2,VP3, VP4) 3.2. Proteine nestructurale

Regiunea P2 codific polipeptida P2 care est precursoare polipeptidelor mature 2A, 2B i 2C. Produsul precursor 2BC este stabil i ar putea fi implicat n sinteza ARN viral. Proteina 2A este o proteaz care se elibereaz intr-un proces autocatalitic de poliproteina virala. Un prim clivaj se realizeaz in n cis la nivelul Tyr/Gly, pentru a elibera extremitatea N-terminal a acestei enzime, separnd astfel precursorul proteinelor de capsid ( P1) de precursorii proteinelor nestructurale ( P2-P3). Proteina 2A este responsabil i de un clivaj alternativ, neesenial, al precursorului 3CD pentru a

13

genera produii maturi 3C i 3D. Riolul acestui clivaj alternativ nu este nc cunoscut. Proteina 2A ar putea fi un element esenial n replicarea ARN deoarece nu a fost observat sinteza viral n celulele transfectate cu ARN dicistronice, avnd aceast protein delatata. Aciune proteazei 2A asupra proteinelor celulare are gazdei n timpul infeciei enterovirale a fost intens studiat. Proteinele 2Apro ale poliovirusurilor i coxackievirusurilor sunt responsabile de clivarea factorului de iniiere a translaiei eucariote, eIF4G, prin care se blocheaz translatia ARN mesageri ai celulei gazd (,,shut-off). Structura ARN mesageri din celula eucariot, numit de autorii englezi ,,cap., indispensabil pentru iniierea translaiei i aezarea corect a ARN pe ribozomi, lipsete la enterovirusuri. nhibarea iniierii sintezei proteiceeucariote ,,capdependente de ctre proteaza viral conduce la stimularea translaiei ARN enteroviral, lipsit de ,,bonet, dirijat de ctre IRES. O alt int celular a proteazei 2A este ,, poly( A)- binding protein ( PABP). Clivarea acestei proteine, din familia proteinelor eucariote care se leaga la ARN, ar putea constitui un alt mecanism prin care enterovirusurile induc procesul de ,,shut-off celular (blocarea sintezei proteinelor celulare). Recent a fost demonstrat faptul c 2Apro a coxackievirusurilor cliveaz in vitro distrofina uman i de oarece. Distrofina poate fi clivat i in vivo n cardiomiocitele oarecilor n timpul infeciei cu coxackievirus B3. Clivarea acestei proteine de citoschelet, a crei deficien de origine genetic determin o cardiomiopatie dilatant ereditar, ar putea fi la originea mecanismului molecular prin care infecia enteroviral contribuie la patogeneza cardiomiopatiei dilatante dobndite. De puin timp 2Apro este suspectat de a fi implicat i n procesul de moarte celular prin apoptoz. Proteina 2BC pare s induc o proliferare membranar, la nivelul membranelor citoplasmatice, ceea ce determin o acumulare de vezicule induse de virus pe care se ancoreaz complexele de replicare. De asemenea, proteina 2BC ar bloca i transportul proteinelor prin reticulul endoplasmic ctre aparatul Golgi i ar putea mri permeabilitatea membranelor celulare.

14

Proteina 2B pare s joace un rol structural n complexele de replicare viral, dar funcia sa exact rmne inc neelucidat. Se bnuiete c blocheaz procesul de secreie a proteinelor celulare la nivelul reticulului ensoplasmic i perturb integritatea aparatului Golgi. Proteina 2C este cea mai conservat dintre proteinele enterovirale, dac se ia n considerare structura primar. Conine trei domenii bine caracterizate: o structur helicoidal amfipatic la captul amino, un situs de legare pentru nucleozid trifosfai (,, NTP binding) caracteristic helicazelor. Aceast protein conine i locusul de rezisten la guanidin, substan care blocheaz sinteza ARN de poliovirus, fiind capabil s inhibe complet replicarea enterovirusurilor la concentraii milimolare. Proteina 2C ar interveni mai ales n cursul iniierii sintezei catenei ARN de polaritate negativ. n complexele de replicare, proteina 2C i precursorul su 2BC, sunt strns asociate mpreun cu ARN viral de membranele veziculelor din reticulul endoplasmic i joac un rol n formarea i organizarea spaiala a complexelor de replicare la nivelul acestor vezicule. De asemenea, ar putea fi implicat n eliberarea ARN viral din complexul de replicare precum i n etapele tardive ale replicrii, n ncapsidarea genomului virel i asamblarea virionilor. Regiunea P3 codific polipeptidul P3, precursor al polipeptidelor mature 3A pana la 3D. Proteinele 3 AB i 3CD sunt stabile, avnd funcii distincte fa de cele ale produilor de clivare 3A, 3B, 3C i 3D. Proteina 3AB intervine la mai multe niveluri n cursul replicarii genomului viral: este precursorul direct al proteinei 3B care este legat la extremitatea 5 a ARN virali de polaritate pozitiv i negativ, fiind i un presupus co-factor al polimerazei 3Dpol. Proteina 3AB se leag nespecific de ARN i, n asociere cu proteina 3CD, poate realiza o legtur specific cu structur treflat din captul 5NC al genomului. Date genetice i biochimice au demonstrat c acest complex nucleoproteic joac un rol esenial n replicare ARN viral. In plus, asocierea peoteinei 3AB cu proteina 3CD ar stimula

15

autoclivarea precursorului stabil 3CD n proteinele mature 3C i 3D. n acelai timp proteina 3 AB prezint o afinitate pentru polimeraza 3Dpol i aceast interacie ar avea un rol central n recunoaterea de ctre polimeraz a matriei, precum i n activitatea sa enzimatic. Proteina 3A, acesteia i se raibuie un rol n inhibarea comunicrii dintre reticulul endoplasmic i aparatul Golgi. Conine o secven de 22 aminoacizi hidrofobi, responsabil de interacia polipeptidului cu membranele i de modificarea permeabilitii acestora. Mai recent, analiza mutanilor a sugerat un rol al proteinei 3A n efectul citopatogen indus viral. Proteina 3B ( VPg ) se leag la extemitatea 5 a ARN genomic. Ea particip direct la replicarea genomului viral. Un studiu recent a demostrat ca VPg, ar putea servi ca amors (,, primer) pentru ARN polimeraz n timpul sintezei ARN viral. Proteina 3CD este precursorul direct al proteazei virale 3Cpro i al polimerazei virale 3Dpol. Este i proteaza direct implicat n procesarea proteolitica la nivelul situsurilor Gln/Gly din regiunea P1, precursor al proteinelor capsidei. Recent, proteina 3CD a fost implicat in n replicarea viral. Ea ar forma un complex ribonucleoproteic cu extremitatea 5 n form de trefl a genomului i o protein celular asociat ribozomilor. Pentru a iniia n trans sinteza ARN de polaritate pozitiv, proteina 3CD poate s se asocieze i cu proteina 3AB i s formeze un complex 3Cdpro/3AB/ARN, implicat n sinteza ARN viral. Proteina 3C este proteaza viral major responsabil de clivajul legturilor dipeptidice Gln/Gly din precursorii P2 i P3., de clivajul primar dintre proteinele 2C i 3A i de autoclivarea sa din precursorul 3DC. Recent, strctura proteazei 3C a poliovirusului a fost determinat prin cristalografie cu raze X.: ea prezint o strcutur asemntoare cu cea a unei serin-proteaze, de tip chemotripsin. Aceast protein ar

16

cliva i anumite proteine celulare printre care: factorul de transcriere TFIIIC ,,TATAbinding protein (TBP, sub-unitate a factorului de trasncriere TFIIID) i factorul de transcriere CREB (,, c-AMP-responsive element-binding protein). Consecina direct a inactivrii acestor factori de transcriere este inhibarea trascrierii genelor celulare asigurat de ctre ARN polimerazele celulare I, II, i III. Proteina 3D este ARN polimeraza dependent de ARN, responsabil de sinteza ARN de polaritate pozitiv i negativ. Activitatea sa este strict legat de prezena unui primer nucleotidic mpreun cu matria. In plus, 3Dpol prezint i una din proprietile helicazelor i anume cea de a derula duplexul ARN. I se atribuie i activitate de terminal adenil transferaz cu rol ipotetic n replicare. Este bine stabilit c 3Dpol se asociaz cu factori virali, cum este proteina 3AB sau VPg, dai i cu proteine celulare pentru a forma complexe de replicare. Structura cristalografic a polimerazei 3D a permis localizarea a 4 domenii: A, B, C i D, nalt conservate printre ARN polimerazele virale.

4. VIRIONUL
4.1. Arhitectura virionului

Studiile de microscopie electronic ct i apoi cele de difracie cu raze X au artat ca virionul are un diametru de 24-30 nm i posed o capsid cu simetrie icosaedric lipsit de un nveli lipoproteic. Structura tridimensional a diferitelor enterovirusuri umane a fost elucidat prin cristalografie cu raze X : poliovirusul de tip I ( Hogie et.al, 1985 ) , cokackievirus B3 ( Muckelbauer et.al., 1995 ) , echovirus 1 ( Filman et. al., 1998 ) . Toate aceste enterovirusuri au o arhitectur a virionului similar cu celelalte enterovirusuri din familia Picornaviridae. Capsida viral este constituit din 60 de protomeri identici, fiecare compus din cele patru proteine structurale ; VP1,VP2, VP3 i VP4. Cinci protomeri formeaz un pentamer i asocierea cu 12 pentameri constituie
17

procapsida. Cnd aceti 12 pentameri sunt asamblati, proteinele VP 1 sunt orientate n direcia axelor de simetrie de ordinul 5, n timp ce pe axele de simetrie de ordinul 3apare o protuberan format din proteinele VP2 i VP 3. Proteinele VP4, situate exclusiv n interior, cptuesc capsida n strns legtur cu ARN genomic. In ciuda diferenelor majore la nivelul structurii lor primare, cele trei proteine: VP1, VP2 i VP3 prezint o structur tridimensional relativ asemantoare. Aceast structur este compus din dou helixuri de tip alfa i din opt planuri beta antiparalele, pliate i legate ntre ele prin patru bucle de conexiune scurte. Extremitile amino ale proteinelor VP1, VP2 i VP3 formeaz o reea pe partea intern a capsidei, n asociere cu VP4. Buclele de conexiune ale proteinelor VP1, formeaz platouri n jurul axelor de simetrie de ordinul 5. Acestea sunt nconjurate de o depresiune destul de profund la poliovirus i rhinovirus, constituit din aminoacizii celor trei proteine: VP1, VP2 i VP3, numit ,, canion , aceast structur a fost propus ca situs de ataare la receptorul celular, att pentru grupul rhinovirus ( Colonno et.al. , 1998 ) i pentru poliovirus. Descifrarea structurii tridimensionale a capsidei mai multor enterovirusuri a determinat un progres considerabil n nelegerea funciilor acestei organizri, protejarea genomului viral de nucleazele de mediu, recunoa terea receptorului celular specific ca prim determinant n specificitatea de gazd i n tropismul celular, suport pentru determinantii antigenici, sediu pentru informaiile privind ncapsidarea genomului viral i maturarea virionilor, ca i pentru maturarea virionilor, ca i pentru eliberarea genomului viral n celulele int ale gazdei. 4.2. Proprietile fizico-chimice

Enterovirusurile sunt, ntre altele, definite i prin proprietile lor fizico-chimice, caracteristice acestui gen. Ele sunt rezistente la alcool etilic 70%, lizol 5%, amoniu

18

cuaternar 1% i fat de al i compu i similari cu rol dezinfectant. De asemenea, sunt rezistente la tratamentul cu eter, dezoxicolat i al i solven i organici sau detergen i. n schimb, enterovirusurile sunt termolabile : expunerea la temperaturi de 500C le distruge rapid, dar inactivarea este parial n prezena clorurii de magneziu 1 M. Sunt virusuri foarte stabile la ph-uri acide ( ncepnd cu 2,5 ) ceea ce ilustraz o perfect adaptare la mediu : enterovirusurile trebuie s treac prin mediul acid din stomac nainte de a ajunge n zonele primare de replicare din intestin. 4.3. Determinani antigenici

Proprietile antigenice ale virusurilor au permis dezvolatarea principalelor metode de difereniere a acestora, implicit de identificare i clasificare. Trebuie s se tin seama de sistemul de identificare serologic, bazat pe antigenitatea virusurilor. In plus, n cadrul profilaxiei maladiilor provocate de infecii cu enterovirusuri, va trebui s se in seama ntotdeauna de antigenitatea acestora pentru prepararea vaccinurilor. Una din caracteristicile familiei Picornaviridae este un numr impresionant de serotipuri ( peste 200 ) . Serotipul este definit cu ajutorul unui antiser monospecific care este capabil s neutralizeze infectivitatea viral. Antiserul este produs prin imunizarea unui animal care nu a fost expus anterior infeciei cu virusul care este investigat. Statusul antigenic al unui virion integru poate fi conservat i n cazul unei particule virale, a crei infectivitate a fost abolit n urma tratamentului cu formaldehid . Acesta este principiul de preparare al vaccinului polio inactivat ( VP1 ) . Diverse tratamente fizice sau chimice determin o denaturare a virusului, incapabil de a se mai adsorbi pe celula gazd. El prezint un status antigenic modificat care este putin specific dec t cel al virusului n stare nativ deoarece proteinele de la suprafaa virusului au o conformaie modificat. ( Minor et.al. , 2000) de aceea, metodele care se bazeaz pe identificarea

19

virusurilor dupa astfel de tratamente ( ex: tehnicile imunochimice ca: Elisa sub imunoblot) trebuie completate cu alte tehnici mai fiabile. Localizarea situsurilor antigenice de la suprafaa virionului este de importan major pentru nelegerea mecanismelor de neutralizare viral precum i a bazelor moleculare ale diversitii serotipuilor. Una dintre principalele caracteristici ale enterovirusurilor este numrul im presionant de serotipuri ( 64 pana n prezent ) . Situsurile antigenice sunt reflectate de secvena proteinelor structurale recunoscute de ctre sistemul imun al unui animal injectat cu antigenele virale i sunt capabile s induc anticorpi care neutralizeaz infectivitatea virionului nativ. Caracterizarea mutatiilor de poliovirus care au rezistat la neutralizarea cu anticorpi monoclonali precum i a structurii tridimensionale a capsidei au permis localizarea situsurilor antigenice de neutralizare n proteinele VP1, VP2 i VP3, la nivelul buclelor hidrofile expuse la suprafa a particulei virale. Secvenele de aminoacizi implicatii n eptopi de neutralizare sunt grupate n trei situsuri antigenice de neutralizare : situsurile 1,2,3 , ultimul fiind divizat n trei domenii 3a, 3b, 3c ( Hogle & Filman, 1989 ; Mateu, 1995; Minor et.al., 1986 ; Page et.al., 1988) Cele mai multe situsuri antigenice de neutralizare sunt de fapt epitopi discontinui. Acetia sunt compu i fie din secven e peptidice scurte i cel mai adesea necontinue, fie din secvene situate pe proteine diferite de capsid. Diferenele de conformaie cele mai semnificative ntre serotipurile de polivirus sunt localizate la nivelul buclelor. Astfel, exist o diferen important de conformaie la nivelul buclei B-C din VP1. Aceasta este mult mai expus n cazul poliovirusului de tip 3 Sabin. O mai bun accesibilitate a sa ar putea fi responsabil de imunodominana situsului antigenic 1. Aceast bucl B-C este supus unei variaii intense de secven ( modificri de lungime prin inserii sau deleii) , ntre enterovirusuri aparinnd unor grupuri

20

taxonomice diferite i constituie , probabil, o structur important n diversificarea enterovirusurilor.

Dei situsurile antigenice au fost intens studiate pentru poliovirusuri, cele ale altor enterovirusuri sunt nca puin cunoscute. Probabil c structura antigenic a acestora este asemntoare cu cea a poliovirusului. Construcia de virusuri himerice coxsackieivirus B3/B4 a permis identificarea unui situs antigenic de neutralizare specific de serotip la nivelul buclei B-C din VP1 la coxackie B4 ( Reimann et.al., 1991 ) totu i , aceast caracteristic nu se poate extinde la totatlitatea enterovirusurilor. Analiza antigenic a virusului coxackie A 9, a revelat faptul c anumite situsuri antigenice corespund cu localizarea situsurilor 2 si 3 de la poliovrus , dar nici un epitop de neutralizare nu a fost similar situsului antigenic 1 ( Pulli et.al., 1998 ) . Patogenitatea, capacitatea virusurilor de a induce manifestri clinice n organismele infectate, este rezultatul unor interaciuni complexe la care particip factori implica manifestri clinice n organismele infectate, este rezultatul unor interaciuni complexe la care particip factori implicai n carcteristicile biologice, biochimice i genetice ale virusului, pe de o parte, i reactivitatea gazdei, pe de alt parte. Boala se manifest clinic dac funcii importante sau vitale ale unor grupe de celule sunt afectate de replicarea viral. In general, nu toate celulele i esuturile din organismul infectat sunt sensibile fa de infecia viral. Tropismul unui virus pentru o celul gazd reprezint, n primul rnd, o interaciune ntre componentele de suprafa ale virusului i receptorii de la nivelul membranei celulelor infectate. De aaemenea ,n acest proces intervin i molecule intracelulare necesare multiplicrii virale,

5. Receptorii celulari
21

Evenimentul iniial din ciclul infecios al virusurilor este adsorbtia pe membrana celular unde se gsesc receptorii specifici. Enterovirusurile, care induc o patologie foarte divers, recunosc diferii receptori celulari, n ciuda unei anumite unit i strcturale i genetice. Unele variante mutante se multiplic ns n celule care nu sunt permisive pentru tulpinile parentale, ceea ce reflect o anumit flexibilitate a interaciunii dintre virus i gazd. Probabil c aceasta reprezint o strategie viral pentru a permite o mai mare variabilitate a tropismului celular i o palet mai larg de gazde, d nd sanse mai mari supravieuirii genului viral ( Evans & Almond, 1998 ). In plus receptorii nu ar fi responsabili numai de fixarea virusului la suprafaa celulei gazda ci ar putea interveni i n etapele precoce ale ciclului viral ( decapsidare i eliberarea ARN viral n celul). Receptorul poliovirusului ( PVR ) este prezent numai pe suprafaa anumitor celule de primate. Gena care codific pentru PVR uman se gsete pe cromozomul 19. ( Koike, et.al., 1990 ) . Acest receptor specific este o glicoprotein din familia imunoglobulinelor ( Mendelsohn, et.al., 1989 ) , al crei rol fiziologic nu este nc cunoscut. Exist patru isoformeare PVR uman ( dou forme membranare( i ), care funcioneaz ca receptori i dou forme secretat ( i ) care nu sunt func ionale pentru infecia viral. Aceast molecul, puternic glicozilat, comport trei domenii extracelulare cu o configuraie de tip V2-C2-C2, o regiune transmembranar i un domeniu intracelular. A fost demonstrat faptul c cel care interacioneaz cu particula viral este domeniul V2 ( Kolike, et.al., 1991 ) . Cu ajutorul anticorpilor monoclonali, care au blocat infecia viral a unor celule, au putut fi identificai receptori poteniali, ai altor enterovirusuri, astfel receptorul celular pentru echovirus ( acum recunoscui ca fiind un singur serotip ) a fost identificat ca fiind integrina VLA-2 , ai crei ligani naturali sunt colagenul i
22

laminina ( Bergelson et.al., 1992 ). Aceeasi autori au demostrat ca infecia celulelor de ctre acest echovirus depinde de subunitatea 2 din VLA-2. Integrinele, glicoproteinele membranare heterodimerice, sunt moleculele responsabile de adeziunea intercelular i de interaciunile celulelor cu matricea extracelular, dar i de ataarea viral la celule i infectarea acestora. Un prim motiv identificat din proteinele matricei extracelulare care interacioneaz cu integrinele este coxackievirus A9 prezint o inserie de 17 aminoacizi la extremitatea C-terminal a proteinei de capsid VP1 care include i motivul RGD. ( Rovainen, et.al., 1991 ), au demontrat ca peptidele sintetice care conin motivul RGD blocheaz ataarea virusului coxsackie A9 pe celule, ceea ce sugereaz faptul c o integrin servete ca receptor pentru acest virus. Este vorba de integrina v 3 ( pentru care ligandul natural este vitronectina ), receptorul celular pentru Coxackievirus A9 ( Rovainen , et.al., 1994 ). A fost demostrat existena unor receptori suplimentari pentru CV-A9 ( 2 microglobulina i o protein de 70 KDa asociat CMH de tip 1 ), necesari n evenimentele de internalizare ( Triantafilou , et.al., 2000 ). A fost sugerat i faptul c 2 microglobulina reprezint un cofactor n etapele precoce ale ciclului viral pentru echovirus 7 ( Ward, et.al, 1998 ), integrina v 3 este molecul candidat i pentru receptorul celular al echovirusului 9 Barty. Aceast secven RGD ar putea explica caracterul patogen al acestei tulpini pentru oriceii nounscui, motiv care lipsete din capsida tulpinii nepatogene de Echovirus 9. Pentru numeroase tulpini de echovirus ( E 3, 6,7,11-13, 19-21, 24, 25, 29, 30, 33 ) ca i pentru anumite coxackievirusuri B ( CV-B1, B3 i, B5 ), pentru coxackie virus A 21 sau pentru enterovirus 70, unul din elementele complexului de receptori ar fi format din molecula DAF ( ,, Decay Accelranting Factor sau CD 55) . DAF intervine n reglarea activitii complementului i n semnalizarea intercelular. Exprimarea sa este ubicvitara, inclusiv pe eritrocite, ceea ce explic fenotipul hemaglutinant al tripeptidul RGD. Nu ntampltor,

23

enterovirusurilor care utilizeaz acest receptor. DAF este o glicoprotein de 70 KDa i este definit prin ase domenii: patru regiuni SCR ( ,, Short Consensus Repeat) de aproximativ 60 aminoacizi, o regiune bogat n serin/treonin i o regiune Cterminal membranar, fixat covalent pe un acid gras. Regiunea SCR-1 este necesar pentru interac iunile cu CV-A21, EV-70 i mai general cu Human Enterovirus C si D, pe cnd regiunea SCR-4 este necesar pentru Human Enterovirus B . Dar exprimarea sa la suprafaa celulei nu este suficient pentru ca infecia s aib loc.

In ultimii ani, numeroase lucrri au artat c virusurile ( inclusiv enterovirusurile nu utilizeaz un receptor celular unic ci , mai degrab, un complex receptor compus din mai multe elemente cuprinznd proteine de ataare i molecule accesorii ( Evans& Almond, 1998) . In lumea virusurile, enterovirusurile manifest cea mai mare diversitate privind tipul de receptor. Acest lucru este ilustrat foarte bine de coxackievirusurile B, capabile s utilizeze cel puin trei receptori diferii ( CD55, CAR i o protein mambranar din familia nucleolinelor ). Pentru receptorii ale caror fun ii r m n a fi determinate ( de ex: CAR i PVR uman ), remarcabil este faptul c ace tia reprezint molecule din familia imunoglobulinelor i deci, susceptibile s joace un rol n imunitate. Alegerea unei familii de proteine comun pentru mai multe virusuri ar putea fi consecina unei presiuni selective n timpul evolutiei enterovirusurilor.

6. MULTIPLICAREA VIRALA
Ciclul complet de multiplicare a enterovirusurilor este unul dintre cele mai scurte si dureaz in vitro aproximativ 8 ore. Avnd o localizare exclusiv citoplasmatic, ciclul

24

viral este iniiat prin fixarea virusurului pe receptorul celular i se termin prin liza celulei infectate i eliberarea virionilor nou formai. Studiul poliovirusului prototipul enterovirsurilor a furnizat ansamblul elementelor care au permis nelegerea ciclului de multiplicare enteroviral.

6.1.

Etapele precoce: adsorbia, ptrunderea i decapsidarea

25

Pentru iniierea ciclului de relicare, virusul trebuie sa interacioneze cu receptorul celular i s elibereze acidul nucleic n compatimentul celular adecvat. Dar mecanismul prin care enterovirusurile introduc ARN n celula int ramne controversat. In general este admis faptul c interaciunea enterovirusurilor cu receptorul lor specific antreneaz modificri conformaionale importante ale particulei virale. La temperatur fiziologic, aceste interciuni determin aparitia unor particule stabile numite A ( 135S), mult mai hidrofobe dect particulele native i capabile de internalizare celular. Aceast structur intermediar de 135S este obiect al unor controverse: Dove i Racaniello au sugerat ca formarea nu pare absolut necesar infeciei virale productive, iar Curry et al. au artat c aceste particule, spre deosebire de particulele native, pot infecta celule care nu exprim receptorul. Totui date recente pledeaz n favoarea rolului de intermediar al particulei 135S pentru intrarea virusului n celul. Aceti autori propun chiar o etap suplimentar in procesul de intrare, care ar avea loc dup formarea particulei 135S i ar fi asociat cu eliberarea ARN. Schimburile conformaionale ale capsidei virale sunt, n principal, caracterizate prin pierderea proteinei VP4 i prin externalizarea extremitii N-terminale hidrofobe a proteinei VP1, antrennd astfel reducerea coeficientului de sedimentare de la 160S al virionului intact la 135S pentru particula modificat. Aceast particul modificat, care prezint o mai mare afinitate pentru membrane, a fost propus ca intermediar obligatoriu n mecanismul internalizrii virusului. ntr-adevr, aceste schimbri conformaionale par a fi indispensabile decapsidrii, care ncepe imediat ce virusul este adsorbit pe membrana celular.

6.2.

Multiplicarea la enterovirusuri

Dintre particulele adsorbite, 50% sunt internalizate, restul sunt eliberate n mediul extracelular prin procesul numit eluie.

26

Particulele neeluate intr n celul fie ptrunznd direct prin membrana celular dupa legarea de receptor, fie printr-un mecanism de endocitoz mediat de receptorul celular. n acest ultim caz, acidifierea endozomului nu este necesar pentru decapsidare i pentru trecerea genomului viral prin membrana endozomal. S-a sugerat ca translocarea ARN viral in citoplasma celulei infectate ar putea s se realizeze prin formarea unor pori trans-membranari aprui prin inseria extremitii N-terminale a VP1 i, eventual, a proteinei VP4 miristilate. Acest model a fost susinut prin detectarea unui canal ionic, dup punerea n contact a particulelor virale cu membrane lipidice.

6.3.

Sinteza viral: translaia si replicarea genomului viral

Dup eliberarea ARN n citoplasm, acesta este tradus direct de ctre aparatul translaional al celulei gazd. Proces anticipat de clivarea proteinei VPg din extremitatea 5a genomului de ctre o proteaz de origine celular. Spre deosebire de ARN de la eucariote, genomul enterovirusurilor nu prezint o structur ,,cap sau ,,bonet ,etilat la extremitatea 5. Iniierea translaiei se face printr-un mecanism numit ,,iniiere intern: subunitatea 40S a ribozomului recunoateun segment cu o structur secundar particular al regiunii 5NC, IRES, care este localizat cu 150 de nucleotide situate n amonte de codonul start. Subunitatea 40S migreaz apoi pn la primul AUG care se gsete intr-un context favorabil iniierii translaiei. Se pare c buna funcionare a codonului start necesit prezena n amonte a unui tandem constituit dintr-o secven bogat n pirimidin i intr-un AUG criptic. Este interesant de notat c regiunea 5NC conine 6-8 codoni AUG care nu sunt utilizai pentru iniierea translaiei. n plus fat de

27

factorii ,,clasici ai inierii, activare translaiei virale necesit o serie de factori celulari, care se fixeaz specific pe structuri secundare din regiunea 5NC, cum sunt autoantigenul LA( p52), ,,polypyrimidibe-tract-binding protein (PTB), factorul eucariot de iniiere a translaiei eIF- 2 i ,, poly (rC)-binding protein 2 ( PCBP2). Aceste proteine care se leag de ARN ar acionaca molecule ,, chaperones care ar menine IRES n conformaia necesar pentru interaciunea cu sistemul translaional celular, n special cu eIF- 2 . Aa cum a fost deja descris, genomul enterovirusurilor este n final translat ntr-o singur poliprotein, care este clivat cotranslaional de ctre proteazele virale neosintetizate 2Apro, 3Apro i 3Cdpro, pentru a da natere proteinelor de capsid i celor nestructurale. n momentul n care suficiente proteine virale au fost sintetizate, se produce o basculare de la translaie la replicarea genomului viral, n principiu aceste dou fenomene neputnd avea loc simultan. Gamarnik i Andino au propus existena la nivelul structurii n trefl din 5NC a unor semnale care controleaz att translatia ct i replicarea viral, prin formarea unor complexe ribonucleoproteice. In acest model, interaciunea dintre PCBP celular i aceast structur ar favoriza traslaia. Dup sinteza precursorului viral 3CD, aceasta se leag de structura treflat i nhib astfel translatia n favoarea sintezei actenei de ARN de polaritate negativ. Mecanismul replicrii genomului enterovirusurilor este nc puin nteles. In celulele normale nu este cunoscut o activitate de tip ARN polimeraz dependent de ARN. ARN polimeraza viral 3Dpol este strict necesar oentru virus. Totui, aceast enzim nu este suficient i replicarea necesit nu numai proteine virale nestructurale dar i anumite proteine celulare. Procesele replicative au loc n citoplasm, la suprafaa extern a veziculelor formate din organite celulare cum sunt: reticulul endoplasmic, aparatul Golgi i lizozomii. Aceste vezicule sunt probabil induse de proteinele virale 2BC i/sau 2C i se organizeaz n rozete n jurul complexelor de replicare. Aceste complexe sunt

28

constituite din membrane celulare netede, molecule matrice de ARN, molecule n curs de a fi sintetizate, moleculele de polimeraz viral 3Dpol, alte proteine virale i din ali factori celulari. Replicarea ncepe prin sinteza unei catene de ARN negativ, complementar genomului viral; acesta va servi apoi la rndul su ca matrice pentru sinteza numeroaselor molecule de ARN de polaritate genomic pozitiv. n citoplasma celulei infectate se mai gsesc forme replicative (RF), constituite din actene pozitive i negative ca hibrizi n dublu helix precum i forme intermediare de replicare ( RI), constituite dintr-o matrice asociat cu mai multe catene de polaritate opus n curs de sintez. Este n general admis c numai regiunile 5NC i 3NC ale genomului sunt implicate n mecanismele de iniiere a replicrii, graie structurilor secundare i a prezenei semnalelor de repliacare care acioneaz in cis, numite cre. Extremitatea 3 ( oriR) ar interveni n iniierea n cis a sintezei catenei negative, iar extremitatea 5 ( oriL) ar fi necesar pentru iniierea n trans a replicrii catenei pozitive. Totui, o regiune de tip cre a fost recent identificat i n regiunea care codific pentru proteina 2C .

6.4.

Etapele tardive: morfogeneza i eliberarea vironilor.

Etapa iniial a morfogenezei virale este eliberarea procursorului miristilat P1 al poliproteinei in urma activitii autocatalitice a proteinei 2Apro. Precursorul P1 sufer apoi o clivare de ctre proteaza 3CD, pentru a da natere proteinelor de capsid VP0, VP1 i VP3. Procesul de asamblare viral poate astfel s nceap: proteinele structurale se asociaz pentru a forma un protomer care sedimenteaz la 5S i care este cea mai mic sub-unitate a capsidei. Cinci protomere se combina apoi pentru a forma sructura pentameric de 14S. Urmeaz asamblarea a 12 pentamere care formeaz procapsida de 75S. Etapa urmtoare este unirea ARN viral cu capsida imatur pentru a constitui o particul instabil, provirionul de 125S.
29

O ultim etap de maturare este necesar pentru formarea virionului infectant, n care precursorul VP0 este clivat n VP4 i VP2 printr-un mecanism probabil autocatalitic. Aceast clivare i ncapsidarea ARN declaneaz un rearanjament structural care este un proces specific, n sensul c nici un alt tip de ARN viral sau celular nu poate fi ncapsidat. Specificitatea s-ar putea explica prin cuplarea funcional dintre morfogenez i replicarea viral. Asamblarea odat realizat, particulele mature se acumuleaz n citoplasma celulelor infectate sub forma unor incluziuni cristaline, dup care sunt eliberate prin spargerea vacuolelor la suprafata celulelor. Eliberarea masiv de virioni nou sintetizai este concomitent cu liza celulei, n care proteina viral 2B ar putea juca un rol important.

7. EPIDEMIOLOGIA
Transmiterea este in general de tip fecal-oral, difuzarea virusurilor fiind sporadic, endemic, epidemic i chiar pandemic, cu predilecie pentru senzorul vartoamn n regiunile temperate. Anumite serotipuri domin i circul simultan timp de mai muli ani, apoi scad ca frecven, revenind dup un timp pentru initierea unor noi epidemii. Serotipurile dominante sunt ins imprevizibile de la un an la altul. 7.1. Moduri de transmitere

Sunt cunoscute moduri de transmitere a enterovirusurilor, fiecare influentnd n mod diferit caracteristicile epidemiologice ale infeciei provocate. Schema principal de difuzare a enterovirusurilor este contaminarea fecalo-oral, fiind confirmat n primul rnd n rile n curs de dezvlatare unde condiiile sanitare sunt precare dar i n anumite comuniti din arile dezvoltate cum sunt creele i colile. De fapt, enterovirusurile de

30

transmit de la individ la individ prin intermediul minilor contaminate, a obiectelor, a alimentelor lichide sau solide stropite cu saliv sau prin materii fecale. n contextul conjunctivitelor hemoragice acute provocate de enterovirus 70 sau de coxackievirus A24, secreiile nalt infecioase se transfer prin intermediul minilor i chiar prin instrumentar oftamologic insuficinet sterilizat. Calea aerian poate s joace i ea un rol n transmiterea unor serotipuri cu tropism pentru tractul respirator. Nu este de neglijat nici transmiterea oral-oral la populaii cu nivel socio-sanitar ridicat.

7.2.

Epidemiologia molecular

Epidemiologia molecular permite recunoaterea tulpinilor diferite din aceeai specie, provenind din circumstane epidemiologice cariate, pe baza polimorfismului genetic. Dintre mecanismele care determin polimorfismul genetic, mai importante sunt variabilitatea natural determinat de polimeraze (n special ARN polimeraze) i modificrile genetice (deleii, inserii, recombinri, trasnlocaii). De cativa ani, epidemiologia virusurilor s-a imbogit cu o serie de tehnici moleculare noi care permit caracterizarea diferenelor genetice i antigenice ntre diferite izolate. Aceste tehnici recente, fac posibile investigaii privind originea i evoluia tulpinilor, avnd astfel implicaii n prevenirea anumitor boli enterovirale cu importan deosebit pentru sntatea public. In acelai timp, epidemiologia molecular permite ameliorarea metodelor de diagnostic i terapeutice precum i identificarea unor markeri genomici (de exemplu secvenele din genom care pot fi asociate cu o cretere a virulenei sau cele implicate n modificrile ctre fenotipuri patogene).

31

8.

PATOGENEZA

Poarta de intrare a enterovirusurilor este calea oral (cu excepia enterivirusurilor asociate cu conjuctivitele). Situsurile primare ale replicrii virale sunt mucoasele faringian i intestinal, virusurile ajungnd n intestin dup ce au trecut de bariera stomacal n virtutea rezistenei lor la pH acid. Enterovirusurile traverseaz bariera intestinal prin celulele M din structurile limfoide de la nivelul plcilor Peyer. Aceast faz digestiv din intestinul subire ar fi urmat de o faz limfatic prin care virusul ajunge n ganglionii cervicali mezenterici. Faza viremic ce urmeaz ar putea fi ntreinut prin invadarea acestor ganglioni, precum i a altor esuturi. Viremia tranzitorie este, din punct de vedere clinic, silenionas sau este nsoit de semne clinice nespecifice cum sunt vom, febr, dureri n gt, etc. Dup ce virusul trece n snge, acesta se multiplic n celulele sistemului reticulo-endotelial apoi ajunge n organul int. Perioada de incubaie, acoperind toate aceste faze, este n general de 7 la 14 zile, dar poate fi i de 2 la 35 de zile. Dup apariia semneleor clinice, care reflect leziuni la nivelul organelor int, virusul dispare destul de repede din orofaringe, dar multiplicarea intestinal poate persista cu o excreie viral prin materiile fecale, timp de mai multe sptmni. Fiecare tip de enterovirus are propriul su organ int: creier, inim, muchi, piele, etc. Izolarea enterovirusurilor se face din diferite tipuri de probe clinice: fecale, secreii faringiene, lichid cefalo-rahidian ( LCR), maduva spinrii, creier, inim, snge, secreii oculare (conjunctivite) sau din leziuni ale pielii sau ale mucoaselor. Poliovirusul infecteaz sistemul nervos central (SNC) i astfel trebuie s traverseze bariera hemato-encefalic, fie direct, fie prin infectarea celulelor endoteliale . Dei calea sangvin rmne ipoteza privilegiat pentru a se explica pasajul poliovirusului ctre SNC, s-a propus i ipoteza migrrii virusului pe cale nervoas prin nervii periferici. inta preferenial a poliovirusului este neuronul motor periferic din coarnele anterioare ale maduvei spinrii sau din echivalentele lor de la nivelul
32

trunchiului cerebral. Distrugerea neuronului motor periferic determin paralizia muscular flasca zonelor dependente topografic de neuronii distrui. Infeciile simultane de ctre mai multe serotipuri de enterovirusuri sunt posibile, dar pot aprea competiii la nivelul intestinului ntre diferitele virusuri. Patogeneza enteroviral descris astfel, cu referire la o infecie acut, este cea adoptat n mod clasic, dar se cunosc cteva excepii. Enterovirozele cronice i conjunctivita hemoragic acut nu corespund schemei prezentate. n conjuctivita hemoragic acut, contaminarea este direct, pe cale conjunctival i incubarea este de 24 la 48 de ore. Virusul are o temperatur optim de replicare mai sczut, de 33-35 C i se izoleaz din secreiile conjunctivale i din oro-faringe, dau nu din materii fecale. Enterovirusurile sunt o cauza destul de frecventa de encefalita acuta virala, diagnosticul etiologie este dificil, dozarea de IgM care stabileste diagnosticul de infectie acuta nefiind efectuata intotdeauna. Un rol important il are si deficitul de IgA, precum si valoarea scazuta a complementului seric care sunt factori esentiali in mecanismele de aparare. De altfel, copiii cu diferite deficiente ale sistemului imunitar sunt predispusi la infectii cu enterovirusuri, difera atat de serotipul implicat dar mai ales de statul imun al gazdei. Este de remarcat aparitia ambelor episoade in luna august, perioada de incidenta maxima a infectiei cu enterovirusuri. Particularitatea cazului Encefalita acuta cu enterovirusuri ( ECHO si Cocsackie), manifestata prin ataxie cerebeloasa, repetata la un interval de un an, la un copil cu deficit imunologic IgA pe fond de valori scazute ale complementului seric, cu raspuns favorabil la tratamentul patogenic si simptomatic aplicat.

33

CAPITOLUL II

TEHNICI DE BIOLOGIE MOLECULARA

I. Reacia de polimerizare n lan ( PCR) 1. Generaliti:

Reacia de polimerizare n lan ( polymerase chian reaction, PCR), este o metod de sintez ADN in vitro, prin care o anumit secven din aceasta este amplificat n mod specific. Principalii reactani care intervin n procesul de amplificare sunt: - primerii /amorse sunt dou oligonucleotide cu secvena complementar capetelor 3 ale fragmentului de ADN intit, orientarea lor permind sinteza secvenei din regiunea pe care o delimiteaza. - Deoxinucleozid trifosfaii acetia fiind unitile constitutive ale acizilor deoxiribonucleici, respectiv dATP, dCTP, dGTP, dTTP - ADN polimeraza termorezistent , aceasta fiind enzima care catalizeaza construirea catenelor complementare prin extensia primerilor
34

Reacia se desfaoar ntr-un tampon care contine Tris-HCl, KCl, MgCl2 ( concentraia optim de Mg2+ variind ntre 1-10 mM) i ali aditivi ( gelatina , tween 20, Nonidet P-40, Triton X-100) . Reacia de PCR se desfaoar pe parcursul a mai multor cicluri ( 25-45), fiecare constituit din trei etape: 1. denaturarea ADN se realizeaz prin expunerea la temperaturi de 94-95oC 2. hibridizarea primerilor la monocatenele ADN , se realizeaz la temperaturi de 45-68oC 3. extensia primerilor la captul 3, respectiv sinteza de ADN la temperatura de 72oC,temperatura optima de activitate a Taq-polimerazei. Rezultatul acestui proces ciclic repetat este o crestere exponenial a numrului total de fragmente ADN care includ secveneledintre primeri PCR utilizai. Teoretic amplificarea final a matriei ADN int este de 2n, unde n reprezint numrul de cicluri PCR. Produsul de reacie ( amplicon) cumuleaz dimensiunea celor doi primeri i a secvenei dintre ei. El poate fi identificat, respectiv verificat ca specificitate, n mai multe moduri. Cel mai frecvent se recurge la aprecierea lungimii sale precis definit ( vizualizare in UV, dup migrare n gel de agaroz i colorare cu bromur de etidiu), exprimat n perechi de baze azotate ( bp) i comparat cu un martor de greutate molecular. Acestei analize i se poate aduga evidenierea perezenei anumitor situsuri de restricie, prin digestia ampliconului cu endonucleaze de restricie . Identificarea prodului PCR se poate face i prin hibridizarea lui cu o sond specific sau prin secveniere. Optimizarea parametrilor reaciei PCR este de cea mai mare importan pentru sensibilitatea si specificitatea reaciei.

35

2.Componentele reaciei:
2.1. Matria ADN Proba PCR trebuie s fie un ADN monocatenar sau dublucatenar, liniar sau circular. Puritatea ADN folosit ca matri reprezint un factor deosebit de important ( o prob infectat cu cantiti mari de ARN va dispune de o activitate sczut a ADN polimerazei n reacie , ARN fiind rspunztor de chelatarea ionilor de Mg 2+ ). Cantitile recomandate pentru o reacie PCR sunt: maximum 500 ng pentru ADN genomic uman, 1-10 ng pentru ADN bacterian i 0,1-1 ng ADN plasmidial. 2.2. Primeri oligonucleotidici

In general dimensiunea primerilor utilizai n reaciile PCR este cuprins ntre 15-30 nucleotide ( folosirea unor primeri mai lungi de 30 nucleotide duce la creterea specificitii). De regulprimerii sunt cinstituiti astfel nct s aib complementaritate perfect sau aproape perfect cu capetele 5 i repspectiv 3 a matriei de ADN. Este recomandat ca primerii s aib un procent molar de citozin ( C) + guanin ( G) cuprins ntre 40-60% i s aib o distribuie echilibrat a celor patru baze. Primerii nu trebuie sa fie complementari ntre ei ( pentru a nu dimeriza), s nu prezinte secvene cu complementaritate intracatenar ( s nu formeze structuri secundare interne) i s aib valori ale Tm ( temperatura de topire) identice sau foarte apropiate. Se recomand ca cei doi primeri s aib Tm cuprins ntre 55-65 oC ( pentru creterea specificitii se impun temperaturi de ataare ridicate: 62-65o C) Concentraia optim de primer e cuprins ntre 0,1 i 0,6 M. Concentraii prea mari de primer duc la obinerea produilor nedorii. 2.3. ADN polimerazele termostabile

Iniial, pentru reacia PCR s-a utilizat fragmentul mare al ADN polimerazei I de la Escherichia coli fragmentul Klenow. Marele avantaj al acestei enzime ers faptul ca se
36

inactiva la temperaturile ridicate ale etapei de denaturare. Ca urmare, la fiecare ciclu de replicare trebuia adugat o nou cantitate de enzim n tubul de reacie. In prezent toate reaciile PCR folosesc ADN polimerazele termostabile derivate ( n urma manipulrii genetice) de la variantele naturale, izolate din microorganisme termofile. Cantitatea optim de polimeraz utilizat este cuprins ntre 0,5-2,5 uniti / 50 l volum de reacie. ADN polimerazele ADN dependente termostabile se mpart n mai multe clase:

1. a.

Clasa Taq Taq polimeraza -izolat din microorganismul Thermus aquaticus. Temperatura

optima de activitate este de 75-78 oC, iar la temperaturi de peste 90oC, activitatea sa scade semnificativ. Polimerizeaz cu o vitez de aproximativ 150 nc/ secund. Are o activitate de polimerizare ( n direcia 5 3 ) i exonucleazic n aceeai direcie. Este ns lipsit de activitate exonucleazic n direcia 35, responsabil de citirea i ncorporarea corect a dNTP ( nu are activate proofreading). Reacia PCR mediat de aceast enzim are loc n trei trepte ( ataarea primerilor i polimerizarea au loc la trepte diferite de temperatur). b. Ampli-Taq ADN polimeraza recombinant obinut prin exprimarea unei forme modificate a genei de Taq pot din E.coli. Se activeaz la temperatura de 55-75 0C ( proprietate ce determin simplificarea reaciei PCR de la trei trepte de temperatur la dou trepte ). Are o stabilitate mult mai mare la temperaturi de peste 90 oC i prezint n plus activitate exonucleazic 35 ( crete specificitatea de ncorporare a nucleotidelor) c. Fragmentul Stoffel este reprezentat de un Ampli-Taq trunchiat la captul N-terminal. Fragmentul excizat find responsabil de activitatea exonucleazic 35, absena lui mrete mult viteza de polimerizare, Temperaturi de polimerizare: 55-60 oC.

37

Este de doua ori mai stabil dect Ampli-Taq i ii pstreaz activitatea optim pe o plaja mare de concentraii de Mg2+. Se utilizeaz n PCR cu dou trepte. 2. a. Clasa Vent i Deep Vent Vent pol izolat din Thermococcus litoralis, bacterie ce triete n izvoarele

marine calde. Temperatura optim : 55-60oC i desfoar ambele tipuri de activitate exonucleazic ( 3 5 i respectiv 53 )

b. c.

Vent pol ( exo)- similar cu Vent pol, dar nu are activitate exonucleazic 53 Deep Vent pol izolat dintr-o tulpin de Pyrococcus, din izvoarele marine calde

de mare adncime. Temperatura optim: 55-60oC i desfoar ambele tipuri de activitate exonucleazic, dar este mai rezinstent dect Vent pol i Ampli Taq pol la temperaturi mai mari de 100oC. d. 3. Deep Vent Pol ( exo) similar cu DEP Vent pol, dar nu prezint activitate Clasa ADN polimerazelor ambivalente termostabile exonucleazic 53. rTth pol ADN polimeraz recombinant. Caracterul ambivalent const n faptul c poate fi folosit ca ADN polimeraz ARN dependent n prezena MnCl 2, dup care, prin chelaterea ionilor de Mn2+ i adugarea MgCl2, poate aciona ca ADN polimeraz ADN dependent. Cantitatea optim de enzim utilizat ntr-o reacie PCR este de 0,52,5 uniti/ 50l volum de reacie. Cantiti crescute de enzim sau timpi prelungii de polimerizare pot genera artefacte, datorit activitii exonucleazice 53 a Taq pol. 2.4. Deoxinucleotid trifosfai ( dNTP)

DNTP ( dATP, dGTP, dCTP, dTTP ) sunt folosii de polimeraz n etapa de elongare a PCR. n amestecul de reacie de introduc cantiti echimoleculare din cele patru tipuri
38

de dNTP ( n caz contar scade fidelitatea ADN polimerazei ). Cantitatea optim utilizat n PCR este de aproximativ 200 m. Concentraii mai mari conduc la reducerea concentraiei de Mg2+ liber, influennd activitatea polimerazei i scade ataarea primerilor. Din acest cauz concentraia lor trebuie corelat cu concentraia de Mg2+.

2.5.

Tamponul de reacie conine : TRIS-HCl, pH=8,3, KCl, MgCl 2, n soluie

Tamponul de reacie

concentrat 10X care trebuie diluat 1:10 ( v/v). Concentraia MgCl 2 are o importan crucial n reacie, ionii de Mg2+ fiind necesari pentru buna funcionare a polimerazei. Ionii de Mg2+ formeaz complexe solubile cu moleculele dNTP pentru a produce substratul propriu-zis recunoscut de adn apolimeraz. Un exces de Mg 2+ va determina ns reducerea fidelitii enzimei, creterea valorii Tm i creterea amplificrilor nespecifice. Concentraia optim intr-o reacie s poat fi optimizat, exist i variante n care tamponul este livrat fr Mg2+, acesta fiind livrat separat. 2.6. Uleiul mineral

In cazul aparatelor fr capac nclzit , un strat de ulei mineral care s acopere amestecul de reacie este necesar, n vederea prevenirii evaporrii volumului de reacie. Orice evaporare determin o cocentrare a componentelor PCR i o descretere a temperaturii.

3. Detectarea produilor PCR

39

Cea mai utilizat metod de detecie este electroforeza n gel de agaroz sau poliacrilamid. Se mai poate utiliza i Southern Blotting ( detectarea i identificarea produilor PCR se realizeaz prin hibridizare cu sinde specifice marcate radioactiv sau neradioacvtiv). Gel electroforeza- este ceam mai simpl metod. Detectarea Produilor PCR se realizeaz pe un gel de agaroz, de concentraie diferit n funcie de lungimea fragmentului de amplificat. Gelul va fi marcat cu bromur de etidiu, un colorant fluorecent ce se intercaleaz ntre perechile de baze ale ADN i favorizeaz vizualizarea benzilor carecateristice ampliconilor ( sub aciunea UV). De asemenea, pe gel se incarc i un marker de greutate molecular ( pentru identificarea fragmentului de interes), ct i martorii pozitivi i negativi. De obicei, pentru vizulaizarea produilor de amplificare este suficient agaroza cu rezoluie standard . Pentru evidenierea produilor mici se folosesc ns geluri de agaroz de nalt rezoluie. 3.1. Contaminarea i evitarea contaminrii n reaia PCR

Poteniale surse de contaminare : probe biologice ( alt ADN ), metoda de colectare a probei, manipularea probei de mai multe persoane, utilizarea de reactivi i instrumentarul de laborator ( tuburi de reacie, pipete, tipsuri, termocycler, autoclav, centrifugi, ghea, etc) contaminat, mediu de laborator sau aer condiionat. Este important s se realizeze controlul pozitiv i negativ pentru fiecare reacie PCR efectuat. Prin martori negativi se verific dac reactivi sunt contaminai cu ADN , iar prin martorii pozitivi se verific eficient i specificitatea reaciei PCR. Evitarea contaminrii este un lucru foarte important. Se realizeaz prin utilizareade hote de flux laminar i lamp de UV, utilizarea de mnui, tipsuri cu filtru, utilizarea de

40

pipete diferite pentru mix i prob, reactivii PCR trebuie s fie alicotai pstrai la -20oC, orice material ce poate fi autoclavat trebuie sterilizat corespunztor. Alte procedee de decontaminare : iradierea UV, tratamentul enzimatic,uracil Nglicolaza. Tratamentul cu UV ADN din tuburile PCR contaminate este degradat cu formarea dimerilor de timin ( form neamplificabil ). Susceptibilitatea ADN de a fi distrus de radiaii depinde i de: coninutul n pirimidine ( n special timin ), lungimea intei ADN , timpul de iradiere, lungimea de und, energia. Tratamentul enzimatic se realizeaz cu DNA-ze i enzime de restrsicie care au situsuri de recunoatere n inta ADN. Acest lucru are ca dezavantaj introducerea de noi pai n reacia PCR, ceea ce coduce la risculo crescut de contaminare i scderea eficienei reaciei PCR. Uracil N-glicozilaza (UNG) - utilizat pentru decontaminarea reaciilor PCR naintea realizrii ciclurilor termice. dUTP se ndeprteaz prin digestia enzimatic cu uracil N-glicozilaz, ce se adaug la mix ( fr Taq ). Atunci cnd reaciile sut realizate n prezena UNG, se elimin eventualiicontaminani din reaciile anterioare, ce conin uracil in molecul. Metoda nu e utilizat pentru toate polimerazele, deoarece nu toate ncorporeaz dUTP att de eficient ca Taq polimeraza. 3.2. Probleme ce apar n reaciile PCR a. Nici un produs nu este identificat sau este slab amplificat Cauze posibile: - reactie dezechilibrat se recomand recalcularea concentraiilor finale a componentelor PCR - ciclurile de amplificare se recomand revederea programului PCR sau creterea numrului de cicluri - concentraia mic de matri se recomand creterea concentraiei i verificarea

41

ei din punct de vedere calitativ - concentraia primerilor sau secvena lor se recomand optimizarea concentraiei. Verificarea secvenei iar dac e necesar reconstruirea lui - mix de reacie degradat sau incomplet se reacomand realizarea de controale pozitive pentru verificarea diecrui component - temperatura de hibridizare prea mare se recomand reacalcularea Tm a primerilor i descreterea temperaturii de hibridizare - temperatura de denaturare subotimal se recomand optimizarea temperaturii de denaturare i durata acestei etape - timp de extensie suboptimal se recomand creterea cu un minut a timpului de extensie. b. Trene ( Smiruri ) Cauze posibile i recomandri : - amplificri nespecifice se recomand verificarea concentraiilor i a cilurilor de amplificare, optimizarea magneziului i a primerilor, descreterea numrului de cicluri, verificarea matriei, utilizarea procedeului hot start c.Produi multimpli Cauze posibile i recomandri : - numr mare de cicluri se recomand scderea numrului de ciluri - temperatur de hibridizare prea joas se recomand creterea temperaturii de hibridizare 3.3. Specificitatea reaciei

Condiii ce favorizeaz creterea specificitii : scderea cantitii de Mg2+, dNTP, Taq ADN polimeraza, primeri; scderea numrului de cicluri i scurtarea duratei

42

etapelor ciclurilor; cresterea temperaturii de specificitate ; creterea vitezei de ramp ; utilizarea de hot-star PCR , nested-PCR i touchdown PCR. Specificitatea orocrei reacii PCR depinde de specificitatea de legare a primerilor la matri, iar reaciile se standardizeaz astefel nct s se evite pstrarea mixului mai mult dect este necesar, pn la introducerea n Temal Cycler. 3.4. Variante de PCR

3.4.1.Hot start PCR este o metod prin care se separ unul sau mai multe componenete ale reaciei, astfel nct toi compuii ce iau parte la reacie sa ia contact abia dup denaturarea matriei. Se realizeaz separarea fizic a componentelor, cu ajutorul unui material ce funcioneaz ca o barier iniial, dar care se topete odata cu creterea temperaturii, ceea ce duce la amestecul tuturor componentelor reaciei la punctul START. Avantaj : se minimizeaz hibridizarea primerilor la inte nespecifice i se reduce obinerea oligomerilor de primeri. 3.4.2. Touchdown PCR temperatura de hibridizare este sczut progresiv n timpul ciclurilor de reacie, de la o valoare iniial mai mare dect a TM, pn la o valoare inferioar acestuia. Acest lucru ncurajeaz hibridizarea optim a primerilor la secvena int, iar ampliconii urmrii se vor acumula naintea altor produi nespecifici. 3.4.3. Invers PCR utilizat pentru amplificareaunor segmente de ADN cu secven necunoscut ( ex: situsurile n care se inser traspozomii sau genomul unor virusuri) . Secvena de ADN cunoscut ( ncadrat de secvene necunoscute ) se selecioneaz cu endonucleaze. Molecula se circularizeaz i se introduce n PCR cu primeri complementari secvenei cunoscute. Se obine secvena necunoscut.

43

3.4.4. Multiplex PCR- n reacie se introduce mai mult de o pereche de primeri, cu scopul de a detecta mai multe inte 3.4.5. Real time PCR sinteza ADN este detectat pe msur ce se produce. Cea mai simpl metod folosete un colorant care , prin legare la ADN dublu catenar, emite fluorencen proporional cu cantitatea de PCR acumulat. Avantaje : nu necesit metode de detecie suplimentar, aceasta avnd loc direct n tubul de reacie; se reduc ansele de contaminare ; se reduce durata experimentului. 3.4.6. RT-PCR permite amplificarea ARN cu o etap suplimentar de revers transcriere de la ARN la ADN complementar ( ADNc). Pentru sinteza primei catene de 3.4.7. ADNc se pot folosi: primeri ,, random , un primer complementar cu secvena ARN , primeri oligo(dT) care hibridizeaz pe secvena poli (A) de la captul 3. Polimerizarea se realizeaz cu ajutorul unei reverstranscriptaze : rTth ADN polimeraz ambivalent ; AMV ( Avian Myeloblastosis Virus ) are activitate endonucleazic i se 3.4.8. utilizeaz n scopul obinerii de fragmente mici de ADNc ; MMLV ( Maloney Murine Leukemia Virus ) - este lipsit de activitate endonucleazic i se utilizeaz pentru sinteza moleculelor mari de ADNc. Reacia are loc la temperatura ce poate fi ajustat la o valoare ntre 37 oC i 55 oC ( n funcie de revers-trabscriptaza utilizat ), n timp de 30 minute i este urmat de o reacie obinuit de PCR. Aplicaii : se analizeaz ARN mesager i virusuri ARN. 4. Aplicaii ale tehnologiei PCR Multe tehnici biochimice i genetice se bazeaz pe PCR, pentru c de cele mai multe ori probele de ADN de analizat sunt n cantiti insuficiente. Aplicaiile se ncadreaz n dou categorii :

44

4.1. 4.2.

preparative sintez de ADN ( RT-PCR, clonare, sinteza i marcarea sondelor ) analitice diagnosticul unor infecii umane sau a unor boli monogenice ; studii privind mecanisme genetice ce acompaniaz procese maligne sau chiar diagnosticul cancerului; biologia populaiilor; studii de taxonomie, sistematic i filogenie molecular; aplicatii n medicina legal; amplificarea moleculelor de ADN preistoric.

4. Restricia enzimatic
Enzimele de restricie , cunoscute i sub numele de endonucleaze de restricie, sunt responsabile de fenomenul restricie-modificare. Sistemele de restricie i modificare ( metilare) au fost descoperite n urma studiilor interactiilor bacteriofag-bacterie, n care s-a constatat c o tulpin bacterian prezint metilaze si endonucleaze care au aceeai specificitate de secven ( metilaza va aduga o grupare metil la aceeai secven care este recunoscut de enzimele de restricie , astfelnct n urm metilrii un situs int devine rezistent la restricie ) ( T.Vass, 2001 ). Metilarea reprezint un mecanism de aprare a celulei baxteriene fa de propriile endonucleaze. Endonucleazele de restricie sunt enzime care recunosc secvene de ADN specifice, scurte, legarea fiind urmat de clivare, fie la situsul de recunoatere, fie la o distan oarecare de acesta, n funcie de tipul de enzim.

45

PARTEA EXPERIMENTALA

46

Materiale necesare - amestec dNTP, 10 mM fiecare - Taq ADN polimeraza 5U/l - Tampon pentru PCR 10X - primer fimH1 20pmoli/l - primer fimH2 20pmoli/l
47

- ap ultrapur steril - lizat termic ( ADN) - vrfuri albe i galbene cu/fr filtru pentru pipete ( sterile) - tuburi Eppendorf de 0,2 , 1,5ml ( sterile) - ghea i cutii pentru ghea - stative pentru tuburi Eppendorf - hrtie prosop Aparatur: - pipete automate P10, P20, P200 ( dedicate celor dou arii de lucru) - aparat termocycler cu capac inclzit - microcentrifug - vortex - hota cu flux laminar - frigider - congelator Mod de lucru : A. Prepararea master mixului: Se lucreaz n spaiu special ADN free, cu echipamente dedicate camerei respective Se schimb vrfurile de pipet dup adugarea fiecrui reactiv 1. se decongeleaz urmtorii reactivi, pstrndu-i n ghea: - tamponul pentru PCR - amestecul de dNTP - perechea de primeri fimH1/fimH2 2. se pregtete pe un stativ 1 tub Eppendorf de 1,5 ml i 4 tuburi de 0,2 ml.; se noteaz pe capac cu M 3. pentru a efectua n paralel cele n reacii PCR, se prepar n tubul de 1,5ml

48

(notat M) un amestec ( master mix) adaugnd volumele calculate de ap, tampon, dNTP, primeri i Taq ADN polimeraza. Volumele corespunztoare se calculeaz pentru n+1 reacii. Pentru o reacie este nevoie de volumele indicate in tabelul de mai jos: Tabelul 1: Cantiti de reactani pentru PCR ntr-un volum final de 50 l Reactiv (concentraie iniial) Ap ultrapur tampon pentru pcr 10x amestec dNTP ( 10mM) primer fimH1 ( 20pmoli/l) primer fimH2 ( 20pmoli/l) Taq ADN polimeraza ( 5U/l) Volum ( l) 30,7 5 1 1,5 1,5 0,3 Concentraie final 1x 0,2 mM 30 pmoli 30 pmoli 1,5 U

4. amestecul se vortexeaz scurt, apoi se centrifugheaz scurt 5. folosind un singur vrf de pipet se distribuie cte 40l din acest amestec n cele 4 tuburi de 0,2. B. Adugarea ADN Se transfer tuburile n spaiul seprat de cel n care s-a preparat master mixul. 1. Folosind pipeta dedicat acestei arii i vrfuri de pipet diferite se adaug n Tuburi. 2. Se centrifugheaz scurt toate tuburile i se pun n ghea pn cnd se introduc n maina PCR C. Amplificarea

49

1. Se pornete maina de PCR. Se verific programul de amplificare: Programul de amplificare: 1 ciclu: 25 cicluri: 94oC - minute 94oC- 30 secunde 60oC- 30secunde 72oC- 1 minut 2. 3. Dup ce se verific ca sunt bine nchise, tuburile se pun n maina i se pornete programul de amplificare . Dup terminarea programului, tuburile se scot pe ghea i se pstreaz la +4oC pn la verificarea produilor de amplificare.

1. PCR pentru enterovirusuri non-polio

Descriere: Metoda RT-PCR ( Reverstranscription-Polymerization Chain Reaction) Const n conversia ARN n ADN complementar ( ADNc) n prezena unei reverstranscriptaze i amplificare enzimatic n regiunea genomic VP1-2A. Probe: Suspensie materii fecale, LCr ( lichid cefalorahidian), alte produse patologice specifice, supernatant cultur celular) Condiii de transport: + 4oC, condiii de securitate conform normelor n viguare. Se lucreaz la cteva ore de la recoltare sau dup stocare la -20oC. Controlul reaciei PCR: se face introducnd n sistem doi martori : un martor negativ i un martor pozitiv. Ca martor negativ se introduce apa n loc de ARN. Scopul acestui martor este de a detecta contaminrile din timpul lucrului sau potenialele contaminri ale reactivilor. Martorul pozitiv conine ARN extras din enterovirusuri; prin compararea probelor cu martorul pozitiv se confirm sau infirm prezena virusului n proba analizat.

50

2. Extractie ARN viral ( protocol adaptat dupa kit-ul de extracie Qiagen) Se lucreaz la hota cu flux laminar destinat acizilor nucleici pentru a evita . contaminarea probei i a pentru a proteja operatorul de o potenial infectare cu agenii patogeni din prob. Principiul metodei: Extracia ARN are la baz o serie de proceduri care vizeaz dezorganizarea virionului i separarea materialului genetic de celelalte componente ale virionului. Etapele extraciei: a. Dezorganizarea structurii virionilor n acest scop se utilizeaz tamponul de liz AVL. Acest tampon conine ageni caotropici care denatureaz proteinele virale de nveli i deorganizeaz capsida. Deasemenea tamponul conine un inhibitor de ribonucleaz ( previne degradarea enzimatic a ARN) i un carrier care leag ARN. b. Precipitarea ARN Se realizeaz cu etanol 96% c. Fixarea ARN pe coloana de separare Fixarea se realizeaz prin intermediul carrier-ului coninut n AVL

d. splarea coloanei Are ca scop ndeprtarea celorlalte componenete din amestec provenite din materialul biologic. Se efectueaz cu tampoanele AWI i AW2 e. Eluarea ARN Eluarea ARN este etapa n care ARN este desprins din coloan i reluat sub form pur n tamponul AVE. Materiale necesare:

51

- kit(Qiagen) destinat exraciei ARN ( QlAamp viral RNA mini kit cat nr. 52906) - vrfuri: 200-1000 l - tuburi Eppendorf: 1,5 ml - mnui de unic folosin - dezinfectant - stativ pentru tuburi Eppendorf - pipete automate - frizet - vas pentru dezinfectat Aparatura : - hot cu flux laminar - vortex - minicentrifug Mod de lucru: a. b. c. d. se pipeteaz 560l tampon AVL ntr-un tub Eppendorf 1,5 ml se pipeteaz n tub 140l supernatant cultur celular i se vortexeaz se incubeaz la temperatura camerei timp de 10 minute se pipeteaz 560l etanol 96-100% i se vortexeaz timp de 15 secunde

e.

din tub se reiau 630l amestec i se introduc n coloana de extracie ( care a

fost fixat intr-un tub de colectare de 2 ml); se centrifugheaz la 6000g ( 8000rpm). Se fixeaz coloana intr0un tub nou de colectare f. g. se repeta punctul e coloana se spal cu 500 l tampon AW2 i se centrifugheaz la 20.000g

( 14.000rpm) timp de trei minute i se reia intr-un tub de colecie nou i se centrifugheaz 1 minut la 20.000rpm , pentru eliminarea completa a tamponului AW20

52

h. la 6000g

coloana este trasferat intr-un tub steril de 1,5 ml i arn este eluat cu 50 l

tampon AVE. Se incubeaz la temperatura camerei timp de un minut. Se centrifigheaz

3. Reverstranscriere pentru originea genomica VP1-2A Principiul metodei: Reverstranscrierea reprezint transcrierea unei matrie de ARN sub forma ADN. Procesul se ntlnete n natura la retrovirusuri i st la baza tehnicii RT-PCR. Pentru reverstranscriere se folosesc enzime ( reverstranscriptaze) produse de microorganisme recombinate ( n genomul microorganismului a fost introdus gena viral care codific pentru reverstranscriptaz). Reverstranscrierea necesit: o reverstranscriptaz ( exemplu: M-MLV: MoloneyMurine Leukemia Virus Reverse Transcriptase) i un primer ( primer =amorsa, oligodeoxinucleoid; fragment sintetic de ADN de la care ncepe reverstranscrierea). In tehnica RT-PCR, reverstranscrierea se face n dou etape succesive: RT-1: n acest etap primer-ul se leag la matria ARN prin complementaritate. Procesul se numete,, anneling ( hibridizare) RT-2: reverstranscriptaza sintetizeaz o caten de ARN complementar matriei ARN. Procesul se numete ,, elongation ( elongare) Materiale necesare: - inhibitor de RN-aza( Promega RNAsin 40U/l); 20 U per prob ( 0,5 l) - primeri EUC2a, EUC2b; 20 pmoli per prob din fiecare primer ( 2l) - dNTP mix ( dGTP, dCTP, dATP, dTTP) ; 10 milimoli per prob ( 1l mix) - reverstranscriptaza ( M-MLV Promega) ; 200 U per prob ( 1l) - tampon reverstranscriptaza concentrat 5X ( 4l)
53

- ap distilat steril - vrfuri cu filtru 0,5-10l - vrfuri cu filtru 2-20l - vrfuri cu filtru 20-200 l - tuburi Eppendorf 0,2 ml - tuburi Eppendorf 0,5 ml - mnui de unic utilizare - stativ pentru Eppendorf - frizet - pahar Berzelius pentru deeuri - dezinfectant - ghea Aparatura: -hot cu flux laminar, vortex, minicentrifug de mas, main PCR, pipet automat, main de gheat, congelator, frigider. 4. Reacia PCR pentru regiunea genomic VP1-2A Principiul metodei: Reacia PCR const in replicarea unei matrie ADN cu ajutorul ADN polimerazelor izolate din microorganisme termofile este necesar datorit faptului c reacia PCR implic utilizare unor valori nalte de temperaturi care ar denatura polimerazele obinuite. Etapele reaciei: Denaturarea n acest etap se realizeaz desfacerea duplexului ADN ( trecerea din forma bicatenar n forma monocatenar ) . Procesul se realizeaz la temperaturi apropiate de valoarea 90oC.
54

 Alinierea primerilor ( hibridizare) Taq polimeraza necesit fragmente scurte de ADN ( oligonucleotide ). complementare cu ADN int, de la care s se inceap sinteza. Alinierea primerilor la catena matri se face prin complementaritate. Hibridizarea are loc la temperaturi in jurul valorii de 50oC. Extensia Extensia reprezint polimerizarea deoxinucleotideloraflate n amestecul de reacie prin aciunea ADN polimerazei. Pentru sinteza catenei noi, polimeraza ,, aplic principiul complemetaritii utiliznd catena matri. Extensia are loc la aproximativ 70oC. Materiale necesare: - apa distilat steril - tampon Taq polimeraza concentrat 10X; 5 l /prob - dNTP mix ( dGTP, dCTP, dATP, dTTP ) ; 10 mM per reacie pentru fiecare deoxinucleotid ( 1l ) - Taq polimeraza ( Q-BIOgene ); 1,25 U/ prob - Primeri: EUG2, EUG3a, EUG3b, EUG3c ; 5 picomoli/prob din fiecare primer ( 0,5 l) - MgCl2 25 mM ; 2 mM/ prob ( 4 l) - Vrfuri cu filtru 5. Electroforeza n gel de agaroz Principiul metodei: Electroforeza reprezint micarea dirijat a moleculelor ncrcate electric sub aciunea unui cmp electric continuu.

55

Direcia de deplasare a moleculelor este disctat de sarcina electric total a acestora; moleculele cu sarcina electric pozitiv vor migra ctre catod ( polul negativ), iar moleculele cu sarcin electric negativ total vor migra spre anod ( polul pozitiv). Viteza de migrare a particulelor este determinat att de sarcina electric ct si de masa lor molecular, moleculele cu masa molecular mai mic vor migra mai repede dect moleculele care au masa molecular mai mare dar sunt ncrcate cu aceeai sarcin electric. Acizii nucleici ( ADN i ARN ) sunt ncrcai cu sarcini electrice negative datorit grupelor fosfat ionizate, n consecin ei vor migra de la polul negativ catre polul pozitiv. Mediul de migrare este asigurat de gelul de electroforez; gelul este separat prin hidratarea unui polimer natural extras din alge marine ( agaroz). Agaroza este un polimer cu mas molecular mare, cu lanuri liniare i ramificate, alctuite din retsuri de glucoz i derivai ai acestuia. n uram hidratrii agarozei, rezult un gel care prezint o microretea tridimensional prin porii creia se deplaseaz acizii nucleici sub aciunea curentului electric cintinuu. Dimenisunea porilor este direct proporional cu concentraia gelului de agaroz; cretera concentraiei de agaroz favorizeaz deplasarea fragmentelor mai mici de acizi nucleici i reinerea pentru un timp mai ndelungat a fragmentelor mari; acest lucru duce la o mai bun separare a fragmentelor de acizi nucleici. Tamponul de migrare are rolul de a menine sarcina electric negativ a ADN ( datorit pH-ului alcalin) dar i de a nchide circuitul electric. In funcie de mrimea ampliconului se stabilete concentraia gelului de agaroz. Concentraia gelului este invers proporional cu dimensiunea ampliconului. Materiale necesare electroforezei: - agaroz ( polimer natural extras din alege) - tampon TAE ( tris-etilaminhidroximetan, acid acetic, EDTA ) 1 X

56

- bromur de etidiu soluie stoc 10 mg/ml - spatul - vas Erlenmeyer - cilindru gradat - piepten - band adeziv sau dispozitiv pentru fixarea tviei Aparatura: pipete automate, balana de laborator, sistem de electroforez, tvi special pentru formarea godeurilor, cuptor cu microunde Mod de lucru: se fizeaz cu band adeziv capetele libere ale tviei

se cntrete agaroza n funcie de concentraia dorit ( 0,8-2%) . Pentru migrarea ampliconilor obinui prin tehnica prezentat, este necesar o cencentraie de agaroz de 1,5 % se msoar volum de tampon necesar preparrii gelului se nclzete amestecul de agaroz TAE n cuptorul cu microunde pn la obinerea unei soluii transparente se rcete treptat soluia de agaroz ( soluia trebuie s fie la aproximativ 600C) se adaug bromur de etidiu ( 1,25 la 25 ml soluie agaroz ) , se omogenizeaz Si se toarn n tvia n care s-a fixat pieptenul gelul se solidific la temperatura camerei

Incrcarea ampliconilor n gel i migrarea Materiale necesare: - gel pregtit anterior - tanc de electroforez

57

- surs de curent continuu - pipete - vrfuri sterile fr filtru marker de mas molecular ( Promega , 100 pb ) - colorant albastru de bromfenol - parafilm Mod de lucru: se aeaz gelul n tancul de electroforez i se acoper cu TAE 1X pe parafilm se repatizeaz un numr de ,,n picturi molecular n fiecare pictur de colorant se adaug 5 l amplicon i se omogenizeaz cu pipeta prin aspirare se ncarc n godeuri ( se noteaz ordinea ncrcrii probelor) se seteaz parametrii de migrare gelul se vizualizeaz la lumina UV i se forografiaz albastru de

abromfenol; n fiind numarul de ampliconi plus markerul de greutate

Profil electroforectic al regiunii VP1-2A

MK

278 279 280 292 295

370 371
58

MK 374

375 443 476 450 Martor negativ

Amplicon de 1450 pb Concentraie gel de agaroza 1% , tampon de migrare TAE 1X

Concluzii

59

Scopul acestei lucrri a fost evidenierea eficienei sistemului PCR-RFLP, n tiparea celor mai rspndite genotipuri la noi n tar. Probele au fost furnizate de Insitutul de Boli Infecioase ,, Matei Bal au fost supuse restricei enzimatice. Majoritatea probelor aveau profile electroforetice u or de interpretat prin PCR-RFLP. Epidemiologia molecular permite recunoaterea tulpinilor diferite din aceeai specie, provenind din circumstane epidemiologice cariate, pe baza polimorfismului genetic. Dintre mecanismele care determin polimorfismul genetic, mai importante sunt variabilitatea natural determinat de polimeraze (n special ARN polimeraze) i modificrile genetice (deleii, inserii, recombinri, trasnlocaii). Epidemiologia virusurilor s-a imbogit cu o serie de tehnici moleculare noi care permit caracterizarea diferenelor genetice i antigenice ntre diferite izolate. Aceste tehnici recente, fac posibile investigaii privind originea i evoluia tulpinilor, avnd astfel implicaii n prevenirea anumitor boli enterovirale cu importan deosebit pentru sntatea public. Epidemiologia studiat prin tehnici de biologie molecular permite ameliorarea metodelor de diagnostic i terapeutice precum i identificarea unor markeri genomici (de exemplu secvenele din genom care pot fi asociate cu o cretere a virulenei sau cele implicate n modificrile ctre fenotipuri patogene).

BIBLIOGRAFIE

60

1. infections

Colllier L. , Balows A., Sussman. M Microbiology and microbial Edit.Topley and Wilsons, 1998

2. Fields B., Knipe M.D, Howlley P. Virology fourth edition, Lippincott Williams and Wilkins vol.1, ( 2001) 3. Oprisan G. Teza de doctorat : Markeri moleculari utilizabili n ncadrarea taxonomic i caracterizarea enterovirusurilor , 2002 4. Rolfs A., Schuller I., Finckh U., Weber-Rolfs I., : PCR Clinical diagnostics and reseaarch Edit. Springer Laboratory, 1992 5.Rebedea I ,, Boli infecioase edit Medical , Bucureti, 2000 6.SarnbrookJ., Fritsch E.F, Maniatis T. Molecular cloning-a Laboratory manual CSH ( 2000) 7.Vassu T., Stoica L., Csutak O.,Muat F. Genetica microorgansimelor i inginerie genetic microbian , Edit. Petrion, Bucureti 2001 8.Blomqvist S., Bruu A-L.,Stenvik M.,Hovi T. Characterization of a recombinant type 3/type 2 poliovirus isolated from a healthy vaccinee and containing chimeric capsid protein VP1 Journal of General Virology 2003,vol.84,573-580 9.Brown B.,Oberste S.,Maher K.,Pallansch M. Complete genomic sequencing Shows that polioviruses and members of human enterovirus species C are closely Related in the noncapsid codin regionJournal of Virology,vol.77,2003,8973-8984 10.Dove A.W Racaniello V.R. The Polio Eradication Effort:Should Vaccine Eradication Be Next? Science,1997,vol.277,779-780 11.Guillot Sophie. Application a letude de la variabilite genetique des suoshes du VPO.Digestion enzimatique ,2004 12.Hull h. F.,Aylward R. Invited commentary:The Scientific Basis for Stopping Polio Imunization American Journal of Epidemiology,1999,vol.150,1022-1025 13.Lukashev N. A Role of recombination in evolution of enteroviruses Reviews

61

In Medical Virology,2004 14.Masatoshi N.,Sudhir K. Molecular evolution and phylogenetics Edit.Oxford University ress,2000,187-207 15.Sloan K.,Eustace B.,Steward J.,Zehetmeier C.,Torella C., Simeone H., Roy J., Unger C., Louis D., Ilag L., Jay D. CD155/PVR plays a key role in cell motility During tumor cell invasion and migration BMC Cancer,2004,vol.4,73

62