MICROSCOPIA ELECTRONIC Microscopia electronic utilizeaz instrumente de examinare (microscoape electronice) care func ioneaz pe baza unui fascicul

de electroni de nalt energie (accelerai) n scopul examinrii unor detalii de dimensiuni reduse ale obiectelor observate. Dimensiunile relative ale structurilor biologice i sistemele de vizualizare specifice sunt prezentate n figura de mai jos:

Tipuri de microscoape electronice Se descriu, la ora actual, cteva tipuri de microscoape electronice, utile n cercetarea biomedical sau n completarea diagnosticului de laborator: - Microscopul electronic de transmisie (TEM) - Microscopul electronic de baleiaj (SEM) - Microscopul electronic de reflexie (REM) - Microscopul electronic de baleiaj i transmisie (STEM) - Microscopul electronic cu voltaj redus (LVEM) Microscopul electronic se deosebete de cel fotonic prin faptul c utilizeaz ca sistem de examinare un fascicul de electroni emis ntr-un sistem vidat, n locul unui fascicul de fotoni. Scopul acestui tip de microscop este de a produce, asemenea celui fotonic, o imagine mrit a preparatului. Cu toate acestea, microscopul electronic are o putere de rezoluie mai mare dect un microscop fotonic, datorit dependenei acestei puteri de lungimea de und a radiaiei electromagnetice folosite. Electronii au o lungime de und de 100.000 de ori mai mic dect cea a luminii vizibile (fotoni) iar lungimea de und este invers proporional cu puterea de mrire. n plus, cu ct electronii au o vitez mai mare (implicit, cu ct tensiunea de accelerare este mai mare), cu att lungimea de und este mai redus i rezoluia microscopului electronic crescut. Rezoluia microscopului electronic ajunge la circa 0,2 nm i la mriri de circa 2 milioane de ori, n timp ce microscoapele optice obinuite (non-confocale) sunt limitate de fenomenul de difracie la o rezoluie de 200 nm i mriri sub 2000 de ori. Rezoluia TEM este limitat adesea de aberaiile de sfericitate dar noile sisteme

corectoare i tensiunile de alimentare mari au dus la apariia HRTEM (high resolution TEM) care are o rezoluie sub 50 pm i o putere de mrire de circa 50 de milioane de ori. Lentilele utilizate n microscopia electronic sunt electrostatice sau electromagnetice, spre deosebire de microscopia optic, unde lentilele sunt din sticl sau compozite transparente. Lentilele de sticl nu pot influena traiectoria fasciculului de electroni. Formarea imaginii depinde de electronii transmii prin preparat (TEM) sau emii secundar de ctre acesta (SEM). Informaii obinute cu ajutorul microscopiei electronice Informaiile care se pot obine cu ajutorul microscoapelor electronice se refer la ultrastructura unor probe biologice sau anorganice, care pot cuprinde: microorganisme, celule, molecule mari, fragmente tisulare, metale sau cristale. Aceste informaii pot sublinia: - Topografia - caracteristicile de suprafa ale unui obiect, textura, raportul direct dintre aceste caracteristici i proprietile materialului din care este compus obiectul (duritate, reflectivitate); - Morfologia - forma i/sau dimensiunile componentelor unui obiect, relaia dintre aceste structuri i proprietile materialului din care este compus obiectul (ductilitate, rezisten, reactivitate); - Compoziie - cantitatea i calitile elementelor dintr-un obiect analizat; relaia direct dintre compoziie i proprietile obiectului studiat; - Noiuni cristalografice - modul de distribuie a atomilor i relaia cu proprietile obiectului de studiat. n biologie, scopul declarat al dezvoltrii microscoapelor electronice este de a investiga aspecte ale universului celular, inaccesibile prin examinarea cu ajutorul microscoapelor optice. Astzi, pornind de la principiul dezvoltat de Ernst Rushka i Max Knoll n 1931, putem examina ultrastructura celulelor i chiar a organitelor celulare. n aprilie 2010, la centrul de microscopie de la Universitatea California, LA, SUA a fost publicat prima imagine a unui atom, obinut prin crioelectronomicroscopie, iar posibilitile de explorare ale universului submolecular i chiar subatomic par inepuizabile. Microscopia electronic de transmisie Este o metod de investigaie microscopic n care un fascicul de electroni este transmis printr-un preparat ultrafin, interacionnd cu elementele componente ale preparatului i fiind refocalizat de o serie de lentile, pentru a genera imaginea final, mult mrit, a obiectului de examinat. Microscopul electronic de transmisie (TEM) utilizeaz un fascicul de electroni de nalt energie, emii de un tun electronic care conine un filament de tungsten sau un cristal de hexaborur de lantan (LaB6); filamentul sau cristalul menionate formeaz catodul. Electronii sunt accelerai de un anod, la o diferen de potenial de 100 keV. Traiectoria electronilor este controlat cu ajutorul unor lentile electromagnetice. Electronii sunt direcionai n form de fascicul de ctre lentilele condensor i sunt orientai ctre preparat de ctre lentilele obiectiv. Lentilele de proiecie direcioneaz fasciculul de electroni spre sistemul de formare a imaginii. Acest sistem poate fi reprezentat de o plac fluorescent, o plac fotografic acoperit de emulsie sau un senzor CCD care poate transmite imaginea spre un ecran.

Rezoluia microscopului electronic Rezoluia maxim (rezmax) pe care o poate atinge un microscop fotonic este limitat de lungimea de und a fotonilor () i de apertura numeric a sistemului optic (NA). rez max 2n sin 2 NA Apertura numeric (NA) a unui sistem optic reprezint o mrime adimensional care caracterizeaz limita unghiului sub care acel sistem optic poate accepta sau emite lumin. NA = n*sin, unde este semi-unghiul conului maxim de lumin emis sau acceptat de o lentil (sistem optic). Lungimea de und a fotonilor este mult mai mare dect a electronilor i astfel, invers proporional, rezoluia maxim a unui microscop electronic este mult mai mare dect a unuia fotonic. Lungimea de und a fasciculului de electroni nu reprezint un factor limitant al rezoluiei TEM, deoarece aceast lungime de und este funcie de energia electronilor i implicit de tensiunea de accelerare (ex. o rezoluie de 2 pm se obine la o tensiune de 300 kV). Cu toate acestea, aberaiile de sfericitate (care produc curbarea mai puternic a frontului de und la marginea lentilelor fa de axul optic), cromatice sau de astigmatism ale lentilelor electromagnetice i instabilitatea curenilor care le strbat limiteaz rezoluia la 50 pm chiar i pentru cele mai scumpe TEM. Prile componente ale unui microscop electronic Un TEM include - o surs de emisie pentru electroni (tun electronic plus surs de alimentare), o coloan care include lentile electromagnetice i plci electrostatice, o camer a preparatului i o camer de examinare. Toate aceste sisteme sunt situate ntr-un vid nalt, generat de un sistem special de vidare. Lentilele i plcile sunt necesare manipulrii i ghidrii fasciculului de electroni. n plus, un sistem ecluz i un dispozitiv special permite inseria, amplasarea sau ndeprtarea preparatului n axul optic al microscopului. Ataate microscopului se regsesc sistemele electronice de formare sau amplificare a calitii imaginii (camer video lateral sau de fund, sistem de augmentare a contrastului, sisteme de imprimare a imaginii).

Schem de funcionare a microscopului electronic de transmisie

Prile componente ale microscopului electronic de transmisie Philips CM100 din dotarea disciplinei de Biologie Celul ar i foarte Molecular Iai -tun de electroni; -Sistem de vidare (pompe); -lentile electromagnetice i aperturi; -camera probei, cu sistem de ecluz pentru vidare; ,- panouri de control (5 - pentru aliniere, 6 - pentru mrire i focalizare); -ecran pentru afiarea imaginii captate de camera CCD; -camera de observaie cu ecran fluorescent

Toate prile componente ale TEM n care circul electronii (de la filament la sistemul de observaie din camera de formare a imaginii) sunt dispuse n interiorul sistemului care genereaz un vid nalt. Tunul electronic (sursa de electroni) este format din: - filament (catod) - circuit de polarizare - cilindru Wenhelt (se citete "venelt") - anod de extracie Sursa de electroni, reprezentat de filamentul de tungsten sau de cristalul de hexaborur de lantan (sau de ceriu) (catodul), nclzite de un circuit special. Sursa de tensiune, de voltaj nalt, de obicei de 100-300 kV, alimenteaz anodul i catodul. n plus, exist un circuit electric suplimentar pentru nclzirea filamentului. Creterea curentului care trece prin filament duce la o saturaie a curbei de emisie a electronilor. Pentru prelungirea duratei de exploatare a filamentului, trebuie s existe un echilibru ntre nclzirea filamentului i tensiunea de accelerare. Sistemul de extracie/filtrare a electronilor - cilindrul Wenhelt. Acesta este format dintr-un circuit de polarizare cuplat la o diferen de potenial de numai cteva sute de voli fa de filament (catod). Este util pentru focalizarea i controlul fasciculului de electroni. A fost inventat n 1902, de ctre fizicianul german Arthur Rudolph Berthold Wenhelt. Are rolul de a nu permite dispersia electronilor emii de filament. Sistemul de accelerare a electronilor - anodul. Este format dintr-o plac de metal, perforat, ncrcat pozitiv.

Funcionarea sursei de electroni. Filamentul (sau cristalul) genereaz electroni prin fenomenul de emisie termoionic (efect Edison) sau prin emisie electronic asistat de cmp, n mediu vidat. Prin emisie termoionic, electronii sunt emii de filamentul nclzit printr-un circuit electric separat. Curentul care traverseaz filamentul controleaz temperatura acestuia (optim 2500K) i implicit numrul de electroni emii. n general, avem nevoie de un numr mare de electroni emii de o regiune ngust a filamentului; putem obine acest efect prin "saturarea" filamentului, implicit creterea curentului n filament pn la un prag limit (unde numrul de electroni emii rmne constant) Electronii sunt emii cu o anumita vitez, ctigat prin ciocniri cu atomii care au o agitaie violent datorat temperaturii generate de alimentarea filamentului (catod). O parte mic din aceti electroni ating anodul chiar in lipsa unui cmp electric aplicat. Electronii sunt apoi extrai i selectai cu ajutorul cilindrului Wenhelt, accelerai i focalizai cu ajutorul anodului. Circuitul de polarizare

controleaz dimensiunea regiunii de filament care emite electroni. Dac polarizarea este prea mare, nu exist emisie de electroni. Variaia curentului de polarizare influeneaz iluminarea probei. Orificiul specific al anodului emite un fascicul divergent de electroni. Electronii de energie nalt permit examinarea unor probe cu grosimi mai mari, dar determin i afectarea probei. Lentilele electromagnetice au rolul de a focaliza razele paralele la o anumit distan focal. TEM utilizeaz lentile electromagnetice pe baz de solenoizi (bobine) care formeaz lentile convexe. Cmpul electromagnetic generat de aceste lentile trebuie s fie simetric radial, n caz contrar aprnd aberaii de sfericitate, cromatice sau astigmatism. Lentilele sunt alctuite din fier, fier-cobalt i aliaje nichel-cobalt cum ar fi permalloy-ul. Lentilele TEM sunt dispuse pe 3 nivele - condensor, obiectiv, proiector: - lentilele condensor au rolul de a forma fasciculul primar de electroni; - lentilele obiectiv au rolul de a focaliza fasciculul de electroni dup trecerea prin preparat; - lentilele proiector au rolul de a proiecta fasciculul care provine de la lentilele obiectiv pe ecranul fluorescent sau pe senzorul CCD. Lentilele posed i un sistem de rcire bine calibrat care disip cldura format n timpul utilizrii. n plus fa de lentile, coloana TEM mai include plci metalice inelare (aperturi) care au rolul de a exclude electronii care sunt mai ndeprtai de o anumit distan fa de axul optic. Aceste plci sunt practic formate din discuri mici, metalice, cu orificiu central, care sunt suficient de groase pentru a mpiedica trecerea electronilor prin disc n timp ce trecerea electronilor axiali este permis. Aperturile au rolul de a reduce intensitatea fasciculului de electroni precum i filtrarea electronilor mprtiai sub unghiuri mari prin procese determinate de aberaii cromatice sau de sfericitate. Ajustarea lentilelor electromagnetice astfel nct planul imaginii este nlocuit cu planul focal posterior determin obinerea unui spectru de difracie pe sistemul de formare a imaginii. Probele cristaline formeaz o imagine cu un spectru multipunct n timp ce probele policristaline sau amorfe genereaz un spectru de difracie inelar.

Spectru de difracie cristalin pentru o granul de oel austenitic

Formarea imaginii pentru TEM depinde de modul de operare. n modul de operare obinuit (cmp luminos), formarea contrastului este clasic, prin obstruarea sau

absorbia electronilor n prob. Zonele mai groase ale preparatului sau zonele cu atomi mai grei vor aprea ntunecate, n timp ce zonele fr preparat apar luminoase, de unde i denumirea de "cmp luminos". Imaginea final reprezint o proiecie bidimensional a probei de-a lungul axului optic. Microscopia electronic de baleiaj Microscopia electronic de baleiaj se distinge de TEM prin faptul c analizeaz fasciculul de electroni emii de preparat, n urma impactului cu electronii primari emii de surs. Electronii de nalt energie emii de surs baleiaz suprafaa probei dup un model prestabilit (de la stnga la dreapta i de sus n jos). Electronii primari interac ioneaz cu nucleii i electronii atomilor din prob. Aceste interac iuni genereaz mai multe tipuri de semnale: electroni secundari (cei care sunt analizai i care formeaz imaginea, electroni de retrodifuzie, electroni Auger, radiaii X, luminiscen de catod. Structura SEM: 1. Sursa de electroni (tunul electronic) care accelereaz electronii n coloana microscopului. 2. Lentile electromagnetice (condensor i obiectiv) care pot controla diametrul fasciculului de electroni i l pot focaliza pe preparat. 3. Aperturi (filme metalice cu orificii punctiforme) care filtreaz electronii deflectai sau cu un unghi incident prea mare. 4. Sistem de control al poziiei probei (deplasri n plan orizontal, balans, rotaie) 5. O suprafa de interaciune ntre fascicul i prob care genereaz semnalele menionate mai sus. Aceste semnale produc imagini sau spectre. 6. Toate elementele menionate sunt meninute n vid de diferite niveluri (vidul din coloana superioar este mai nalt dect n camera probei). Rezoluia SEM la ora actual este de 0,4 nm pentru microscoapele industriale (voltaj nalt - 30kV) i de 0,9 nm pentru microscoapele biologice (Magellan de la FEI) (voltaj redus - 1 kV) Modul de funcionare al SEM - tunul electronic genereaz un flux monocromatic de electroni - fluxul de electroni este condensat de ctre prima lentil condensor; lentila este util pentru formarea fasciculului de electroni ct i pentru limitarea curentului din fascicul - fasciculul de electroni este condiionat de apertura condensorului, eliminnduse astfel electronii care au un unghi incident prea mare - a doua lentil condensor formeaz un fascicul de electroni subire, coerent i controlabil - o a doua apertur condensor filtreaz electronii cu unghi de inciden crescut un set de bobine produc baleierea fasciculului de electroni dup un model prestabilit (de la stnga la dreapta i de sus n jos); viteza de baleiere este reglabil, fasciculul insistnd cteva microsecunde asupra fiecrui punct al probei - lentilele finale - obiectiv - focalizeaz fasciculul de electroni n zona dorit de la suprafaa probei - cnd fasciculul de electroni atinge proba, sunt produse semnalele menionate mai sus (electroni secundari, de retrodifuzie, radiaii X etc)

sistemele de detecie interpreteaz semnalele emergente i formeaz imaginea sau dau alte date analitice procesul de formare a imaginii dureaz 30-60 sec.

Schem de funcionare a SEM

Granule de polen, imagine SEM