PRUEBAS BIOQUIMICAS DE IDENTIFICACIN BACTERIANA(INFORME)2004

INTRODUCCIN Los microorganismos a diferencia de las plantas no son capaces de crear materiaorgnica a partir de elementos inorgnicos, por eso, han de nutrirse a expensa del medioen que se encuentren, y de ah que en el interior de estos ocurran una serie de reaccionesde sntesis y de descomposicin de sustancias orgnicas, las cuales reciben el nombre demetabolismo.A partir de estas caractersticas metablicas se realizan pruebas obtenidas para laidentificacin de microorganismos y productos obtenidos de la relacin microorganismo-medio.Otro de los aspectos importantes de la realizacin de estas pruebas, es que a partir deestas ayudan a dar una respuesta ante la posible contaminacin de los alimentos pormedio de microorganismos patgenos. Las tcnicas de bioqumica han proporcionado unaherramienta til para la deteccin directa de los microorganismos contaminantes.La identificacin bacteriana se puede realizar por medio de una serie de anlisis quenecesitan de diferentes cultivos y procedimientos para llegar a identificar las especiesbacterianas que contaminan los alimentos o las aguas.A continuacin, se desarrollan diferentes tcnicas para la identificacin de algunosmicroorganismos y productos obtenidos en la relacin ya mencionada, microorganismo-medio.

OBJETIVOSOBJETIVOGENERALES Realizar y analizar las diferentes tcnicas de identificacin bacteriana. OBJETIVOS ESPECIFICOS Caracterizar en cada medio de cultivo el fundamento de la tcnica empleada. Analizar los respectivos resultados y por medio de estos hacer una previainterpretacin.

1. TEORA RELACIONADA Metabolismo Bacteriano La capacidad de utilizar y transformar la energa es una de las propiedadesfundamentales de los sistemas vivientes. La energa puede hallarse en muchas formas,pero aprovechables a los organismos vivos solo muy pocas. La energa mecnica selibera, por ejemplo, durante movimiento celular, agitacin de cilios y flagelos, y lasalteraciones de la forma celular; la energa electromagntica se encuentra en forma deradiaciones (la luz es la fuente de energa primaria para los organismos sintticos comolas algas y las plantas), la energa trmica es producida por la agitacin molecular y, laenerga qumica que es la contenida en los enlaces de sustancias y puede ser liberadade los compuestos orgnicos e inorgnicos a travs de ciertas reacciones. Las reaccionesqumicas son acompaadas por cambios en el nivel energtico. La energa requerida paraque una reaccin inicie se llama energa de activacin.Otros aspectos importantes a considerar es la necesidad de la clula de poseer, ademsde catalizadores, una reserva de energa, esta servir para los procesos de sntesiscelular y en la conversin de sustratos a formar actividades. En la clula ocurre dosimportantes y opuestos procesos, y la generacin de energa y utilizacin de ella en losprocesos de sntesis celular, los cuales constituyen el metabolismo, este es la suma detransformaciones de la materia que ocurre en el interior de las clulas y que da lugar a lasntesis de material celular a partir de sustancias nutritivas.El metabolismo puede dividirse para su mejor estudio en tres aspectos diferentes perontimamente ligados; el catabolismo que es la suma de reacciones exergnicas quepermiten liberar la energa contenida en los nutrientes o sustratos y ser acumuladas enforma de ATP, u otros compuestos, el metabolismo intermedio que es el conjunto dereacciones de los productos de hidrlisis del catabolismo y algunos nutrientes sontransformados en cidos orgnicos, esteres fosfricos y otros compuestos comoaminocidos, y el Anabolismo que es la parte del metabolismo implicado en la sntesis emacromolculas (cidos nucleicos, protenas, sustancias de reserva y otros, todosreacciones endergnicas). EnsayosBioqumicos La identificacin de un aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando diferentescombinaciones de caractersticas y diferentes criterios en la evaluacin de similitudes. Los ensayos bioqumicos tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas bioqumicasconvencionales, generalmente determinan la actividad de una va metablica (conjunto dereacciones qumicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo yque la bacteria al crecer transforma o no.Existen diferentes sistemas que facilitan la realizacin de tales ensayos, porque proponenel mejor conjunto de pruebas bioqumicas para la identificacin de un grupo bacteriano,porque simplifican la interpretacin de un resultado utilizando un valor numrico, porque proveen los reactivos listos para su uso o porque son totalmente automatizables.Las pruebas o ensayos bioqumicos, son pruebas simples que se han desarrollado parademostrar en forma clara una determinada caracterstica bioqumica como presencia oausencia de una determinada actividad enzimtica, grupo de enzimas o determinada vametablica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia deinhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismobacteriano.Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio de cultivo,indicador, revelador, etc.) que puede ser

diferente an para el mismo ensayo si se trata dediferentes microorganismos. Por ejemplo se debe suplir con factores de crecimiento elmedio de cultivo para estudiar la fermentacin de distintos azcares cuando se sabe queel microorganismo en estudio es exigente. A la determinacin de la especie se puedellegar segn diversos sistemas (manuales de identificacin, comerciales, etc.). a) Los comerciales utilizan modificaciones de las pruebas bioqumicas convencionales,ya sea sustratos deshidratados, tiras de papel de filtro impregnadas en reactivos opequeos compartimentos con medios listos para sembrar. En todos los casos seemplean cdigos numricos para la interpretacin de resultados. Los sistemas comerciales ms comnmente usados son: BBL, ENTEROTUBE II (Becton Dickinson). Es un sistema para usar en la identificacinde Enterobacterias, definida como bastones Gram -, aerobios o anaerobios facultativos,oxidasa (-). Consiste en un tubo de plstico con 12 medios de cultivo contenidos encompartimentos individuales que se inoculan simultneamente en una etapa y permiten ladeteccin de 15 caractersticas bioqumicas. OXI/FERM TUBE II, (Becton Dickinson). Es un sistema listo para usar para laidentificacin de bastones gram (-), aerobios o anaerobios facultativos, oxidasa (+).Consiste en un tubo de plstico de 12 medios de cultivo que permite la realizacinsimultnea de 14 pruebas bioqumicas. API 20 E. Es un sistema estandarizado para la identificacin de Bacterias Gram -.Consiste en una plantilla con microtubos conteniendo medios de cultivo deshidratadosque se reconstituyen al agregar una suspensin bacteriana. Permite la realizacin de 23pruebas bioqumicas a partir de una nica colonia bacteriana. Otros sistemas: Quintet 3H de Diagnostics Pasteur para Enterobacterias. API 10S, versin miniaturizada del API 20 E API Listeria API NH (Neisseria - Haemophilus) Existen tambin sistemas de identificacin comerciales para levaduras: API 20 C (Para levaduras del gnero Candida)Auxacolor de Diagnostics PasteurFongiscreen 4H de Diagnostics Pasteur (Para identificacin de levaduras de intersmdico) b) En la Ctedra se desarroll un sistema para la identificacin de Enterobacterias queconsta de nueve pruebas bioqumicas convencionales (SYS 9E). Este sistema identificalas 23 especies ms frecuentemente aisladas de muestras clnicas. Est integrado por lassiguientes pruebas: produccin de H2S en agar triple azcar hierro (TSI), fenilialanina de aminasa, produccin de indol, descarboxilacin de lisina, descarboxilacin de ornitina,crecimiento en citrato, fermentacin de arabinosa, fermentacin de sorbitol y produccinde acetona (VP). En esquema, la realizacin de una prueba bioqumica implica:

1) Cultivar el microorganismo en un medio que contiene un determinado sustrato oinhibidor y luego de la incubacin visualizar el crecimiento y la degradacin de unsustrato, ya sea por viraje de un indicador o por agregado de un reactivo revelador de lapresencia del sustrato, o de algn producto de su degradacin. 2) Cultivar el microorganismo en un medio de propagacin que contenga el sustrato deuna enzima inducible y luego de la incubacin demostrar la actividad enzimtica. En todos los casos se debe tener un cultivo fresco (18-24 hrs. de incubacin) en un medioen que el microorganismo se desarrolla en forma ptima, a pH, fuerza inica, atmsfera ytemperatura adecuados. Siempre que se prepara un nuevo lote de medio de cultivo parauna prueba, deben llevarse a cabo los correspondientes controles de calidad, sembrandoen dicho medio una cepa positiva y otra negativa para ese test. Si bien existe una gran variedad de pruebas bioqumicas empleadas con fines deidentificacin, se enumerarn a continuacin solo las que se utilizan ms frecuentemente,agrupadas segn el tipo de ensayo y se denominan segn su nombre corriente. 1) Enzimas vinculadas con la respiracin a) oxidasa b) catalasa 2) Descomposicin de azcares simples, cidos orgnicos y otros 2.1) Requerimientos de oxgenoOF (xido-fermentacin)Crecimiento en caldo tioglicolato 2.2) Produccin de cido, o cido y gasFermentacin de carbohidratos 2.3) Deteccin de enzimas y vas metablicas a) RM-VP (rojo de metilo - Voges Proskauer) b) Gluconato c) O.N.P.G. (orto nitro -D-galactopiransico) d) Esculina e) Hipurato 3) Fuente nica de carbono a) citratob) malonatoc) hipurato para coliformes 4) Utilizacin de compuestos nitrogenados 4.1) Reduccin de nitratoa) asimilacinb) denitrificacin 4.2) Descomposicin de carbohidratos aminocidos y otros a) indol b)H2S c) Fenilalanina d) Lisina, arginina, ornitina e)Urea 5) Ensayos combinados a) TSI (Triple Azcar Hierro) b) LIA (Agar Hierro Lisina) c) Bilis esculina 6) Deteccin de exoenzimas a) lecitinasa b) proteasas, coagulasa c) amilasas d) celulasas

e) desoxirribonucleasas f) accin de microorganismos sobre la sangre (hemolisinas) 7) Miscelneos a) KCN b) Bilis c) produccin de pigmentos 8) Test de crecimiento o inhibicin a) Temperatura b) NaCl c) Antibiticos 2.FLUJOGRAMAS 2.1 TSI o KIA Sembrar en medio 2.2 CITRATO Sembrar en medio resultados

TSI o KIA

Incubar 37C por 24h

Observar resultados

Simmons Citrato

Incubar 37C, (24,48,72h)

Observar

2.3 INDOL Sembrar en medio Caldo peptona tripticasa Incubar 37C, (24,48h) reactivo Kovacs Agitar Observar resultados 2.4 ROJO DE METILO Sembrar en medio Caldo RM.VPIncubar 37C, (2-4das) Agregar indicador rojo de metiloObservar resultados 2.5 DESCARBOXILASA Sembrar en medio LIAIncubar 37C, (28-48horas)Observar resultados 2.6 VOGES PROSKAUER Sembrar en medio Caldo RM.VPIncubar 37C, (2-4das) Agregar 0.6ml Naftol al 5% Agregar 0.2ml KOH al 40% AgitarExponer al aire 15 minObservar resultados 2.7 MOTILIDAD Y H 2 S Sembrar en medio SIMIncubar 37C, (28-48horas)Agregar reactivo KovacsAgitar Observar resultados 2.8 CATALASA Extraer colonias Colocar en portaobjetosAgregarH 2 O 2 Observar resultados 2.9 UREASA Sembrar en medio urea ChristensenIncubar 37C, (1-6das)Observar resultados 2.10 GELATINAZA

Agregar

Sembrar en medio gelatinaUtilizar un tubo de controlIncubar 37C, (1-5das)Observar resultados

TABLA DE RESULTADOS PruebasbioqumicasMedios decultivosRangode pHIndicador Color inicial Color final ResultadoTSI TSI 7,4 0,2Rojo de fenol Rojo oscuro Negro + KLIGER Kliger Rojo de fenol Caf vino Caf vino Citrato Simmonscitrato6.9 Azul debromotimolVerde Azul(pico de flauta) yverde(profundidad)+ Indol CaldopeptonatripticasaKovacs Incoloro Rosado sin anillo Rojo de metilo Caldo RM-VP6,9 0,1Rojo de metilo Anaranjado Amarillo Descarboxilasa LIA Prpura debromocresolAmarillo Amarillo Voges proskauer Caldo RM-VPAmarillo Rojo (superficie) yamarillo(fondo)+ Motilidad y H 2 S SIM Tiosullfato desodio y sulfatoferrosoAmarillo Amarillocoaguloso(superficie) ynegro(fondo)+ Catalasa H 2 O 2 Amarillo Blanco efervescente + Gelatinaza Gelatina AmarillotransparenteAmarillo transparente Ureasa UreaChristensenRojo de fenol Piel de ante fucsia + Nitrato Nitrato Griess-ilosvayy Kovacstransparente Amarillo Baird parker agar Baird parkeragar6.80.2Cloruro deltio y teluritoAmarillas(colonias)Caf oscuro (colonias) + Mac Conkey Mac Conkey 7.1 0.1Rojo neutro Amarillas(colonias)Rosado (colonias) + Hektoen EntericAgar HektoenEnteric Agar7.70,1.Azul debromotimol yfucsina cidaAmarillas(colonias). Negro con verdebrillante(colonias)+ Endo C Endo C 7.4 0.2Fucsina-sulfitoAmarillas(colonias)Rojo (colonias) +

ANLISIS DE RESULTADOS Las pruebas bioqumicas realizadas en el laboratorio arrojaron los siguientes resultados:En la prueba TSI (hierro tres azucares) el medio est constituido por tres azucares:lactosa, glucosa y sacarosa, de las cuales la lactosa y la sacarosa se fermentan en medioaerobio y la glucosa en medio anaerobio. Al inocular el microorganismo ( Pseudomona ) seobserv una coloracin caf-amarillo en el pico de flauta lo cual indica la produccin decido por la fermentacin de los tres azucares y negro en la profundidad que demuestra laformacin de H 2 S, adems se observ un rompimiento del medio lo que indica ladesprendimiento de gas (CO 2 yH 2 ). (ver anexo 1)Para la prueba Kliger, el medio ya se encontraba de un color caf vino y con rompimiento,al inocular la Pseudomona no mostr cambio alguno. Por lo tanto, no podemos sacarconclusiones, de ah que los resultados sean negativos, pues consideramos que el mediono estaba en condiciones ptimas para realizar esta prueba. (ver anexo 2)En la prueba citrato, el medio simmons citrato con la Pseudomona se not un cambio decolor de verde a azul en el pico de flauta y verde en la profundidad, por lo tanto huboproliferacin de microorganismos, estos utilizaron el citrato presente en el medio comofuente de carbono para la realizacin de sus reacciones metablicas, por lo tanto elresultado fue positivo. (ver anexo 3)La prueba de Indol realizada con la E. Coli fue negativa, despus de habrsele adicionadoel reactivo de kovacs, no present ningn anillo, lo que indica que el microorganismo nodesdobl el triptfano presente en el caldo peptona tripticasa para convertirlo en Indol.(veranexo 4)La prueba rojo de metilo realizada al microorganismo E. Coli se observ un color amarillo,lo que indica la incapacidad del organismo de producir cidos a partir de la fermentacinde la glucosa, siendo la prueba negativa.(ver anexo 5)En la prueba de descarboxilasa realizada con el microorganismo Pseudomona nopresent cambio de color, se puede considerar como especie LD negativa debido a queno origina aumento alguno del pH y por lo tanto, no se produce un viraje del indicador acausa del dbil crecimiento condicionado por este motivo.(ver anexo 6) En la prueba Voges-Proskauer, se observ un anillo rojo en la superficie lo que indica lapresencia de diacetilo, producto de oxidacin de la acetona y por lo tanto es una pruebaVP positiva.(ver anexo 7)En la prueba de Motilidad y H 2 S, con la inoculacin de la Pseudomona, present un coloramarillo coaguloso en la parte superior, lo que indica motilidad a lo largo de dicho canal, yun negro en el fondo que se refiere a la formacin de H 2 S.(ver anexo 8)Para la catalasa, realizada con

Pseudomona , la rpida aparicin y produccin sostenidade burbujas de gas o efervescencia, indica una prueba positiva, esto quiere decir que haypresencia de la enzima catalasa.(ver anexo 9)En la prueba ureasa, el resultado fue positivo. la degradacin de la urea produceamoniaco e hizo variar el color del indicador de piel de ante a fucsia, ponindose as demanifiesto la actividad ureasa.(ver anexo 10)En la prueba gelatinaza, arroj un resultado negativo debido a que no se licu e mediogelatina.(ver anexo 11)En la prueba del nitrato, la reaccin fue negativa lo que indica que no se ha producidodegradacin alguna del nitrito o que este se ha reducido hasta nitrgeno o hastaamoniaco.(ver anexo 12)En la prueba de baird-parker, las colonias se observaron caf oscuro con halos claros, porlo tanto se considera un prueba positiva.(ver anexo 13)En la prueba de MacConkey, se produjeron colonias rosas, el aislado fue capaz defermentar la Lactosa, por tanto la prueba result positiva.(ver anexo 14)En la prueba de Hektoen Enteric Agar, el resultado di positivo, se vi una coloracinnegra en las colonias, lo que indica que eran H 2 S positivas.(ver anexo 15)Para la prueba de Endo C, se observ una coloracin rojas en las colonias debido a queel aldehdo libera fucsina a partir de la combinacin fucsina-sulfito, el resultado de estaprueba fue positiva.(ver anexo 16) PREGUNTAS COMPLEMENTARIASFundamento de las pruebas realizadas TSI (Triple Sugar Iron) El agar triple azcar hierro es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar lacapacidad de produccin de cido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en unnico medio. Tambin permite la deteccin de la produccin de H 2 S. Es un medio til parala identificacin de enterobacterias.El agar se prepara en forma de pico de flauta. Esto determina que existan 2 cmaras dereaccin dentro del mismo tubo. La porcin inclinada (pico) expuesta en toda susuperficie al oxgeno es aerobia y la porcin inferior (fondo) est protegida del aire y esrelativamente anaerobia. La porcin inclinada del tubo que est expuesta al oxgenoatmosfrico tiende a tornarse alcalina (roja por el rojo fenol) por la utilizacin aerobia delas peptonas.En el fondo del tubo, donde no hay oxgeno, la degradacin proteica es mnima y sepueden detectar pequeas cantidades de cido por la aparicin de un color amarillo(indicador: rojo fenol). En ausencia de fermentacin de carbohidratos, no se formarncidos y por la produccin de aminas en el pico, todo el medio quedar rojo. Esto se daen organismos no fermentadores.El medio est diseado de tal forma que la glucosa se encuentra en una proporcin 10veces menor que la lactosa y la sacarosa. Si el TSI es inoculado con una bacteriafermentadora de glucosa pero no de lactosa ni de sacarosa, la cantidad de cidoproducida por fermentacin a partir de la glucosa ser baja porque la concentracin deglucosa es baja. Al principio se producir viraje del indicador al amarillo en tubo, pero alcontinuar la incubacin, el pico del tubo retornar al rojo por la degradacin aerobia de laspeptonas antes descrita.Si el microorganismo fermenta la lactosa y/o la sacarosa, como las concentraciones deestos azcares es 10 veces mayor, se producir mayor cantidad de cido que no puedeser revirado por la produccin de aminas en la superficie por metabolismo aerobio. Laproduccin de H 2 S a partir de tiosulfato se pone en evidencia por precipitar el Fe +2

delsulfato ferroso. Como esta reaccin se da slo en medio cido, un ennegrecimiento delfondo del tubo se lee como fermentacin de algunos de los azcares del medio. Ademspuede observarse la produccin de gas, como burbujas en el fondo del tubo. Microorganismos Escherichia coli Citrobacter freundi Enterobacter cloacae Shigella flexneri Salmonella thyphimurium Salmonella enteriditis Proteus mirabilis Proteus vulgaris Crecimiento BuenoBuenoBuenoBuenoBuenoBuenoBuenoBueno Columna vertical AmarilloAmarillo y negroAmarilloAmarilloAmarillo-negroAmarillo-negroAmarillonegroAmarillo -negro Sup inclinada AmarilloAmarilloAmarilloRojoRojoRojoRojoAmarillo For de H 2 S -+--++++ Interpretacin Pico alcalino/fondo alcalino (Alc/Alc) No hay fermentacin de azcares. Caracterstica de bacterias no fermentadoras. Pico alcalino/fondo cido (Alc/A) Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. Pico alcalino/fondo negro (Alc/A/H 2 S +) Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, produccin de cido sulfhdrico. Pico cido/fondo cido (A/A) Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse H 2 S o no. (A/A/H 2 S -)A estos resultados se les agrega el resultado de la produccin de gas. Ej. A/A/gas+/H 2 S-. AGAR KLIGER Medio nutritivo de ensayo, para identificacin de bacterias intestinales gram negativas.pH: 7.40.1La degradacin de azcar, con formacin de cido se manifiesta por un cambio de colordel indicador o por un viraje de tojo intenso en caso de alcalinizacin. CITRATO La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono es una prueba til en laidentificacin de enterobacterias.La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono se detecta en un medio de cultivocon citrato como nica fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinizacin del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira alalcalino a pH 7,6.CRECIMIENTO MICROORGANISMOSPositivo: medio de cultivoAzul oscuroCitratos - positivos: Enterobacter, S. parathyphi, S. enteriditis, S.typhimurium, Arizona.Klebsiella, Serratia. Negativo o inhibido Citratos

 negativos: Shigella, Escherichia, S. paratyphi y otros. Interpretacin El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estra, acompaadoo no de un viraje del indicador al azul. INDOL El indol es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptfano. Lasbacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptfanocon produccin de indol, cido pirvico y amonaco. La produccin de indol es unacaracterstica importante para la identificacin de muchas especies de microorganismos.La prueba de indol est basada en la formacin de un complejo rojo cuando el indolreacciona con el grupo aldehdo del p-dimetilaminobenzaldehdo. Este es el principioactivo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich descriptos ms adelante. El medio de cultivoutilizado debe ser rico en triptfano.Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, al aadir al medio 5 gotas del reactivo deKovacs, se producir un anillo de color rojo en la superficie del caldo y la prueba serconsiderada positiva. Si esto ocurre despus de 24 horas, la prueba se consideracompleta, pero si es negativo deber incubarse otras 24 horas y repetirse la prueba. Porello es conveniente hacer siempre la prueba no en el tubo incubado sino en una porcinde unos 2ml que se retira de l aspticamente Interpretacin El desarrollo de un vivo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo, segundosdespus de aadir el reactivo indica la presencia de indol y una prueba positiva. ROJO DE METILO Una de las caractersticas taxonmicas que se utilizan para identificar los diferentesgneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporcin de productos defermentacin que se originan por la fermentacin de la glucosa. Se conocen 2 tiposgenerales: La fermentacin cido-mixta y la fermentacin del 2,3 butanodiol. En lafermentacin cido mixta se forman fundamentalmente lctico, actico y succnico,adems de etanol, H2 y CO2. En la va del butanodiol se forman cantidades menores decido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H 2 y CO 2 .El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo),que se utiliza para visualizar la produccin de cidos por la va de fermentacin cidomixta.Reaccin cromticaDe anaranjado a rojoDe anaranjado a amarilloRojo (positivo)Sin reaccin (negativo)Microorganismos Eschericha coli citrobacter y otros Enterobacter aerogenes Enterbacter cloacae Enterobacter coli Interpretacin La prueba es positiva si se desarrolla de un color rojo estable. Esto indica que laproduccin de cido es suficiente para producir el viraje del indicador y el microorganismoferment la glucosa por la va de cido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre elrojo y el amarillo no es considerado como positivo.

DESCARBOXILASAS Medio de cultivo LIA se utiliza para la demostracin simultnea de lisina descarboxilasade la formacin de sulfuro de hidrgeno. Sirve para identificacin bioqumica deenterobacterianceas.Este medio de cultivo ajustado a pH 6, muestra un color amarillo debido a su contenido enprpura de bromocresol, que acta como indicador de pH. A este pH las enterobacterias,solo crecen escasamente, las especies LD positivas lo alteran debido a la formacin decadaverina por descarboxilacin de la lisina cerca del punto de la neutralizacin,producindose condiciones ms favorables para el crecimiento. Este efecto conlleva unviraje de pH, que pasa de amarillo a violeta, las especies con capacidad para reducir eltiosulfato formando cido sulfhdrico, causan el ennegrecimiento del medio cultivo violeta,por la precipitacin del sulfuro de hierro que tiene lugar. Las especies LD negativas nooriginan aumento alguno del pH y por lo tanto, no se produce un viraje del indicador a causa del dbil crecimiento condicionado por este motivo, las especies H 2 S positivastampoco producen cido sulfhdrico. Las especies LD negativas no pueden serreconocidas como tales. Colonias Microorganismos Negras eventualmente con la zonalimtrofe visible en tono violetaLD-positivos: Salmonella y Edwardsiella. Violeta LD-positivos y H 2 S negativos: Escherichia,Klebsiella, Hafnia. Amarillo sin alteracin de color: crecimientoretardado.LD-negativos: Shigella, Citrobacter,Enterobacter, Proteus. VOGES-PROSKAUER En la prueba de Voges-Proskauer se determina la va de fermentacin del butanodioldescripta en la prueba de rojo de metilo. El acetil-metil-carbinol (o acetona) es unproducto intermediario en la produccin de butanodiol. En medio alcalino y en presenciade oxgeno la acetona es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftoldando un color rojo-fucsia. Interpretacin El desarrollo de un color rojo-fucsia luego de 15 minutos indica la presencia de diacetilo,producto de oxidacin de la acetona y por lo tanto una prueba VP positiva. MOTILIDAD Y H 2 S Medio de cultivo de ensayo para comprobar la formacin del sulfuro, la formacin de indoly motilidad en el marco del diagnstico de entero bacteriaceas. El medio de cultivo esampliamente recomendado para el anlisis de alimentos.La motilidad se pone de manifiesto de turbidez difusa del medio de cultivo alrededor delcanal de la picadura. La motilidad se caracteriza por el crecimiento producidoexclusivamente a lo largo de dicho canal. La formacin de H

2 S se reconoce por elennegrecimiento de la zona de crecimiento, la demostracin del indol se demostrarmediante el reactivo segn Kovacs. La formacin del indol da lugar a una coloracin rojo-prpura de la capa del reactivo. Sirve para determinar si un organismo es mvil o inmvil. Las bacterias tienen movilidadpor medio de sus flagelos que se encuentran principalmente entre los bacilos aunqueexisten algunas formas de cocos mviles.Entre las enterobacterias, la movilidad nos permite diferenciar el gnero Klebsiella (-) delas restantes que suelen ser movilidad (+).Dentro del gnero Bacillus , nos permite diferenciar B.anthracis (-) de otras especiesgeneralmente (+).MICROORGANISMOS H 2 S INDOL MOTILIDAD Escherichia - + +/Enterobacter --+ Klebsiella --Salmonella +-+ Serratia --+ Shigella - +/- CATALASA La catalasa es una enzima que descompone el perxido de hidrgeno en oxgeno y agua.Qumicamente, la catalasa es una hemoprotena de estructura similar a la de lahemoglobina, excepto que los 4 tomos de hierro de la molcula estn en estado oxidado(Fe+++) en lugar de reducido (Fe++). Excluyendo los estreptococos, la mayora de lasbacterias aerobias y anaerobias facultativas poseen actividad catalasa.El perxido de hidrgeno se forma como uno de los productos finales del metabolismooxidativo aerbico de los hidratos de carbono. Si se deja acumular, el perxido dehidrgeno es letal para las clulas bacterianas. La catalasa transforma el perxido dehidrgeno en agua y oxgeno de acuerdo a la siguiente reaccin:H 2 O 2 H 2 O+O 2 (burbujas de gas)Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra en lamayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. Laprincipal excepcin es Streptococcus

.Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes gneros: Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+). Bacillus (+) de Clostridium (-). Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de C.pyogenes y C.haemolyticum , ambos -) de Erysipelothrix (-) Interpretacin 1. Prueba cualitativa: la rpida aparicin y produccin sostenida de burbujas de gas oefervescencia, indica una prueba positiva. Dado que algunas bacterias pueden poseerenzimas distintas de la catalasa, capaces de descomponer el perxido de hidrgeno, unaspocas burbujas diminutas, formadas a los 20 a 30 segundos no se consideran una pruebapositiva.2. Prueba semicuantitativa: las determinaciones cuantitativas de catalasa se llevan a caboms comnmente en la identificacin de micobacterias. Se mide la altura que alcanza laformacin de burbujas de gas en el tubo, luego de aadir el perxido de hidrgeno. Unacolumna de burbujas de 50 mm o ms, se considera una reaccin fuertemente positiva. UREASA Determina la capacidad de un organismo de desdoblar la urea formando dos molculasde amoniaco por accin del enzima ureasa. Esta actividad enzimtica es caracterstica detodas las especies de Proteus y se usa sobre todo para diferenciar este gnero de otrasenterobacterias que dan negativo o positivo retardado.Se cultiva el microorganismo en slant en agar urea de Christensen. Este medio secomplementa despus del autoclavado con 50ml/l de urea. sta ser degradada poraquellos microorganismos capaces de producir el enzima ureasa. Esta degradacinproduce amoniaco que har variar el color del indicador de amarillo a rojo, ponindose asde manifiesto la actividad ureasa.Para revelar el resultado de esta prueba es importante tener en cuenta el tiempo deincubacin ya que especies de Proteus vuelven alcalino el medio poco despus de lainoculacin y sus resultados deben ser ledos en las primeras 2-6 horas, mientras que Citrobacter freundii y

Klebsiella pneumoniae tienen actividad ureasa dentro de las 24-48horas de incubacin.ColoniasRojofucsiaAmarilloMicroorganismosUrea positivos: Proteus, Klebsiella, Enterobacter,Citrobacter. Urea negativos: Shigella, Salmonella, Escherichia,Citrobacter, Enterobacter, Serratia,Providencia. GELATINAZA Para la determinacin del nmero total de grmenes y para la investigacin, en aguas degrmenes que licuan la gelatina. Hay aparicin de halos de aclaracin alrededor de lascolonias que licuan la gelatina. Microorganismos Escherichia coli Proteus vulgaris Staphilococcus aureus Enterococcus faecalis Bacillus cereus Cuotas de recuperacin (%) 170170170170170 Caldo Nitrato Medio de cultivo de ensayo para la demostracin de la reduccin del nitrato y formacindel indol con los correspondientes reactivos en la identificacin bioqumica demicroorganismos. La coloracin roja corresponde a la cantidad de nitratos formada. Si lareaccin es fuerte el color pasa de rojo a amarillo.La reaccin negativa indica que no se ha producido degradacin alguna del nitrito o queeste se ha reducido hasta nitrgeno o hasta amoniaco. Baird parker agar Para el aislamiento y la diferenciacin de estafilococos en materiales y materialesfarmacuticos.Este medio de cultivo contiene cloruro de ltio y telurito para la inhibicin de la floraacompaante, en tanto que el piruvato y la glicocola actan favoreciendo selectivamenteel crecimiento de estafilococos.Sobre el medio de cultivo, opaco por su contenido en yema de huevo, las colonias deestafilococos muestran dos caractersticas diagnsticas por liplisis y proteolisis, seproducen halos y anillos caractersticos y, debido a la reduccin del telurito a teluro, sedesarrolla una colonia negra. La reaccin con la yema de huevo y la reduccin del teluritose presentan con notable paralelismo con la coagulasa-positividad, y por tanto, puedenutilizarse como ndice de esta ltima. Colonias Microorganismos Negras, lustrosas, convexas, con bordeextrecho blanquecino, rodeado por un haloclaro. Staphilococcus aureus. Negras, lustrosas, pero de forma irregular. Staphilococcus epidermis. Crecimiento ocasional: muy pequeas,pardas hasta negras, ausencia de halos declarificacin. Micrococcus. Pardo-oscuras, mates, presencia a vecesde halos de clarificacin. Bacillus.

Blancas sin halos de clarificacin. Levaduras. MacConkey Medio selectivo para BGN. Lactosa+indicadorEl agar MacConkey II es una medio selectivo y diferencial para la deteccin deorganismos coliformes y patgenos entricos.La frmula del agar MacConkey II se dise especialmente para mejorar su capacidad deinhibir el swarming de Proteus spp y para alcanzar una definitiva diferenciacin entre fermentadores y no fermentadores de la Lactosa.Este medio es ligeramente selectivo ya que la concentracin de sales Biliares, que inhibenel crecimiento de los microorganismos Gram positivos, es baja en relacin con otrosmedios similares. Se incluye tambin cristal violeta para inhibir el crecimiento de lasbacterias Gram positivas, especialmente estafilococos y enterococos.La diferenciacin de organismos entricos se lleva a cabo con la combinacin de Lactosacon el indicador Rojo neutro. Se producen colonias rosas a rojas si el aislado es capaz defermentar la Lactosa y colonias sin color en caso contario.LECTURA:colonias lactosa (-): incoloras (= no hay fermentacin de la Lactosa). Salmonella , Shigella , Pseudomonas colonias lactosa (+): rosa/rojo ladrillo rodeadas de un halo de sales biliaresprecipitadas. E. coli (rosa/roja), E. aerogenes (rosa y mucosa) Hektoen Enteric Agar Agar selectivo para la demostracin y aislamiento de bacterias intestinales patgenas.Debido a los dos indicadores, azul de bromotimol y fucsina cida, las colonias lactosa-positivas muestran una expresiva diferencia cromtica frente a las colonias lactosa-negativas. Igual ocurre en el caso de colonias que fermentan lentamente la lactosa y msfcilmente la sacarosa y la salicina, sustancias reaccionantes fcilmente fermentables, loque impide hallazgos de patgenos falsamente positivos. La combinacin de tiosulfato,como sustancia reaccionante, y una sal de hierro como indicador, da una coloracin negraa las colonias H 2 S positivas. Una mezcla de sales biliares inhiben a una gran parte de laflora acompaante.Las placas con medio de cultivo son claras y de color azul-verdoso. Endo-CAgar Medio selectivo para la demostracin y aislamiento de E. Coli fecal y coliformes.El sulfito sdico y la fucsina inhiben a las bacterias grampositivas. E. Coli y coliformesconsumen lactosa formando aldehdo y cido. Por otra parte, el aldehdo libera fucsina apartir de la combinacin fucsina-sulfito, lo cual da lugar a la coloracin roja de lascolonias. En el caso de E. Coli, esta reaccin es tan intensa que la fucsina llega acristalizar y por este motivo, confiere a dichas colonias un brillo metlico estable, de reflejoverde (tpico de la fucsina cristalizada).Las placas con medio de cultivo son claras y casi incoloras. Si una placa con medio decultivo muestra, tras la solidificacin, un tono rojo demasiado intenso, puede eliminarsedicho exceso de rojo aadiendo algunas gotas de una solucin recin preparada al 10%de sulfito sdico anhidro.Por la accin del oxigeno atmosfrico y debido a

la consiguiente oxidacin del sulfito, elmedio de cultivo vertido en placas se vuelve paulatinamente rojo y, por lo tanto, inservible.Incluso conservando en la oscuridad y a la temperatura de nevera, solo es utilizabledurante pocos das. BIBLIOGRAFIA http://bilbo.edu.uy/~microbio/identific02.html MARTINEZ SILVA, Jorge y coautores. Microbiologa General. Ed. Pueblo yeducacin. Playa ciudad de la Habana. 1989 Manual de medios de cultivos Merck. MURRAY y otros. Bioqumica de Harper. ED. Manual moderno S.A. Mxico-Bogota. 1993 CONCLUSIN Las pruebas bioqumicas convencionales, generalmente determinan la actividadde una va metablica (conjunto de reacciones qumicas) a partir de un sustratoque se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma ono. A partir de las pruebas bioqumicas de identificacin bacteriana, medianteestndares establecidos, podemos conocer que bacteria tenemos en una muestraproblema basndonos en sus reacciones metablicas las cuales soncaractersticas de cada microorganismo. Son funciones especificas del metabolismo: o Obtencin de energa para los procesos celulares. o Conversin de los compuestos nutritivos en precursores de los componentescelulares. o Organizacin de esas macromolculas en polmeros. o Formacin y degradacin de las biomolculas necesarias para las funcionesespecializadas de la clula.