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METODOLOGIA PARA A CONTAGEM DE CIANOBACTRIAS EM CLULAS/ML. UM NOVO DESAFIO PARA O ANALISTA DE LABORATRIO
METHODOLOGY
TO CYANOBACTERIA CELLS COUNT IN CELLS/ML.

NEW

CHALLENGE FOR THE LABORATORY ANALIST.

FERNANDO ANTNIO JARDIM
Mestrado em Saneamento Meio Ambiente e Recursos Hdricos pela Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG); Bilogo, formado pelas Faculdades Metodistas Integradas Izabela Hendrix; coordenador do setor de Biologia do Laboratrio Metropolitano (L.M.) da COPASA

SIMONI DE OLIVEIRA CAVALIEREI

Biloga, formada pelas Faculdades Metodistas Integradas Izabela Hendrix, Belo Horizonte - MG; analista de laboratrio do setor de Biologia do L. M. da COPASA.

PATRCIA CASTANHEIRA GALLINARI

Biloga, formada pela Pontifcia Universidade Catlica de Minas Gerais, Belo Horizonte - MG; analista de laboratrio do setor de Biologia do L. M. da COPASA e mestranda do curso de Saneamento Meio Ambiente e Recursos Hdricos da Escola de Engenharia da UFMG.

LENORA N. LUDOLF VIANNA

Mestrado em Microbiologia pela Universidade Federal de Minas Gerais; Biloga, formada pela Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte - MG; pesquisadora autnoma do setor de Biologia do L. M. da COPASA. Recebido: 04/02/02 Aceito:07/08/02

RESUMO
O trabalho apresenta uma metodologia para a contagem de cianobactrias (Cyanophyceae) em nmero de clulas por mililitro de amostra face real necessidade exigida pela portaria no. 1469 do Ministrio da Sade (12/2000) aos laboratrios de hidrobiologia das companhias de saneamento e institutos de pesquisa no Brasil. Com o objetivo de se padronizar a contagem das clulas de cianobactrias e facilitar a execuo dos trabalhos rotineiros do laboratrio, realizou-se uma adaptao ao clculo da Unidade Padro de rea (UPA), aceita internacionalmente. Aps a padronizao dessa contagem, a tcnica foi ento avaliada atravs da aplicao nas anlises de rotina, com resultados satisfatrios. PALAVRAS-CHAVE: Cianobactrias, metodologia de contagem de clulas.

ABSTRACT
The paper presents a methodology to cyanobacteria cells count in number per millilitre sampled due to real necessity demanded by new Brazilian drinking water regulation edict n. 1469 from Health Ministry 2000/12 to Brazilians sanitation company hydrobiological departments and research institute, aiming the standardisation the cyanobacterias cells counting and improve the laboratory routine work. An adaptation to Area Standard Unit (ASU), internationally accepted, was carried out. After the standard cells counting, this technique was then valued across the direct application in routine works with good results.

KEYWORDS: Cyanobacteria, cells counting procedures. se realizavam as anlises hidrobiolgicas, as unidades utilizadas para a expresso do quantitativo eram aquelas j padronizadas e propostas por rgos competentes. Para tanto, pode-se citar a expresso dos resultados em organismos por mililitro de acordo com A.P.H.A. (1998) ou por Unidade Padro de rea (UPA/mL), cujo clculo didaticamente explicado pela CETESB (1978). Para ambos os casos a contagem era realizada

INTRODUO
A partir da edio da portaria no. 1469 do Ministrio da Sade em 12/ 2000 passou-se a exigir o monitoramento das cianobactrias em guas de abastecimento, com o objetivo de que fossem implantados monitoramentos sistemticos para a tomada de aes preventivas e corretivas que visassem minimizar os impactos sade humana, engenharia sanitria e ambiental

das toxinas produzidas por linhagens de algumas espcies desses organismos. Essa exigncia legal trouxe um grande desconforto s companhias estaduais de saneamento, aos servios autnomos e s prefeituras pois, aliada carncia de setores hidrobiolgicos nos laboratrios desses rgos existia uma falta de padronizao das metodologias utilizadas para a enumerao do fitoplncton. De uma maneira geral, naqueles laboratrios onde 109

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Jardim, F.A. et al

segundo o critrio da contagem por conjuntos ou clump counting (BRANCO, 1986), entendendo-se por conjunto a unidade caracterstica do gnero, isto : uma clula, no caso de seres unicelulares livres; uma colnia, no caso de unicelulares coloniais; um filamento ou tricoma no caso de cianobactrias filamentosas. A referida portaria em questo mencionava que o resultado para as cianobactrias passasse a ser expresso em nmero de clulas por mililitro amostrado. Alm disso, um pouco antes da publicao da legislao brasileira que substituiu a portaria no. 036 (01/90), CHORUS & BARTRAM (1999) elaboraram uma srie de recomendaes operacionais para se monitorar a presena de cianobactrias na gua aonde a expresso dos resultados dada em nmero de clulas por mililitro ou pelo biovolume. Criou-se o seguinte impasse: como manter toda uma rede de monitoramento e tomar medidas operacionais se os resultados das anlises no eram expressos em nmero de clulas por mililitro? JARDIM (1999) fez uma adaptao ao clculo da unidade padro de rea, aceita internacionalmente e

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aplicou nos seus trabalhos rotineiros no laboratrio metropolitano da companhia de saneamento de Minas Gerais com resultados satisfatrios.

METODOLOGIA
JARDIM (1999) levou em considerao para aplicar o novo mtodo o extenso intervalo da margem de erro proposta pela metodologia da contagem estimativa (A.P.H.A., 1998) que possui um limite de confiana de 95 20% quando se contam 100 organismos da espcie predominante. Sendo que esse erro cai para 10% quando se contam 400 indivduos da espcie predominante de acordo com a distribuio de Poisson, cuja frmula apresentada na equao 1:

2 (100% ) N

(1)

onde: N o nmero de organismos contados da espcie predominante. Os passos para a utilizao da metodologia foram os seguintes: para as

colnias de Microcystis ou outras cianobactrias da famlia Chroococcaceae, contou-se quantas clulas estavam contidas num quadrado maior do retculo de Whipple (R.W) ao se sobrepor pelo menos 30 colnias encontradas aleatoriamente no aumento de 200 vezes. Calculou-se a seguir uma mdia aritmtica do nmero de clulas contadas. Durante a contagem, utilizando o mesmo aumento, contou-se quantos quadrados maiores do RW se sobrepunham s colnias encontradas e para se estimar o nmero de clulas, bastou multiplicar o nmero de quadrados maiores contados, pela mdia do nmero de clulas contadas anteriormente. J para as cianobactrias filamentosas (tricomas) contou-se a quantidade de clulas em pelo menos trinta tricomas encontrados aleatoriamente na amostra. Em ambos os casos, tanto para a contagem do nmero de clulas nas colnias quanto nos tricomas, procurou-se contar um nmero total por volta de 400 clulas, pois dessa forma, de acordo com a distribuio de Poisson, o limite de confiana foi de 10%. A contagem das clulas para a padronizao foi realizada por trs diferentes analistas de laboratrio. Na Figura 1 observa-se um desenho esquemtico da sobreposio de uma colnia em forma de cocos no retculo de Whipple.

RESULTADOS
A aplicao da metodologia gerou o seguinte procedimento descrito na Tabela 1. Aps a realizao de vrios experimentos verificou-se que o nmero de clulas nos tricomas ou nas colnias (enumeradas dentro de um dos quadrados maiores do RW) no sofria grande alterao e alm disso, o grau de liberdade do intervalo proposto era muito amplo

Figura 1 - Retculo de Whipple com uma colnia de cianobactria sobreposta

Tabela 1 - Procedimento operacional padro para a contagem do nmero de clulas de cianobactrias em amostras de gua.
Etapas Antes da contagem Durante a contagem Estimativa do nmero de clulas Colnias de Cianobactrias Mdia do nmero de clulas (em 30 colnias aleatrias) contadas no quadrado maior do RW. Contar quantos quadrados maiores do RW se sobrepem s colnias encontradas. Multiplicar o nmero de quadrados maiores contados pela mdia do nmero de clulas. Tricomas Mdia do nmero de clulas em 30 tricomas aleatrios. Contar os tricomas Multiplicar a mdia do nmero de clulas por tricoma pelo nmero de tricomas contados.

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Contagem de cianobactrias

Tabela 2 - Cianobactrias catalogadas com a mdia do nmero de clula encontrada 10% em microscpio invertido no aumento de 200 vezes por ocalidade.
Cianobactrias Anabaena planctonica Anabaena circinalis Anabaena spiroides Radiocystis fernandoi Microcystis panniformis Cylindrospermopsis raciborskii Aphanizomenon sp. Localidades em Minas Gerais Pitangui So Simo Pitangui Betim Betim Pedra Azul Trs Marias Mdia do nmero de clulas encontrada 10% 25 por tricoma 98 por tricoma 102 por tricoma 20 por quadrado maior do RW 40 por quadrado maior do RW 10 por tricoma 13 por tricoma

CONCLUSES
A metodologia proposta passvel de ser aplicada em laboratrios de hidrobiologia podendo sofrer modificaes de acordo com as condies de cada laboratrio, mas sugere-se a observao das consideraes feitas acima, pois atravs delas, foi possvel uma adaptao rpida ao que exigido pela portaria no. 1469 do Ministrio da Sade ou seja, expressar os resultados em nmero de clulas por mL e promover as medidas cabveis de freqncia de monitoramento e aes operacionais preventivas a fim de se minimizar os efeitos causados pelas cianotoxinas em guas de abastecimento.

( 20% para as anlises de rotina). Atravs dos resultados das contagens entre os trs analistas de laboratrio obtiveram-se as mdias aritmticas do nmero de clulas por tricomas ou colnias apresentadas na Tabela 2.

DISCUSSO
Apesar do extenso intervalo de confiana permitido pela metodologia ( 10%) alguns cuidados devem ser tomados para se evitar que haja a extrapolao desse intervalo. De preferncia, a contagem das clulas para a padronizao, dever ser feita sempre que possvel com o material in vivo, pois em amostras fixadas ou coradas as clulas modificam a sua forma e o tamanho podendo assim ocorrer uma superestimao no momento da contagem de amostras nos trabalhos rotineiros. O contrrio tambm pode ocorrer, quando se contam indivduos de amostras cultivadas, onde as clulas aparecem em nmero e tamanho maiores do que as de amostras naturais, nesse casso, pode ocorrer uma subestimao no momento da contagem das amostras de rotina. As amostras devero ser sempre coletadas na superfcie dos mananciais, devendo-se evitar a coleta em profundidade ou aps a sada de estaes elevatrias de gua bruta (EEAB), essas amostras, ao microscpio, apresentaram colnias impregnadas de partculas, o que dificulta a contagem das clulas. Alm disso, a presena de tricomas j partidos ou at mesmo hormognios interferem no resultado final.

O aumento utilizado para a contagem das clulas no presente trabalho foi de 200 vezes, mas para a contagem de clulas menores como de algumas Chroococcaceae utilizou-se aumentos maiores, mas para isso, as contagens das amostras nos trabalhos de rotina foram realizadas no mesmo aumento utilizado para se contar as clulas nas colnias. O mesmo procedimento foi utilizado para se contar as clulas das formas tricomiais (filamentosas) com clulas mais largas que longas (que lembram botes de camisa sobrepostos) de algumas Oscillatoriaceae, mas nesse caso, depois que foi feita a padronizao do nmero de clulas por tricoma, a dimenso do aumento utilizado no interferiu em nada ao se contar os tricomas nas amostras dos trabalhos de rotina. Outro fator que interferiu muito durante a contagem das clulas para a padronizao foi a sobreposio das mesmas, mas quando se contou somente o que estava dentro do quadrado maior do RW, essa interferncia foi menor. Durante a contagem das amostras de rotina, desde que tenha-se realizado um exame qualitativo contento, possvel contar separadamente espcies de um mesmo gnero, cuja diferena entre o nmero de clulas ultrapasse os 10%, permitido pela metodologia, caso contrrio o resultado poder ser expresso em gnero. Observou-se tambm durante o trabalho que as clulas podem modificar de tamanho e quantidade nas colnias ou nos tricomas de acordo com variaes sazonais, por isso, recomenda-se que a padronizao proposta seja realizada pelo menos duas vezes ao ano, uma na estao

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION. Standard methods for the examination of water and wastewater. 20. ed. Washington: APHA/WEF/AWWA, 1998. BRANCO, S. M. Hidrobiologia aplicada engenharia sanitria. 2. ed. So Paulo: CETESB, 1986. 620 p. BRASIL. Ministrio da Sade - Portaria no. 36/GM - 01/90 - Dirio Oficial, 23/01/1990. BRASIL. Ministrio da Sade - Portaria no. 1.469 12/2000 - Dirio Oficial, no. 35-E, 19/02/2001. CETESB, NT 06: L5. 303. Determinao de fitoplncton de gua doce - mtodos qualitativo e quantitativo. So Paulo, 1978. CHORUS, I., BARTRAM, J. Toxic Cyanobacteria in water: a guide to public health consequences, monitoring and management. World Health Organization. London and New York, 1999. 416 p. JARDIM, F. A. Implantao e realizao de anlises de cianotoxinas com avaliao do potencial txico em estaes de tratamento da COPASA MG. Belo Horizonte, 1999. Dissertao de Mestrado Departamento de Engenharia Sanitria e Ambiental - Escola de Engenharia - Universidade Federal de Minas Gerais.

Endereo para correspondncia:

Fernando Antnio Jardim
Companhia de Saneamento de Minas Gerais - COPASA Br 356 - Km 4 - Cercadinho CEP: 31950-640 Belo Horizonte - MG Tel.: (31) 3250-2340 fjardim@copasa.com.br

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seca e fria e outra na estao quente e chuvosa, para pases de clima predominantemente tropical como o Brasil.