CLCULO DE DATOS TUTORIAL

VERSIN 1.6

INTRODUCCIN
El Clculo de Datos es un mdulo exclusivo de InfinicytTM que proporciona una potente herramienta para calcular distintas caractersticas de las clulas en parmetros que no han sido medidos directamente. El Clculo de Datos est basado en el conocimiento de estas caractersticas en clulas fenotpicamente similares que ya han sido medidas en una alcuota diferente. Para fusionar y calcular los parmetros, los archivos originales deben tener tantos parmetros comunes como sean necesarios para permitir la identificacin inequvoca de la poblacin en la cual queramos calcular los parmetros. El nmero de parmetros comunes necesarios y el diseo del panel de anticuerpos apropiado son dos cuestiones fundamentales para obtener resultados satisfactorios con la herramienta de Clculo de Datos.

Figura 1. Matriz de Informacin de Fusin de Archivos y Clculo de Datos

Estas tablas muestran un ejemplo de 9 archivos (columnas) que forman parte de un panel, con los parmetros que se han medido en cada tubo (filas). Hay tres tipos de parmetros: Parmetros comunes C: Caractersticas que se han medido repetidamente en todos los tubos y que sern utilizadas por el programa como base para el Clculo en clulas similares.

Fecha de publicacin: 19 diciembre 2011. Edicin 01

Parmetros reales R: Parmetros que han sido medidos realmente en cada tubo y que no son parmetros comunes. Datos Calculados D: Nueva informacin generada tras el proceso de Clculo.

InfinicytTM reconstruye de forma multidimensional los nuevos archivos de datos que contienen tanto Parmetros Reales como Datos Calculados para aquellos parmetros que no han sido medidos directamente. El nmero total de parmetros del nuevo archivo ser el nmero total de parmetros medidos en el conjunto de los tubos. Esto posibilita una identificacin y caracterizacin ms potente de las poblaciones. La caracterizacin de la poblacin se lleva a cabo con datos procedentes de todos los marcadores del panel para cada clula en cada tubo. En el siguiente diagrama se muestra el resultado del Clculo de Datos; tras los clculos es posible representar en un diagrama de puntos la expresin de marcadores que haban sido medidos inicialmente en tubos diferentes.

Figura 2. Datos Calculados

Para que el algoritmo del Clculo funcione correctamente, el archivo FCS que vamos a calcular debe cumplir los siguientes requisitos: El proceso de Clculo de Datos est limitado a clulas clonales, que muestran la misma expresin para todos los marcadores calculados. En relacin con el diseo del panel, los parmetros comunes de la poblacin que queremos calcular deben mostrar caractersticas diferentes, es decir, los marcadores con distinta expresin en una misma poblacin deben estar presentes en el mismo tubo. Las opciones de adquisicin en el citmetro deben ser las mismas en cada tubo para que pueda realizarse el Clculo de Datos. InfinicytTM tambin es capaz de armonizar las caractersticas de FSC/SSC en casos en que hay

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tinciones de superficie y e intracelulares, buscando las mismas clulas seleccionadas en los diferentes archivos. InfinicytTM incluye un sistema de control interno del proceso de Clculo de Datos que verifica que se aplican todas las condiciones anteriormente mencionadas. En todo caso, siempre es posible llevar a cabo un control propio del Clculo de Datos comparando los resultados de los datos calculados con un archivo en el que se hayan medido realmente los parmetros. Nota: La validacin del Clculo de Datos debe hacerla cada usuario para sus propios paneles teniendo en cuenta las condiciones previamente citadas.

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OBTENCIN DE ARCHIVOS DE DATOS DE MUESTRA

Para descargar los archivos de datos de muestra que se emplearn en este tutorial, visite www.infinicyt.com y haga clic en Support Tutorials and Videotutorials Tutorials o use el acceso rpido a los tutoriales (Tutorials) en el men inferior de la pgina de inicio. Descargue la carpeta con archivos de muestra (Sample Folder; Demo_Calculo_de_datos); en ella encontrar 5 archivos de estudio de sndrome linfoproliferativo crnico de clulas B (B-CLPD) con diferentes marcadores para el estudio de clulas B (ver la tabla inferior). Para analizar el archivo calculado, este panel especfico usa como marcadores comunes: FSC, SSC, CD19-PE-Cy7, CD20-PB y CD45-PO.

Tubo
1 2 3 4 5 FSC-A FSC-A FSC-A FSC-A FSC-A SSC-A SSC-A SSC-A SSC-A SSC-A

FITC CD8+ IgL CD23 CD31 CD103 CD62L

PE CD56+ IgK CD10 LAIR1 CD95 CD39

PerCPCy5.5 CD5 CD79b CD11c CD22 HLADR

PE-Cy7 CD19+ TCRgd CD19 CD19 CD19 CD19

APC

APC-H7

PB CD20+C D4 CD20 CD20 CD20 CD20

PO

CD3 CD200 IgM CXCR5 CD27

CD38 CD43 CD81 CD49d

CD45 CD45 CD45 CD45 CD45

Figura 3. Tabla de parmetros de los archivos de datos a fusionar

En el tubo 1, hay dos marcadores conjugados con el mismo fluorocromo para varios canales de fluorescencia. Esto es posible porque cada uno de los dos marcadores es especfico para una poblacin diferente. Por ejemplo, CD8 es un marcador especfico para clulas T, muestras que IgL (inmunoglobulina lambda) es especfica de clulas B. Por tanto, a la hora de analizar la muestra, es posible identificar la expresin del marcador especfico de cada poblacin modificando la visibilidad de las poblaciones.

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CALCULAR DATOS
El proceso de Clculo de Datos, es muy simple, slo hay que seguir los pasos del Asistente Calcular Datos que se explica a continuacin.

ABRIR InfinicytTM Y MDULO CALCULAR DATOS

Abrimos InfinicytTM haciendo doble-clic sobre el icono que aparece en el escritorio; a la pantalla principal seleccionamos la opcin Calcular Datos.

Figura 4. Men principal de InfinicytTM

Asistente para Calcular Datos, Paso 1

Seleccionar archivos
En primer lugar, hacemos clic en Seleccionar archivos y se abrir una ventana de seleccin de archivos. Seleccionamos el directorio donde hemos guardado la carpeta de muestra (Demo_Calculo_de_datos) y cargamos los cinco archivos incluidos. Existen varias visualizaciones diferentes en la ventana de Seleccin de Archivos: Lista de Archivos, Matriz de Parmetros (Vista Preliminar de Archivos) o ambas, siendo esta ltima la opcin por defecto. Para modificar estas vistas, haremos clic en los iconos .

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Figura 5. Paso 1: Ventana de Seleccin de Archivos

Podemos seleccionar los archivos uno a uno mediante clic + Ctrl o todos juntos con la tecla Shift o Mays. Cuando los archivos estn seleccionados, pulsar Seleccionar.

Figura 6. Ventana de Seleccin de Archivos

Tambin podemos cargar directamente los archivos a fusionar arrastrando y soltando los archivos FCS (Drag & Drop) desde la carpeta en que estn guardados hasta el cuadro de la lista de archivos, o bien directamente al icono de InfinicytTM que aparece en el escritorio. Para este tutorial emplearemos archivos simples, pero para el Clculo tambin puede utilizarse archivos fusionados.

Matriz Calcular Datos

Al seleccionar los archivos, aparecern en el Asistente Calcular Datos en el mismo orden en que han sido seleccionados. En la parte inferior de la ventana aparecer una matriz con todos los archivos seleccionados (columnas) y los parmetros que han sido medidos en cada uno de ellos (filas).

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Figura 7. Matriz Calcular Datos

Coincidencia en las leyendas de los parmetros

Para que un parmetro sea detectado como comn en diferentes archivos, InfinicytTM debe reconocer exactamente el mismo nombre en la descripcin del parmetro. En caso de que existan diferencias, ej. maysculas, puntos, guiones, comas, ortografa, etc., el software no identificar a los parmetros como comunes. Por tanto, es esencial revisar la escritura de los parmetros, muy especialmente de aquellos que son parmetros comunes. Como se menciona al inicio del tutorial, los cinco archivos de muestra deben tener como parmetros comunes FSC, SSC, CD19, CD20 y CD45, pero CD19 y CD20 no aparecen como parmetros comunes (marcados con C) en la matriz de fusin porque en el primer tubo estos anticuerpos estn combinados con TCRgd y CD4 respectivamente en el mismo fluorocromo.

Tubo
1 2 3 4 5 FSC-A FSC-A FSC-A FSC-A FSC-A SSC-A SSC-A SSC-A SSC-A SSC-A

PE-Cy7 CD19+TCRgd CD19 CD19 CD19 CD19

PB CD20+CD4 CD20 CD20 CD20 CD20

PO CD45 CD45 CD45 CD45 CD45

Figura 8. Escritura diferente de los parmetros comunes

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Para resolver las discordancias en las etiquetas, haremos clic en el botn Agrupar.

Figura 9. Resolver Discordancias en Etiquetas

Aparecer un cuadro de dilogo para seleccionar las etiquetas que deben ser agrupadas.

Agrupar CD20
Veamos un ejemplo de cmo agrupar el parmetro CD20. Como hemos visto, CD20 tiene una escritura diferente en el archivo 1 (tubo 1). Haciendo clic en , aparecer una lista con todos los parmetros.

Figura 10. Agrupar

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Seleccionamos la casilla del primer parmetro, CD20+CD4:PB-A. Nos fijamos que al seleccionar, algunos parmetros desaparecen de la lista (los pertenecientes al mismo archivo). Se crear un nuevo grupo llamado CD20+CD4: PB-A. Este nombre aparecer por defecto en la matriz de fusin como marcador comn, pero los nombres de los grupos pueden personalizarse.

Figura 11. Grupos de etiquetas para CD20

Despus, seleccionamos de la lista los siguientes parmetros que se agruparn con el primero. En este ejemplo, queremos agrupar CD20+CD4: PB-A con CD20: PB-A.

Figura 12. Grupos de etiquetas para CD20

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Si hacemos clic en el botn Hecho, en la matriz de fusin aparecer ya CD20 como parmetro comn con el nombre asignado por defecto.

Figura 13. CD20 agrupado en todos los archivos

Agrupar CD19
Ahora agruparemos el parmetro CD19. Seguimos los pasos que hemos explicado previamente para CD20, pero en este caso agrupamos CD19+TCRgd: PE-Cy7-A y CD19: PE-Cy7-A.

Figura 14. Grupos de etiquetas para CD19

Si tuvisemos ms parmetros comunes con diferente escritura, repetiramos el mismo proceso.

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Al tiempo que se crean los grupos de etiquetas, InfinicytTM elabora un diccionario con las etiquetas agrupadas. De este modo, la siguiente vez que se cargue el mismo tipo de archivos para realizar el Clculo de datos, el programa podr hacer los grupos automticamente.

Usar grupos previos

Para poder usar los grupos guardados, repetiremos los pasos del proceso de fusin y seleccionamos Agrupar, pero en este caso haremos clic en . Automticamente, agrupar las etiquetas de los parmetros usando los grupos que han sido previamente guardados en el diccionario.

Figura 15. Opcin Usar grupos previos

Seleccionamos la pestaa Grupos previos para revisar el diccionario.

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Figura 16. Grupos dentro del Diccionario

Hacemos clic en

y continuamos con el paso 2.

Asistente para Calcular Datos, Paso 2

El segundo paso en el Clculo de Datos consiste en seleccionar los eventos que van a ser calculados. Para ello, se abrirn la ventana de Anlisis Manual y varios diagramas.

Figura 17. Paso 2: Seleccionar y Clasificar eventos

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Se pueden mostrar dos tipos de diagramas: Diagramas que muestren parmetros comunes Diagramas que muestren parmetros no comunes; en stos aparecer el mensaje Regiones desactivadas.

Slo es posible dibujar regiones en los diagramas que muestren parmetros comunes dado que si queremos calcular una poblacin que est presente en todos los archivos, dicha poblacin slo puede ser seleccionada mediante parmetros comunes.

Figura 18. Tipos de diagramas

Ahora dibujaremos regiones sobre parmetros comunes para seleccionar las poblaciones que queremos calcular. En este tutorial slo queremos calcular una poblacin de inters (clulas B); en caso de que quisisemos clasificar ms de una poblacin el procedimiento sera el mismo. En nuestro ejemplo, haremos las siguientes regiones consecutivas: Dibujamos una regin en el diagrama de puntos FSC vs. SSC incluyendo los eventos presentes en la zona de linfocitos. Si necesitamos ver el diagrama en modo pantalla completa, haremos doble-clic en la barra superior del diagrama. Despus, dibujamos una regin en el diagrama de puntos CD45 vs. SSC incluyendo tambin los eventos de la zona de linfocitos. Por ltimo, dibujamos otras dos regiones consecutivas en los diagramas CD19 vs. SSC (incluyendo los eventos positivos) y CD20 vs. SSC (incluyendo los eventos positivos). De este modo, los eventos CD19 y CD20 positivos que no estn en la zona de linfocitos se eliminarn de la seleccin; slo el rea de interseccin de las cuatro regiones aparecer seleccionada (en este caso, en negro). Asignamos los eventos a la etiqueta Clulas B del rbol de Poblaciones.

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Figura 19. Regiones dibujadas en diagramas con parmetros comunes

A continuacin, hacemos clic en

y continuamos con el proceso de Clculo.

Asistente para Calcular Datos, Paso 3

En este paso debemos seleccionar la poblacin que queremos calcular. En este caso slo queremos calcular las Clulas B; por tanto, las otras poblaciones deben estar deseleccionadas (en este caso, la poblacin Eventos, en gris).

Figura 20. Paso 3: Elegir Poblaciones a Calcular

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InfinicytTM muestra el nmero de eventos que tiene la poblacin y el nmero de eventos que todava no se han calculado antes del inicio del proceso de Clculo de Datos. Hacemos clic en y continuamos con el proceso.

Ahora el programa calcular todos los parmetros presentes en el archivo para la poblacin seleccionada. Cuando el proceso de Clculo haya terminado, el programa nos mostrar una ventana con la informacin sobre el proceso. En este caso los eventos se han calculado correctamente, por lo que los Eventos no Calculados son 0. Haremos clic en Aceptar para continuar con el paso 4.

Figura 21. Informacin del proceso de Clculo de Datos

Asistente para Calcular Datos, Paso 4

Una vez que se han realizado los pasos anteriores, el proceso de Clculo ha terminado. El Paso 4 es el paso de verificacin antes de cerrar el mdulo Calcular Datos.

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Figura 22. Paso 4: Verificar y guardar resultados

Cuando el proceso de Clculo ha terminado, tenemos dos opciones: Hacer clic en el botn de Anlisis Manual si queremos trabajar directamente con el archivo generado. Hacer clic en Guardar como si no queremos analizar el archivo en ese momento y preferimos guardarlo; se salva en formato .cyt.

Si seleccionamos las opciones Anlisis Manual o Men Principal, el asistente para Calcular Datos se cerrar. InfinicytTM nos mostrar un mensaje de advertencia sobre el cierre de la ventana Calcular Datos; haremos clic en S y continuaremos con el anlisis.

Figura 23. Mensaje de Informacin

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ANLISIS DE ARCHIVOS DE DATOS CALCULADOS Opciones de Anlisis

En el Paso 4 del Asistente para Calcular Datos, podemos seleccionar entre las siguientes tres opciones: 1. Anlisis Manual 2. Guardar como 3. Men Principal

1. Anlisis Manual
Si elegimos Anlisis Manual en el Paso 4 del Asistente para Calcular Datos, iremos directamente al mdulo de Anlisis Manual. Desde la ventana de Anlisis Manual tambin es posible guardar el nuevo archivo generado (Archivo Guardar Archivo Analizado) o podemos continuar con el anlisis sin salvar los datos. Al entrar en el mdulo de Anlisis Manual, se mostrar un archivo analizado con la poblacin calculada (en este caso, Clulas B) y el resto de los eventos no analizados (en este caso, Eventos), as como el rbol de Poblaciones y los diagramas.

Figura 24. Pantalla de Anlisis Manual

Analizaremos el archivo como si se tratase de un archivo fusionado (vase tutorial de Fusin de Archivos).

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Nos fijamos en que en el archivo calculado, cada archivo incluye datos de todos los parmetros para la poblacin calculada. Es posible mostrar nueva informacin, por ejemplo, diagramas de puntos con parmetros que fueron combinados en la misma fluorescencia o parmetros que fueron medidos en diferentes archivos, como se puede apreciar en la siguiente figura.

Figura 25. Nueva informacin disponible

2. Guardar como
Si hemos elegido la opcin Guardar como en el Paso 4 del Asistente, para analizar el archivo generado accederemos al mdulo de Anlisis Manual en la pantalla principal y seleccionaremos en la ventana de Anlisis Manual Archivo Abrir Archivo Analizado. Seleccionamos el archivo calculado para abrirlo y despus realizamos en anlisis como de costumbre.

3. Men Principal
Al seleccionar Men Principal, abandonamos el Clculo de Datos sin opcin de poder salvar el proceso.

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CONTROLES DEL CLCULO DATOS

Durante el proceso de Calcular Datos, InfinicytTM intenta encontrar para cada evento de una determinada poblacin el evento equivalente en los otros archivos. A continuacin, InfinicytTM aplica los mismos valores para los parmetros que no han sido medidos realmente en cada archivo. Al igual que se explica en el tutorial de Fusin de Archivos (Controles de Coherencia de Fusin), existe tambin un sistema de control para el proceso de Calcular Datos (vase Manual de Usuario, captulo 5, Clculo de Datos, Controles del Clculo de Datos). Para acceder a la configuracin de los Controles del Clculo de Datos, seleccionaremos Perfil Configuracin Controles, tambin podemos acceder desde el primer paso del Asistente para Calcular Datos, haciendo clic en Configuracin. Una vez que la ventana de Controles est abierta, haremos clic en el botn Avanzado que aparece en la seccin Controles de Clculo de Datos; aparecer una ventana con los tres tipos de controles disponibles.

Figura 26. Controles de Clculo de Datos

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Controles de Clculo de Datos

Mxima distancia en el espacio de poblacin para excluir un evento: El valor por defecto es 100% para la mxima distancia posible para considerar para considerar dos eventos como equivalentes. Esta distancia puede reducirse para excluir los eventos que estn fuera del umbral, es decir, para que no sean considerados como vlidos en la bsqueda el evento vecino equivalente ms prximo. Mnima distancia en el espacio de poblacin para aplicar el control de heterogeneidad: El valor por defecto es 90%, pero puede cambiarse para modificar el rea en la que un evento es vlido como vecino equivalente. A los eventos que estn fuera de esta regin y dentro de la regin del control anterior se les aplicar el control de heterogeneidad. Valor para el control de heterogeneidad: Para los eventos que se encuentren dentro de la regin creada por el primer control y fuera de la segunda, el usuario puede definir la heterogeneidad mxima de la poblacin.

Configuracin de los Controles de Clculo de Datos

Vamos a repetir el proceso de Clculo de Datos, pero modificando los valores umbral de los controles. Antes de iniciar el proceso de clculo, iremos a Configuracin (en el primer paso del Asistente para Calcular Datos), cambiaremos el valor del primer control al 5% (es un valor muy estricto) y haremos clic en OK.

Figura 27. Controles del Clculo de Datos

Proceso de Calcular Datos

Para llevar a cabo el Clculo, seguiremos los pasos explicados previamente para el procedimiento normal de Clculo de Datos.

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Como se ha mencionado previamente, al finalizar el Clculo el software muestra una ventana con informacin sobre la ejecucin del proceso.

Figura 28. Eventos no calculados

Con una configuracin de controles ms estricta, aparecen 1106 eventos como no calculados. La razn es que el con un umbral ms estricto para la Mxima distancia en el espacio de poblacin para excluir un evento, el rea donde un evento dado tiene que encontrar su evento equivalente es ms restringida y, por tanto, no siempre es posible encontrar un evento equivalente. Aceptamos para continuar con el Paso 4 (Verificar y Guardar resultados).

Verificar los resultados

En el ltimo paso podemos comprobar dnde se localizan los Eventos no calculados en los diagramas de puntos, as el usuario puede decidir si quiere incluirlos o no en la poblacin calculada. Para visualizar estos eventos, haremos clic-derecho en la etiqueta de la poblacin calculada del rbol de Poblaciones y elegiremos la opcin Seleccionar eventos sin informacin para todos los parmetros. Estos eventos no calculados pueden incluirse dentro de alguna de las poblaciones definidas en el rbol de Poblaciones (poblacin celular o debris). Para ello, eliminamos la visibilidad de todas las poblaciones, dejamos slo visibles los eventos no calculados, los seleccionamos y los asignamos a la poblacin correspondiente.

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Figura 29. Eventos calculados y Eventos no calculados

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INFORMACIN ADICINAL RELACIONADA CON EL CLCULO DE DATOS

Recuerde que el Clculo de Datos es una herramienta para rellenar informacin sobre parmetros que no han sido medidos directamente en un grupo de clulas inmunofenotpicamente idnticas. Por tanto, es importante prestar atencin a la distribucin de la poblacin de inters para cada marcador. Esta situacin de grupo de clulas inmunofenotpicamente idnticas no aparece, por ejemplo, en clulas B CD19+ normales, ya que la distribucin de KAPPA y LAMBDA no es homognea (unas clulas B CD19+ son KAPPA y otras LAMBDA). Usando como marcadores comunes FSC, SSC and CD19, el proceso de Clculo nos dar un resultado errneo puesto que nos proporcionar las siguientes cuatro poblaciones: K+/L+, K+/L-, K-/L+ y K-/L-. En estos casos tenemos dos alternativas: a. Aadir ms marcadores comunes para poder identificar de forma ms clara la poblacin de inters.

b. Eliminar de la matriz de parmetros aquellos marcadores cuya expresin no es la misma dentro de la poblacin si sta se selecciona con los marcadores comunes, y hacer el Clculo sin esos parmetros. En este tutorial no hemos excluido KAPPA y LAMBDA porque la poblacin seleccionada es clonal para KAPPA (todas las clulas B CD19+ patolgicas son KAPPA). En las siguientes figuras podemos ver qu ocurre cuando hacemos el Clculo con una muestra normal sin clonalidad para KAPPA o LAMBDA. En este caso, FSC, SSC, and CD19 son marcadores comunes y tratamos de calcular los parmetros KAPPA y LAMBDA en clulas B CD19+.

Figura 30. Matriz de Fusin

1.- Dibujamos una regin en FSC vs. SSC en la zona de linfocitos y seleccionamos las clulas CD19+.

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Figura 31. Regin para seleccionar Clulas B

2.- Calculamos la poblacin de clulas B CD19+ y el resultado para KAPPA y LAMBDA ser el siguiente:

Figura 32. Datos calculados con las poblaciones ficticias

Como podemos observar hay un conflicto puesto que en las clulas B CD19+ hay unas clulas que son Kappa+ y otras Lambda+, pero no hay dobles positivos ni dobles negativos; con estos marcadores no podemos calcular la expresin de KAPPA y LAMBDA.

En resumen, para poder usar esta herramienta correctamente, deben usarse como marcadores comunes aquellos que permitan la identificacin inequvoca de una poblacin de clulas inmunofenotpicamente idnticas, que ser la poblacin calculada. Slo bajo estas condiciones la herramienta de Clculo de Datos funcionar correctamente y dar resultados fiables.

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