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Universidad de la Frontera Facultad de Ing. Ciencias y Administracin.

"Mtodos analticos aplicados al propleo"

Integrantes : Ricardo Godoy Sebastin Hernndez Andrs Prez Profesor Carrera : Felipe Gallardo : Bioqumica

Introduccin

El propleo (Del griego Pro: delante de y Polis: ciudad) es una sustancia orgnica que fabrican las abejas (Apis Mellfera) a partir de cortezas y resinas de diversas especies de origen vegetal, aunque su participacin enzimtica nos da a entender que tambin hay un origen animal. Esta sustancia de caractersticas farmacolgicas y antispticas, es utilizada para proteger a la colmena contra agentes patgenos como virus, hongos o bacterias.

Fig. 0 "Propleo" Javier Prez Espinoza

La composicin de esta sustancia se caracteriza por su complejidad, dependiendo de la zona vegetal del cual provenga. Bsicamente consiste en un 50% a 55% de resinas y blsamos, de 30% a 40% de cera de abejas, aceites esenciales en un 10%, adems de polen y otros minerales como aluminio, cromo, bario, hierro, estao entre otros (alimentacionsana.org) . Se deben considerar tambin los bioflavonoides como la galangina y pinocembrina, importantes al momento de hablar sobre las cualidades del prpoleo, ya que contribuyen en gran parte de las actividades biolgicas. De acuerdo con esto ltimo, cabe decir que los estudios cientficos demuestran que los efectos del propleo son la suma sinrgica de todos sus componentes (Tosi et al., 2007). Las porciones de impurezas ya sean orgnicas e inorgnicas dependern de factores como la poca de recoleccin, el origen vegetal de la resina y la raza de las abejas.

Este producto es conocido desde tiempos antiguos donde los primeros indicios se remontan a los griegos, quienes lo utilizaban para fabricar perfumes, y tambin los egipcios que se servan del propleo en el arte de embalsamar los cadveres. Prcticamente todas las civilizaciones del mundo antiguo como la persa, romana, china e hind conocieron los beneficios de usar este compuesto natural en alguna de sus actividades cotidianas (Vctor Hugo Groppa, 2000). En tiempo ms contemporneos, el propleo comenz a adquirir mayor importancia en la dcada de los 50 en la U.R.S.S y los pases de Europa del Este con resultados satisfactorios, donde la primera patente fue inscrita en Rumania en el ao 1965. En Amrica, Europa del Oeste y Japn, la popularidad del propleo lleg en la dcada de los 80 cuando fueron anunciadas sus propiedades farmacolgicas en el Trigsimo Congreso de Apicultura de Nagoya. Actualmente, Brasil es uno de los mayores proveedores de propleo en el mundo debido a que en este lugar se pueden encontrar climas ecuatoriales, tropicales y subtropicales, por esto su composicin qumica es mucho ms variada. Las propiedades de este son ampliamente utilizadas sobre todo en el mbito de la medicina ya sea para tratamientos de enfermedades digestivas, afecciones en vas respiratorias, regeneracin de tejidos e incluso para la salud bucal y tratamientos para reducir el crecimiento de tumores. Estos beneficios tienen su sustento en la gran variedad de vitaminas y minerales que contiene. A medida de que fue avanzando el uso de este producto apcola tanto en la industria farmacolgica, alimenticia o cosmtica surgi la necesidad de ampliar los mtodos de anlisis en cuanto a control de calidad y normalizacin de este. Tambin se ha desarrollado el rea identificacin de los compuestos responsables de muchas de las cualidades y caractersticas de esta sustancia. Estos mtodos siguen cobrando cada vez ms importancia, ya que son determinantes a la hora de cuantificar o cualificar compuestos tales como los bioflavonoides o las resinas fenlica, todo esto en pro del desarrollo cientfico e industrial del rubro de los propleos.

Normas IRAM
El Instituto Argentino de Normalizacin (IRAM) es una asociacin cuto fin es establecer normas tcnicas, adems de propender al conocimiento y la aplicacin de la normalizacin como base de la calidad, promoviendo las actividades de certificacin de productos y de sistemas de la calidad en las empresas que darn seguridad al consumidor. IRAM es el representante de la Argentina en la International Organization for Standardization (ISO), en la Comisin Panamericana de Normas Tcnicas (COPANT) y en la Asociacin MERCOSUR de Normalizacin (AMN). (Vctor Hugo Groppa, 2000) Segn estas normas, el propleo posee unas caractersticas definidas y estndares mnimos o mximos en la cuantificacin de los compuestos que son requisitos necesarios mnimos al momento de un anlisis de este.

Cualidad Aroma

Caracterstica Caracterstico de este producto: resinoso o balsmico, dependiendo de su origen botnico. Amarillo, pardo, verdoso, marrn, rojizo y otros similares, variando conforme a su origen botnico. Variable, de suave, balsmico, a fuerte y picante, dependiendo de su origen botnico. Maleable o rgido, dependiendo de su origen botnico. Tabla 1 Fuente: Victor Hugo Groppa, 2000

Color

Sabor

Consistencia (T ambiente)

Caracterstica Humedad Ceniza Ceras Impurezas mecnicas Compuestos fenlicos

Mximo o Mnimo Mximo 10% Mximo 5% Mximo 35% Mximo 25% Mnimo 5% (m/m)

Resinas solubles en etanol Mnimo 35% (m/m) Flavonoides ndice de oxidacin Mnimo 1% (m/m) Mximo 22 s.

Tabla 2 Fuente: Victor Hugo Groppa, 2000

Propiedades Antimictico Antibacterial Antisptico Antiviral Acido Antimutagnica Citotoxicidad e inhibicin de tumores Anestsico local Antihemorrgico Curacin de heridas Estimula la mitosis y aumenta la biosntesis de protenas Curacin de ulceras gastroduodenales Antioxidante Antiinflamatorio

Compuestos Qumicos Pinocembrina, cido actico y cafico Pinocembrina, Kaemferol y cido cafico cido Benzico cafico, luteolina y quercetina cido ferlico, cido cinmilo y cido coumrico cido Cafico, fenetil ester, quercetina y crisina Pinocembrina Flavonoides Acidos Fenlicos y flavonoides Arginina

Luteolina, apigenina, pinocembrina y galangina Flavonoides, cido cafico y fenetil ester Flavonoides y cido cafico

Promueve desarrollo de colgeno y elastina cido ferlico Tabla 3 Fuente: Medelln, et al, 2007

Materiales y mtodos
1) Materiales: Propleo
En la apicultura existen dos mtodos para extraer el propleo de las colmenas.

a. Raspado del propleo


Consiste en raspar con una esptula o cualquier otra herramienta con corte, todas las partes de la colmena donde las abejas han depositado propleo. Los cuadros (donde van instalados los paneles en las colmenas mviles). Las tapas, las paredes de la colmena, los cubre panales, tambin se procede de igual forma. El raspado es un trabajo arduo para el apicultor, pocos son, los que debido al esfuerzo que supone practican este mtodo. Cuando las colmenas llevan varios aos son extraer los propleos, se pueden obtener hasta 200 gr. por colmena, despus de varias horas de fatigoso raspado.

Fig. 1 Propleo obtenido mediante raspado mielarlanza.com

b. Colocacin de rejillas
Este es el mtodo ms empleado por los apicultores profesionales que se dedican a la produccin de propleo. Principalmente se utilizan dos clases de rejillas: la plstica, hecha con troquel, y las de trenzado de nylon. Consiste, en una lmina agujerada (espacios de 1,5 a 3 mm.) por donde las abejas no pueden pasar, por lo tanto, se ven en la necesidad de tapar los agujeros para impedir la entrada de fro o posible enemigos. Se colocan encima de los panales de la colmena, preferentemente en otoo, por ser la poca en que las abejas recolectan ms propleo. Despus de un periodo de tiempo prolongado (de 1 a 6 meses), la rejilla se retira de la colmena y se reemplaza por otra limpia. Para extraer el propleo de las rejillas con facilidad, se introducen en un congelador, despus de una hora en su interior, se sacuden sobre una superficie dura para que se desprenda, ya que al congelarse se vuelve muy quebradizo. Con las rejillas, se obtiene el propleo de mejor calidad y ms puro, adems arrastra muy pocas impurezas. Tambin sabemos que es fresco, ya que est empezando a fabricar desde el momento que colocamos las rejillas en las colmenas. En cambio, el obtenido mediante raspado, puede llevar muchos aos dentro de la colmena y haber perdido partes de sus valiosas cualidades. Mediante este sencillo mtodo de trabajo se pueden conseguir, de 100 a 200 gr. propleo de primera calidad, al ao. Adems a las abejas les ahorramos muchas molestias, y el apicultor emplea menos tiempo y esfuerzo.

Fig. 2 Propleos extrado con rejilla.

mielarlanza.com

2) Mtodos a) Mtodos de extraccin de la muestra de propleo


Los mtodos ms utilizados para extraer la muestra de propleo son: Maceracin La frmula de propleo ms utilizada en agricultura es la solucin hidroalcohlica. Se obtiene con la mezcla de una solucin acuosa de la maceracin del propleo en agua y la maceracin del propleo en alcohol, tambin llamado solucin alcohlica. Para esto se procede a diluir las dos soluciones con ayuda de un molinillo. Un punto a tener en cuenta es que el propleo a 30 C se torna un tanto pastoso por lo que refrigerarlo es un paso importante antes de manipularlo.

Soxhlet Es un instrumento de vidrio, que se utiliza para separar la muestra que contiene los compuestos que se desean analizar, en este caso el soxhlet separa restos de materia no deseada que contiene el propleo, como organismos externos que quedan atrapados en esta sustancia.

Fig. 3 Soxhlet glossary.periodni.com

b) Mtodos de anlisis de los compuestos del propleo.


Segn Javier Carlos Vzquez, 2010 podemos utilizar los siguientes mtodos de anlisis en muestras de propleos:

Determinacin de ceras. Metodologa: Mtodo de Soxhlet segn Norma IRAM 15.935-1: 2008. Materiales y aparatos:
1- Balanza Analtica. 2- Equipo de Soxlhet. 3- Cartuchos de celulosa. 4- Plancha calefactora. 5- Estufa. 6- Desecador.

Reactivos:
7- n-Hexano

Procedimiento:
Se pesa aproximadamente 2 gramos de muestra, los que se transfieren a un cartucho de extraccin (de porosidad adecuada que permita un rpido flujo del n-hexano); se conecta la placa calefactora y se realiza la extraccin durante 6 horas. Una vez concluida la extraccin se recupera solvente del baln por destilacin y por ltimo se elimina el hexano remanente al aire, pasando el baln a estufa a 80 C durante 30 minutos. Luego se lleva el baln a un desecador donde se enfra; transcurrido esto se pesa, se vuelve a colocar en estufa por intervalos de media a una hora hasta alcanzar una pesada constante.

Clculo y expresin de resultados: %Cera =


Donde: P1: peso del baln con cera. P2: peso del baln vaco. g: gramos de muestra pesados. - Es importante tener en cuenta el residuo del cartucho para un posterior anlisis de resinas.

Determinacin de Resinas. Metodologa: Mtodo de Soxhlet segn Norma IRAM 15.935-1: 2008. Materiales
1. Balanza Analtica. 2. Equipo de Soxlhet. 3. Cartuchos de celulosa. 4. Plancha calefactora. 5. Estufa. 6. Desecador.

Reactivos:
1- Etanol. 2- Solucin de FeCl3 al 10%.

Procedimiento:
Se coloca el residuo de muestra que qued de la extraccin de ceras en el equipo de soxlhet. En el baln se colocan aproximadamente 120 ml de etanol, se conecta la placa calefactora y se realiza la extraccin durante 6 horas. Se realiza una prueba con solucin de FeCl3 para verificar el fin de la extraccin. Una vez concluida sta, se transfiere cuantitativamente el contenido del baln a un matraz de 100 ml y se lleva a volumen con etanol. Se toman 50 ml, se coloca en un baln tarado. Se destila todo el alcohol a bao mara de 80 C, luego se lleva a estufa a 80 C, se coloca finalmente en desecador y se pesa. Se repite esta ltima operacin hasta constancia de pesada.

Clculo y expresin de resultados: %Resinas=

Donde: P1: peso del baln con resinas. P2: peso del baln vaco. g: gramos de muestra pesados. V1: volumen al cual se diluye el extracto total de resinas (100ml). V2: volumen que se toma para evaporar el alcohol y realizar el clculo (50ml). - Se debe guardar el los restos del cartucho para determinar impurezas mecnicas.

Determinacin de impurezas mecnicas.

Metodologa: Mtodo gravimtrico segn Norma IRAM 15.935-1: 2008. Materiales


1- Balanza Analtica. 2- Desecador.

Procedimiento:
Se saca el resto de la muestra que queda luego de la extraccin de ceras y resinas, se seca en estufa a 80 C, se coloca en desecador y se pesa. Se repite esta ltima operacin hasta pesada constante.

Clculo y expresin de resultados: %IM =

Donde: IM: Impurezas Mecnicas. P1: peso del cartucho con impurezas. P2: peso del cartucho vaco. g: gramos de muestra pesados.

Determinacin de compuestos fenlicos totales.


Antes de efectuar el anlisis en el laboratorio, se acondicionaron las muestras para el ensayo: se fraccionan las mismas en trozos de un centmetro de dimetro y se colocan en un refrigerador para solidificarlas. Luego se trituran los trozos en un mortero, se mezclan para su homogenizacin y finalmente se toma la cantidad adecuada (1 gramo) por triplicado para realizar la determinacin correspondiente.

Metodologa: Mtodo espectrofotomtrico segn Norma IRAM 15.935-1: 2008. Materiales: 1. Espectrofotmetro que permita hacer lecturas de absorbancia a 765 nm
2. Bao termostatizado.

Reactivos:
1. Solucin de referencia de cido glico de 0,5 mg/ml 2. Reactivo de Folin-Ciocalteu. 3. Solucin de carbonato de sodio. 4. Etanol al 10%.

Curva de calibracin
Se toman alcuotas de 5 ml, 10 ml, 15 ml, 20 ml y 25 ml de la solucin de referencia y se colocan en un matraz aforado de 25 ml. Se lleva a volumen con etanol de 10 %. Se obtienen diluciones 0,1 mg/ml; 0,2 mg/ml; 0,3 mg/ml;.0,4mg/ml y 0,5 mg/ml, respectivamente, de cido glico. Se toma 1 ml de cada una de las soluciones y se coloca en matraces aforados de 25 ml, se agregan 10 ml de agua para anlisis y 1 ml del reactivo de Folin-Ciocalteu, se agita suavemente y se deja en reposo durante 2 minutos. Se aaden 4 ml de la solucin de carbonato de sodio y se completa el volumen con agua destilada, sin agitar. Se llevan un bao mara a 50 C durante 5 minutos y se enfra hasta temperatura ambiente. Se lee la absorbancia a 765 nm, contra un blanco preparado en las mismas condiciones con los reactivos, pero utilizando 1 ml de agua para anlisis en lugar de la solucin de referencia diluida.

Procedimiento:
5 ml del extracto alcohlico obtenido en la determinacin de resinas se llevan a 100 ml con agua destilada. Se completa con agua destilada y se agita vigorosamente para estabilizar la emulsin formada. Se toma 1 ml de la solucin anterior y se coloca en un matraz de 25 ml, se agregan 10 ml de agua destilada y 1 ml del reactivo de Folin-Ciocalteu, se agita suavemente y se deja en reposo durante 2 minutos. Se aaden 4 ml de la solucin de carbonato de sodio y se completa el volumen con agua, sin agitar. Finalmente, se lleva a bao Mara a 50 C 5 minutos, y se enfra hasta temperatura ambiente. Se lee la absorbancia a 765 nm, contra un blanco.

Clculo y expresin de resultados: Donde:

Abs = B x C

C: valor de concentracin de la curva. Abs.: absorbancia. B: pendiente de la curva. - El resultado obtenido indica el contenido de compuestos fenlicos totales, en g/100 g de propleos, expresado como su equivalente en cido glico.

Determinacin de flavonoides totales. Metodologa: Mtodo espectrofotomtrico segn Norma IRAM 15.935-1: 2008. Materiales:
1. Espectrofotmetro que permita hacer lecturas de absorbancia a 425 nm 2. Bao termostatizado.

Reactivos:
1. Solucin patrn de quercetina de 100 g/ml 2. Solucin de tricloruro de aluminio al 5%. 3. Metanol.

Curva de calibracin
Se toman alcuotas de 0,5 ml, 1,0 ml, 1,5 ml, 2,0 ml y 2,5 ml de la solucin patrn de quercetina y se colocan en matraces aforado de 25 ml. Se agregan 0,5 ml de solucin de AlCl3, se lleva a volumen con metanol. Se obtienen diluciones 2 g/ml; 4 g/ml; 6 g/ml; 8 g/ml y 10 g/ml, respectivamente, de quercetina. Se dejan en oscuridad 30 minutos, luego se leen las absorbancias a 425 nm contra un blanco preparado en las mismas condiciones con los reactivos, pero utilizando agua para anlisis en lugar de la solucin.

Procedimiento:
0,1 ml del extracto alcohlico obtenido en la determinacin de resinas se colocan en matraz de 25 ml, se agregan 0,5 ml de solucin de AlCl3 se lleva a volumen con metanol, se deja en oscuridad 30 minutos y se lee a 425nm. Se prepara un blanco utilizando 0,1 ml de agua destilada.

Clculo y expresin de resultados:

Fe =
Donde:
Abs b.C

C: valor de concentracin de la curva. Abs.: absorbancia. B: pendiente de la curva.

- El resultado obtenido indica el contenido de flavonoides totales, en g/100 g de propleos, expresado como su equivalente en quercetina. Determinacin del ndice de oxidacin
Este ndice se define como el tiempo de decoloracin, medido en segundos, de una solucin de permanganato de potasio 0.1N por accin de los compuestos oxidantes del propleos. Para ello, se tritur la muestra con alcohol de 96, luego se llev a 100mL con agua destilada y se filtr. Se tom una alcuota del filtrado, se acidific con cido sulfrico al 20 % y se aadi una gota de permanganato de potasio 0.1N. Se midi con cronmetro el tiempo de decoloracin. (Mensagem Doce, 1999)

Fundamentos de las tcnicas empleadas.


Ceras: Se aprovecha la solubilidad de la cera en solventes orgnicos como del n-hexano, se extrae en el mismo y se determina gravimtricamente. Resinas: Se realiza una extraccin similar a la anterior, empleando etanol como solvente, ya que las resinas son altamente solubles en alcohol. (Ass, 1989) Fenoles Totales: Se basa en una reaccin colorimtrica de oxido-reduccin. El reactivo de Folin-Ciocalteau es una mezcla de cido fosfotngstico (H3PW12O10) y de cido fosfomolbdico (H3PMo12O40), que se reduce, en medio alcalino, por oxidacin de los compuestos fenlicos, a una mezcla de xidos azules de tungsteno (W8O23) y de molibdeno (Mo8O23). La coloracin azul producida presenta absorbancia mxima a 765nm. y es proporcional al contenido de compuestos fenlicos presentes en la muestra (Singleton y Rossi, 1965). Flavonoides totales: Se us espectrofotometra en el UV, utilizando cloruro de aluminio (AlCl3) como reactivo (Sawaya et al., 2011). Se fundamenta en la formacin de un complejo coloreado estable de los flavonoides con el catin aluminio (AlCl3) en metanol, produciendo un corrimiento batocrmico con intensificacin de la absorbancia a 425-428 nm. As se evita la interferencia de otras sustancias fenlicas principalmente cidos fenlicos. (Marcucci et al., 1998)

Impurezas mecnicas: Se basa en la determinacin gravimtrica de los residuos que quedan luego de las dos extracciones (con n-hexano y con etanol).

Resultados obtenidos mediante Cromatografia aplicada a propleo brasileo. Cromatografa Lquida de Alta Eficacia (HPLC)
Como los extractos de propleos son solubles en etanol y en soluciones hidroalcohlica, el mtodo de cromatografa lquida de alta eficacia (HPLC), se ha convertido en el mtodo cromatogrfico ms utilizado para el anlisis de propleos. Compuestos fenlicos y flavonoides pueden absorber en la gama UV-Vis y fcilmente se puede detectar con un detector de arreglo de diodos (DAD). HPLC-DAD se ha aplicado a la tipificacin de propleo brasileo (figura 1). Tambin se ha aplicado con xito a la identificacin y cuantificacin de componentes en fracciones de propleos obtenidos por cromatografa de columna abierta. Sin embargo, terpenos tienen una mala absorcion del UV-Vis y pueden pasar desapercibidos, para ello se puede utilizar mtodos como el de espectrometra de masas. (Sawaya et al., 2011)

Fig. 4 (Sawaya et al., 2011) Perfiles de HPLC-DAD de muestras de: propleos A) BRP/verde de So Paulo y Minas Gerais, propleos B) BRP/verde de Paran, propleos C) BRG/marrn de D) mixta BRPG verde y marrn de Paran, Paran y Santa Catarina. Compuestos: cido (1) cafeico, cido (2) p-cumrico, cido dicaffeoylquinnic (3), (4) dihydrokampferide, (5) 3-Lucas-4-hidroxicinmico cido, cido (6) 2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran-6-propenoic, (7) 3,5-diprenyl-4-hidroxicinmico cido, cido (8) 2,2-dimethyl-8-prenyl-2H-1-benzopyran-6-propenoic, el cido cinmico (9) 3Lucas-4-dihydrocinnamoyloxy (10) vainillina, (11) 3-methoxy-4-hydroxycinnamaldehyde y (12) viscidone.

Otras tcnicas cromatogrficas utilizadas para el anlisis del propleo y aislamiento de sus componentes:

Cromatografa de Columna Abierta (CC)


Utilizado para el aislamiento de lignanos y cidos diterpnicos que previamente fue necesario para encontrar tri-terpenos, compuestos fenlicos y flavonoides. La matriz compleja de propleos puede dividirse en fracciones por cromatografa en columna abierta, en un esfuerzo por reducir los componentes de cada fraccin que podran ser responsables de una determinada actividad biolgica y luego se identifican los compuestos en la fraccin activa por otros medios. (Custodio et al., 2000)

Cromatografa en capa fina (TLC)


Puede utilizarse para comparar muestras de propleos, o diferentes tipos de extractos de la misma muestra de propleos. Ciertas actividades biolgicas como antifungicidas, antibacteriano y antioxidante pueden determinarse directamente en TLC, y los compuestos responsables de estas actividades se extraen y se identifican por otros medios. El uso de TLC para caracterizacin de propleos es bastante limitado, ya que el nmero de componentes es demasiado grande para una separacin adecuada. (Sawaya et al., 2002)

Conclusin

En la actualidad, los mtodos analticos adquieren una gran importancia en el mbito de los propleos, ya que su utilidad ya sea para la investigacin o fabricacin de productos derivados de ste, son esenciales en el rubro de la apicultura. Actualmente es posible ver como el propoleo ha entrado de lleno al mercado abarcando mltiples usos dentro de la medicina, siendo un excelente producto natural. La fabricacin de estos elementos as como tambin el uso que tendrn se basan en gran parte en los compuestos orgnicos que contienen, como los flavonoides, o las vitaminas y minerales que existen. Sin duda si no existieran mtodos de anlisis apropiados hubiera sido mucho ms difcil poder aprovechar estos recursos. El mtodos de extraccin como la maceracin y el mtodo soxhlet son de suma importancia sobre todo para el enfoque productivo que se requiera del propoleo, ya que se debe tener el total cuidado de obtener una muestra representativa de esta sustancia donde se encuentren todos los componentes que se requieren. Los mtodos de anlisis juegan tambin un papel muy importante al determinar los compuestos qumicos que contiene la muestra ya que aqu se ver si esta ltima cumple con las cantidades de analito que se requieren para la produccin o investigacin. En primer caso la gravimetra nos permite desechar impurezas que interfieran nuestro anlisis, para despus seguirle la cromatografa con la cual se cuantificarn los tan nombrados flavonoides responsables de las cualidades medicinales del propoleo. Sin duda aunque se haya avanzado bastante en los ltimos aos con respecto a esta sustancia de la naturaleza, an queda bastante por investigar, y es ah donde los mtodos analticos cumplen su tarea prcticamente como pilar fundamental en la produccin industrial y en la investigacin cientfica.

Bibliografa

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TABLA 3 MEDELLIN PICO, R.; CORREA, B.; PEREZ, A. (2007). Los Beneficios del propleos. Apitec N 60. Tosi, E; Re, E; Ortega, M; Cazzoli, A (2007). Food preservative based on propolis: Bacteriostatic activity of propolis polyphenols and flavonoids upon Escherichia coli. Food Chemistry (Sciencedirect.com) 104 (3): pp. 1025-29

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