UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA

PRACTICAS DE LABORATORIO IDENTIFICACION BACTERIANA

Maye Bernal Rivera Profesora Asistente

Introduccin Para establecer el Diagnstico Etiolgico de la Enfermedad Infecciosa, hay que partir de una muestra clnica procedente del paciente en estudio, para ser procesado en el Laboratorio Clnico, dependiendo del Diagnstico Presuntivo consignado en la Orden de Solicitud expedida por el mdico tratante. Para realizar la Identificacin Bacteriana la muestra del paciente se siembra en diferentes medios de cultivo, en condiciones ambientales especficas, dependiendo del microorganismo que se pretenda aislar. Esta primera parte del mdulo de Bacteriologa corresponde a la identificacin del microorganismo (gnero y especie) la cual conlleva a establecer el Diagnstico Etiolgico. Medios de Cultivo Definicin: Medio de Cultivo es el conjunto de nutrientes y sustratos que permiten el crecimiento la multiplicacin y el aislamiento de las diferentes especies bacterianas para llegar a su identificacin y otros estudios complementarios, tales como su comportamiento frente a los antimicrobianos. Un medio de cultivo mnimo debe tener: agua, una fuente de carbono, una fuente de nitrgeno y una sal para mantener estable la concentracin de iones. Clasificacin Los medios de cultivo se clasifican de acuerdo a: Origen - Naturales - Sintticos Consistencia - Lquidos - Slidos - Semi-slidos Composicin - Nutritivos - Enriquecidos - Selectivos - Diferenciales

Medios de Transporte Son aquellos que aseguran la viabilidad de la bacteria desde el momento de la toma de la muestra hasta su llegada y procesamiento en el Laboratorio. Carecen de un nutriente mnimo indispensable, evitando as el crecimiento de las bacterias. Como ejemplo tenemos el medio de Stuart, Ames, Slica gel, Cary Blair, etc. Medios de Conservacin Son medios que permiten mantener la viabilidad de las bacterias, conservando sus caractersticas fisiolgicas, morfolgicas, tintoriales, etc. Los hay para tiempos cortos y tiempos ms prolongados, aunque para mantener y garantizar todas las caractersticas bacterianas se deben conservar liofilizadas o congeladas a -70C o en nitrgeno a -120C. . Ejemplos de este tipo de medios son: medio de Dorset, medio de leche descremada triptona glucosa glicerol (LDTGG), solucin de Greaves, etc. Para el cultivo de bacterias, adems de suministrarles sus requerimientos nutricionales (medios de cultivo ptimos), se les debe proporcionar las condiciones ambientales necesarias para permitirles su crecimiento y multiplicacin. Condiciones ambientales - Temperatura - Concentracin atmosfrica - Presencia de de O2 (Aerobiosis) - Disminucin de O2 (Microaerofilia) - Presencia de CO2 (Capnofilia) - Atmsfera de Nitrgeno (Anaerobiosis) - Porcentaje de humedad - Presencia de Luz Seleccin de Medios Para la recuperacin de los microorganismos a partir de las muestras clnicas, es indispensable hacer la seleccin adecuada de los medios primarios de cultivo para obtener resultados ptimos. Es importante para el medico conocer los diferentes medios utilizados en el Laboratorio Clnico para en un momento dado poder interpretar adecuadamente los resultados y detectar posibles falsos negativos. En el siguiente cuadro se pude ver, dependiendo del agente etiolgico en determinada entidad, el medio de cultivo adecuado.

SELECCION DE MEDIOS DE CULTIVO

Entidad Faringitis estreptoccica Uretritis gonoccica Tuberculosis pulmonar Tos ferina
modificado

Agente Etiolgico Streptococcus pyogenes Neisseria gonorrhoeae Mycobacterium tuberculosis Bordetella pertussis

Medio de Cultivo Agar Sangre Thayer Martin * Ogawa Kudoh Bordet Gengou

Tcnicas de Inoculacin Las tcnicas para inocular las muestras en los diferentes medios de cultivo varan, dependiendo del objetivo. Esterilizacin del Asa Bacteriolgica Las asas bacteriolgicas bsicamente son alambres unidos a un mango que permite manipularlas. El alambre puede ser de diferente material, (ferro nquel, nicromo, platino, etc.) y la forma (recta, curva, etc.,) dependiendo de la necesidad. Para su esterilizacin se utiliza calor seco (llama), y se procede as: Prender el mechero Tomar el asa bacteriolgica por el mango y colocarla en posicin vertical, sobre la llama del mechero, hasta que el alambre quede al rojo vivo. Dejar enfriar o enfriar dentro del medio de cultivo, antes de tomar las colonias.

Inoculacin en Medios de Cultivo en Tubo de Ensayo 1. Siembra en Medio Lquido (Caldo) - Obtener la muestra con asa bacteriolgica o escobilln - Introducir en el caldo de cultivo, haciendo movimientos de rotacin. 2. Siembra en Agar Inclinado (pico de flauta) - Obtener la muestra con asa - Hacer estras en la superficie del medio 3. Siembra en Agar semislido (taco) - Obtener la muestra con asa recta - Hacer una picadura por el centro, hasta la mitad del medio

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Medios en Caja de Petr Siembra por agotamiento:

El objetivo de esta tcnica es diluir la muestra de tal manera que al final se obtenga colonias separadas para poder iniciar el estudio de identificacin y sensibilidad a los antimicrobianos. 1. Obtener la muestra con escobilln o asa y suspenderla en un extremo de la placa de agar, haciendo estras (lneas) de un extremo a otro (primer cuadrante) 2. Flamear el asa, enfriar en el extremo e iniciar estras desde el cuadrante primero y extenderlas hasta el cuadrante dos 3. Flamear el asa, enfriar en el extremo e iniciar estras desde el cuadrante dos y extenderlas hasta el cuadrante tres 4. Flamear el asa, enfriar en el extremo e iniciar estras desde el cuadrante tres y extenderlas hasta el cuadrante cuatro.

Siembra en cuadrcula: El objetivo de esta tcnica es hacer recuento de unidades formadoras de colonias (UFC) 1. Obtener la muestra con asa calibrada o pipeta automtica que dispense una cantidad exacta y distribuirla con el asa en lnea recta por todo el centro 2. Hacer estras de extremo a extremo en sentido contrario a la lnea de inculo 3. Girar la placa y hacer estras de extremo a extremo, en sentido contrario a las anteriores

PRACTICA DE LABORATORIO
Objetivo Proporcionar al estudiante el conocimiento cientfico y las habilidades prcticas de los mtodos y tcnicas utilizados en Microbiologa Mdica para el aislamiento e identificacin de los principales agentes patgenos para el hombre a partir de muestras clnicas, lo que le permitir actuar correctamente en su prctica mdica en el campo de las enfermedades infecciosas.

PARTE I. SIEMBRA
Objetivos especficos

Practicar el manejo asptico de medios de cultivo Aprender a esterilizar el asa bacteriolgica Realizar la transferencia de bacterias de desde un cultivo puro a diferentes medios de cultivo. Tomar una muestra de frotis farngeo. Objetivos: - Trabajar con una muestra real - Aprender a tomar una muestra farngea - Practicar la siembra por agotamiento en una placa de Agar Sangre - Conocer un cultivo bacteriano mixto - Apreciar y conocer la flora bacteriana normal en orofaringe - Detectar portadores de Streptococcus pyogenes - Informar adecuadamente el resultado del faringocultivo, para una correcta interpretacin de reportes recibidos posteriormente.

Materiales Asa curva y asa recta Mechero Cepas bacterianas puras Medios de Cultivo - Tubos: - Caldo Nutritivo - Agar Nutritivo (inclinado) - Agar semislido (taco) - Cajas de Petr - Agar Nutritivo - Agar Sangre (2 cajas) - Agar Mc Conkey - Escobillones y baja-lenguas estriles

Procedimiento 1. Conocer, ordenar y describir cada uno de los 6 medios de cultivo que va a sembrar 2. Marcar en la base (nunca en la tapa) adecuadamente cada uno de los medios.
Pedro Lpez 170305001 FF

La etiqueta debe contener: 1. Nombre del paciente 2. Registro de laboratorio, que debe incluir la fecha y consecutivo del Laboratorio 3. Tipo de muestra

3. Siembra en Caldo de cultivo:

4. Coger con la mano izquierda el tubo que contiene la cepa pura, 5. Coger el asa con la mano derecha y esterilizarla 6. Retirar la tapa del tubo con el dedo meique de la mano derecha y mantenerla ah (no colocar sobre el mesn, para evitar contaminacin) 7. Flamear la boca del tubo 8. Introducir el asa estril y tomar una colonia 9. Flamear nuevamente la boca del tubo y colocar la tapa 10. Coger el tubo que contiene el caldo con la mano izquierda, y con el meique de la derecha retirar la tapa, flamear la boca del tubo 11. Introducir el asa en el caldo y dar movimientos de rotacin 12. Retirar el asa, flamear y tapar el tubo 13. Esterilizar el asa 14. Siembra en Agar Inclinado: Seguir los mismos pasos (4 al 13) pero al sembrar hacer estras sobre la superficie del agar 15. Siembra en Agar semislido: Seguir los mismos pasos (4 al 13) pero al sembrar, utilizar el asa recta e inocular en lnea recta por el centro y hasta la mitad del agar. 16. Siembra en Agar, en Cajas de Petr: Sembrar por agotamiento primero el Agar Nutritivo, luego el Agar Sangre y por ltimo el agar McConkey, as: a. Seguir los pasos 4 al 9 b. Tomar la base de la caja por los bordes, con el ndice y pulgar de la mano izquierda y voltear la mano para que la superficie del agar quede hacia arriba c. Descargar el inculo en el primer cuadrante haciendo estras de lado a lado, como lo indica la figura (ver arriba, siembra por agotamiento); flamear el asa y enfriarla en un extremo del agar d. Girar la caja e iniciar las estras partiendo del primer cuadrante, flamear el asa, y enfriarla en el extremo del agar e. Girar nuevamente la caja y repetir una vez ms el mismo procedimiento. 17. Colocar las cajas de Agar Sangre con la tapa hacia abajo dentro de la jarra con vela (CO2 al 5%) 18. Colocar los otros medios (cajas con la tapa hacia abajo y tubos en los vasos) en la canasta destinada para ello 19. Incubar a 37C por 24 horas en aerobiosis Siembra a partir de muestra farngea 1. Identificar correctamente la caja 2. Sentar al paciente cmodo 3. Alistar el escobilln (pretratado) y bajalenguas estriles 4. Colocarse los guantes 5. Indicar al paciente que abra la boca, colocar el bajalenguas y con el escobilln frotar las amgdalas 6. Hacer la siembra por agotamiento y luego picar el medio unas 4 veces 7. Incubar en CO2, 24 horas a 37C. Actividad 1. Clasifique los medios de cultivo utilizados

2. Investigue en caso de ser necesario transportar una muestra farngea, cul o cules medios de transporte se recomiendan 3. Describa las tcnicas de siembra y su utilidad 4. Una vez obtenido el crecimiento, que pasos se debe seguir para la identificacin bacteriana? 5. Escriba los microorganismos que forman parte de la flora normal farngea