REVISIONES

Cultivos celulares: utilidad en investigacin biomdica

M. Cofn y J. Fernndez-Sol
Grupo de Investigacin Muscular. Laboratorio de Cultivos Celulares. Servicio de Medicina Interna General. Hospital Clnic i Provincial. Barcelona.

cultivos celulares, medios de cultivo

Los cultivos celulares son un procedimiento tecnolgico de mantenimiento y estudio de clulas vivas en un medio artificial que permite reproducir, de forma bastante fiable, las condiciones biolgicas que las clulas tienen en su lugar de origen. Las reas de aplicacin potencial de los cultivos celulares se han ido ampliando de forma progresiva, por lo que constituyen ya una tcnica habitual en muchos procedimientos de investigacin1,2. En este artculo se revisan los principios, ventajas, inconvenientes y principales aplicaciones actuales de los cultivos celulares en ciencias biomdicas. Potencialmente todas las clulas son cultivables, pero cada una de ellas presenta peculiaridades y requerimientos especficos3. Ello hace que existan numerosos modelos diferenciados de cultivo celular (tabla 1). Segn su estructura, se pueden diferenciar tres grandes grupos de cultivo celular: cultivo de rgano, cultivo de tejido y cultivo de clulas aisladas. En el cultivo de rgano y de tejido, se mantienen la estructura y funcin intactas del rgano entero o de una parte del mismo, sin disociar sus clulas4,5. Se dispone as de una poblacin heterogneo de clulas que se puede mantener slo durante un perodo de tiempo limitado6. El cultivo de clulas aisladas es un sistema biolgico que logra la supervivencia fuera del organismo de clulas independientes, pero capaces de dividirse y mantener sus funciones in vitro . Esta ltima modalidad se denomina tambin cultivo en monocapa o suspensin y es la ms utilizada habitualmente7-9 . Existe tambin la posibilidad de realizar un cultivo limitado en el tiempo de organelas subcelulares como las mitocondrias, retculo sarcoplasmtico y ribosomas10,11 . La posibilidad de realizar cultivos celulares es relativamente reciente. Harrison12 y Carrel13 describieron entre 1885 y 1900 las primeras tcnicas de cultivo hstico al intentar mantener neuronas vivas fuera del organismo y delimitaron as sus principales normas de mantenimiento. En 1933, Gey14 consigui el primer cultivo de clulas tumorales. Las tcnicas de separacin enzimtica de tejido se iniciaron en 1952 cuando Moscona15 tripsiniz fragmentos de embrin de pollo y consigui clulas aisladas capaces de crecer in vitro sobre placa de cultivo, tcnica que, con mejoras, sigue an usndose en nuestros das. En los ltimos veinte aos, y de forma clara-

mente exponencial, han aparecido mltiples variantes tcnicas y campos potenciales de aplicacin de los cultivos celulares. Inicialmente, los cultivos se emplearon para el estudio del comportamiento biolgico de los tumores16,17 , pero actualmente sus aplicaciones son mltiples18 y se han extendido a campos tan diversos como pueden ser el estudio de enfermedades inmunolgicas19, genticas 20 y al control de salud ambiental21,22 . No todas las clulas presentan las mismas caractersticas dinmicas y de mantenimiento en cultivo1,23. As, existen clulas sin capacidad de reproduccin o divisin celular que se pueden mantener en medios de cultivo de forma limitada y a las que se denominan clulas terminales. Tal es el caso de las neuronas o de las clulas miocrdicas. Otros tipos celulares como los fibroblastos, las clulas epiteliales y las tumorales se mantienen de forma ms prolongada en los medios de cultivo. Espontneamente, por clonacin o por induccin mediante substancias qumicas o virus (SV-40), algunas clulas pueden transformarse y mantenerse indefinidamente en el medio de cultivo y dar lugar a lneas celulares permanentes2,3. Segn la fuente de obtencin de clulas, un cultivo se denomina primario si procede directamente del organismo vivo, y secundario cuando se obtiene de la resiembra de otro cultivo. A partir de este punto se puede hablar de lneas celulares, ya que se trata de clulas que mantienen sus caractersticas de una forma constante y homognea a lo largo TABLA 1 Principales modelos de cultivo celular
Clulas mesenquimatosas Fibroblastos Condrocitos Clulas musculares esquelticas y cardacas Adipocitos Osteoblastos Clulas endoteliales Clulas neuroepiteliales y parenquimatosas Clulas epidrmicas: queratinocitos y melnocitos Neuronas corticales y medulares Clulas de la gla Clulas endocrinas Hepatocitos Clulas renales Clulas bronquiales y pulmonares Clulas hematopoyticas Medula sea Clulas linfoides Clulas mieloides Clulas eritroides Clulas gonadales Hibridomas Clulas tumorales

Este trabajo ha sido realizado parcialmente con las ayudas EE 90/2-4.098 CIRIT. Generalitat de Catalunya y FIS de la SS 92/0699. Correspondencia: Dr. J. Fernndez-Sol. Grupo de Investigacin Muscular. Servicio de Medicina Interna General. Hospital Clnic i Provincial. Villarroel, 170. 08036 Barcelona. Manuscrito recibido el 6-5-1991

Med Clin (Barc) 1992; 98: 782-789

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del tiempo. Un cultivo puro es el que contiene clulas de un solo tipo, pero existen tambin cultivos celulares mixtos, en los que coexisten clulas de diversos tipos celulares, por ejemplo msculo estriado y nervio9. Sin embargo, no es posible realizar un cultivo mixto de cualquier combinacin de clulas 3. Cuando las clulas a cultivar se encuentran libres o circulantes en su origen, pueden cultivarse en suspensin. Tal es el caso de las clulas hematopoyticas24. Si las clulas proceden de un tejido compacto, deben primero someterse a tcnicas de disociacin mecnica y/o enzimtica que las independicen y faciliten as su contacto entre s y con la superficie de cultivo. Para la disociacin mecnica, se emplean tcnicas de microcorte, separacin por vibracin, centrifugacin diferencial o electroforesis25,26. Para la disociacin enzimtica, se utilizan enzimas proteolticas (tripsina, colagenasa, pronasa, dispasa) encargadas de romper la matriz intersticial sin causar lesin celular 27, aunque este ltimo trmino no siempre se consigue plenamente28,29 . Una vez separadas las clulas, debe procederse a su recuento mediante una cmara de Newbauer y verificar su viabilidad30. Todo ello se realiza con la finalidad de sembrar una concentracin de clulas adecuada a la superficie a cultivar. Un defecto en el nmero de clulas dificultar su contacto y potencial fusin e hipotecar su supervivencia. Un exceso de clulas no permite su distribucin en monocapa y dificulta su crecimiento organizado. Las clulas deben mantenerse en unas condiciones ambientales y nutritivas correctas para su subsistencia 2,3, para ello se incluyen en un medio de cultivo apropiado. Aun cuando la mayora de medios de cultivo presentan una composicin similar, cada tipo celular tiene unos requerimientos diferenciales31. Por ello, se han desarrollado numerosos medios de cultivo especficos para un determinado tipo celular (tabla 2). A los medios de cultivo es frecuente aadirles suero con el objeto de mejorar sus caractersticas citodinmicas32. Sin embargo, la composicin del suero animal no es homognea y pueden existir componentes que modifiquen o interfieran diversos procesos celulares, y ocasionar as cambios no controlables31,33 . Se denominan medios de base los que contienen una cierta concentracin de suero y medios definidos los que prescinden de este elemento y presentan una composicin tanto cualitativa como cuantitativa perfectamente conocida31. En la actualidad se tiende a la utilizacin de medios adaptados a cada tipo celular y sin suero o con sustitutos sintticos del mismo para obviar los problemas antes referidos 33,34. Adems del medio de cultivo, existen diversos aditivos como son los extractos embrionarios, hormonas (corticoides, insulina) y los factores de crecimiento que pueden ayudar a modificar las caractersticas de la dinmica de reproduccin y diferenciacin de las clulas en cultivo33,35-37. En la tabla 3 se refieren los factores de crecimiento ms conocidos. En la metdica de realizacin de cultivos, un factor importante a considerar es el recipiente del cultivo. Este debe ser de tamao adecuado al nmero de clulas sembradas y debe disponer de una superficie apropiada que facilite la adherencia celular y su posterior diferenciacin. Inicialmente se utilizaban recipientes de vidrio, pero ste no era un material idneo. En la actualidad se usan recipientes desechables de plstico acondicionados en su superficie mediante tratamiento fsico (radiaciones gamma) 1,3. Tambin se puede aadir al recipiente factores de adherencia tales como la gelatina, colgeno, fibronectina o laminina, que mejoran sus condiciones de contacto celular38,39 . Existen diferentes formas y tamaos de recipientes en funcin de las necesidades especficas de cada cultivo, ya que la concentracin celular es un factor limitante. Todo el sistema de cultivo debe mantenerse a su vez en condiciones ptimas de temperatura y oxigenacin, preservndolo de una posible contaminacin. Para ello se utilizan las

TABLA 2 Medios de cultivo utilizados segn el tipo celular

Tipo celular Medio de cultivo

Fibroblastos Condrocitos Clulas epiteliales (queratinocitos) Clulas neoplsicas

Clulas musculares lisas Clulas musculares esquelticas Clulas cardacas Clulas endoteliales Clulas hematopoyticas (lnea granulomonocitaria) Clulas de la lnea eritroblstica (medula sea) Macrfagos Hibridomas Clulas glandulares de la adenohipfisis Neuronas y clulas gliales Clulas glomerulares Adipocitos Hepatocitos Clulas amniticas Clulas de la crnea

MEM-BME Ham F-12 MEM-DMEM DMEM: F12 - RPMI Medios definidos sin suero especficos para cada lnea tumoral DMEM-Ham F12 DMEM MEM-DMEM Medio 199 MEM-McCoy IMDM MEM-DMEM-RPMI Opti-MEM1 Reduced Hibridoma Medium HAM F12-HAM F10 DMEM: F12 MEM RPMI-Medio de Waitmouth Ml99-DMEM DMEM-M199 Ham F-10-Ham F12-M199Williams E/Leibovitz15 Ham F-10 DMEM: F-12

MEM = minimal essenctial medium; DMEM = Dubelco minimal essenctial medium; BME = basal eagle medium; IMDM = Iscovers modified Dubelcos medium .

TABLA 3 Principales factores de crecimiento para las clulas en cultivo

Factores de crecimiento Clulas aplicables

Factor de crecimiento epidrmico (EGF) Factor de crecimiento relacionado con la insulina (IGF) Factor de crecimiento neural (NGF) Factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) Factor de transformacin (TGF) Factor de crecimiento fibroblstico (FGF) Interleucina-2 (ILA-2) Factor estimulante de colonias tipo 1 Factor estimulante de colonias tipo 2 Factor estimulante de colonias tipo 3 Factor de crecimiento celular tipo Y

Epiteliales y mesenquimatosas Epiteliales y mesenquimatosas Neuronas Mesenquimatosas y trofoblsticas Epiteliales y mesenquimatosas Epiteliales y fibroblastos Linfocitos citotxicos Macrfagos Macrfagos y granulocitos Eosinfilos, mastocitos y linfocitos T Linfocitos T

estufas de cultivo que mantienen unas condiciones ambientales de temperatura, humedad y oxigenacin constantes. Para garantizar la estabilidad en el pH celular, se adicionan a los medios de cultivo tampones biolgicos (CO3H-, PO4H-, HEPES), junto con un indicador (rojo fenol) que nos marcar cualquier cambio del mismo. Es necesario controlar la osmolaridad del medio mediante una tensin de vapor de agua ambiental que evita la evaporacin del medio. El mantenimiento de unas condiciones estrictas de esterilidad es una premisa bsica para la supervivencia y la potencial utilizacin de los cultivos para estudio1,2. Por sus caractersticas biolgicas, los cultivos celulares pueden ser contaminados fcilmente por numerosos grmenes40. En la tabla 4 se refieren los grmenes ms habituales. De ellos, la contaminacin bacteriana es potencialmente controlable mediante la adicin de pequeas cantidades de antibiticos (penicilina, gentamicina) al medio de cultivo, y la contaminacin fngica 783

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mediante la adicin de anfotericina B. Sin embargo, muchos autores propugnan la no utilizacin de antibiticos en el medio ya que pueden interferir en los procesos metablicos celulares y alterar las condiciones del cultivo3. Ms difcil es el control de la infeccin de virus y micoplasmas, organismos habitualmente intracelulares y que presentan una gran capacidad de supervivencia en cultivo41,42. Para evitarlos, slo es vlida la realizacin estricta de los diferentes pasos con una estricta tcnica asptica1. En los cultivos secundarios la adicin de antibiticos puede enmascarar una contaminacin latente y modificar de por s las condiciones basales del medio43. El mantenimiento de un ambiente asptico no se limita a los medios y frascos de cultivo sino que debe extenderse a la habitacin donde se realizan los mismos y a todos los pasos intermedios referidos1. La habitacin o dependencia donde se realizan los cultivos debe estar aislada del exterior, evitando corrientes de aire y el acceso de partculas de polvo mediante la instalacin de aireacin controlada y filtrada, con un flujo vertical descendente. La diseccin del tejido, disociacin y cambios de medio deben realizarse siempre en una campana de flujo areo laminar vertical que evita la introduccin de partculas desde el medio al cultivo. El operador debe equiparse de guantes estriles, mascarilla y adems utensilios habituales de una estricta tcnica asptica. Las clulas en cultivo tienen una vida limitada que depender de cada tipo celular concreto. La realizacin de subcultivos permite obviar parcialmente este problema, pero el fenmeno de senescencia celular se mantiene en el cultivo de forma semejante al tejido original 23,44. La capacidad de reproduccin celular se puede valorar mediante el tiempo de duplicacin y por recuento del nmero total de clulas existente. Las clulas en cultivo pueden tambin someterse a procesos de criopreservacin que las mantienen viables durante un perodo largo de tiempo a partir de cualquier momento de su ciclo celular45,46. Dado que las caractersticas de un modelo de cultivo a otro son diferentes, se describirn algunas particularidades de algunos ellos. Cultivos celulares especficos

TABLA 4 Microorganismos aislados habitualmente como contaminantes de los cultivos celulares y sus fuentes habituales de contaminacin
Mycoplasma M. orale M. fermentans M. arginini M. hominis M. hyorhinis M. bovis Acholeplasma laidlawi Virus Enterovirus Virus sincitial respiratorio Citomegalovirus Agente de la rinotraquetis infecciosa Bacterias Pseudomonas Micrococos Estafilococos Escherichia coli Estreptococos Bacillus diphtheroides Klebsiella Enterobacter Difterioides Hongos Aspergillus (fumigatus, niger) Mucor Oospora Penicillium Candida Levaduras
Fuentes habituales de contaminacin Tejidos originales (en cultivo primario): piel, tracto digestivo y respiratorio Lnea celular establecida Reactivos Medio de cultivo Suero Factores de crecimiento Soluciones salinas Utillaje (pipetas, jeringas, agujas) Aire ambiental (campana de flujo, personal directa e indirectamente) Personal directo: ropa, piel, cabello Personal indirecto (aerosoles)

Clulas mesenquimatosas Los fibroblastos son un modelo de cultivo celular perfectamente caracterizado y fcil de reproducir. Cuando se cultivan, tienen una morfologa fusiforme o estrellada con prolongaciones celulares caractersticas lo que hace que sean fcilmente identificables. Crecen en monocapa, sin grandes requerimientos nutritivos, con una gran facilidad de adherencia al soporte de cultivo. Los fibroblastos se pueden obtener a partir del tejido conjuntivo a cualquier nivel, aunque por su facilidad de acceso, se obtienen habitualmente de la dermis 47. Su marcador especfico es la produccin de colgeno tipo l. Dada su ubicuidad y facilidad de cultivo es frecuente que contaminen otros cultivos celulares (clulas epiteliales, msculo). Tambin es fcil establecer lneas celulares tanto de tejidos embrionarios como de adulto. Su principal utilidad est en el estudio y deteccin de enfermedades metablicas, flujos celulares, diferenciacin celular y en el diagnstico gentico. Las clulas adiposas son tambin de fcil obtencin y cultivo. Se utilizan principalmente para valorar cambios hormonales, metablicos y farmacolgicos 49.
Las clulas musculares estriadas adultas (miocitos) son clulas terminales que se mantienen en cultivo de forma limitada. Se pueden identificar fcilmente por sus marcadores especficos (troponina, miosina). En cambio, s que se pueden obtener lneas celulares a partir de clulas satlite (mioblastos) 784

de embrin o de adulto50. Las clulas musculares estriadas se obtienen por disociacin mecnica y enzimtica del tejido muscular esqueltico. En fases iniciales son fcilmente confundidas con fibroblastos, pero posteriormente se reconocen fcilmente por su aspecto estriado y multinucleado peculiar51 . Tambin pueden identificarse con anticuerpos monoclonales especficos52. Se puede objetivar su contraccin espontnea su fusin formando una estructura miotubular reticular 53 . Son tiles para estudio de ultraestructura muscular, receptores de membrana, intercambio inico y en la fisiopatologa de la fusin y contraccin muscular54. El cultivo de mioblastos es la base para las tcnicas de implantacin muscular utilizable en pacientes con distrofia o enfermedad muscular crnica55. El cultivo de clulas musculares lisas se puede obtener fcilmente a partir de msculo liso de pared artica o bronquial56. Este modelo de cultivo tiene una gran importancia en investigacin sobre fisiopatologa del sistema vascular y su respuesta a diversos frmacos y hormonas57,58 . As mismo, en estos cultivos es posible estudiar los flujos inicos (Ca++, Na +), y su potencial modificacin por determinados frmacos y factores hormonales59. El cultivo de clulas musculares cardacas es limitado dado que estas clulas carecen de capacidad de divisin. Por ello, slo se consiguen mantener durante un perodo de 2-4 semanas. En ellas, se puede observar la contraccin espontnea a partir del segundo da60. Constituye un buen modelo para estudios de morfologa, funcin y de mo-

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lculas intracelulares 61-63. Los condrocitos, a pesar de su escaso nmero, son el nico elemento de la matriz cartilaginosa capaz de adaptarse al medio de cultivo64. Para ello se requiere previamente su disociacin mecnica y digestin enzimtiva del cartlago. Son sensibles a los factores de crecimiento epidrmico y fibroblstico65. Su viabilidad en cultivo es limitada, y presentan desdiferenciacin progresiva. Constituye un modelo til en fisiologa, patogenia y respuesta farmacolgica del tejido cartilaginoso, por ejemplo en el estudio de medicamentos antiinflamatorios. Los osteoblastos son clulas de difcil manejo y procesamiento. Se pueden obtener por digestin enzimtica con EDTA y colagenasa del tejido seo66. Habitualmente no dan lugar a lneas permanentes. En cambio, s que es posible obtener lneas tumorales de osteosarcoma67. Las clulas endoteliales se obtienen fcilmente a partir de aorta y cordn umbilical 68. Constituyen un modelo muy vlido para el estudio de marcadores endoteliales, reactividad vascular y efecto de diversos factores humorales sobre el vaso 69. Son tiles para el estudio in vitro de fenmenos de trombosis, arteriosclerosis y vasculitis.

Los cultivos de clulas parenquimatosas se obtienen a partir de los epitelios de los diferentes rganos. El tipo celular ms bien caracterizado de este grupo son los hepatocitos, que constituyen un excelente modelo para estudios metablicos y toxicolgicos celulares84-86 . El cultivo de hepatocitos fetales mantiene mejor sus caractersticas enzimticas que el de hepatocitos adultos, que pierden rpidamente su diferenciacin celular. Se obtienen mediante la disociacin progresiva por perfusin enzimtica con colagenasa del rgano entero. Con tcnicas de cocultivo es posible realizar estudios bioqumicos y de funcionalismo heptico84 El cultivo de clulas renales tubulares87, glomerulares88 o mesangiales89 constituye un buen modelo para el estudio de funcionalismo renal y nefrotoxicidad por frmacos. Tambin pueden cultivarse las clulas pulmonares bronquiales51 , alveolares9O y pleurales, incluso a partir de un aspirado broncoalveolar o puncin pleural 91 . Se han utilizado para estudios de broncorreactividad y respuesta bronquial a frmacos51,91 .

Clulas neuroectodrmicas De ellas, las ms utilizadas son las clulas epiteliales. El cultivo de queratinocitos es el tipo de cultivo epidrmico ms bien caracterizado70-72. Se identifican fcilmente por su morfologa. Se puede comprobar su naturaleza con anticuerpos para citoqueratina especfica. Su aislamiento se realiza previa separacin enzimtica de la epidermis con colagenasa. Se contaminan fcilmente con fibroblastos y deben cultivarse con medios especficos. La adicin de hidrocortisona e isoproterenol facilita su crecimiento, aunque presentan un nmero limitado de subcultivos. Los melanocitos se pueden identificar fcilmente por sus caractersticas pigmentarias. Es difcil obtener un cultivo puro, ya que se contaminan fcilmente con fibroblastos y queratinocitos73. Los melanocitos cutneos raramente sobreviven en cultivo y pierden progresivamente su actividad, al contrario de los melanocitos procedentes de retina. No sobreviven si no se aaden medios de crecimiento especficos74. Ms fcil es el cultivo de melanomas a partir de la tumoracin primaria o de ganglios linfticos infiltrados. Las clulas nerviosas fueron el primer modelo celular utilizado en Cultivo12. Habitualmente su obtencin es laboriosa. Son potencialmente cultivables las neuronas75 y las clulas de la gla, astrocitos y oligodendrocitos76,77. El cultivo de neuronas es necesariamente limitado en el tiempo dada su ausencia de mitosis, problema que no se resuelve ni aun utilizando cultivos embrionarios. Para evitar la contaminacin de clulas gliales se precisan tambin medios de cultivo especficos. No se pueden utilizar en el cultivo antibiticos o antifngicos dado que son txicos para estas clulas. Si se pretende realizar estudios de neurotransmisores en clulas en cultivo, stas pueden obtenerse selectivamente de diferentes lugares del sistema nervioso como el hipocampo75, hipotlamo78 y ncleos basales o crtex79. El cultivo de clulas de la gla puede ser mixto o puro de oligodendrocitos o astrocitos8O. Se identifican por sus marcadores proteicos especficos (protenas fibrilares gliales). Se obtienen a partir de crtex cerebral77. Al contrario de las neuronas, las clulas gliales s que tienen capacidad de divisin 76,77. Su principal utilidad es en estudios estructurales, bioqumicos y farmacolgicos77,81 . Las clulas endocrinas son clulas secretoras muy especializadas cuyo cultivo se dificulta por su escaso nmero y alta diferenciacin. Por ello, se utilizan habitualmente lneas tumorales. Los modelos de clulas endocrinas ms bien caracterizados son los de clulas hipofisarias82, pancreticas83, tiroideas7 y suprarrenales82.

Cultivo de clulas hematopoyticas Se pueden cultivar clulas pluripotenciales de medula sea24 o precursores de una lnea concreta (eritroide, mieloide, linfoide)92 o clulas diferenciadas como los linfocitos B93, T94, monocitos y macrfagos95. Habitualmente se cultivan en inclusin en agar o cultivo en suspensin24. Se pueden obtener de los rganos hematopoyticos primarios (bazo y medula sea) o de sangre perifrica previa concentracin96. Los cultivos celulares han permitido conocer mejor la fisiologa de las diferentes lneas hematopoyticas, sus alteraciones en el curso de diferentes situaciones patolgicas como leucemias, neutropenias o aplasias97,98, el conocimiento de factores de crecimiento especficos (activadores e inhibidores de la eritropoyesis) y sus variaciones fisiolgicas o patolgicas92-95. Los cultivos aportan tambin elementos para el diagnstico clnico hematolgico, deteccin temprana y valoracin de remisin postrasplante. Tambin son tiles para el estudio de la accin de medicamentos sobre el ciclo celular, produccin de neutropenia, control de toxicidad y respuesta in vitro de nuevos quimioterpicos y citostticos susceptibles de actuar sobre clulas tumorales98. Clulas gonadales Las clulas gonadales pueden cultivarse y conservarse solas o conjuntamente con clulas mesenquimatosas99-101. As, se han obtenido cultivos de tbulos seminferos 100 , espermatozoides101 y clulas de la granulosa102. Sin embargo, no se han conseguido cultivos puros de clulas germinales. Cultivo de hibridomas Dos lneas celulares cocultivadas pueden inducirse a fusin mediante la exposicin a virus (transformacin por virus SV 40) o por mtodos qumicos (polietilenglicol) dando lugar a una nueva clula denominada hibridoma103,104 . La posibilidad de hibridacin celular ha jugado un papel sumamente importante en inmunologa, en la produccin de anticuerpos monoclonales105. Los hibridomas al obtenerse por la fusin de dos genomas diferentes constituyen un nuevo modelo celular diferente al de los predecesores, y son tambin tiles para estudios de regulacin gentica y mapa cromosomtico celular. Clulas neoplsicas Potencialmente son cultivables la mayora de clulas tumorales106. Los tumores especficos ms utilizados en cultivo son el carcinoma de mama, pulmn, colon, piel, ovarios, tero, prstata, vejiga, sarcomas, neuroblastomas, gliomas, melanomas y leucemias107-114. En general, las clulas tumorales tienen una alta capacidad de reproduccin, por lo que son fcilmente cultivables y permanecen durante un tiempo indefinido en cultivo (clulas transformadas o lneas celu785

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lares). Igualmente, contaminan con mucha facilidad otros cultivos o bancos de cultivos celulares115. Existen modelos de clulas tumorales muy bien definidas y ampliamente estudiadas, como es el caso de la lnea de carcinoma de crvix HeLa 116. Las lneas celulares tumorales (inmortales) son la base y constituyen un buen modelo vlido para el estudio de la biologa de las clulas transformadas, de marcadores tumorales117, de su quimiosensibilidad 116-118, de sus mecanismos de resistencia y de la regulacin molecular por los oncogenes.

TABLA 5 Lneas celulares ms representativas y funciones diferenciales que expresan

Lnea celular Propiedades diferenciales

N1E- 115 Neuroblastoma de ratn MH1 1C 1 1 Hepatoma de rata HSDM1 1C 1 1 Fibrosarcoma de ratn RPMI 8226 Mieloma humano ACHN Adenocarcinoma renal humano RAW 309 Cr.1 Monocitos y macrfagos de ratn C6 Glioma de rata

Principales aplicaciones de los cultivos celulares en investigacin biomdica Los cultivos celulares se han evidenciado corno un buen modelo experimental, ya que permiten reproducir in vitro de una manera semejante las condiciones que las clulas tienen in vivo. Aunque para su realizacin presentan algunos problemas tcnicos, creemos que, en muchos aspectos, son ms tiles que los modelos de experimentacin animal. Por ello, progresivamente se ha generalizado su uso en diversas disciplinas biomdicas. Mencionaremos las ms destacadas. En biologa celular los cultivos celulares se utilizan para estudios de potenciales y dinmica de membranas, receptores, transmisores, influencia hormonal, canales inicos e intercambio de electrlitos 119,120. Debido a que son un modelo celular dinmico, permiten el estudio de procesos de embriognesis, estructura hstica, interrelacin e interaccin celular51,53,66.121-125. En la tabla 5 se refieren algunas funciones diferenciales expresadas por varias lneas celulares y en la tabla 6 algunos marcadores celulares que facilitan la identificacin celular en cultivo. En microbiologa, los cultivos permiten la deteccin de antgenos y el diagnstico temprano de enfermedades infecciosas y constituyen un modelo til para la obtencin de vacunas126-127. Tambin facilitan la observacin secuencial del efecto citopatgeno de los microorganismos sobre las clulas cultivadas. Otro de los grandes campos de utilizacin de los cultivos celulares es en farmacologa y toxicologa. Permiten obviar el modelo animal de estudio y trabajar directamente sobre las clulas humanas potencialmente implicadas en una respuesta farmacolgica o en un efecto txico. En ellos, se pueden realizar estudios de toxicidad celular tanto aguda como crnica. En este sentido, el cultivo de hepatocitos es el mejor modelo 84,86 . Tambin se han utilizado como modelo de nefrotoxicidad128, en el estudio del mecanismo de accin de los frmacos, dosis lmite, interacciones y teratogenia89,107,129,130. Una ampliacin de este campo es la posible utilizacin de los cultivos para evaluacin de contaminacin ambiental, ya que en ellos se puede evaluar la exposicin repetida a un contaminante durante largo tiempo a dosis conocidas e independientemente de otros factores21. As mismo, con ellos se evala el riesgo txico potencial de una nueva substancia qumica antes de someterla a una utilizacin industrial y/o comercial3,131. En endocrinologa los cultivos celulares permiten la realizacin de estudios sobre fisiologa de secrecin hormonal7,36,82,83 y sobre los diversos cambios que se pueden ejercer en condiciones patolgicas sobre las clulas glandulares132,133. Se ha comentado anteriormente ya la potencial utilidad de los cultivos celulares en inmunologa, ya que permiten la realizacin de pruebas de citotoxicidad in vitro , as como diferentes estudios de la accin de factores humorales sobre las clulas69. Mediante la hibridacin, se puede conseguir un modelo celular nuevo que puede ser til para la produccin de inmunoglobulinas y anticuerpos monoclonales especficos105,134. En clulas en cultivo se pueden realizar con facilidad estudios genticos como visualizacin cromosmica 135, evalua786

Sntesis enzimtica neuronal Sntesis de albmina Secrecin de prostaglandinas Secrecin de la cadena ligera de lgG Interfern Fagocitosis, secreccin de lisozima Secrecin de protena S-100

TABLA 6 Identificacin de clulas en cultivo segn sus marcadores celulares

Tipo celular Marcador proteico

Clulas mesenquimatosas Fibroblastos Clulas endoteliales Clulas musculares Msculo liso Msculo esqueltico Msculo cardaco Clulas epiteliales Clulas mesoteliales Clulas gliales Astrocitos Clulas ependimarias Neuronas centrales y perifricas

Vimentina

Desmina

Queratinas

Protena acdica Fibrilar glial

Protenas neurofilamentosas

cin de mutaciones espontneas o inducidas, hibridacin103, transformacin celular, cambios o aberraciones cromosmicas inducidas por frmacos, txicos o virus136, estudio de mapa cromosmico2O, deteccin de enfermedades genticas y prediccin del riesgo teratolgico137. En oncologa, se han utilizado cultivos celulares para estudiar tanto los potenciales efectos de carcingenos sobre clulas normales como las caractersticas biolgicas de las clulas tumorales en cultivo. En el primer modelo, son tiles para el estudio del efecto de dosis efectivas y letales de los diferentes frmacos, cambios cromosmicos, mutaciones espontneas, promotores de tumores y efecto citognico de los virus17,18,21,138,139 . El cultivo de clulas tumorales es til para el estudio de la dinmica y mecanismos de reproduccin celular, oncogenes, marcadores tumorales y accin de los frmacos antineoplsicos98,107,110,111,114,117,140 . Las clulas en cultivo constituyen un modelo idneo para el estudio de la reproduccin y senescencia celular8,44. Se ha observado que mediante diferentes tcnicas, como la transfeccin con virus SV 40, ha sido posible modificar las caractersticas de crecimiento celular y conseguir lneas celulares inmortales. Algunos cultivos pueden llegar a ser espontneamente inmortales, sin que se hayan desvelado los motivos de esta peculiar situacin a pesar de numerosos estudios de este fenmeno. La posibilidad de mantener y proliferar selectivamente un tipo celular da pie a la idea de la reimplantacin de estas clulas en los tejidos de donde proceden cuando stos estn afectos. As, se ha desarrollado un potencial campo de implantaciones y trasplantes celulares. Este modelo se ha utilizado ya con xito en las clulas hematopoyticas y tambin es posible realizarlo en tejidos slidos como es el caso de la recientemente desarrollada implantacin de mioblastos procedentes de cultivo59. De un

M.COFN Y J. FERNNDEZ-SOL.- CULTIVOS CELULARES: UTILIDAD EN INVESTIGACIN BIOMDICA

donante sano, se extraen mioblastos que, despus de su cultivo y crecimiento, pueden ser implantados en el paciente que sea deficitario de los mismos (por ejemplo, en la distrofia de Duchenne). Existen modelos ms ambiciosos en los que se pretende inducir un cambio gentico o molecular en las clulas en cultivo para reimplantarias al organismo con una nueva funcin. Finalmente queremos constatar que, a medida que se han ido obteniendo y manteniendo diferentes cultivos celulares, se han creado verdaderas colecciones o bancos celulares donde se puede dirigir el investigador que busca realizar un estudio sobre una lnea celular concreta141. Estos bancos tienen la ventaja de una cuidadosa caracterizacin y seleccin de las lneas celulares, con controles estrictos de calidad que garantizan su homogeneidad celular as como la ausencia de contaminacin bacteriana, y hacen que los estudios celulares sean ms homogneos y reproducibles. En resumen, se puede afirmar que los cultivos celulares son ya actualmente un modelo experimental aceptado, asequible y reproducible. No son un modelo ideal ni estn exentos de problemas, pero permiten efectuar una gran diversidad de tcnicas de estudio sobre clulas especficas en condiciones prefijadas por el observador. Se perfilan como una alternativa vlida a los modelos de experimentacin animal y, posiblemente, en algunas fases pueden sustituir incluso los modelos de experimentacin humana.
BIBLIOGRAFA 1. Freshney RI. Biology of the cell cultured. En: Freshney RI, ed. Culture of animal cells, 2nd ed, Nueva York: Alan R. Liss lnc 1987; 1-12. 2. Iturralde M, Coll J. Cultivo de clulas animales. Med Clin (Barc) 1984; 82: 273-280 3. Nardone RM. Cell culture techniques 1987; 5: 122-127. From donor to cell lines.Biotechniques 1987; 5: 122-127 4. Kondo S, Hozumi Y, Aso K. Long-term organ culture of rabbit skin: effect of EGF on epidermal structure in vitro. J Invest Dermatol 1990; 95: 387-402. 5. Vanbrunt J. Artificial organs from culture. Bio-Technology 1991; 9: 136-137. 6. Douglas WHJ, McAter JA, DellOrco RT, Phelps D. Visualization of cellular aggregates cultured as a three-dimensional collagen sponge matrix. In Vitro 1980; 16: 306-312. 7. Penel C, Gerard C, Mauchamp J, Verrier B. The thyroid cell monolayer in culture: a thight sodium absorving epithelium. Pflugers Arch 1989; 414: 509-515. 8. Hayflick L, Moorhead P. The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp Cell Res 1961; 25: 585-621. 9. Michikawa M, Kobayashi T, Tsukagoshi H. Early events of chemical transmission of newly formed neuromuscular junctions in monolayers of human muscle cell cocultered with fetal rat spinal cord explants. Brain Res 1991; 538: 79-85. 10. Wyskovsky W, Hohenegger M, Plank B, Hellamnn G, Klein S, Suko J. Activation and inhibition of the calcium-release channel of isolated skeletal muscle heavy sarcoplasmic reticulum. Eur J Biochem 1990; 194: 549-559. 11. Cardellach F, Taraschi TF, Ellingson JB, Stubbs CD, Rubin E, Hoek JB. Maintenance of structural and functional characteristics of skeletal-muscle mitochondria and sarcoplasmic-reticular membranas after chronic ethanol treatment. Biochem J 1991; 274: 565-573. 12. Harrison RF. Observations on the living developing nerve fiber. Proc Soc Exp Biol Med 1907; 4: 140-145. 13. Carrel A. On the permanent life of tissues outside the organism. J Exp Med 1912; 15: 516-528. 14. Gey GO. An improved technique for massive tissue culture. Am J Cancer 1933; 17: 752-756. 15. Moscona A. Cell suspensions for organ rudiments of chick embryos. Exp Cell Res 1952; 3: 535-539. 16. Giard DJ, Aaronson G, Todaro P et al. In vitro cultivation of human tumors: establishment of cell lines derived from a series of solid tumors. JNCI 1973; 51: 1.417-1.423. 17. Ambrose EJ, Dudgeon GA, Easty DM, Easty GC. The inhibition of tumor growth by enzimes on tissue culture. Exp Cell Res 1961; 24: 220-227. 18. Kruse P, Keer LN, Whittle WL. Application of tissue culture. En: Techniques and applications. Nueva York: Academic Press, 1973; 746-768. 19. Leyva-Cobin. Los cultivos celulares in vitro cien aos despus. Inrnunologa 1985; 4: 85-87. 20. Hsu TC. Kariology of cells in culture. A preparation and analysis of karyoptypes and idiograms. En: Kruse P, Paterson T, ed. Tissue cultures: methods and applications. Nueva York: Academic Press, 1973; 550-565. 21. Ames BN. ldentifying environmental chemicals causing mutations and

cancer. Science 1980; 204: 587-593. 22. Barnik FG, Pittermann WF, Mendorf N, Tillman U, Knstler K. Skin organ culture for the study of skin irritancy. Toxic Vitro 1990; 4: 293-301. 23. Ham RG. Survival and growth requirements of nontransformed cells. Handbook Exp Pharmacol 1981; 57: 13-88. 24. Serke S, Sauberlich S, Huhn D. A liquid culture method for the in vitro growth of hemopoyetic progenitor cells from normal human adult peripheral blood. Eur J Haematol 1991; 46: 85-92. 25. Kaighn ME, Lechner JF. Cell separation by biological methods. En: Pretlow TG, Pretlow T, ed. Cell separation: selected methods and applications. Vol III. Nueva York: Academic Press, 1984; 285-306. 26. Adams RLP. Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology. En: Work TS, Burdon RH, ed. Cell culture for biochemists, Amsterdam: Elsevier-North Holland Biomedical Press, 1980; 25-37. 27. Altman PL, Katz D. Enzymes used for dissagregation on tissue to obtain viable cells. En: Altman PL, Katz D, ed. Biological handbook cell biology. Bethesda: FASEB; 1976; 76-80. 28. Philips H. Some metabolic changes resulting from treating kidney tissue with trypsin. Can J Biochem 1967; 1495: 45-50. 29. Waymouth C. To disaggregate or not to disaggregation. lnjury and cell disagregattion, transient or permanent? In Vitro 1974; 10: 97-111. 30. Peterson WD, Simpson WF, Hukku B. Cell culture characterization: monitoring for cell identification. Methods Enzymol 1979; 58: 164-178. 31. Taub M.The use of defined mediain cell and tissue culture.Toxic Vitro 1990; 4: 213-225. 32. Sato GH. The role of serum in cell culture. En: Litwack G, ed. Biochemical actions of hormones. Nueva York: Academic Press, 1975; 391396. 33. Mather JP, Sato GH. The use of hormone supplemented serum free media in primary cultures. Exp Cell Res 1979; 124: 215-219. 34. Barnes D, Sato G. Serum-free cell culture: a unifying approach, Cell 1981; 22: 649-655. 35. Bochini V, Angeletti PU. The nerve growth factor: purification as a 30.000-molecular weight protein. Proc Natl Acad Sci USA 1969; 64: 787794. 36. McCarthy TL, Centrella M, Canalis E. Cyclic AMP induces insulin-like growth factor I synthesis in osteoblast-enriched cultures. J Biol Chem 1990; 265: 15.353-15.356. 37. Astermark J, Stenflo J. The epidermal growth-factor-like domains of factor IX. J Biol Chem 1991; 266: 2.438-2.443. 38. Kleinman HK, Klebe RJ, Martin GR. Role of collagenous matrices in the adhesion and growth of cells. J Cell Biol 1981; 88: 473-485. 39. Kleinmann HK, McGoodwing EB, Rennart SI, Martin GR. Preparation of collagen surfaces for cell attachment: effect of collagen concentrations and phosphate buffer. Anal Biochem 1979; 94: 309. 40. Cour l, Maxwell G, Hay RJ. Tests for bacterial and fungal contaminants in cell cultures applied at the American Tissue Culture Association (ATCC). En: Evans VJ, Perry VP, Vincent MM, ed. Manual of the ATCC, Bethesda: ATCC, 1979; 1.157-1.160. 41. Barrile MF, McGarrity GJ. lsolation of mycoplasmas from cultures by agar and broth techniques. En: Tully JG, Razin S, ed. Methods in Mycoplasmology. Bethesda: NIH Publications, 1983; 1: 159-165. 42. Blazec R, Schmith K, Hadding U. Fast and simple procedure for the detection of cell culture mycoplasmas using a single monoclonal antibody. J lmmunol Methods 1990; 131: 203-212. 43. Hay RJ. The seed stock concept and quality control for cell lines. Anal Biochem 1988; 171: 225-237. 44. Cristofalo VJ. Animal cell culture as a model system for the study of aging. Adv Gerontol Res 1972; 7: 45-49. 45. Harris LW, Griffiths JB. Relative effects of cooling and warming rates of mammalian cells during the freeze-thaw cycle. Cryobiology 1991; 14: 662669. 46. Klebe RJ, Mancuso MG. ldentification of new cryoprotective agents for cultured mammalian cells. In Vitro 1983; 19: 70-73. 47. Groetz L. Growth of human skin fibroblasts from punch biopsies. En: Tissue Culture Association (TCA) manual of techniques, eds. Bethesda, TCA, 1975; 13-15. 48. Hollenberg CH. Prespectives in adipose tissue physiology. Int J Obes 1990; 14: 135-152. 49. Lau DCW, Shillabeer G, Wong KL, Tough SC, Russell JC. lnfluence of paracrine factors on preadipocyte replication and differentiation. lnt J Obes 1990; 14 (Suppl 3): 193-201. 50. Feldman JL, Stockdale FE. Skeletal muscle satellite cell diversity. Dev Biol 1991; 143: 320-334. 51. Blau H, Webster C. lsolation and characterization of human muscle cells. Proc Natl Acad Sci USA 1981; 78: 5.623-5.627. 52. Chamley JH, Groschel-Steward U, Campbell GR. Distiction between smooth muscle, fibroblasts ans endotelial cells in culture by use of fluoresceinated antibodies against smooth muscle actin. Cell Tissue Res 1977; 177: 445-457. 53. Sklar RM, Beggs AH, Lev AA et al. Defective dystrophin in Duchenne and Becker dystrophy myotubes in cell culture. Neurology 1990; 40: 1.8541.858. 54. Brodie Ch, Sapmson SR. Thyroid hormones up-regulate Ca-channels in cultured skeletal muscle of the rat. Neurosci Lett 1990; 117: 325-330. 55. Karpati G. The principles and practices of myoblast transfer. J Neurol Sci [Suppl] 1990; 98: 33. 56. Mattoli S, Mezzetti M, Riva G, Allegra L, Fasoli A. Specific binding of endothelin on human bronchial smooth muscle cells in culture and secretion

787

MEDICINA CLNICA VOL. 98 NM. 20. 1.992

of endothelin-like material from bronchial epithelial cells. Am Respir Cell Mol Biol 1990; 3: 145-151. 57. Warren JB, Brady AJ, Taylor GW. Vascular smooth muscle influences the release of endothelium-derived relaxing factor. Proc R Soc London (Biol) 1990; 241: 127-131. 58. Sasaki Y. lnhibition of myosin light chain phosphorylation in cultured smooth muscle cells by HA1077, a new type of vasodilatador. Biochem Biophys Res Commun 1990; 171: 1.182-1.187. 59. Vivaudeu M, Singer J, Walsh JV. Multiple types of Ca++ channels in visceral smooth muscle cells. Eur J Physiol 1991; 418: 144-152. 60. Decker ML, Simpson DG, Behnke M, Cook M, Decker M. Morphological analysis of contracting and quiescent adult rabit cardiac myocytes in longterm culture. Anat Rec 1990; 227: 285-299. 61. Hassall CSJ, Penketh R, Burnstock G. lmmunocytochemical studies of cardiac myocytes and other non-neural cells of the fetal human heart in culture. Anat Embryol (Berl) 1990; 182: 339-346. 62. Isobe Y, Warner FD, Lemanski LF. Three-dimensional immunogold localization of alfa-actinin within the cytoskeletal networks of cultured cardiac muscle and nonmuscle cells. Proc Natl Acad Sci USA 1988; 85: 6.7586.762. 63. Hassall CSJ, Penketh R, Rodeck C, Burstock G. The intracardiac neurones of the fetal human heart in culture. Anat Embryol (Berl) 1990; 182: 329-337. 64. Green WT. Behaviour of arthicular chondrocytes in cell culture. Clin Orthop Rel Res 1971; 75: 248-260. 65. Benya PD, Padilla SR, Nimmi ME. lndependent regulation of collagen types by chondrocytes during the loss of differenciated function in culture. Cell 1978; 15 (4) 1.313-1.321. 66. Nijweide PJ. Embryonic chicken periosteum in tissue culture: osteoid formation and calcium uptake. Proc Kon Ned Akad 1975; C78: 410-418. 67. Weichselbaum R, Epstein J, Little JB. A technique for developing established cell lines for human osteosarcomas. In Vitro 1976; 12: 833-836. 68. Weis JR, Sun B, Rodgers GM. lmproved method of human umbilical arterial endothelial cell culture. Thromb Res 1991; 61: 171-173. 69. Kahaleh. The role of vascular endothelium in the patogenesis of connective tissue disease: endothelial injury, activation; participation and response. Clin Exp Rheumatol 1990; 8: 595-601. 70. Shmith WJ, Clark L, Gross MS, Chan P, Meier HL. The use of human epidermal keratinocytes in culture as a model for study the biochemical mechanisms of sulfur mustard toxicity. Cell Biol Toxicol 1990; 6: 285-291. 71. Ohkura K, Fujii T, Terada H. lncrease attachment and confluence of skin epidermal cells in culture induced by ascorbic acid: detection on trypan blue across cultured cell layers. Cell Struct Funct 1990; 15: 143-150. 72. Grafstrm RC. Carcinogenesis studies in human epithelial tissues and cells in vitro: emphasis on serum-free culture conditions and transformation studies. Acta physiol Scand 1990; 140 (Suppl. 592): 93-133. 73. Medrano E, Nordlund JJ. Successfuld culture of adult human melanocytes obtained from normal and vitiligo donors. J lnvest Dermatol 1990; 95: 441-445. 74. Pittelkow MR, Shipley GD. Serum-free culture of normal human melanocytes: growth kinetics and growth factor requirements. J Cell Physiol 1989; 139: 565-576. 75. Koroshetz WJ, Frushpan E. Seizure-like activity and glutamate receptors in hypocampal neurons in culture. Neurosci Res (Suppl.) 1990; 13: S65S79. 76. Morrison RS, Vellis J. Growyh of purified astrocytes in a chemically defined medium. Proc Natl Acad Sci USA 1980; 77: 3.464-3.468. 77. Kim SU. Neurobiology of human oligodendrocytes in culture. Neurosci Res 1990; 27: 712-728. 78. Taglialatela M, Canzoniero LM, Craoge EJ, Di Renzo F, Annunciato L. Na-Ca exange activity in central nerve endings. II. Relationship between pharmacological blockade by amiloride and dopamine release from tuberoinfundibular hypothalamic neurons. Mol Pharmacol 1990; 38: 393400. 79. Giffard RG, Monyer H, Choi DW. Selective vulnerability of cultured cortical glia to injury by extracellular acidosis. Brain Res 1990; 530: 138141. 80. Loo DT, Sakai Y, Rawson CL, Barnes DW. Serial passage of embryonic human astrocytes in serum-free hormone-supplemented medium. J Neurosci Res 1991; 28: 101-109. 81. Furshpan EJ. A cell-culture approach to the study of seizure activity. Q J Exp Physiol 1989; 74: 975-985. 82. Buonassisi V, Sato G, Cohen Al. Hormone-producing cultures of adrenal and pituitary origin. Proc Natl Acad Sci USA 1962; 48: 1.184-1.190. 83. Schwartz JL, Mealing G, Whitfield JF, Braaten JT. Long-term culture of neonatal rat pancreatin cells as a model for insulin-secretion and ion-channel estudies. Diabetes 1990; 39: 1.353-1.359. 84. Krerners P, Negro L, Gielen JE. Rat fetal hepatocytes in culture: a model for metabolic and toxicological studies. Acta Pharm Jugosl 1990; 40: 383393. 85. Birge R, Bartolone JB, Emeigh SG et al. Acetaminophen hepatotoxicity: correspondence of selective protein arylation in human and mouse liver in vitro, in culture and in vivo. Toxicol Appl Pharmacol 1990; 105: 472-482. 86. Guillouzo A, Morel F, Ratanasavanh D, Chesne C, Guguen C. Longterm culture of funciontal hepatocytes. Toxic Vitro 1990; 4: 415-427. 87. Boogaard PJ, Nagelkerke JF, Mulder J. Renal proximal tubular cells in suspension or in primary culture as in vitro models to study nephrotoxicity. Chem Biol lnteract 1990; 76: 251-292.

88. Holdsworth SR, Glasgow EF, Thomsen NM, Atkins RC. Tissue culture of isolated human glomeruli. Pathology 1978; 10: 59-61. 89. Frandey J, Rob PM, Jelkmann W. Theophyline and magnesium inhibit the contraction elicited with ciclosporin and angiotensin II in mesangial cell cultures. Nephron 1991; 57: 94-98. 90. Oomen LCJM, Have-Opbroek AAW, Hageman C et al. Fetal mouse alveolar type II cells in culture express severas type II cell characteristics found in vivo, toghether with major histocompatibility antigens. Am J Respir Cell Moll Biol 1990; 3: 325-339. 91. Li XY, Brown GM, Lamb D, Donaldson K. Secretion of plasminogen activator inhibitor by normal rat pleural leukocytes in culture. Lung 1990; 168: 309-322. 92. Juvonen E, Ruutu T. Effect of culture condition on in vitro eritroid colony formation in myelodysplasic syndromes. Exp Hematol 1990; 18: 1.070-1.072. 93. Howard M, Kessler S, Chused T, Paul WE. Long term culture of normal mouse B lymphocytes. Proc Natl Acad Sci USA 1981; 78: 5.788-5.792. 94. Gillis S, Watson J. lnterleukin-2 dependent culture of cytolytic T cell lines. Immunol Rev 1981; 54: 81-109. 95. Kuhnert P, Schalch L, Jungi TW. Cytokine induction in human mononuclear cells stimulated by IgG-coated culture surfaces and by IgG for infusion. Clin lmmunol Immunopathol 1990; 57: 218-232. 96. Wolf M, Raggliolini M. ldentification of phosphatidylserine-binding proteins in human white blood cells. Biochem J 1990; 269: 723-728. 97. Schump B, Schlaeger EJ. Optimization of culture conditions for high density proliferation of HL-60 human promyelocytic leukemia cells. J Cell Sci 1990; 97: 639-647. 98. Fountzilas G, lnoue S, Ohnuma T. Schedule-dependent interaction of cytarabine plus doxirubicin or cytarabine plus mitoxantrone in actue myelocytic leukemia cells in culture. Leukemia 1990; 4: 321-324. 99. Hohn HP, Denker HW. A three-dimensional organ culture model for the study of implantation of rabbit blastocyst in vitro. Trophoblast Res 1990; 4: 71-96. 100. Seid K, Holstein AF. Organ culture of human seminiferous tubules: a useful tool to study the role of nerve growth factor in the testis. Cell Tissue Res 1990; 261: 539-547. 101. Chowdhury AK, Steinberg A, Steinberg E. A quantitative study of spermatogonial population in organ culture of human testis. Andrologia 1975; 7: 297-307. 102. Orly J, Sato G, Erikson GF, Serum supresses the expression of hormonally induced function in cultured granuloso cells. Cell 1980; 131: 817-27. 103. Schmid G, Blanch H, Wilke CR. Hybridoma growth, metabolism and product formation in hepes-buddered medium: l. Effect of passage number. Biotechnol Lett 1990; 9: 627-632. 104. Schmid G, Blanch HW, Wilke ChR. Hybridoma growth, metabolism, and product formation in Hepes-buffered medium: II. Effect of pH. Biotechnol Lett 1990; 12: 633-638. 105. Bibila T, Flickinger MC. A structured model for monoclonal antibody synthesis in exponentially growing and stationary phase hybridoma cells. Biotechnol Bioengineering 1991; 37: 210-226. 106. Giard GD, Aaronson SA, Todaro GJ et al. In vitro cultivation of human tumors: establishment of cell lines derived from a series of a solid tumors. JNCI 1973; 51: 1.417-1.423. 107. Susuki T, Horibe l, Uchida N et al. Effects of antiandrogens on growth of androgen-dependent mouse mammary tumors. Steroid Biochem Mol Biol 1990; 37: 559-567. 108. Carney DN, Bunn PA, Gazdar AF, Pagan JA, Minna JD. Selective growth in serum-free hormone-supplemented medium of tumor cells obtained by biopsy from patients with small cell carcinoma of lung. Proc Natl Acad Sci USA 1981; 78: 3.185-3.189. 109. Edwards PAW, Easty DM, Foster CS. Selective culture od epithelioid cells from a human squamous carcinoma using a monoclonal antibody to kill fibroblasts. Cell Biol lnt Rep 1980; 4: 917-922. 110. Horoszewicz JS, Murphy GP. Prospective new developments in laboratory research and clinical trials in prostatic cancer. Cancer 1990; 66: 1.083-1.085. 111. Chevillard S, Vielh P, Bastian G, Coppey J. Adriamycin uptake and metabolism in organotypic culture A 549 human adenocarcinoma cells according to exposure time. J Cancer Res Clin Oncol 1990; 116: 633-638. 112. Oswald CB, Chaney SG, Hall IH. lnhibition of nucleic acid synthesis in P388 lympocytic leukemia cells in culture by cis-platinum derivases. Biomed Biochim Acta 1990; 49: 579-587. 113. Allegra J, Lipman ME. Growth of a human breast cancer cell line in serum-free hormone-supplemented medium. Cancer Res 1978; 38: 3.8233.829. 114. Biedler JL, Helson I, Spengler BA. Morphology and cell growth, tumorigenicity abd cytogenics of human neuroblastoma cells in continuous culture. Cancer Res 1973; 33: 2.643-2.662. 115. Nelson-Rees WA, Daniels DW, Flandermeyer RR. Cross-contamination of cells in culture. Science 1981; 212: 446-452. 116. Bastos MT, Benigna MA, Oliveira M, Campello P, Klppel LW. Metotrexate: studies on celular methabolism in mitochondrial oxidation in HeLa cells. Cell Biochem Funct 1990; 8: 199-203. 117. Escalona J, Alvarez-Fernndez E, Dez N. Posibilidades del cultivo de tejidos en el estudio de los tumores. Med Clin (Barc) 1985; 85: 380-384. 118. Colombo R, Dalle I, Milzani A. Metal ions modulate the effect of doxorrubicin on actin assembly. Cancer Biochem Biophys 1990; 11: 217225.

788

M.COFN Y J. FERNNDEZ-SOL.- CULTIVOS CELULARES: UTILIDAD EN INVESTIGACIN BIOMDICA

119. Kostyuk PG, Belan PV, Tepikin AV., Free calcium transients and oscillation in nerve cells. Exp Brain Res 1991; 83: 459-464. 120. Brodie C, Sampson SR. Effects of ethanol on voltage-sensitive Nachannels in cultured skeletal muscle. J Pharmacol Exp Ther 1990; 255: 1.195-1.201. 121. Pechak D, Kujawa M, Caplan Al. Morphological and histochemical events durin first bone formation in embryonic chick limbs. Bone 1986; 7: 441-458. 122. Bruder SP, Caplan A. Osteogenic cell lineage analysis is facilitated by organ cultures of embrionyc chick periosteum. Dev Biol 1990; 141: 319329. 123. Buchanan J, Sun YA, Poo V.M. Studies of nerve-muscle interactions in Xenopus cell culture: fine structure of early functional contacts. J Neurosci 1989; 9: 1.540-1.554. 124. Osinska HE, Lemanski LF. lmmunofluorescent localization of desmin and vimentin in developing cardiac muscle of syrian hamster. Anat Rec 1989; 223: 406-413. 125. Sanberg LW, Roos PJ, Pollman MJ, Hodkin DD, Blankenship JW. Quantification of elastin in tissues in culture: problems related to the accurate measurement od small amounts of elastin with special emphasis on the rat. Connect Tissue Res 1990; 25: 139-148. 126. Rhodes A, James W. lnhibition of human immunodeficiency virus replication in cell culture by endogenous synthesized antisere RNA. J Gen Virol 1990; 71: 1.965-1.974. 127. Margall N, Montesinos E, Rato G. Deteccin temprana de CMV en cultivos medulares. Med Clin (Barc) 1989; 93: 365-367. 128. Gandolfi AJ, Brendel K. In vitro systems for nephrotoxicity studies. Toxic Vitro 1990; 4-5: 337-345. 129. D.A.T. New. The physiological Laboratory. Cambridge. Whole embrio culture teratogenesis and the stimation of teratologic risc. Teratology 1990;

42: 635-642. 130. Klara AB, Bird MM. The effect of various antidepressant drugs on the fine-structure of neurons of the cingulate cortes in culture. Neuroscience 1990; 37: 685-692. 131. Tolbert WR, Feder J. Large-scale cell culture technology. Ann Rep Ferment Processes 1983; 6: 35-74. 132. Florini JR. Hormonal control of muscle growth. Muscle Nerve 1987; 7: 577-579. 133. Jefferson DM, Coob MH, Genaro JF, Scott WN. Transporting epithelium. Culture in hormonally defined serum-free medium. Science 1980; 210: 912914. 134. Duteil AP, Sene C, Boschetti E. Choice of culture medium and purification process applied to monoclonal antibodies devoted to in vivo use. Dev Biol Stand 1990; 71: 79-85. 135. lshihara T, Moore GE, Sanberg A. The in vitro chromosome constitution of cells from human tumor. Cancer Res 1962; 22: 375-379. 136. Chapin RE, Phelps J. Recent advances in testicular cell culture: implications for toxicology. Toxic Vitro 1990; 4: 543-559. 137. Peters PW, Piersma AH. In vitro embriotoxicity and teratogenicity studies. Toxic Vitro 1990; 4: 570-576. 138. Grafstrm RC. In vitro studies of acetaldehyde effects related to human respiratory carcinogenesis. Mutat Res 1990; 238: 175-184. 139. Jouvenot M, Alkhalaf M, Pellegrin I, Marechal G, Royez M, Adessi GL. Uterine epithelial cells in primary culture: a model system to study cell proliferation. Cell Mol Biol 1990; 36: 421-427. 140. Kelner MJ, McMorris MC, Taetle R. Preclinical evaluation od illudins as anticancer agents: basis for selectiva cytotoxicity. JNCI 1990; 82: 1.5621.565. 141. American Tissue Culture Association The American Type culture collection and how it works. Scientist 1990; 4: 16.

789