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Licenciatura / Ingeniera en: Biotecnologa

Programa de la asignatura Microbiologa y Taxonoma Microbiana

Clave 200920416 190920416 ESAD

Unidad 1 Presentacin de la unidad

La importancia de estudiar Taxonoma Microbiana radica en conocer las investigaciones y logros cientficos, mediante anlisis taxonmicos, donde el alumno desarrollar habilidades para identificar los sistemas de clasificacin de microorganismos y como es que llevan a cabo su proliferacin de tal manera que se apliquen los conocimientos adquiridos para la elaboracin de un ensayo

Propsitos El alumno analizar la forma de nombrar a los microorganismos y su importancia dentro del mbito ambiental e industrial, donde incorporar los conceptos fundamentales de taxonoma microbiana con el fin de entender el desarrollo cuantitativo de las bacterias, lo cual posteriormente le permita desarrollar habilidades para la investigacin, resolucin de problemas y toma de decisiones.

Competencia especfica

Analizar la taxonoma y crecimiento bacteriano mediante la comprensin de sus fundamentos y beneficios para proponer mejoras a los distintos procesos biotecnolgicos.

1.1 Definicin de taxonoma La Taxonoma es un rea de la ciencia biolgica que comprende tres disciplinas diferentes: clasificacin, nomenclatura e identificacin. La taxonoma se divide en microtaxonoma (su objetivo es identificar, describir y delimitar especies) y macrotaxonoma (su finalidad es construir clasificaciones de los taxones y se auxilia de la microtaxonoma) (Solomon et al., 2008). Para llevar a cabo la clasificacin de las bacterias los taxnomos bacterianos se vieron forzados a buscar adems de las caractersticas estructurales, diferentes tipos de propiedades como las bioqumicas, fisiolgicas, ecolgicas. Dicha clasificacin se basa en

atributos funcionales, la mayor parte de las bacterias slo pueden identificarse por lo que hacen y no simplemente por su apariencia. Esto representa un problema adicional para el taxnomo bacteriano, el estudio de estas propiedades funcionales conlleva a la realizacin de experimentos, por lo tanto ste nunca podr estar seguro de haber llevado a cabo los experimentos adecuados con fines taxonmicos: podra ocurrir que omitiera la realizacin de ciertos experimentos que indicaran la existencia de agrupamientos significativos dentro de una coleccin de cepas. Sin embargo, est tomando auge una nueva alternativa biotecnolgica que podra resolver pronto el problema, son las tcnicas moleculares para la caracterizacin genotpica bacteriana, que proporcionan una posible base objetiva para la definicin de especie bacteriana (Trtora, 2008). En el siglo XVII Carlos Linneo desarrollo un sistema de clasificacin para nombrar a los microorganismos como una forma de facilitar la comunicacin eficaz entre los microbilogos, a Linneo se le conoce como el Padre de la Taxonoma que es la ciencia encargada de la clasificacin y denominacin de la gran variedad de especies existentes (Solomon et al., 2008).

FCarl Von Linneo (1707-1778) desde la web http://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:Carl_von_Linn%C3%A9.jpg

La Taxonoma (del griego , taxis, "ordenamiento", y , nomos, "norma" o "regla") es la ciencia de la clasificacin; est relacionada con la Sistemtica que se refiere a la clasificacin o agrupamiento sistemtico de los organismos en grupos o categoras llamados taxa (del griego , transliterado como taxis, "ordenamiento") es un grupo de organismos emparentados, que en una clasificacin dada han sido agrupados, asignndole al grupo un nombre en latn, una descripcin, y un "tipo", de forma que el taxn de una especie es un espcimen o ejemplar concreto. La taxonoma se divide en tres partes: a) Clasificacin: es el agrupamiento ordenado de unidades en grupos dentro de unidades mayores. b) Nomenclatura: es la denominacin de las unidades definidas y por la clasificacin.

c) Identificacin: hace uso del criterio establecido por la clasificacin y nomenclatura mencionados, los microorganismos se identifican comparando las caractersticas de las unidades desconocidas y las conocidas.

1.1.1. Nomenclatura Respecto a la Nomenclatura existen cdigos como el zoolgico, botnico y bacteriolgico que se basan en determinados principios comunes mediante el sistema de clasificacin de Linneo el cual se denomina sistema binomial de nomenclatura donde a cada especie se le asigna un nombre compuesto de dos partes: la primera designa el gnero, y la segunda, el epteto especifico los cuales se escriben letra cursiva; los dos anteriores forman el nombre cientfico de cada especie. El epteto especfico siempre debe ir precedido del nombre del gnero abreviado o completo (Solomon et al., 2008). 1.1.2. Biologa sistemtica El sistema binomial de nomenclatura que agrupa a las especies dentro de un gnero comn, estos a su vez se constituyen una familia, las cuales a su vez se agrupan en ordenes, los ordenes en clases, las clases en filums filo (phylum, plural phyla que es un tipo de organizacin), los filums forman reinos y los reinos dominios (Fig. 2 o Tabla 1) (Solomon et al., 2008). La forma de nombrar a los microorganismos es mediante la clasificacin en grupos de una serie grande de microorganismos; los cuales deben parecerse entre s con un grado mayor de semejanza que los miembros de otro grupo. El objetivo del nombre cientfico es el de poseer un nico nombre que deba ser utilizado en todo el mundo, en cualquier lengua, para referirse a un nico taxn (Solomon et al., 2008). Los nombres cientficos son en latn, o latinizados; por ejemplo, nombre vulgar perro y su nombre cientfico es Canis familiaris o C. familiaris, latrans, la bacteria que causa el clera Escherichia coli o E. coli, la bacteria causante de la fermentacin del yogurt Lactobacillus bulgaricus o L. bulgaricus. Los nombres cientficos no son muy usuales, puesto que se escriben en latn es muy difcil su pronunciacin; por lo que es preferible usar el nombre vulgar o comn ya que suele variar segn las localidades, regiones.

Categora taxonmico Especie

nivel Caractersticas Organismo que solo se puede reproducir con otro de su misma especie Grupo de especies relacionadas. Grupo de gneros relacionados. Grupo de familias relacionadas. Grupo de rdenes relacionadas. Grupo de clases relacionadas. Grupo de phyla relacionados Grupo de reinos.

Gnero Familia Orden Clase Filum o Phylum Reino Dominio

Niveles o categora taxonmica

Niveles taxonmicos. Forma para basarse y editar imagen Actividad 1. Archivo evolutivo En esta actividad ejercitars el dominio de nomenclatura segn la clasificacintaxonmica de varias clases de microorganismos. Descripcin: 1. En un documento de texto describe la clasificacin taxonmica de dos microorganismos diferentes que t debers elegir. 2. Ten cuidado de elegir especies diferentes a las de tus compaeros. 3. Apoya con imgenes el trabajo de informacin que realizaste 4. S cuidadoso con la ortografa.

Nota: Te exhortamos atentamente a abstenerte de cualquier accin de plagio o copia de contenidos, el facilitador puede detectar esta situacin sin dificultad; tu formacin exige que desde esta etapa todo producto o tarea que reportes sea totalmente original y propio de tu iniciativa y creatividad; para que en lo sucesivo esta actitud se proyecte directamente en tu prctica profesional. 1.1.3. rboles filogenticos La clasificacin moderna a menudo recibe el nombre de sistemtica, porque se basa en relaciones evolutivas. Muchos taxnomos utilizan la sistemtica ya que tratan de reconstruir la historia evolutiva o filogenia (produccin de los filums) de los organismos. Por lo tanto un rbol filogentico (fig. 3) muestra las relaciones evolutivas entre varias especies u otras entidades que se cree que tienen un ancestro en comn; es una forma de cladograma (Solomon et al 2008). Un cladograma es un diagrama representativo en la clasificacin biolgica taxonmica de los organismos, en el que se muestra la relacin entre distintas especies segn una caracterstica derivada, resultado del anlisis cladstico de una especie. Los cladogramas son importantes herramientas filogenticas para el estudio de conceptos cientficos. En biologa se utilizan rboles parecidos a los genealgicos para representar cmo se encuentran emparentados los organismos vivos, se les conoce como rboles filogenticos. En los rboles genealgicos se utiliza informacin proporcionada por los familiares y para los rboles filogenticos se usa informacin proveniente de fsiles, as como aqulla generada por la comparacin estructural y molecular de los organismos (Solomon et al., 2008).

rbol filogentico de la vida Editar de la web http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/5/55/Phylogenetic_tree-es.png

En la figura se explica a manera de rbol filogentico el origen evolutivo de la vida en el planeta, de acuerdo a las caractersticas morfolgicas de dichos organismos estos van desde las formas sencillas como las bacterias hasta las ms complejas como las plantas y animales (Solomon et al., 2008). Debido al origen evolutivo de las especies estas pueden tener diferentes formas de rboles filogenticos y estos pueden ser: Monofilticos: es un grupo de organismos que tiene un antepasado comn con todos y cada uno de sus descendientes.

rbol monofiltico tomado de la web http://www.ual.es/GruposInv/myco-ual/galer13.htm Parafiltico: si faltan algunos de los descendientes, los cuales han sido incluidos en otros grupos.

5. rbol monofiltico tomado de la web http://www.ual.es/GruposInv/myco-ual/galer13.htm Polifiltico: si contiene organismos de varios clados, es decir, que no proceden de un antepasado comn cercan; simplemente, se han reunido por conveniencia de los investigadores.

rbol monofiltico tomado de la web http://www.ual.es/GruposInv/myco-ual/galer13.htm Para reforzar lo visto anteriormente sobre rboles filogenticos realizar la actividad 2.

Actividad 2. Bacterias fichadas. En esta actividad profundizars en el conocimiento de las relaciones que existen dentro del rbol filogentico enfocado a las bacterias patgenas y especies de microorganismos que causan enfermedades comunes en Mxico. Dirgete a la base de datos y a continuacin: 1. Agrega una nueva entrada y redacta tu listado de 4 especies de bacterias que causan enfermedades en Mxico colocando entre parntesis que enfermedad provocan. 2. Responde a la pregunta Cul es la relacin entre ellas? tomando en cuenta su distancia filogentica y metabolismo. 3. Revisa y comenta las aportaciones de tus compaeros(as). Nota: Te exhortamos atentamente a abstenerte de cualquier accin de plagio o copia de contenidos, el facilitador puede detectar esta situacin sin dificultad; tu formacin exige que desde esta etapa todo producto o tarea que reportes sea totalmente original y propio de tu iniciativa y creatividad; para que en lo sucesivo esta actitud se proyecte directamente en tu prctica profesional.

1.2. Crecimiento individual y poblacional El crecimiento bacteriano implica un aumento ordenado en el nmero de clulas (poblacin) y de los componentes celulares de un organismo del estado inmaduro al estado adulto; incluye inmersamente la divisin de una bacteria en dos clulas hijas en un proceso llamado fisin binaria, biparticin, las clulas hijas resultantes sern genticamente idnticas a la clula original. De este modo tiene lugar la "duplicacin

local" de la poblacin bacteriana. Las dos clulas hijas creadas tras la divisin no sobreviven necesariamente (Brooks, 2011) Sin embargo, si el nmero de supervivientes supera la unidad, la poblacin bacteriana experimenta un crecimiento exponencial. La medicin de una curva del crecimiento exponencial de las bacterias en un cultivo ha sido tema de estudio de los microbilogos. Los procesos fundamentales empleados para ello son la enumeracin bacteriana (recuento celular) por mtodos directos e individuales (microscopa), mtodos directos y masivos (biomasa), por mtodos indirectos e individuales (conteo de colonias), o por mtodos indirectos y en bloque (nmero ms probable (NMP), turbidez, absorcin de nutrientes). El objeto de estudio del biotecnlogo es reconocer de manera terica el crecimiento bacteriano en un cultivo que conlleva a resumirse en cuatro fases diferentes: fase Log, fase exponencial, fase estacionaria y fase de declive o muerte; y de esta manera podr aplicar los conocimientos a nivel industrial y ambiental dichos microorganismos para un beneficio especfico tomando en cuenta factores del ambiente tanto abiticos como pH, Temperatura en C, O2, (oxigeno), presin osmtica, nutrientes (CHONSP) y biticos como la competencia por los nutrientes, depredacin y lisis viral (Trtora, 2008). Las clulas bacterianas son microorganismos unicelulares que presentan un tamao de unos pocos micrmetros (0.5 a 5 m) y diversas formas incluyendo esferas (cocos), barras (bacilos) y hlices (espirilos) (Fig. 7). Las bacterias son procariotas (no tienen ncleo definido ni presentan orgnulos membranosos internos), poseen una pared celular compuesta de peptidoglucano estructura bsica de la pared celular de las bacterias; la molcula es un copolmero formado por una secuencia alternante de N-acetil-glucosamina y el cido N-acetilmurmico unidos mediante enlaces -1,4. Muchas bacterias disponen de flagelos o de otros sistemas de desplazamiento y son mviles. Del estudio de las bacterias se encarga la bacteriologa (rama de la microbiologa) (Trtora, 2008).

Respecto al tamao de las bacterias que son microscpicas, hablemos primero cuando medimos la longitud de un objeto, estamos viendo cuantas veces entra una unidad de medida en el largo del objeto. La unidad de medida de la longitud es el metro (m). El sistema de unidades de medida que incluye al metro junto a sus mltiplos y submltiplos se llama Sistema Mtrico Decimal (Tabla 2).

Mltiplo mirimetro 1 mam = 10,000 m kilmetro 1 km = 1,000 m hectmetro 1 hm = 100 m

Submltiplos Metro m Decmetro 1 dm = 0.1 m Centmetro 1 cm = 0.01 m

Longitudes microscpicas Micrmetro 1m = 0.001 mm 1 mm = 1000 m 1 m = 0,001 mm = 1 10-3

mm decmetro 1 dam = 10 m Milmetro 1 mm = 0.001 m 1 m = 0,000 001 m = 1 106 m 1 m = 10 dm = 100 cm = 1 1 m = 1 000 000 m mm Conversiones para determinar las diferentes longitudes

Morfologa de las bacterias. Editar desde la web http://es.wikipedia.org/wiki/Archivo:Morfolog%C3%ADa_bacteriana.jpg

Generalmente el crecimiento de las bacterias es porque se reproducen ya sea por biparticin o fisin binaria (forma asexual); tras la duplicacin del ADN, que est dirigida por la ADN-polimerasa que se encuentra en los mesosomas, la pared bacteriana crece hasta formar un tabique transversal separador de las dos nuevas bacterias. Tambin presentan reproduccin sexual o parasexual (intercambian fragmentos de ADN) (Trtora, 2008). Es importante distinguir el crecimiento individual de clulas y el crecimiento de poblaciones de clulas: Crecimiento individual: es el incremento de una clula respecto al tamao y peso, es usualmente un preludio a la divisin celular Crecimiento poblacional: es el incremento en el nmero de clulas como una consecuencia del crecimiento y divisin celular El crecimiento microbiano se divide principalmente en cuatro etapas que son (fig. 8):

Etapas del crecimiento bacteriano Trtora et al, (2007) a) Fase Lag, b) fase exponencial, c) fase estacionaria y d) fase de declinacin o muerte.

a) Fase Lag o de Rezago. Este periodo consiste en la adaptacin de las clulas microbianas a su nuevo ambiente. En esta fase, las clulas microbianas no tienen muchos metabolitos y enzimas, debido a las condiciones desfavorables que representaba el cultivo previo. En este lapso de tiempo se forman las enzimas y los metabolitos intermedios hasta alcanzar las concentraciones necesarias para reiniciar el crecimiento (Trtora, 2008). Este periodo se puede prolongar en el caso de que el medio de cultivo previo y las condiciones actuales resulten tan diferentes que las clulas sean genticamente incapaces de sobrevivir, por lo que slo unas cuantas mutantes podrn subsistir, y obviamente se requerir ms tiempo para que stas se multipliquen lo suficiente y sea notorio el aumento de clulas (Trtora, 2008). b) Fase Exponencial. En esta fase las clulas se encuentran en un estado de crecimiento sostenido. Se sintetiza nuevo material celular a una tasa constante (tasa = relacin entre la cantidad y la frecuencia de un fenmeno), pero ste material es en s cataltico y la masa aumenta de manera exponencial, es decir crece muy rpidamente en el tiempo. Matemticamente exponencial se refiere elevar un nmero o -base- X a un determinado exponente- y (xy); por ejemplo, si la base x es igual a 2 y el exponente y es igual a 4; la potencia ser 24 lo cual equivale a 2x2x2x2 = 16. Para el caso del crecimiento microbiano por razones y resultados experimentales la base de potencia que se considera es el nmero e- que es la base de los logaritmos de Neper, el cual es un nmero importantsimo en la naturaleza que vale e = 2.7182818284; por lo tanto sus potencias se escriben y = ex o x = ey .

El crecimiento continuar hasta que uno o ms nutrimentos se agoten, o hasta que se acumule tal cantidad de metabolitos txicos que se inhiba el crecimiento. El nutrimento limitante para los organismos aerobios suele ser el oxgeno: cuando la concentracin bacteriana es de aproximadamente 1 x 107 ml es necesario incrementar el ingreso de

oxgeno mediante agitacin o burbujeo; pero cuando la concentracin alcanza 4 o 5 x 109 bacterias por ml, la tasa de difusin de oxgeno no puede satisfacer las demandas aun en un medio aireado, por lo que el crecimiento disminuye progresivamente (Trtora, 2008). A diferencia del crecimiento exponencial, el crecimiento lineal slo implica que se est aumentando en solo una unidad la masa con respecto al tiempo. c) Fase Estacionaria. Ante el agotamiento de nutrimentos en el medio o la acumulacin de metabolitos txicos el crecimiento cesa por completo despus de un periodo de decrecimiento en la tasa de crecimiento. Por lo general en esta fase se observa recambio celular, lo cual se debe a que, aunque existe una prdida lenta de clulas por muerte, dicha prdida se compensa exactamente por la formacin de nuevas clulas a travs de crecimiento y divisin. As, la cifra de clulas viables se mantiene constante, aunque en realidad en el conteo aumente poco a poco el nmero de clulas, si se cuentan tambin las muertas (Trtora, 2008). Para comprender lo anterior debemos considerar que, para una clula microbiana, muerte significa la prdida irreversible de la capacidad para reproducirse (crecer y dividirse), lo cual se comprueba cuando una clula es incapaz de producir una colonia en cualquier medio. De lo anterior se deriva que designar a una clula microbiana como muerta no implica su destruccin fsica. La duracin de esta fase depende de la naturaleza del microorganismo y de las condiciones del medio. d) Fase de Declinacin y/o Muerte. Esta fase representa el decremento de clulas debido al aumento progresivo de la tasa de mortalidad, misma que tarde o temprano alcanza un valor sostenido. Por lo general, una vez que la mayora de las clulas ha muerto, la tasa de mortalidad disminuye bruscamente, por lo que un nmero pequeo de sobrevivientes pueden persistir en cultivo por meses o aos. Dicha persistencia puede deberse a que las clulas consiguen crecer gracias a los nutrimentos liberados por las clulas que mueren y se lisan, observndose recambio celular (Trtora, 2008).

1.2.1. Tasa de crecimiento y tiempo de generacin El crecimiento microbiano que es el cambio en el nmero de clulas por unidad de tiempo determinada. El tiempo juega un papel muy importante para que la clula se divida en dos, el cual puede ser desde minutos, horas y hasta das. Tasa de crecimiento: es el cambio del nmero de clulas o masa por unidad de tiempo Generacin: intervalo para la formacin de dos clulas provenientes de una.

Tiempo de generacin: tiempo que tarda una poblacin en duplicarse. Se puede definir tambin como la cantidad de tiempo requerida para completar un ciclo de divisin. Factores que influyen en el crecimiento a. Factores externos Condiciones ambientales o culturales: pH, T (en escala centgrada = grados centgrados C), disponibilidad de H2O, O2, CO2 y tiempo. Condiciones nutricionales: Tasa C/N 10:1, 12:1, azufre y otros microelementos. b. Factores internos Capacidad metablica

1.2.2. Crecimiento exponencial y sincrnico El crecimiento de una poblacin resulta de la suma de los ciclos celulares de todos los individuos de dicha poblacin. Crecimiento exponencial: durante el crecimiento exponencial, la tasa de crecimiento de las clulas (medida en gramos de biomasa producida por hora), cuando el crecimiento no es limitado por los nutrimentos, se puede obtener multiplicando la constante de la tasa de crecimiento por la concentracin de biomasa. La constante de la tasa de crecimiento es la tasa a la cul las clulas producen ms clulas, y el valor que esta toma se interpreta como los gramos de biomasa producidos por cada gramo de biomasa preexistente creados en una hora. El crecimiento se denomina exponencial porque la biomasa se incrementa exponencialmente con respecto al tiempo. De lo anterior se deriva que, si graficamos el logaritmo de la concentracin de la biomasa (o celular) en funcin del tiempo, como ocurre en la curva del crecimiento, obtendremos una lnea recta como representacin de esta fase (Trtora, 2008). Crecimiento sincrnico: todas las clulas se encuentran simultneamente en la misma fase del crecimiento celular. Los cultivos sincrnicos son muy difciles de mantener por lo que su importancia est principalmente ligada a los estudios bsicos de biologa microbiana. Sin embargo, en la naturaleza, las bacterias del suelo se encuentran en condiciones de crecimiento prximas a la fase estacionaria (en la que se produce una cierta sincronizacin del cultivo) y, por consiguiente, durante cierto tiempo las poblaciones naturales probablemente se comporten como relativamente sincrnicas (Trtora, 2008).

1.2.3. Determinacin del crecimiento Existen diferentes sistemas para detectar y medir el crecimiento de microorganismos. Se mide por cambios sucesivos en el nmero de clulas o por el peso de la masa de las clulas. Existen varios mtodos para contar las clulas o estimar la masa de stas (Brooks, 2011).

Formas de visualizar el crecimiento bacteriano Caja petri autora nuestra de practica en el laboratorio (crecimiento bacteriano colonias blancas) y Tubos de ensaye color amarillo indica presencia de colonia A. Recuento de clulas 1) Conteo de clulas al microscopio: se emplea un dispositivo graduado con 25 cuadrados cuyo volumen y rea es conocido: Cmara de Petroff-Hausser, cmara de Neubauer, hemocitmetro. Limitaciones: Es muy cansado, no es prctico para un gran nmero de muestras. No es muy sensible, se necesitan al menos 106 bacterias/ml para que sean observadas al microscopio No distinguen clulas vivas de muertas.

Dispositivo graduado para el conteo de clulas bacterianas Tomado de la web para editar 2). Conteo de clulas viables: una clula viable es definida como aqulla que es capaz de dividirse y formar una colonia en el medio de cultivo. El conteo en placas es el mtodo ms utilizado. Pueden ser: Diseminacin en placa (siembra en placa por extensin). Se asume que cada colonia surgi de una simple clula, contando el nmero de colonias uno puede calcular el nmero de clulas viables en la muestra.

Mtodo de vaciado en placa.

Forma de contar clulas bacterianas en placas de agar Imagen para editar tomada de la web 1.2.4. Medida de masa microbiana Mtodos directos: estos mtodos requieren preparaciones limpias, sin partculas extraas. 1. Determinacin del peso hmedo: se tara (calibrar hasta que la balanza especifique el peso real) un tubo de centrfuga se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante se determina el peso del sedimento. Inconvenientes: grandes errores, debido al lquido intercelular retenido, cuya cuanta depende a su vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa, intensidad del empaquetamiento, etc. 2. Determinacin del peso seco: como el anterior, pero el sedimento se seca antes de ser pesado (105oC, toda la noche), hasta peso constante. Las medidas de peso seco suelen representar el 10-15% de los valores de peso hmedo. Inconvenientes: mtodo tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastantes errores: es difcil pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio. 1 mg de peso seco equivale a unas 5x109 bacterias. 3. Determinacin del nitrgeno total: tcnica de micro-Kjeldahl. 4. Determinacin de un componente caracterstico: peptidoglucano, ADN, ARN, protenas, entre otros. Mtodos indirectos 1. Medida de consumo de nutrientes o de produccin de algn metabolito por unidad de tiempo. Ejemplos: consumo de oxgeno (QO2) y consumo de carbnico (QCO2), determinados por el respirmetro de Warburg. Produccin de cidos.

2. Mtodos turbidimtricos (pticos). La base comn de estos mtodos consiste en la medicin de la cantidad de luz dispersada o transmitida a travs de un cultivo bacteriano. 3. Medicin de luz transmitida: Escala de MacFarland: Se trata de una serie de patrones de turbidez (no son claros o transparentes como el agua) previamente calibrados. Consiste en varios tubos de vidrio hermticamente cerrados que contienen {1% de Cl2Ba + cantidades crecientes de H2SO4 (cido sulfrico) al 1%}; por lo tanto, en cada tubo se origina un precipitado de SO4Ba, origen de la turbidez. Para cada cepa bacteriana hay que establecer la equivalencia entre la turbidez de cada tubo y la masa o la concentracin de bacterias (en cls/ml) que genera una turbidez similar. Se trata de una serie de patrones de turbidez previamente calibrados. Consiste en varios tubos de vidrio hermticamente cerrados que contienen {1% de Cl2Ba + cantidades crecientes de SO4H2 al 1%}; por lo tanto, en cada tubo se origina un precipitado de SO4Ba, origen de la turbidez. Para cada cepa bacteriana hay que establecer la equivalencia entre la turbidez de cada tubo y la masa o la concentracin de bacterias (en cls/ml) que genera una turbidez similar. Espectrofotmetro: Este aparato es de uso habitual en cualquier laboratorio de Microbiologa o Bioqumica. Mide la densidad ptica (D.O.), es decir la absorbancia. D.O. = A = -logT/100 donde T= transmitancia C) Nefelmetro: Es un aparato similar al anterior, pero el dispositivo sensor est situado en ngulo recto respecto de la direccin de la luz incidente, y lo que se mide es pues, la luz dispersada directamente por la preparacin. Posee mayor sensibilidad que el espectrofotmetro.

1.2.5. Medida del nmero de individuos Mtodos directos 1. Cmara de recuento de Petroff-Hauser: Consiste en un portaobjetos especial con una graduacin en superficie y unas medidas muy concretas: excavacin con 0.02 mm de profundidad rea de 1 mm2, dividida en un retculo de 25 cuadrados grandes cada cuadrado grande est subdividido a su vez en 4x4 = 16 cuadrados pequeos. O sea, la muestra se distribuye en 16X25 = 400 celdillas (cuadros pequeos). La muestra, una vez dispensada entre el porta y el cubre, se deja reposar sobre la plataforma del microscopio durante unos minutos, y se cuenta el nmero de clulas en varias celdillas (normalmente en 16, equivalentes a uno de los cuadros grandes). Se anota el nmero n de clulas observadas

en esas 16 celdillas. Entonces, la concentracin celular es fcil de establecer: n x 25 x 50 x 1000 = concentracin en clulas/ml. Ventajas: es un mtodo muy rpido Inconvenientes: slo sirve para suspensiones relativamente concentradas (>10x106 cls./ml). Por debajo de este valor el nmero de clulas vistas en el campo del microscopio es muy pequeo y poco significativo estadsticamente. En bacterias mviles, hay que inmovilizarlas previamente, con una mezcla de alcohol y agua. 2. Recuento en preparaciones teidas: Se dispone de un porta con una excavacin circular (de rea At) con un volumen conocido (v). Sobre esta excavacin se extiende la muestra con asa de siembra o con micropipeta, y se fija y tie por algn colorante. Se observa con un microscopio dotado de un juego de ocular y objetivo que delimitan un rea de campo (Ac). Si en dicho campo se cuentan n bacterias, la concentracin de bacterias por mililitro ser: nAt/Ac 1/v 3. Recuento proporcional de Wright: Se mezcla la suspensin bacteriana problema con una cantidad conocida de bolitas de ltex o de hemates (clulas sanguneas = sangre). La concentracin bacteriana se deduce de la proporcin de bacterias y partculas observadas en el mismo campo microscpico. Este mtodo se emplea ms frecuentemente en Virologa. 4. Contadores electrnicos de partculas (tipo Coulter): Se hace pasar una suspensin bacteriana por un tubo capilar, entre los dos polos de una corriente elctrica. Cada vez que por un orificio (30 mm dimetro) pasa una partcula (p. ej., bacteria) se interrumpe la corriente, lo cual es recogido por un dispositivo de registro electrnico, que detecta el nmero y el tamao de las partculas que van pasando. (El tamao detectado es funcin de la intensidad del pulso de voltaje al paso de la partcula). Recientemente se ha introducido la citometra de flujo activada por fluorescencia (FACS). Es una sofisticada modificacin en la que las partculas a contar se marcan previamente con un anticuerpo monoclonal anticuerpo homogneo producido por una clula hbrida producto de la fusin de un clon de linfocitos B descendiente de una sola y nica clula madre y una clula plasmtica tumoralu otro ligando especfico hacia alguna molcula de superficie, unidos a su vez a un fluorocromo, una molcula que emite fluorescencia al incidir sobre ella un haz de luz lser.

Mtodos indirectos: Son mtodos que miden el nmero de bacterias viables (que no equivale al de totales).

5. Mtodo del nmero ms probable: Su fundamento estriba en la distribucin de Poisson: una distribucin aleatoria de partculas en una serie de muestras iguales, en funcin del nmero medio de partculas presentes en una suspensin (presencia y ausencia de microorganismos). La tcnica consiste en sembrar alcuotas de la suspensin original problema sobre un medio lquido o slido adecuado; tras el tiempo de incubacin adecuado se anota la proporcin obtenida de muestras donde no se haya dado crecimiento, P0 (x = 0). Entonces, segn la distribucin de Poisson: P0= em y por lo tanto es fcil calcular el valor de m: m = -lnP0

Figura 12. Conteo de numero ms probable (NMP) para bacterias Editar de la web http://www.uprm.edu/biology/profs/massol/manual/p4nmpenumeracion.pdf 6. Recuento de viables en placa: Como esta tcnica ser explicada al alumno en clase, y adems la realizar en las prcticas, remitimos a las pertinentes explicaciones "en vivo". Es una de las tcnicas de recuento ms usadas en la rutina del laboratorio de Microbiologa. Precauciones: para minimizar los errores estadsticos de muestreo (para que los resultados san concretos y creibles), se recomienda sembrar 5 placas de cada dilucin, porque llega haber ocasiones en donde no crece nada. hay que usar pipetas nuevas en cada dilucin contar las placas donde existan entre 50 y 300 colonias 7. Determinacin de la proporcin clulas viables/clulas totales: Si se est interesado en conocer esa proporcin se recurre a una tcnica de microcultivos en cubreobjetos: hay que seguir peridicamente la evolucin del crecimiento de clulas individuales y determinar la proporcin de aquellas clulas no viables (visibles al microscopio, pero incapaces de crecer). 8. Recuento sobre filtros de nitrocelulosa: Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. Se hace pasar un gran volumen de suspensin a travs de una membrana de nitrocelulosa estril, que retiene las bacterias. Posteriormente, el filtro se deposita sobre la superficie de un medio de cultivo slido. Las colonias se forman sobre el filtro y se cuentan, deducindose la concentracin original en funcin del volumen de suspensin que se hizo pasar por el filtro.

Actividad 3. Un mundo raro Esta actividad representa uno de los mayores retos pues implica crear un mapa conceptual (MMCC) en el cual reflejars tu dominio de los temas anteriormente vistos, al construirlo describirs en l las relaciones entre los conceptos de la microbiologa relacionados con las fases de crecimiento bacteriano y sus formas de medirlo, adems de la morfologa bacteriana. En un documento de texto o archivo de imagen plasma un mapa conceptual que contenga las siguientes caractersticas: El mapa conceptual debe presentar una estructura arborescente que incluya los siguientes aspectos: 1. 2. 3. 4. 5. Concepto o idea original Palabras clave Conectores Conectivos y palabras de conexin Conceptos en diferentes niveles en este caso puedes desarrollarlo mnimo en tres niveles De esta manera a partir del concepto o idea de origen ocurre: 1. Desprendimiento de conceptos secundarios 2. Conectores y proposiciones.- conectores son palabras o preposiciones insertas entre dos conceptos y son tiles para producir nuevas proposiciones o enunciados con sentido. 3. Enlaces cruzados.- son puentes entre proposiciones dentro de la arborizacin. 4. Jerarquizacin.- es el orden en ascendente-descendente en funcin de la complejidad de los conceptos o proposiciones tratados en la arborizacin del MMCC. Nota: Te exhortamos atentamente a abstenerte de cualquier accin de plagio o copia de contenidos, el facilitador puede detectar esta situacin sin dificultad; tu formacin exige que desde esta etapa todo producto o tarea que reportes sea totalmente original y propio de tu iniciativa y creatividad; para que en lo sucesivo esta actitud se proyecte directamente en tu prctica profesional.

Evidencia de Aprendizaje Mi extincin Esta actividad implica que exteriorices en un cuerpo de ideas e informacin todo lo que haz profundizado en conocimientos de esta asignatura. Para ello enfocars tus conocimientos en un agente patgeno que ha trado consecuencias fatales a la especie humana, el Virus del VIH, para el cual investigars algunas teoras que lo caracterizan, as como propuestas cientficas actuales para combatirlo. Como colofn incursionars en algunas ideas que te permitan desarrollar las tuyas propias acerca de la diferencia que existe entre un microorganismo y un virus. Para cumplir esta evidencia de aprendizaje elabora un documento de texto que contenga un ensayo de las propuestas tericas sobre el virus del VIH y la forma de eliminarlo y la diferencia que existe entre el Virus VIH con respecto a una bacteria, con los siguientes elementos: 1. Una extensin por lo menos de una cuartilla. 2. Que incluya Nombre del tema (original), introduccin, desarrollo, conclusiones, bibliografa y ligas de web consultadas. 3. Contenido sin ningn signo de plagio. 4. Tipo de letra Arial 11, interlineado 1.15.

Fuentes de consulta Bibliografa bsica

Gonzlez, G. M. (2007) Microbiologa ambiental. Corpus. Pidello, A. (2011) Ecologa microbiana. Corpus Willey,J. (2009) Microbiologa Mc. Graw Hill / Interamericana

Bibliografa complementaria

Tortora, G., et al 2007 Introduccin a la microbiologa. Pearson Education Murray, P.2009 Microbiologa mdica. Sptima Edicin Elsevier Spicer, W. 2009 Microbiologa Clnica Y Enfermedades Infecciosas. Segunda Edicin. Elsevier