Sunteți pe pagina 1din 14

HEMATOPOIEZA

Hematopoieza - reprezint ansamblul mecanismelor care asigur producia tuturor elementelor figurate sanguine pornind de la celula stem. Celulele sanguine sunt in cea mai mare parte diferentiate, elemente terminale si functionale ale liniilor celulare medulare. Aceste celule au posibilitati foarte reduase sau absente de sinteza proteica si diviziuni celulare (hematiile si trombocitele sunt celule anucleate). Durata de viata este scurta: cateva ore pentru neutrofile, cateva zile pentru trombocite si cateva saptamani (120 zile) pentru eritrocite. In acelasi timp, numarul acestor celule circulante este crescut si mentinut relativ constant. Hematopoieza asigura deci o productie celulara foarte importanta din punct de vedere cantitativ : in fiecare zi se produc aproximativ 1013 celule sanguine ceea ce corespunde la peste 2 milioane de hematii/sec. Aceasta activitate productiva este asigurata de o mica populatie de celule din maduva osoasa numite celule suse hematopoietice. Hematopoieza trebuie controlata foarte strict pentru a asigura meninerea constanta a numarului de celule sanguine in ciuda variatiilor consumurilor importante legate de contexte patologice (hemoragii, infectii ...). Aceasta reglare se bazeaza pe mecanisme celulare si umorale (factori de crestere) care pot fi stimulatori sau inhibitori ai hematopoiezei Hematopoieza cuprinde cteva etape importante : - autorennoirea celulelor stem ; - angajarea celulelor stem n procesul de difereniere i orientare spre o anumit linie celular, trecnd prin etapa celulelor progenitoare ; - proliferarea, diferenierea i maturarea celulelor progenitoare conducnd spre un anumit tip celular matur. I. Dezvoltarea sistemului hematopoietic/organele hematopoietice Sediul hematopoiezei variaza in functie de etapa evolutiva. Diferitele localizri ale hematopoiezei, n evoluie, nu sunt exclusive unele fa de altele, pot exista suprapuneri ntre ele, n timp. Hematopoieza are dou etape importante : hematopoieza primitiv i hematopoieza definitiv. Ia. Hematopoieza primitiv Debuteaz n ziua 19 a vietii embrionare si dureaza pana in saptamana 8. La inceput este mezodermica, cu formarea de insule sanguine la nivelul sacului vitelin extra-embrionar. In insulele sanguine celulele centrale se diferentiaza in eritrocite nucleate iar celulele periferice formeaza primele celule endoteliale. Ib. Hematopoieza definitiva ncepe n sptmna 8. Apariia reelei vasculare care conecteaz sacul vitelin de embrion i diferitele organe i esuturi embrionare ntre ele permite trecerea celulelor stem hematopoietice din agregatele primitive, n circulaia embrionar i, apoi, n orgnele hematopoietice. n cursul vieii fetale precoce, dup a asea sptmn de gestaie i pe parcursul celui de al doilea trimestru de sarcin, organele hematopoietice principale sunt : ficatul i splina. Ulterior, organul hemetopoietic principal devine medulara osoas. La natere, cavitile medulare ale oaselor reprezint situsul hematopoietic major. Toate oasele sunt implicate n procesul hematopoietic. n evoluie, procesul hematopoietic activ se restrnge la oasele scurte i late (calota cranian, stern, coaste, oasele bazinului, vertebre). n rest, mduva osoas roie, hematoformatoare este nlocuit cu mduv gras,

galben. La acest nivel, predomin adipocitele. Totui, la acest nivel, ca i n alte organe ale sistemului reticuloendotelial, rmn celule stem multipotente ca celule hematopoietice n repaus. Aceste celule i pstreaz capacitatea de activare astfel c, n situaii de necesitate, sau patologice (sindroame mieloproliferative, anemii hemolitice) s dea natere la focare hematopoietice extramedulare. Varsta individului Embrion a-3 a-7 luna in utero a-4a a-5a luna in utero a-7a luna Natere Natere maturitate Adult
a a

Situs-ul hematopoiezei Sacul vitelin apoi ficatul Splina Cavitatea medulara - predominant granulocite i plachete Cavitatea medulara - eritrocite Predominant medular; splina i ficatul in caz de necesitate Numrul de situs-uri active in maduva osoas scade dar i menin capacitatea hematopoietic mduva osoas active la nivel craniu, coaste, stern, vertebre, pelvis, extremitile proximale ale femurului

II. Mduva osoas la adult Mduva osoas (MO) este localizat n cavitatea a numeroase oase. Dei este dispersat din punct de vedere anatomic anatomic, prezint o unitate de organizare datorit particularitilor vascularizaiei sale i reelei de celule stromale care stimuleaz hematopoieza. La dult, MO activ reprezint aproximativ 50 - 60% din volumul medular total i se limiteaz la oasele craniului, clavicule, vertebre, stern, bazin, extremitati proximale ale femurului si humerusului. n oasele cu hematopoiez activ, se produce o involuie adipoas mai marcat n partea central a osului i se accentueaz cu mbtrnirea. Din punct histologic organizatoric, MO cuprinde mai multe compartimente : - Un cadru osos, cu celule asociate ; - Un compartiment vascular cu anumite particulariti - Parenchimul hematopoietic. - Un micromediu sau trama conjunctivo-vasculara care cuprinde celulele stromale i matrice extracelulare II.1. Cadrul osos Este un os spongios, compus de o ntretiere de lamele osoase sau trabecule care delimiteaz mici spatii (lojete) i diverse celule : osteoblati, osteocite, osteoclaste. - Osteoblatii - celule de origine mezenchimatoas care secret tropocolagen (precursor de colagen ce va forma trama osteoida), glicoproteine, mucopolizaharide i factori de crestere : GM-CSF, M-CSF, IL1, TGF. - Osteocite derivate din osteoblaste. Sunt coninute n caviti numite osteoplaste ; particip la nutriia i activitatea osoas. - Osteoclaste celule de origine monocitarmacrofagic cu rol n osteoliz rezorb matricea mineral osoas prin secreia de acizi organici care solubilizeaz srurile de calciu. Sunt stimulate de parathormon i de factorul activator al osteoclastelor (OAF) n contexte patologice. Viata osului este ciclic cu edificri i rezorbii succesive (reinnoirea total a structurii osoase se realizeaz n aproximativ 20 ani). Osul este format initial sub o forma nemineralizata (os osteoid) apoi mineralizarea survine in mod secundar.

II. 2. Vascularizatia osoasa Are un rol functional : nutritia, oxigenarea, productia de factori de crestere, si eliberare de celule mature. Sinusurile venoase medulare sunt formate dintr-un monostrat continuu de celule endoteliale ale cror jonciuni sunt realizate printr-o juxtapoziie celular cu o discret suprapunere a marginilor citoplasmatice. Pe faa extraluminal, celulele endoteliale sunt acoperite de un strat discontimuu format de celule reticulare adventiceale (fibroblati sau miofibroblati care prezint o serie de prelungiri ce formeaz o reea extins n spaiul medular extravascular). Migrarea celulelor hematopoietice intra i extravascular, la nivel medular se realizeaz la nivelul sinusurilor venoase. Un rol esenial l joac celulele endoteliale care regleaz trecerea intravascular selectiv a celulelor sanguine mature, ct i trecerea intramedular a progenitorilor hematopoietici, n special dup grefa medular. II.3. Parenchimul hematopoietic : Din punct de vedere structural se caracterizeaz prin juxtapoziia de diverse celule mieloide care se regsesc n mici regiuni definite de ctre lamelele osoase (lojete medulare). Acestea conin o tram (fibre ale matricei extra-celulare i fibroblati), adipocite, celule endoteliale, capilare sinusoide si ansamblul de elemente imature si difereniate ale hematopoiezei. Regiunile endostale juxtatrabeculare sunt mai bogate in precursori hematopoietici ; compartimentele de maturatie sunt mai ndepartate. n patologie, n sindroamele mielodisaplazice, se constat focare de celule imature la distan de endost i de capilarele sinusoide (ALIP). Din punct de vedere funcional, parenchimul hematopoietic se organizeaz n mai multe compartimente ierarhizate : - celulele stem hematopoietice - celulele progenitoare - celulele precursoare a) Celulele stem Producia permanent a tuturor celulelor mature din snge este asigurat de o populaie celular medular, destul de restrns numeric, capabil de autorennoire, de proliferare intens i difereniere celulele stem hematopoietice totipotente. Capacitatea de autorennoire asigur meninerea unei rezerve constante de celule stem. Capacitatea proliferativ crescut asigur un numr sporit de celule descendente. Totui, nu trebuie uitat c numrul de diviziuni succesive la care particip o celul stem este limitat. Un studiu experimental a artat c o celul stem poate da natere la peste 500.000 celule difereniate, dup doar 19 diviziuni succesive. Aceste celule nu pot fi identificate morfologic, cel puin cu tehnicile actuale. Se crede c sunt celule mononucleate, cu un diametru de 6 microni i un raport nucleo-citoplasmatic foarte ridicat. Marea majoritate sunt n repaus celular (faza G 0 a ciclului celular). Recunoaterea celulei se face pe baza analizei fenotipului imunologic (markerii de suprafa exprimai pe membrana celular) : CD34+, CD38-, DR-, CD45RA-, c-kit+, CD19-. Recent au fost descoperite dou antigene noi, exprimate pe membrana acestor celule : HCA (molecul de adeziune) i HCC-1. Celulele hematopoietice pot trece n sngele periferic, fie n etapa de recuperare a unei neutropenii postchimioterapie, fie sub efectul stimulator al factorilor de cretere hematopoietici. Se pare c aceste celule hematopoietice sanguine ar fi mai imature dect celulele hematopoietice medulare prelevate n faz stabil (nafara situaiilor menionate mai sus).

Celula stem totipotent, aflat n repaus (faza G0), sub aciunea unor factori stimulani, va intra n ciclul celular conducnd la diviziunea celular. Rezultatul diviziunii vor fi celule stem identice i/sau celule angajate. Exist opinii diferite, potrivit crora diviziunile celulare conducnd la cele dou tipuri de celule fiice sunt independente, n funcie de stimul. Ali autori sunt de prere c diviziune celulei stem totipotente este asimetric conducnd la dou celule fiice diferite : una identic cu ea nsi (autorennoirea cu meninerea rezervei) i una angajat n procesul de difereniere, spre anumite linii celulare. Celula angajat rezultat n prima generaie are potenialul de a da descendeni aparinnd mai multor linii celul stem pluripotent sau multipotent (mieloid sau limfoid). n etapa urmtoare procesul de difereniere continu, cu restricia la o singur linie celular - celula stem unipotent. Deci, celula stem va suferi un proces de difereniere i proliferare. Proliferarea va asigura un numr crescut de celule descendente. Diferenierea sau angajarea va determina orientarea treptat spre o anumit linie celular sanguin. Acest proces ireversibil va determina pierderea capacitii de rennoire i limitarea posibilitilor de evoluie spre diferitele elemente mature. b) Celulele progenitoare Odat procesul de angajare iniiat, celulele intr n compartimentul celulelor progenitoare, compartiment intermediar ntre cel al celulelor stem i al celulelor precursoare. Celulele progenitoare au o ierarhie proprie, de la cele mai precoce, cu o gam mai larg de posibiliti evolutive, spre cele tardive, mature cu o singur posibilitate evolutiv. Se pare c procesul de angajare are o ordine bine definit a etapelor. O prim etap este angajarea pe linia mieloid i respectiv limfoid, dnd celule progenitoare pluripotente (CFUGEMM i CFU-L). Ulterior procesul de difereniere progreseaz cu restrngerea paletei evolutive. Fiecare celul progenitoare va da natere la un repertoriu bine definit i limitat de celule mature. Fiecare celul progenitoare i pstreaz capacitatea proliferativ i va suferi multiple diviziuni la fiecare etap, pn la intrarea n compartimentul de celule precursoare. n paralel cu procesul de multiplicare se continu i cel de difereniere, dar capacitatea de difereniere se restrnge de la o etap la alta. Aceste celule progenitoare cuprind : CFU-E (colony forming units erytrocyte), CFU-G (granulocyte), CFU-M (monocyte/macrophage), CFU-MK (megakariocyte), CFU-preB (B lymphocytes), CFU-DL (dendritic/langerhans cell). n anumite linii celulare, cum este cazul celei eritrocitare, pot exista mai multe etape de maturaie. Toate aceste celule nu pot fi identificate morfologic la examenul microcscopic, dar pot fi identificate prin capacitatea lor de a forma colonii celulare. c) Celule precursoare Celulele precursoare reprezint stadiile finale ale hematopoiezei. Celulele sunt destul de difereniate pentru a fi identificate morfologic la examenul microscopic pe frotiuri medulare. Capacitatea de proliferare s-a redus la maximum nct celulele mai pot suferi, n medie, patru diviziuni celulare. n paralel, celulele sufer modificri asociate cu ultimile etape maturaie care conduc la elementele figurate mature. Modificrile se refer la dimensiuni (dimensiunile celulei scad pe msura diviziunilor ultime) aspectul nuclear (nucleul i micoreaz dimensiunile, cromatina se condenseaz n grmezi, nucleolii, prezeni la nceput, dispar) i aspectul citoplasmatic (iniial citoplasma este intens bazofil datorit ncrcrii cu ribozomi i sintezei proteice intense, ulterior tinctorialitatea vireaz treptat spre acidofilie, i se ncarc, eventual, cu granulaii). Acestea vor prsi mduva trecnd n circulaie pentru a compensa pierderile cotidiene.

II.4. Stroma medular (Micromediul medular) Hematopoieza la adult are loc n medulara oaselor late i scurte. Biopsiile osoase au artat c celulele hematopoietice sunt localizate n compartimente situate ntre trabeculele osoase. La acest nivel, nafar de aceste celule hematopoietice i structurile vasculare, mai pot fi puse n eviden elemente celulare nonhematopoietice i structuri acelulare. Toate acestea, n ansamblu, alctuiesc stroma medular sau micromediul medular, concept important n nelegerea mecanismului hematopoiezei. Stroma este alctuit din : elemente celulare : miofibroblati, adipocite, celule endoteliale, limfocite, plasmocite, macrofage ; matricea extracelular : proteine fibroase (colagen I, III, IV, V, VI, fibronectina), glicoproteine (laminina, hemonectina, nascina, trombospondina) i proteoglicani. Stroma sau micromediul medular joac un dublu rol esenial n procesul de hematopoiez: asigur fenomenul de homing$ (de localizare) la nivel medular al celulelor stem hematopoietice i deci al hematopoiezei. Astfel, pe de o parte, se asigur prin anumite semnale atragerea celulelor stem cu colonizarea spaiilor medulare osoase. Colonizare care are loc fie n procesul ontogenetic, fie n cazul celulelor stem toti- sau multipotente recirculate prin sngele periferic, fie n caz de gref medular. Pe de alt parte, se asigur fixarea celulelor hematopoietice la nivel medular, limitnd trecerea celulelor n sngele periferic doar pentru elementele mature. Acest fenomen implic un proces de adeziune a celulelor hematopoietice la celulele i matricea stromal. Rezult o interaciune direct celul-celul. Celulele hematopoietice i cele stromale exprim la nivel membranar molecule de adeziune car permit fixarea intercelular i ancorarea la matrice. Celulele stromale produc i elibereaz numeroi factori de cretere i inhibitori care moduleaz procesul de hematopoiez.
$ Celulele hematopoietice progenitoare posed la nivel membranar receptori care se leag n mod specific la situsuri particulare de pe macromoleculele matricei. Astfel, matricea extracelular asigur o reea structural la care se fixeaz progenitorii, participnd la fenomenul de localizare (homing). Odat cu apropierea de fazele terminale ale maturizrii, celulele hematopoietice i pierd aceste molecule membranare care interacioneaz cu matricea, permind migrarea extramedular. Proteinogliganii intens sulfatai ca heparan sulfatul i condroitin sulfatul contribuie la adeziunea ntre strom i celule hematopoietice. Proteinoglicanii pot aciona prin concentrarea factorilor de cretere solubili, ajutnd hematopoieza.

IV. Factorii de cretere hematopoietic Factorii de cretere hematopoietic reprezint un grup heterogen de citokine care stimuleaz celulele progenitoare ale sistemului hematopoietic. Drept consecin se iniiaz procesul de difereniere, proliferare i maturare al acestor celule. Marea lor majoritate sunt glicoproteine. Sunt sintetizate i elaborate (cu excepia eritropoietinei) de ctre celulele stromei medulare dar i din alte organe (celulele endoteliale, fibroblati, monocite/macrofage, limfocite). Factorii de cretere se leag specific de receptori corespunztori de pe membrana celulelor hematopoietice. Ei joac un rol esenial n reglarea hematopoiezei, att n perioadele de sntate, ct i pe timp de boal. Grupul factorilor de cretere este extrem de heterogen att din punct de vedere al structurii chimice primare, dar i din punct de vedere funcional. Sunt factori de cretere capabili s acioneze pe mai multe linii celulare (Il-3, GM-CSF), dup cum exist factori cu specificitate pe anumite linii celulare (EPO, G-CSF, M-CSF). Exist factori care influeneaz toate etapele devenirii celulelor hematopoietice, dup cum exist factori de cretere care acioneaz punctual, fie n stadiile precoce asigurnd recrutarea celulelor aflate n repaos i introducerea n ciclul celular cu iniierea angajrii celulare i proliferrii, fie acioneaz numai

n stadiile mai tardive fiind necesare diferenierii i maturrii celulare. Astfel procesul de hematopoiez necesit colaborarea tuturor acestor factori pentru iniierea i finalizarea sa. Factorii de cretere i pot exercita aciunea reglatoare asupra hematopoiezei att n mod endocrin (aciunea la distan, pe cale sanguin), n mod paracrin (prin contiguitate, fie prin secreie, fie prin contact membranar), dar i n mod autocrin (fie prin secreie, celula posednd i receptorul membranar corespunztor, fie direct intracelular). Muli dintre factorii de cretere au fost identificai, ca i gena lor codant. Gena a fost clonat i astfel s-a putut trece la producia lor pe scar larg prin inginerie genetic. Acest lucru a permis stuierea lor i studiul in vitro al procesului de hematopoiez n scopul ameliorrii nelegerii lui. n acelai timp a permis utilizarea lor n terapeutic : colectarea celulelor stem pentru gref, diminuarea duratei i profunzimii aplaziilor post-chimioterapie, post-gref a) Controlul pozitiv al hematopoiezei n ansamblu, hematopoieza este controlat n mod pozitiv de : factori cu aciune sinergic, care acioneaz asupra celulelor stem totipotente (capabile de autorennoire) IL-3, IL-1, IL-6 ; factori care acioneaz asupra celulelor pluripotente i asupra progenitorilor cei mai difereniai IL-3, IL-4, GM-CSF ; factori care acioneaz asupra etapelor tardive ale diferenierii i maturrii, avnd specificitate pentru anumite linii celulare G-CSF, M-CSF, Epo, MK-CSF sau Tpo, IL-5. Factorii de cretere se fixeaz pe receptori specifici, exprimai pe suprafaa membranei celulare. Receptorii identificai pn n prezent aparin de dou mari familii de receptori : receptori cu activitate tirozin-kinaz i superfamilia receptorilor citokinelor. Legarea de receptori a factorilor de cretere, determin declanarea unei cascade de reacii chimice i intervenia unor mesageri intracelulari care vor conduce la realizarea rspunsului corespunztor. Fiecare factor de cretere i are propriul receptor, diferit de al celorlali. n acelai timp, o celul hematopoietic poate exprima receptori pentru mai muli factori de cretere. Rolul capital al factorilor de cretere asupra celulelor hematopoietice este acela de a asigura proliferarea, diferenierea i supravieuirea celulelor int. 1) Factorii de cretere asigur antrenarea celulelor aflate n repaos i intrarea lor n ciclul celular proliferant, acionnd mai ales n timpul stadiului G1. 2) Factorii de cretere pot activa factori de transcripie ai unor gene cu declanarea sintezei proteinelor codate i, astfel, iniiaz procesul de angajare i apoi difereniere pe diferitele linii celulare. 3) Un element important de subliniat este rolul de asigurare a suprvieuirii celulare pentru c, absena factorului de cretere nu antreneaz numai oprirea ciclului celular ci i moartea celular. Astfel, factorul de cretere previne declanarea apoptozei, probabil prin reglarea expresiei genei bcl-2, implicat n acest proces. b) Controlul negativ (inhibitor) al hematopoiezei Ca orice proces din organism, i hematopoieza este controlat. Controlul exercitat este att pozitiv (stimulant) ct i negativ (inhibitor). Echilibrul fin ntre cele dou sisteme de control asigur, n condiii fiziologice, o hematopoiez normal (cantitativ i calitativ). Orice dereglare a unuia din mecanisme poate antrena hematopoieza n una din direcii de producie excesiv sau deficitar. Sistemul de control negativ este mai puin bine cunoscut dar progrese importante s-au realizat n ultimii ani. Cunoaterea acestui sistem prezint o serie de interese : a) o mai bun cunoatere a controlului hematopoiezei normale ; b) explicarea modului de implicare a inhibiiei hematopoiezei normale n cursul leucemiilor ; c) posibila utilizare a factorilor

inhibitori pentru scoaterea din ciclul celular a celulelor stem n timpul tratamentului citostatic i, astfel, protejarea capitalului hematopoietic. Ca i factorii stimulani, factorii inhibitori acioneaz la mai multe nivele ale proliferrii i diferenierii hematopoietice. Ei nu au specificitate de linie celular.
Factori de control negativ : Prostaglandinele E Interferonii Tumor Necrosis Factor alfa (TNF alfa) Transforming growth factor beta (TGF beta) Macrophage inflammatory protein (MIP1) Isoferitinele acide Lactoferina Tetrapeptidul acetil-N-Ser-Asp-Lys-Pro (AcSDKP, Seraspenid) Pentapeptid pGlu-Glu-Asp-Cys-Lys (pEEDCK) Factorul plachetar 4 (PF4)

A. ERITROPOIEZA Eritrocitele la adultul normal provin din celulele sue (stem) din mduva osoas hematopoietic care, dup ce s-au difereniat, sufer un proces de maturaie ce dureaz n jur de ase zile. ntregul proces prin care eritrocitele sunt produse la nivelul mduvei osoase se numete eritropoiez. Eritropoieza este un proces controlat care asigur o producie continu ce nlocuiete pierderile fiziologice meninnd constant masa eritrocitar total din organism. Eritropoieza implic un numr i o varietate mare de celule n diferite etape de maturaie ncepnd de la prima celul stem angajat spre linia eritrocitar pn la eritrocitul matur. Aceast ntreag mas de celule eritroide a fost denumit eritron. Acest concept privete masa eritroid ca o unitate tisular funcional. Eritropoieza cuprinde mai multe etape. Celula stem multipotent sub aciunea unor stimuli se angajeaz spre linia eritroid. Celulele rezultate vor suferi iniial un proces de proliferare i difereniere n etape iar ulterior un proces de maturaie. Celulele cele mai precoce ale liniei roii formeaz compartimentul celulelor progenitoare cuprinznd BFU-E (burst-forming unit-erythroid) i CFU-E (colony-forming unit-erythroid). Aceste celule nu pot fi recunoscute din punct de vedere morfologic dar pot fi identificate funcional prin capacitatea lor de a forma in vitro colonii eritroblastice. Procesul se continu cu compartimentul celulelor precursoare ce cuprinde n ordine maturativ : proeritroblastul, eritroblastul bazofil, eritroblastul policromatofil, eritroblastul acidofil, pentru a ajunge la reticulocit i, n final, eritrocitul matur. Celulele progenitoare : Burst Forming Unit Erythroid (BFU-E) apare morfologic ca un blast foarte imatur, uor ovalar, cu citoplasma moderat bazofil, uneori cu pseudopode fine, nucleul mare cu cromatina foarte fin i nucleoli mari. Colony Forming Unit Erythroid (CFU-E) apare morfologic ca o celul imatur, cu nucleu mare cu cromatina nuclear fin, nucleoli mari, evideni, o zon perinuclear clar i citoplasm bazofil cu pseudopode. Celulele precursoare : Proeritroblastul - reprezint cea mai precoce celul a seriei roii posibil de identificat cu ajutorul tehnicilor actuale. Este o celul mare, rotund sau ovalar, cu diametrul de 20-25 m. Nucleul este rotund sau oval cu cromatina fin granular i unul sau doi nucleoli. Ocup aproximativ 80% din celu. Citoplasma are o culoare albastru nchis. Proeritroblastul sufer mitoz dnd natere la dou celule fiice ce se matureaz n eritroblati bazofili.

Eritroblastul bazofil - talia se micoreaz : 16-18 m. Cromatina nuclear ncepe s se condenseze n grmezi dispuse predominant la periferia nucleului. Nucleolii sunt abseni. Citoplasma are o culoare albastru nchis. Are loc o sintez crescut a hemoglobinei n citoplasm dar cantitatea crescut de ARN o mascheaz. Eritroblastul policromatofil - raportul nucleo/citoplasmatic continu s scad, ca i talia celulei, de numai 9-12 m. Nucleul s-a micorat, cu cromatina condensat. Sinteza de hemoglobin este crescut cu invazia treptat a citoplasmei nct coloraia este variabil, n general albastru-gri. Acesta este ultimul stadiu cnd se mai produc mitoze, ducnd la urmtoarea etap. Eritroblastul acidofil sau ortocromatofil - Nucleul complet picnotic, incapabil de sintez a ADN este expulzat din celul (kariorexis). Citoplasma este aproape complet ocupat de hemoglobin, devenind roz-portocalie. Reticulocitul - reprezint stadiul premergtor eritrocitului matur. Citoplasma seamn cu cea a eritroblastului acidofil. Rmn cantiti variabile de ARN dnd culoarea albstruie. Reticulocitele pot prsi mduva i trec n circulaie. Ele sunt evideniabile pe frotiul din sngele periferic prin coloraii speciale (ex. albastru de metilen sau albastru de cresyl) care pun n eviden o reea reticulo-filamentoas, prin precipitarea poliribozomilor. n aceast etap se pierde i restul de organite celulare ajungnd la stadiul terminal. Eritrocitul - celula matur circulant. Are aspect de disc biconcav cu diametrul de 7-8 m, reprezentnd forma cea mai avantajoas din punct de vedere al raportului suprafa/volum, ce asigur o ncrcare optim cu hemoglobin. Pe frotiu apare ca o celul rotund, fr nucleu, cu citoplasma roie-roz, mai palid central i mai intens periferic. Durata medie de via este de 120 zile. Funcia principal este de transport al oxigenului de la plmni la esuturi. De aceea interiorul celulei conine 90% hemoglobin i 10% ap. Eritropoieza, ca ntreaga hematopoiez, se afl sub controlul factorilor de cretere, n principal sub controlul eritropoietinei cu specificitate aproape exclusiv pentru linia roie. Eritropoietina este un hormon glicoproteic produs n principal la nivel renal, pare-se de celulele interstiiale din apropierea tubului contort distal. Producia hepatic, esenial la ft, reprezint doar 10-15% la adult. Sinteza eritropoietinei este sub controlul presiunii O 2 la nivel tisular. B. GRANULOCITELE NEUTROFILE Granulocitele din snge sunt celule care, aa cum arat i numele, conin n citoplasm numeroase granulaii. n funcie de afinitatea tinctorial, se disting trei tipuri de granulaii, care dau i numele celor trei subpopulaii de granulocite : neutrofile, eozinofile i bazofile. Granulocitele neutrofile sunt cele mai numeroase. Granulocitele se formeaz n mduva osoas hematopoietic. Ele iau natere, ca i seria eritrocitar i megacariocitar, dintr-o celul su pluripotent, care se difereniaz spre progenitorul specific liniei. Procesul de maturaie la nivel medular dureaza aproximativ 7 zile i cuprinde n jur de 4-5 mitoze. Procesul de difereniere i maturare se traduce morfologic prin schimbri de form ale nucleului i o maturare progresiv a citoplasmei, cu pierderea bazofiliei i apariia de granulaii specifice. La nivel medular, n cadrul procesului de maturare, pot fi difereniate mai multe etape pe linia celulelor precursoare : mieloblast, promielocit, mielocit, metamielocit, granulocit nesegmentat i granulocitul matur sau polimorfonuclearul (PN). Neutrofilele constituie 40-70% din totalitatea globulelor din snge. Linia lor de maturaie constituie populaia majoritar din maduv. Raportul granulocite/eritroblati este de aproximativ 3/1. 1. Mieloblastul.

Constituie celula cap de serie, recognoscibil morfologic n microscopia optic, a seriei precursoare granulocitare. Este o celul prezent n procentaj sczut n mduva normal (0,52%). Are un diametru de 15-20 microni (etalat). Este oval, uneori rotunjit. Nucleul are cromatina omogen, fin dispersat, cu nucleoli (2-5) bine delimitai. Citoplasma este albastr, mai nchis la periferie, cu rare granulaii azurofile, de talie mic. Numrul granulaiilor crete cu maturarea. Specializarea fiecarei linii celulare apare precoce, nc din aceast etap, dar nu poate fi pus n eviden, n microscopia optic, dect din stadiul de mielocit (granulaiile specifice). 2. Promielocitul. Este o celul mai voluminoas dect mieloblastul. Este prezent n proporie de 2-8% din populaia medular. Nucleul este voluminos, adesea excentric, discret ancoat, cu cromatina ce ncepe s se condenseze, iar nucleolii sunt uneori vizibili. Citoplasma este abundent, mai puin bazofil ca la mieloblast i bogat n granulaii. n vecintatea nucleului este o zona mai srac n granulaii, unde este situat aparatul Golgi. 3. Mielocitul. Este o celul de 15 microni, cu un nucleu rotunjit, cu cromatina condensat n grmezi. Citoplasma este acidofil, bogat n granulaii neutrofile, de culoare maronie deschis. Granulaiile azurofile, dei nc prezente, sunt nvelite n mucopolizaharide cu pierderea capacitilor tinctoriale nct nu mai sunt vizibile. 4. Metamielocitul. Celula se caracterizeaz prin alungirea i ncurbarea nucleului, cu cromatina condensat n blocuri bine delimitate. Citoplasma este acidofil cu aspect similar cu a mielocitului. Urmeaz o etap intermediar de neutrofil nesegmentat (band neutrophil - din literatura anglo-saxon) n care nucleul alungit este total ncurbat, lund aspectul de potcoav. 5. Polinuclearul neutrofil. Aspectul pe frotiu este al unei celule rotunde cu diametrul de 12-14 microni. Nucleul este format segmente (blocuri) cromatiniene (2-5) reunite prin filamente fine. n sngele periferic, 50% din neutrofilele mature au 3 lobi, i sub 5% au 5 lobi sau peste. Citoplasma este roz, plin cu numeroase granulaii neutrofile. 70-80% dintre granulaii sunt neutrofile, iar restul sunt azurofile. C. SERIA MONOCITO - MACROFAGICA Studiul modern al fagocitelor la mamifere a fost nceput secolul trecut de ctre Metchnikoff. Studiul ontogeniei, cineticii, i funciei celulelor fagocitante la animale a determinat crearea conceptului de sistem monocitic-macrofagic sau sistemul fagocitic mononuclear. Acest sistem cuprinde monoblatii i promonocitele din mduva osoas, monocitele sanguine, i macrofagele libere i fixate n esuturi. Acest concept de sistem fagocitic mononuclear exclude polinuclearele, ca celule fagocitante, i nlocuieste conceptul mai vechi al lui Aschoff din 1924, de sistem reticuloendotelial care cuprindea alturi de macrofage, celulele endoteliale, celulele reticulare, celulele dendritice din centrii germinativi ai foliculilor ganglionari. Aceste celule joac un rol complementar n activitatea fagocitar dar au origini diferite fa de sistemul monociticmacrofagic. Producie Sistemul fagocitic mononuclear cuprinde monoblastul, promonocitul, monocitul si macrofagul. i are originea, ca i restul elementelor figurate sanguine, la nivelul mduvei osoase hematoformatoare.

Producia debuteaz prin progenitori foarte nediferentiati = CFU-GEMM (Colony Forming Unit Granulocitar, Eritroblastic, Megacariocitar si Monocitar) care, sub influena diverselor citokine (SCF, FLT3-L, GM-CSF, IL-3) vor da natere la progenitori difereniai. Acesti progenitori mieloizi mai diferentiati (CFU-GM) (Granulocitari i monocitari), vor prolifera n prezena IL-3 i GM-CSF (Granulocyte Monocyte - CSF). Apoi, prezenta suplimentara de G-CSF stimuleaz orientarea spre CFU-G (care vor da natere la linia granulocitar neutrofil), n timp ce prezena suplimentar de M-CSF determin diferenierea spre progenitorii CFU-M apoi spre precursorii monocitari. Timpul de diferentiere al CFU-GEMM in monocite medulare = aprox 4-5 zile. Macrofagul constituie elementul central in reglarea monocitopoiezei. Macrofagul activat de diveri stimuli (imuni, endotoxina) este capabil s produc M-CSF i GM-CSF ce vor stimula monocitopoieza. n acelai timp macrofagul produce citokine (TNF, IL-1) care vor stimula celulele endoteliale i mezenchimale s produca M-CSF i GM-CSF. n acelai timp GM-CSF interacioneaz cu macrofagul matur i l activeaz crescndu-i potenialul citotoxic. Limfocitul T activat secret GM-CSF i IL-3 care vor aciona local i vor regla proliferarea i activarea macrofagelor n focar. Morfologie CFU-GM constituie celula progenitoare a seriei monocitare. Monoblastul i promonocitul sunt celulele precursoare ale seriei. 1. Monoblastul normal este o celul rar la nivelul mduvei osoase normale. Microscopia optic aproape nu poate face diferenierea cu mieloblastul. Monoblastul devine evident n situatii patologice, cum este cazul leucemiei acute monoblastice (LAM5). n general, este o celul cu aspect blastic, celul tnr cu nucleu mare cu cromatin fin granular i uniform dispersat, i cu nucleoli prezeni. 2. Promonocitul reprezint celula intermediar ntre monoblast i monocit. Nucleul este puternic ancoat, neregulat i prezint filamente n mnunchi sau dispersate n citoplasm. Pentru o mai corect difereniere este util folosirea reaciilor citochimice (valabile i pentru monocit). Celulele contin mieloperoxidaza ca i linia granulocitara dar n cantitate mult mai mic. Reaciile citochimice pot pune in eviden o reacie fosfatazic acid, si mai ales esterazic. Aceasta din urm este foarte util fiind cu specificitate pentru linia monocitar deoarece este inhibat de florura de sodiu, fenomen care nu se petrece n cazul esterazelor din linia granulocitar. 3. Monocitul este cea mai mare celula sanguin, are un diametru de 12-15 microni. Nucleul ocup aproximativ jumtate din aria celular i este poziionat, de obicei, excentric. Nucleul este adesea reniform sau puternic ancoat, neregulat, mai rar rotund dar cu contur neregulat. Cromatina este structurat n grmezi situate pe faa intern a membranei nucleare, unite prin benzi fine cromatiniene. Citoplasma are o culoare cenuie, gri-albastruie i conine fine granulaii roz, care, uneori, pot fi numeroase nct dau citoplasmei o tent roz. n citoplasm pot fi prezente vacuole n numr variabil. Monocitele prsesc mduva la scurt timp dupa ultima diviziune celular, ceea ce explic faptul c, spre deosebire de granulocite, nu exist o rezerv medular de monocite. Ele trec n circuitul sanguin. La adultul normal monocitele reprezint 1-6% din populaia leucocitar. Monocitul medular rmne n maduv o zi dupa care migreaz in sngele periferic unde circula 1-4 zile nainte de a iei din capilare (prin diapedeza activ) pentru a se localiza in tesuturile din organism. Se transforma in histiocit cu functie macrofagica si imuna. Durata de viata este de la 3 luni la 3 ani.

10

Spre deosebire de polinuclearele neutrofile monocitele si histiocitele sunt inca capabile sa prolifereze (chiar daca slab), dar mai ales sa sintetizeze numeroase componente (citokine, altele..). Potrivit localizarii lor tisulare aspectul difera i au denumiri diferite: Ficat = celule Kpffer Maduva osoasa = macrofage medulare Rinichi = celule mezangiale intraglomerulare Creier = celulele microgliei Seroase = macrofagele seroaselor Plaman = macrofage alveolare Splina = macrofage sinusale Ganglioni = macrofage sinusale (in sinusuri), celule interdigitate (regiunile T), celule foliculaire dendritice (centrii germinativi) Os = osteoclaste multinucleate Funcii ndeplinite : - fagocitoza - initierea raspunsului imun prin calitatea de celula prezentatoare de antigene - raspunsul inflanmator - coagulare

D. LIMFOPOEZA Limfoctele reprezint o populaie heterogen de celule care difer mult ntre ele din punct de vedere al originii, cii de maturare, durat de via, teritoriile prefereniale de populare n organele limfoide, markeri de suprafa, funcie. Diferite aspecte morfologice ale acestor celule ca : mrime, granulaii, raportul nucleo-citoplasmatic prezint diferene ntre o subpopulaie limfocitat i alta. Totui, diferenele sunt greu de sesizat pentru a diferenia ntre ele aceste subpopulaii doar pe criterii morfologice. Cea mai important metod de difereniere a subpopulaiilor limfocitare ntre ele se bazeaz pe identificarea unor structuri proteice, dintre care unele sunt glicoproteine, exprimate la nivelul membranei celulare. Acestea constituie markeri celulari de suprafa i au fost denumite antigene cluster of differentiation (CD). Aceste antigene pot fi prezente pe mai multe linii celulare, unele pot avea specificitate pentru o anumit linie celular, iar altele pot avea specificitate pentru o anumit etap din evoluia (maturarea) liniei celulare respective. Identificarea lor, cu ajutorul anticorpilor monoclonali, permite identificarea liniei i etapei evolutive a celulei respective. Faptul este cu att mai important pentru identificarea originii celulare a unei celule maligne. n ceea ce privete markerii limfocitari, au fost clasificai n trei tipuri : - markeri de difereniere B sau T - cu specificitate pentru fiecare linie limfocitar n parte ; - markeri de maturaie structuri care apar n anumite etape ale devenirii celulei respective, putnd dispare la etapele urmtoare ; - markeri de activare antigene care apar n cursul ciclului celular ndicnd o proliferare limfocitar. Limfocitele, ca i restul celulelor sanguine, deriv din celula stem hematopoietic totipotent, prin intermediul unei celule progenitoare primitive, angajate spre linia limfoid. Diferenierea n acest sens depinde de o serie de factori celulari i umorali (micromediul) ca i de alte celule sanguine specializate provenite din celula stem.

11

Dup angajarea pe linia linia limfoid, celulele progenitoare continu s prolifereze, s se diferenieze i s se matureze, conducnd la dou clase mari de limfocite : limfocitele B i limfocitele T. Capacitatea lor funcional va asigura cooperarea, constituind elementele eseniale ale sistemului imunitar. Cele dou clase, dei prea puin distincte morfologic, au funcii diferite i, n acelai timp, exprim la nivel membranar o serie de structuri antigenice care le va asigura funcia i recunoaterea (imunofenotipaj). Cele mai importante sunt dou tipuri de molecule cu funcie de receptor : imunglobulina mebranar exprimat de limfocitul B i receptorul T (TCR T cell receptor, cu molecula asociat CD3) exprimat de limfocitul T. Relativ recent a fost identificat o a treia subpopulaie limfocitar, limfoctele non-B, non-T sau limfocitele null. Morfologie : Limfocitele din snge sunt celule mici, n raport cu celelalte elemente figurate. Au un diametru de sub 10 microni. Excepie de la regul fac limfocitele granulare mari care pot atinge un diametru dublu i conin n citoplasm granulaii azurofile. Raportul nucleocitoplasmatic este mare cu tendin ctre 1. Nucleul este rotund-ovalar, de culoare nchis, cu o cromatin grosier, compactat n grmezi. Nucleolii sunt invizibili. Citoplasma formeaz o bordur discret, abia vizibil (uneori) n jurul nucleului. Citoplasma este moderat bazofil i, n general, lipsit de granulaii. Spre deosebire de eritrocite, granulocite i trombocite, limfocitul matur nu constituie elementul terminal al liniei sale, avnd posibilitatea ca sub o stimulare corespunztoare s-i recapete capacitile proliferative cu reevoluie spre stadiul de limfoblast. Limfoblastul are dimensiuni mai mari, cu diametrul ntre 8 i 12 microni, nucleul rotund/ovalar cu o cromatin mai fin, lax, cu nucleol prezent, ocupnd o treime din suprafaa nuclear. Citoplasma este mai abundent, bazofil, bogat n poliribozomi. E. TROMBOCITOPOIEZA Trombocitele reprezint termenul final de maturare al liniei megakariocitare. Elementele acestei linii pot fi izolate din snge i mduva osoas prin centrifugare sub gradient (ex Ficollhypaque), triaj celular cu anticorpi monoclonali (Ac mo), i cultivare pe medii semisolide n prezena unui ser de la un pacient cu insuficien medular cantitativ : serurile de la astfel de pacieni sunt bogate n factori de cretere. Linia megakariocitar provine ca i celelalte linii din celulele stem hematopoietice (CSH). Linia ncepe n momentul n care celula hematopoietic pluripotent se transform ntr-o celul capabil s prolifereze i s dea o colonie de megakariocite in vitro progenitorul megacariocitar. Dup un numr de mitoze n compartimentul celulelor progenitoare, celula ajunge ntr-un stadiu de tranziie, n compartimentul celulelor precursoare, n care celulele nu se mai divid, ele suferind doar endomitoze. Compartimentul celulelor progenitoare este heterogen cu o ierarhie precis constituind o linie continu de celule. Dou - trei tipuri de progenitori au fost identificate fie pe baza studiului tipului de colonii obinut in vitro (cu ct mrimea coloniei este mai mare sau cu ct timpul su de apariie n cultur este mai lung, cu att progenitorul din care a provenit colonia este mai primitiv), fie pe baza studiului ploidiei megakariocitelor ce compun o colonie izolat. Progenitorii megakariocitari se mpart schematic n trei tipuri :

BFU-MK (Burst Forming Units - Megakaryocyte) - sunt progenitorii cei mai primitivi. Dau colonii compuse din peste 50 celule organizate n mai multe subcolonii pe modelul coloniilor eritroblastice derivate din BFU-E. Durata de apariie a coloniilor este de 12 zile la oarece i 21 zile la om. Frecvena lor n mduv este foarte slab. Mai recent a fost descris un progenitor denumit HPP (high proliferative potential)-CFU-MK care are

12

proprieti apropiate sau identice cu BFU-MK doar c, colonia rezultat este grupat ntr-o singur grmad. CFU-MK (Colony Forming Units Megacaryocyte) - aceste celule difer de precedentele prin capacitarea proliferativ mai sczut. Ele dezvolt colonii de megakariocite de 3 - 50 celule, n 5 zile la oarece i 12 zile la om. CFU-MK, spre deosebire de BFU-MK, sunt distruse dup un tratament cu ageni ca 5-fluoro-uracil, ceea ce determin ca recuperarea trombocitar post-terapeutic s fie mai lent dect cea eritrocitar. LD-CFU-MK (Low density) - aceste celule au fost identificate la oarece ca un progenitor cu densitate celular sub 1.050 g/l. Ele dau, n 2 3 zile, colonii formate dintr-un numr mic de megakariocite cu ploidie crescut. Aceste celule corespund unui stadiu de difereniere de tranziie n care, progenitorul megakariocitar i comut sistemul de proliferare ctre endomitoze. Odat intrate n compartimentul precursorilor, sau de maturaie, celulele sufer un proces de maturaie att nuclear ct i citoplasmatic. Din acest moment celula nu se mai divide. Nucleul i dubleaz succesiv coninutul n ADN fr a se divide (endomitoz). Astfel celula i crete ploidia de la 2N pn la 64-128N. La om, majoritatea megakariocitelor sunt 16N (50%). Pe msur ce i crete ploidia nucleul rotund devine ancoat apoi polilobulat i i condenseaz cromatina. n paralel are loc o maturare a citoplasmei cu formarea de granule: dense, alfa i lizozomale, apariia unor antigene plachetare, formarea memebranelor de demarcaie ale sistemului de membrane ce comunic cu exteriorul. Ele provin din invaginarea membranei plasmatice. Au rolul de a constitui o rezerv de membrane a megakariocitelor. Astfel, nainte de a elibera trombocitele, megakariocitul se alungete lund forma unei caracatie, alungire ce se face datorit rezervei de membrane i derulrii ei cu ajutorul microtubilor. La intervale regulate apar constricii unde se concentreaz microtubii i microfilamentele care vor rupe citoplasma i vor forma trombocitele. n aceast compartiment megakariocitul trece prin mai multe stadii : Stadiul I (megakarioblast) - prima celul recognoscibil morfologic a seriei. Este o celul blastic cu diametrul de 15-50 microni. Raportul nucleo-citoplasmatic este mare. Nucleul este mare, ovalar sau ancoat (form de rinichi) cu nucleoli evideni (2-6). Citoplasma este bazofil, fr granulaii ; Stadiul II (promegakariocit, megakariocitul bazofil) - este o celul mai mare 20-80 microni cu nucleu polilobat i citoplasma policromatofil, mai abundent i coninnd granulaii azurofile aezate perinuclear. Stadiul III (megakariocitul granular) - celul foarte mare, cu diametrul de 35-160 microni, cu un nucleu neregulat, polilobat compus din cromatin dens, fr nucleoli vizibili. Citoplasma este abundent, albastru deschis cu granulaii azurofile la periferie. Megakariopoieza are loc la nivelul mduvii osoase unde megakariocitele se regsesc preferenial la nivelul subendoteliului sinusoidelor. Fiecare megakariocit d natere la 1.0008.000 de plachete. Se discut tot mai mult rolul plmnului ca situs principal de producere a plachetelor (din megakariocite ce au prsit mduva prin pasaj transendotelial, i au fost captate la acest nivel). n ceea ce privete mecanismul de producere a plachetelor exist 4 teorii : plachetele ar nmuguri la suprafaa megakariocitelor - foarte puin probabil teritoriile plachetare ar fi predeterminate ca mrime i form n interiorul megakariocitelor ; megakariocitele s-ar fragmenta n plmn sub efectul forelor fizice ale curentului sanguin ; teoria cea mai acceptat este aceea potrivit creia megakariocitele ar trimite prelungiri lungi (pseudopode) care se fragmenteaz n plachete. Fragmentarea ar avea loc n circuitul sanghin unde a fost trimis pseudopodul (prin endoteliul vascular).

13

c. Reglarea tombocitopoiezei Reglarea produciei de plachete se realizeaz prin intermediul a trei parametri independeni : numrul de megakariocite (mecanismul de proliferare), volumul mgakariocitelor; talia megakariocitelor care depinde de ploidia lor. Creterea ploidiei rezult prin endomitoz, nsoit de creterea volumului celular i citoplamatic. maturarea citoplasmatic (cu dezvoltarea reelei membranare intracitoplasmatice membrane de demarcaie care vor servi ca membrate citoplasmatice pentru trombocite). Reglarea produciei plachetare (megakariopoieza), conform ipotezi dublei reglri survine la dou niveluri celulare distincte : o prim citokin ( MK-CSF) acioneaz numai asupra etapelor precoce ale diferenierii (celulele progenitoare), i un factor tardiv de difereniere (trombopoietina) ce influeneaz procesul de maturare al megakariocitelor i ploidizarea lor. Cercetrile au artat c IL-3 i GM-CSF joac rolul de MK-CSF fiind capabile s induc formarea de colonii megakariocitare prin aciunea concomitent asupra BFU-MK i CFU-MK. Trombopoietina acioneaz asupra etapelor ulterioare alturi de citokinele din familia IL-6. Pe de alt parte, megakariopoieza este inhibat n mod fiziologic de factori inhibitori eliberai de plachetele activate: TGF-beta, PF4, beta tromboglobulina. Trombopoietina (TPO) este hormonul fiziologic care regleaz producia trombocitar. Studiile au demonstrat faptul c, pe lng aciunea sa preponderant asupra liniei megakariocitare, TPO ar juca un rol principal n etapele precoce ale hematopoiezei. Gena TPO uman este situat pe cromozomul 3, n 3q27-28.. Gena este exprimat n mod esenial, n ficat, rinichi dar i n mduva osoas, de fibroblastele medulare n cultur i de celulele endoteliale din cordonul ombilical. In vitro, TPO este responsabil de : creterea taliei i ploidiei (deobicei peste 64 N) a megakariocitelor (MK) n cultur; inducerea formrii de colonii megacariocitare de talie mic, comportnd 3 - 5 MK pe colonie; inducerea de markeri de difereniere megakariocitar pe celulele CD34+ : glicoproteina GP Ib et glicoproteina GP IIb/IIIa.

14