Les tests dorientation

Lors de la dtermination dune espce bactrienne, certains critres permettent dorienter notre diagnostic de faon prcise, si on suit une mthode : ce sont les tests dorientation. Aprs une courte description de ces tests, les cls dichotomiques de base seront donnes sous forme de tableaux. Pour finir, nous expliquerons la mthode logique pour identifier une souche laide dexemples. I La coloration de Gram Lexplication thorique de cette coloration est donne dans le texte Observations microscopiques . Ce premier caractre permet de dterminer 3 groupes de bactries : les Gram positifs (violet), les Gram ngatifs (rose) et les bactries non colorables par cette mthode.

Causes derreurs : frottis trop pais ou trop chauff, dcoloration lalcool pas ou trop pousse. II La recherche de loxydase Le terme exact est recherche du cytochrome oxydase . Les cytochromes sont des protines qui appartiennent la chane respiratoire, compose dune succession de transporteurs dlectrons, en particulier les cytochromes.. En fait, ce test recherche le cytochrome coxydase. Depuis plusieurs dcennies, et bien avant que ne soit connu dans le dtail le rle des cytochromes, la recherche de loxydase est un des critres le plus discriminatif et le plus employ pour lidentification des bactries, surtout celles des bactries Gram ngatif. Cette recherche consiste mettre en vidence la capacit de la bactrie teste, oxyder la forme rduite incolore de drivs N-mthyl du paraphnylne diamine, en leurs formes oxydes semi-quinoniques rose-violaces. Les techniques possibles utilisent de prfrence le ractif sous forme doxalate plus stable. On utilise pour cela des disques, des btonnets ou des bandelettes pr-imprgns. On utilise parfois des solutions

Une raction positive se traduit par un virage rapide du ractif de lincolore au violet. Sinon il reste incolore. Causes derreurs : ralisation du test partir dun milieu glucidique, un glucide ayant t attaqu : une fermentation peut cacher une respiration, quantit insuffisante de bactries, humidification trop importante du disque entranant llimination du ractif, ractif prim, instrument oxydase+ (certains mtaux) ou portant des traces de colorant violet, lecture trop tardive : au-del de 30-40 secondes, le ractif soxyde spontanment lair III Recherche de la catalase Certaines ractions mtaboliques aboutissent, dans les conditions de larobiose, la production de peroxyde dhydrogne (= eau oxygne ou H2O2 ). Mais ce compos peut tre le produit de la chane respiratoire. Cependant, ce peroxyde dhydrogne doit tre limin. Cest en effet un poison cellulaire . Sa dcomposition dans lorganisme microbien peut tre ralise soit par des peroxydases, soit par la catalase (la peroxydase ayant toutefois une activit plus faible). En absence de systme enzymatique destructeur, la vie en arobie devient gnralement impossible : les micro-organismes sont alors anarobies strictes. La catalase est une enzyme importante. Elle joue un rle majeur dans llimination du peroxyde dhydrogne selon la raction suivante :

2 H2O2 ------ O2 + 2 H2O La plupart des micro-organismes arobies possdent une catalase . Parmi les bactries Gram positives, seule les Streptococcaceae, les Lactobacillus, les Erysipelothrix (et bien sr les Clostridium) sont dpourvues de catalase. A partir dun milieu solide, prlever une quantit suffisante de culture et la mettre en suspension dans une goutte deau oxygne dpose sur une lame .

Une raction positive se traduit par un dgagement gazeux (parfois trs faible) doxygne. Causes derreurs : ralisation du test sans prcaution partir dune glose au sang : le sang possde une activit catalasique, suspension bactrienne insuffisante, eau oxygne prime, souche catalase faible IV Recherche du mtabolisme respiratoire Les bactries chimiotrophes, pour obtenir l'nergie ncessaire leur croissance, peuvent utiliser 2 mtabolismes diffrents pour dgrader le substrat: - Le mtabolisme respiratoire, o les lectrons librs par l'oxydation du substrat, sont pris en charge par une chane transporteuse d'lectrons (libratrice d'nergie) avant d'tre fixs sur un accepteur final minral. Si cet accepteur final est l' oxygne, on parle de respiration arobie (cytochrome) tandis que si il s'agit d'un ion minral ( NO3-, NO2-, SO42-), la respiration est qualifie d'anarobie (quinones).

- Le mtabolisme fermentatif o il n'existe pas de chane de transporteurs et o les lectrons sont directement fixs sur un accepteur final organique.

Accepteur Organique oxyd

Accepteur Organique rduit

Respirations et fermentations ne sont pas contradictoires: une bactrie peut avoir un mtabolisme oxydatif en arobiose et fermentatif en anarobiose. Le test O/F permet de connatre le comportement de la bactrie tudie vis--vis du glucose en prsence ou absence d'oxygne.

Le milieu utilis ne contenant aucun accepteur final minral, on ne teste que la respiration arobie et les fermentations.
Respiration arobie C6H12O6 + 6 O2 -----------> 6 CO2 + 6 H2O 2 C3H3O3 + 6 H+

Fermentation lactique C6H12O6 ------------->

Or le CO2 et le pyruvate sont des acides. On peut donc les mettre en vidence par le virage d'un indicateur de pH (ici le Bleu de bromothymol ou BBT). Lecture et interprtation

Cas A : Acidification dans les deux tubes. Resp. ou Ferm. en arobiose et Ferm. en anarobiose Par convention on note test o/f = F (germe gnralement aro-anarobie). Cas B : Acidification en arobiose seulement. La bactrie ne peut que respirer test o/f = O (germe arobie strict). Cas C: Aucune acidification. La souche ne sait pas utiliser le glucose test o/f = Ngatif (type respiratoire impossible dterminer par cette mthode). Il existe parfois un 4me cas qui correspond aux anarobies strict aerotolerant (certains Clostridium par exemple) Seul le tube avec bouchon de paraffine vire au jaune. Cependant, le bouchon de paraffine ne permettant pas une anaerobiose complte, le test nest pas valide pour tout les anaerobie. Par convention on decide que ce test est dit Non applicable. V Recherche de la mobilit Voir le texte sur les observations microscopiques. Ce test permet de dterminer si une bactrie est mobile ou non et, ventuellement si elle est mobile, de dterminer le type de ciliature (pritriche, lophotriche, monotriche). Causes derreurs : anse trop chaude, mlange trop brutal, culture ge

VI Autres caractres utiles. Dautres caractres dterminables facilement (par simple lecture) sont parfois utiles. a. lhmolyse

Lhmolyse, ou lyse des hmaties, est due la rupture de leur membrane plasmique, souvent sous laction de phosphatidyl-choline estrase des bactries et sous laction de molcules provoquant la formation de pores membranaires (hmolysine). Ce phnomne libre de lhmoglobine qui est ensuite plus ou moins digre. Si la digestion est totale, la couleur rouge disparat et on observe une zone claircie (hmolyse partielle), voir incolore (hmolyse complte) autour de la colonie. On parle alors dhmolyse . La digestion peut tre incomplte et il se forme des produits verdtres ou marrons (dont la methmoglobine) et on parle dhmolyse . On distingue donc : Les germes hmolyse complte et hmolyse partielle. Les germes hmolyse Les germes non hmolytiques (parfois improprement appele hmolyse gamma)

colonies hmolytiques

colonies hmolytiques

Il arrive quune mme colonie soit entoure de deux zones dhmolyse succesives ( totale puis partielle), on parle alors de souche double-hmo ou hmolyse

Causes derreurs : recouvrement dune petite colonie par une plus grosse, glose prime (auto-hmolyse), glose incube en anarobiose (lhmoglobine rduite prend une couleur marron pouvant tre confondue avec une hmolyse ) b. lexigence de la bactrie

Il peut tre intressant de noter les besoins dune souche bactrienne. Notamment sil sagit dun germe non exigeant cest--dire pouvant pousser sur des milieux non enrichis slectifs ou non (Glose lactose au BCP, Gassner) ou exigeant cest--dire poussant uniquement sur des milieux enrichis (Glose au sang, chocolat) c. lutilisation dun sucre

De nombreux milieux disolement permettent la lecture de certains caractres biochimiques, gnralement un sucre (le lactose le plus souvent). Il est parfois utile de les noter ce qui permet dliminer certains genres bactriens VII Les tableaux dichotomiques Les illustrations sont donnes titre indicatif. En effet, une mme souche bactrienne peut prsenter une morphologie diffrente suivant les milieux, les conditions dincubations, etc VII Raisonnement diagnostique Lidentification bactrienne suit un cheminement logique qui permet, au fur et mesure dliminer certaines familles, puis certains genres et enfin certaines espces pour ne laisser que lespce la plus probable la fin.

Voyons ce cheminement avec 3 exemples : Exemple n1 A la suite de lisolement bactrien, nous obtenons des grosses colonies bleues muqueuses sur milieu de Gassner. Les tests dorientation donnent les rsultats suivant : cocobacille Gram ngatif, mobile, Cat + , Oxy -, test OF= F Le cheminement logique que lont doit avoir est le suivant : - cocobacille Gram ngatif, peu exigeant (pousse sur Gassner), mobile : on souponne les familles suivantes : Enterobacteriaceae, Pseudomonaceae, Alcaligenaceae et Vibrionaceae. - le test OF= F limine les familles des Pseudomonaceae et des Alcaligenaceae. On ne souponne plus alors que les Enterobacteriaceae et Vibrionaceae. - le test Oxydase ngatif limine les Vibrionaceae : le germe appartient a la famille des Entrobacteries. - le caractre Lactose positif limine les genres Salmonella, Shigella, Proteus, Yersinia. Le germe appartient au groupe des coliformes (Genres Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Citrobacter). - le caractre muqueux des colonies nous oriente plutt vers les genres Klebsiella ou Enterobacter. Une galerie biochimique confirmera lun de ces genres et donnera une espce Exemple n 2 Afin dillustrer que lanamnse est trs importante en bactriologie, prenons lexemple suivant : Aprs ensemencement de matires fcales diarrhiques dun jeune veau sur Milieu de Gassner et au sang, on obtient les colonies suivantes : Grosses colonies hmolytiques sur glose au sang correspondant de grosses colonies bleues sur Gassner. Le mme raisonnement que pour lexemple n1 nous amne souponner les genres Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Serratia et Citrobacter. Le fait que les colonies soient hmolytiques et isoles dune diarrhe de veau permet de conclure directement lespce : Escherichia coli. Une galerie biochimique est inutile, mais elle pourrait confirmer cette identification Exemple n3 Lensemencement dun couvillon provenant dune otite de cocker donne des colonies moyennes, blanchtres, prsentant une double hmolyse. Les tests dorientation donnent les rsultats suivants : Coque Gram positif, immobile, Cat +, Oxy -, OF= F Les caractres coque Gram positif, immobile, aro-anarobie nous fait souponner les familles de Micrococcaceae et des Streptococcaceae Le caractre catalase positif limine la famille des Streptococcaceae. Le germe appartient donc la famille des Micrococcacaea (Staphylococcus et Micrococcus) Le caractre oxydase ngatif nous oriente vers le genre Staphyloccocus Le fait que les colonies soient hmolytiques nous fait souponner fortement les espces Staphylococcus aureus et Staphylococcus intermedius Le prlvement venant dune otite de chien, il est plus que probable quil sagisse de Staphylococcus intermedius (cest en effet le germe prdominant dans les otites canines). Un diagnostic par recherche dantignes de surface (type Staphaurex Biorad , voir Srogroupage) permettra de trancher.

GRAM GASSNER + LACTOSE + LACTOSE GASSNER -

OXY CAT+

OXYCAT+

OXY+ CAT+

OXY + CAT+

O/F= F

O/F=F

O/F=F

O/F=O

O/F=Neg

O/F=NA

O/F=F

O/F=Neg

O/F=O

Coccobacille

Bacille

Bacille
incurv

Bacille

Coccobacille

Bacille
incurv

Coccobacille

Coque

Coccobacille

Coque

ure+
Escherichia(Ind+) Proteus Klebsiella (Ind-) Yersinia Citrobacter Serratia Enterobacter

ure Salmonella Shigella Vibrio Aeromonas Pseudomonas Xanthomonas Bordetella Alcaligenes Campylobacter Pasteurella Haemophilus Mannheimia Actinobacillus Taylorella Branhamella Moraxella Brucella Neisseria Francisella

(Anaerobie pref.)

GRAM + COQUES
CAT + en amas O/F=F
En gnral

BACILLE
REGULIER fin pais IRREGULIER OXY-

CAT chanette

O/F=F

O/F=F Arobie CAT+ OXYanarobie CATOXYCAT+ CAT-

OXY+

OXY-

OXY-

OXY -

En gnral

En gnral

CAT +

CAT-

O/F=O

O/F=NA

O/F=F

O/F=O

O/F=F

Micrococcus

Staphylococcus

Streptococcus

Listeria

Erysipelothrix

Bacillus

Clostridium

Corynebacterium

Rhodococcus Arcanobacterium