1 Introduo A obteno de substncias de aplicao imediata em produtos como perfumes, corantes, pesticidas, medicamentos, etc.

, tem sido o objetivo primordial das pesquisas em produtos naturais. Nos ltimos anos, essa pesquisa tem alcanado uma larga amplitude e diversificao fazendo com que este ramo da qumica orgnica seja reconhecido por abranger desde a busca dos princpios ativos bioproduzidos pelas plantas at as questes relacionadas com a biodiversidade, na tentativa de compreender a evoluo da vida na terra (SANTOS, 1999). De fato, v-se claramente que a pesquisa dos produtos naturais tem adquirido novos horizontes; no somente se dedica procura de substncias que sejam biologicamente ativas como a tambm a descoberta de novas substncias e aplic-las em outras reas de conhecimento como a ecologia qumica, taxonomia, agricultura, etc. (SILVA, 2006). Outros pontos relevantes na rea de produtos naturais a descoberta de molculas ativas que podem servir de modelo para snteses, assim podendo ser aplicadas a medicamentos sem a necessidade de explorar a biodiversidade. Nos casos de espcies de fcil cultivo, que tenham constituintes qumicos abundantes, pode-se utilizar o produto natural. Com a notvel busca pela longevidade e melhoria da vida humana, a procura por substncias naturais de importncia teraputica tem sido cada vez mais marcante. Dados confirmam que cerca de 25% das prescries dispensadas nos pases desenvolvidos durante os ltimos 25 anos estavam relacionadas a medicamentos que continham princpios ativos de origem natural ou semi sinttica, normalmente oriundos de plantas superiores (NEWMAN et al., 2003). Em relao ao mercado mundial, cerca de 80% das pessoas utilizam plantas como fonte primria de agentes medicinais (PHILLIPSON, 1995). Nessa busca incessante por substncias naturais, merecem destaque as tcnicas cromatogrficas modernas que aliadas aos mtodos fsicos atualmente disponveis, tm contribudo muito nos trabalhos do qumico de produtos naturais, que tem conseguido elucidar, com maior rapidez e preciso, as estruturas das substncias isoladas (SILVA, 2006).

1.1 Tcnicas Cromatogrficas Introduzida pelo pesquisador russo Mikahail Tswett em 1906, quando separou clorofila de uma mistura de pigmentos de plantas, atravs de uma coluna cheia de carbonato de clcio em p, fazendo a lavagem com ter de petrleo. Conforme a amostra descia pela coluna, apareciam bandas separadas e cores distintas. Palavra de origem grega, onde cromo significa cor e grafia significa escrita, ou seja, escrita em cores. Mas a cromatografia pode separar os componentes sem nenhum aparecimento de cor. A cromatografia preliminarmente uma ferramenta analtica mais usada na separao de substncias em diferentes reas da qumica. Alm de ser usada nos procedimentos de separao na qumica orgnica e, principalmente, na qumica de produtos naturais, tem sido aperfeioada para, inclusive, ser aplicada em tcnicas hifenadas, que consiste na associao da cromatografia aos mtodos fsicos de anlise orgnica (COLINS, 1998). As tcnicas cromatogrficas podem ser classificadas como de adsoro e partio e a separao se d devido migrao diferencial dos componentes de mistura em duas fases diferentes e imiscveis, uma estacionria e outra mvel. Na adsoro, a fase estacionria um slido e a fase mvel um lquido ou um gs e na partio, ambas as fases so lquidas, podendo ser citada como exemplo a cromatografia contra corrente (CCC). Em relao forma fsica do sistema, a cromatografia pode ser subdividida em cromatografia em coluna e cromatografia planar. O fluxograma 1 mostra os diferentes tipos de cromatografia empregados em anlises.

Fluxograma 1: diferentes tipos de cromatografia usados.

1.1.1 Cromatografia Planar A cromatografia em camada em camada delgada (CCD) consiste na separao dos componentes de uma mistura atravs da migrao diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente retido (fase estacionria) sobre uma superfcie plana. Como fase mvel, usase um lquido que geralmente uma mistura de solventes. A figura 1 mostra um exemplo de eluio em CCD. A cromatografia planar pode ser classificada como cromatografia em camada delgada analtica (CCDA) e preparativa (CCDP). A CCDA uma tcnica simples, barata e muito importante para a separao rpida e anlise quantitativa de pequenas quantidades de material. Ela usada para determinar a pureza do composto, identificar componentes em uma mistura comparando-os com padres; acompanhar o curso de uma reao pelo aparecimento dos produtos e desaparecimento dos reagentes e ainda para isolar componentes puros de uma mistura. Na cromatografia de camada delgada a fase lquida ascende por uma camada fina do adsorvente estendida sobre um suporte. O suporte mais tpico uma placa de vidro ou alumnio entre outros. Sobre a placa espalha-se uma camada fina de adsorvente suspenso em gua (ou outro solvente) e deixa-se secar. A placa coberta e seca chama-se "placa de camada fina". A placa de camada fina colocada verticalmente em um recipiente fechado (cuba cromatogrfica) que contm uma pequena quantidade de solvente e um papel embebido com este eluente, para manter a atmosfera do mesmo no interior da cuba. Este eluir pela camada do adsorvente por ao capilar e os efeitos da interao dos componentes entre as fases faz a separao dos mesmos, no caso de anlise de mistura. A aplicao do material deve ser feito com cuidado. O spot no pode ser muito concentrado e nem muito diludo. No primeiro caso pode saturar o ponto de aplicao no havendo a adsoro do material pela fase estacionria neste ponto e na eluio formar-se-o rastros em vez da eluio esperada. No caso da amostra estar muito diluda pode espalhar muito o material no ponto de aplicao e formar um anel do material aplicado.

Figura 1: cromatografia em camada delgada (DEGANI et al.; 1998).

Depois que o solvente ascendeu pela placa, esta retirada da cuba e seca at que esteja livre do solvente. Cada mancha corresponde a um componente separado na mistura original. Se os componentes so substncias coloridas, as diversas manchas sero claramente visveis. Contudo, bastante comum que as manchas sejam invisveis porque correspondem a compostos incolores. Um parmetro freqentemente usado em cromatografia o "ndice de reteno" de um composto (Rf, figura 2). Na cromatografia de camada fina, o Rf funo do tipo de suporte (fase fixa) empregado e do eluente. Ele definido como a razo entre a distncia percorrida pela mancha do componente e a distncia percorrida pelo eluente. Portanto: Rf = dc / ds Onde: dc = distncia percorrida pelo componentes da mistura. ds = distncia percorrida pelo eluente.

ds ds

Figura 2: clculo do fator de reteno. Na CCDP, uma fina camada de adsorvente espalhada sobre uma placa ( em geral vidro). As placas de vidro, geralmente 20x20 cm so colocadas em superfcies plana, limpas com acetona ou fexano embebido em algodo. Pesa-se 25, 0 g de gel de slica com gesso (G) com granulao adequada e indicador fluorescente (PF254), em um frasco com tampa e acrescenta-se cerca de 50 ml de gua destilada. Agita-se bem at que a mistura fique homognea e conscistencia adequada para espalhar na placa de vidro. Deixa-se secar, depois ativado a 100 oC. Uma soluo concentrada do material em solvente voltil aplicada normalmente com capilar formando uma linha contnua e homognea. Aps a aplicao da amostra a placa transferida para uma cuba cromatografica, geralmente revestida com papel filtro onde ocorre uma eluio onde seus parametros tcnicos de separao obedecem as mesmas leis da cromatografia em camada delgada analtica. Porm sua revelao deve ser feita apenas em luz UV detectando-se as diferenas nas coloraes das manchas, pois com o uso dos reagentes cromgenos h perda de material. A figura 3 ilustra uma separao feita, utilizando-se a CCDP.

Figura 3: cromatografia em camada delgada preparativa. Aps eluio, as manchas so raspadas da placa e as substncias separadas da slica atravs de filtrao em funil de de placa porosa com vcuo e lavagem com solvente. A soluo concentrada em evaporador rotatrio (Figura 4), colocada em frasco previamente pesado e com o uso de vcuo e ar quente retira-se o resdou do solvente, o material seco em dessecador ou pistola Abderhalden para anlise. Vcuo

Figura 4: evaporador rotatrio.

Com

relao

a em

aplicaes, laboratrios

CCD de

tem

demonstrado orgnicas

ser e

de

valor

extraordinariamente

substncias

inorgnicas,

acompanhamento de reaes em snteses e em processos de purificaes (COLINS, 1998). 1.1.2 Cromatografia em Coluna No caso de cromatografia em coluna tem-se: a cromatografia em coluna aberta, figura 5, na qual a fase mvel arrastada atravs da coluna apenas pela fora da gravidade; coluna de excluso; cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE), na qual se utilizam fases estacionrias de partculas menores, sendo necessrio o uso de uma bomba de alta presso para a eluio da fase mvel; cromatografia gasosa (CG) e cromatografia gasosa de alta resoluo (CGAR). A diferena entre os dois tipos est na coluna, enquanto na CGAR so utilizadas colunas capilares, nas quais a fase estacionria um filme depositado na mesma, a CG utiliza colunas de maior dimetro empacotadas com a fase estacionria em ambas usam-se como fase mvel um gs (COLINS, 1998). 1.1.2.1 Cromatografia em Coluna Aberta Esta tcnica muito utilizada muito utilizada para isolamento de produtos naturais e purificao de produtos de reaes qumicas. As fases estacionrias mais utilizadas so slica e alumina (DEGANI et al.; 1998).

Pastilha do material a ser cromatografado.

Figura 5: cromatografia em coluna aberta (DEGANI et al.; 998).

De uma maneira geral, a coluna cromatogrfica constituda por um tubo de vidro, em posio vertical: extremidade superior aberta e a inferior afilada terminando numa torneira, que permitir o controle de vazo da fase mvel, que lquida. A fase que fica no interior da coluna (adsorvente) suportada, na parte inferior, por um chumao de algodo (COLINS, 1998). Para que a amostra seja cromatografada em coluna aberta, necessrio que se faa uma pastilha, constituda de a mostra e slica gel. A pastilha feita da seguinte maneira: a amostra colocada em um gral, juntamente com um solvente, de preferncia voltil, e adciona-se slica gel, esta mistura triturada, utilizando-se um pistilo, at formar um p, de colorao homognea. Para se escolher o eluente ideal para comear a eluio, necessrio se fazer uma anlise em CCDA. O eluente adequado aquele, que promove uma separao em CCDA, na qual os Rfs das substncias presentes seja menor que 0,5. 1.1.2.2 Cromatografia em Coluna de Excluso Neste caso, (figura 6) usa-se uma fase estacionria que capaz de reter partculas menores e permite que sejam eludas as maiores. Um exemplo muito usado em separao de metabolitos secundrios de plantas o sephadex, que pode ser usado com solventes orgnicos.

Figura 6: separao por excluso (Sephadex LH-20).

1.1.2.3 Cromatografia Lquida de Ala Eficincia (CLAE) A CLAE utiliza instrumentos muito sofisticados que podem ser totalmente automatizados. um tipo de cromatografia lquida que emprega pequenas colunas, recheadas de materiais especialmente preparados e uma fase mvel que eluda sob altas presses. Ela tem a capacidade de realizar separaes e anlises qualitativas e quantitativas de amostras contendo misturas de muitos constituintes. Atualmente, uma das tcnicas analticas mais usadas. frequentemente empregada para obter perfis cromatogrficos de misturas, fornecendo informaes do nmero de componentes da amostra e, inclusive, de acordo com o fator de reteno, aliado aplicao de padres, pode-se obter informao a respeito das classes dos metablitos presentes no material. A CLAE tem sido muito usada acoplada a tcnicas de anlise estrutural como ultravioleta, espectrmetro de massas e ressonncia magntica nuclear. A figura 7 mostra um esquema dessa aplicao e a figura 8 CLAE como tcnica hifenada.

Figura 7: CLAE acoplada a outras tcnicas (HOSTETTMANN K et al.; 2003).

OH HO O HO OH O OH O O OH

Figura 8: exemplo de aplicao de tcnica hifenada, HPLC-UV na identificao de um flavonide. De uma forma simplificada, a figura 9 mostra os equipamentos bsicos de CLAE. Um exemplo prtico de sua aplicao abordado no item 4 (Resultados e Discusso).

Figura 9: equipamentos bsicos de CLAE. a) reservatrio de fase mvel; b) bomba de alta presso; c) vlvula de injeo; d) coluna; e) detector e f) registrador (DEGANI et al.; 1998). 1.1.2.4 Cromatografia a Gs

10

Nesta tcnica, a separao baseia-se na diferente distribuio das substncias entre a fase estacionria slida e uma fase mvel gasosa. A amostra, atravs de um sistema de injeo, introduzida em uma coluna, que pode ser capilar ou empacotada, contendo a fase estacionria. O uso de temperaturas convenientes no local de injeo da amostra e na coluna possibilita a vaporizao destas substncias que, de acordo com suas propriedades e as da fase estacionria, so retidos por tempos determinados e chegam a sada da coluna em tempos diferentes. O uso de um detector adequado na sada da coluna torna possvel a deteco e quantificao destas substncias. A cromatografia gasosa uma tcnica de poder de resoluo excelente, tornando possvel, muitas vezes, a anlise de dezenas de substncias de uma amostra. Um dos principais motivos que tornam a CG de uso bastante acentuado a sua sensibilidade. Dependendo do tipo de substncia analisada e do detector empregado, consegue-se detectar cerca de 10-12g. Essa sensibilidade faz com que haja necessidade de apenas pequenas quantidades de amostra, que em certos casos, um fator crtico que limita a utilizao de outras tcnicas. A figura 10 mostra um esquema simplificado de um cromatgrafo a gs.

Figura 10: equipamentos utilizados na CG (DEGANI et al.; 1998). Como exemplo de aplicao de cromatografia a gs, podemos citar o caso da separao dos componentes da msitura de esterides, estigmasterol, sitosterol e

11

campesterol (Figura 11). A identificao dos compontes foi possvel com a tcnica hifenada (CG-EM), atravs da obteno dos espectros de massas e comparao com a biblioteca do sistema.

m/z 400

m/z 412

m/z 414

Figura 11: exemplo de utilizao de CG. 1.1.3 Cromatografia Contra Corrente A cromatografia contracorrente (CCC) uma forma de cromatografia de partio lquido-lquido sem uso de adsorvente. Esta tcnica consiste na utilizao de duas fases lquidas imiscveis, onde uma a fase mvel e a outra a fase estacionria. A distribuio do soluto em cada uma das fases determinada atravs de seus respectivos coeficientes de partio (MASTON & HOSTETTMANN , 1994). Esta tcnica amplamente utilizada na separao de produtos naturais, pois, devido ausncia de suporte slido, evita problemas

12

como a adsoro irreversvel das amostras e a degradao de seus constituintes (MASTON & HOSTETTMANN , 1994 e OKA et all.; 1998), assim como permite a injeo de grande quantidade de amostra sem necessidade de pr-purificaes, a recuperao total da mesma e, tambm, um baixo consumo de solventes. O sucesso da CCC depende da escolha correta do sistema de solvente, que pode ser realizada atravs de cromatografia em camada delgada analtica (CCDA), partio lquido-lquido ou consulta de listas de solventes otimizados para classes especficas de produtos naturais (MASTON & HOSTETTMANN , 1994, HOSTETTMANN et all.; 1986 e MANDAVA & ITO, 1988). 1.2 Mtodos Fsicos de Anlise A utilizao de mtodos fsicos na determinao estrutural de grande importncia para o qumico de produtos naturais. a partir da decodificao de sinais emitidos em espectros de diversas tcnicas, tais como espectroscopia na regio do IV, de RMN de 13C, RMN de1H, espectroscopia de massas (EM), etc. que os profissionais da qumica orgnica conseguem a elucidao das estruturas das substncias sintetizadas ou isoladas. Para o qumico de produtos naturais, alm do conhecimento destas tcnicas, necessrio conhecimentos de biossntese de metablitos especiais e os conhecimentos profundos de qumica orgnica, tais como reaes (rearranjos, mecanismos, estereoqumica, etc.), dando a este profissional uma diversidade de conhecimento. Pode-se acrescentar neste comentrio as exigncias do meio cientfico e social, cobrando deste profissional, conhecimentos de farmacognosia, ecologia, entre outras cincias correlatas. 1.2.1 Espectroscopia no IV A espectroscopia de IV baseia-se na propriedade vibratria inerente aos tomos de uma molcula. Cada grupo funcional responde de forma diferente a radiao, o que proporciona diferentes bandas de absoro no espectro IV. Por isso, os espectros de IV fornecem informaes sobre a estrutura dos grupos funcionais presentes nas molculas, bem como sobre a natureza de suas ligaes qumicas e suas reatividades (STEVENSON, 1994; JONHSTON & AOCHI, 1996). Como exemplos desta tcnica, podem ser destacadas as Figuras 18 e 22.

13

1.2.2 Espectroscopia de RMN de 1H e13C A espectrometria de ressonncia magntica nuclear (RMN) basicamente uma outra forma de espectrometria de absoro, semelhante a espectrometria no infravermelho ou ultravioleta. Sob condies apropriadas, uma amostra pode absorver radiao eletromagntica na regio de radiofreqncia em uma freqncia governada pelas caractersticas da amostra. A absoro funo de determinados ncleos da molcula. Um registro grfico das freqncias dos picos de absoro contra suas intensidades constitui-se um espectro de RMN. Pode-se, atravs dessa tcnica, detectar grupos funcionais, montar esqueletos estruturais e, inclusive incorporar informaes de estereoqumica (SILVERSTEIN et al.; 2000). O qumico orgnico usa anlise de vrios ncleos principalmente prton (1H) e carbono-13 (13C) e, s vezes, de nitrognio-15 (15N). Tem sido a tcnica mais informativa no que se refere a elucidao estrutural. Isto se deve principalmente devido ao avano da tecnologia nesta rea criando equipamentos de alta resoluo e permitindo a aplicao de tcnicas especiais importantes na elucidao de estruturas de novos compostos e inclusive na correo de estruturas registradas na literatura. Alguns exemplos desta tcnica so abordados no item 4 (Resultados e Discusso). 1.2.3 Espectrometria de Massas A espectrometria de massas (EM) vem sendo amplamente utilizada na soluo de problemas analticos e estruturais de compostos orgnicos. uma tcnica que pode fornecer informaes valiosas sobre compostos desconhecidos, seja em relao composio elementar, ao peso molecular ou s massas de seus fragmentos. Alm disso, a EM tornou-se um instrumento analtico de fundamental importncia na deteco, elucidao estrutural e quantificao de compostos orgnicos presentes em misturas complexas, mesmo a nvel traos. Na EM os compostos presentes em uma determinada amostra so ionizados para fornecer ons caractersticos das molculas e de seus fragmentos, como produtos. A informao analtica resulta na medio da massa e abundncia desse on (MCLAFFERTY, 1963 e SCHLUNEGGER, 1980). A principal caracterstica do espectro de massas revelar a relao massa/carga do on molecular para que seja possvel se determinar a frmula molecular em questo.

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Atualmente, com o avano de tcnicas de separao e fragmentao tem permitido acoplar a sistemas cromatogrficos tornando-a extremamente til em anlise de produtos naturais em diferentes reas de aplicao. Os fragmentos mostrados nele tambm nos do noo de algumas caractersticas funcionas das substncias em questo. Exemplo figura 11. 1.2.4 Espectroscopia no UV-Vis A absoro molecular na regio do ultravioleta e do visvel depende da estrutura eletrnica da molcula. A absoro de energia quantizada e conduz passagem dos eltrons de orbitais do estado fundamental para orbitais de maior energia em um estado excitado. Para muitas das estruturas eletrnicas esta absoro ocorre em ma poro pouco acessvel do ultravioleta. Na prtica, a espectroscopia no ultravioleta limitada, na maior parte aos sistemas conjugados. Exemplo, Figura 8. A absorvncia (A) ou densidade pitica da amostra dada pela equao conhecida como a lei de Beer-Lambert.

A= bc
Onde o coeficiente de extino molar da amostra para a radiao de comprimento de onda , b o caminho ptico e c a concentrao do cromforo na amostra. Essencialmente, essa expresso mostra que a medida da absorvncia da amostra proporcional a trs quantidades: que uma caracterstica intrnseca s propriedades Eletrnicas de cada cromforo em cada comprimento de onda e aos parmetros experimentais extrnsecos, a concentrao do cromforo e o caminho ptico percorrido pela luz da amostra. A espectroscopia de absoro no UV-Vis tem ampla aplicao em laboratrios de anlises e pesquisas fsicas, qumicas, bioqumicas, farmacolgicas, etc. Inmeras vantagens contribuem para sua popularidade: a principal o fato de ser uma tcnica espectroscpica quantitativa. Aliado a isso a tcnica tem baixo custo operacional, de fcil utilizao e produz resultados de interpretao geralmente bastante simples (GALO & COLOMB, 2009). 1.3 Contribuio no Estudo Fitoqumico de Talinum triangulare (Jacq.) Willd. Na participao do projeto Estudo Fitoqumico de T. triangulare utilizaram-se tcnicas cromatogrficas para isolamento e purificao dos metablitos especiais desta

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planta. Considerando os objetivos deste relatrio, fiz a descrio da parte experimenal relacionada aos mtodos cromatogrficos usados no isolamento e nos mtodos fsicos de anlise orgnica, empregados na identificao das substncias.

2 Objetivos a) Aprender as tcnicas de isolamento e purificao de metablitos especiais de plantas; b) Aprender a utilizar as tcnicas cromatogrficas e os mtodos fsicos de anlise, com o intuito de suar esses conhecimentos para elucidar as estruturas das substncias isoladas.

3 Parte Experimental 3.1 Equipamentos e Reagentes Os espectros obtidos na regio de infravermelho (IV) foram registrados em espectrofotmetro Perkin-Elmer 1600/1605 FT-IR, em pastilhas de KBr. Os espectros 1D e 2D de Ressonncia Magntica Nuclear de 1H e 13C foram obtidos em espectrmetro Bruker [400 MHz (1H) e 100 MHz (13C)] da UFRRJ. Como padro interno para referncia de deslocamento qumico dever ser usado tetrametilsilano. Os deslocamentos qumicos () foram obtidos em partes por milho (ppm) e as constantes de acoplamento (J) em Hertz (Hz). Os cromatogramas e os espectros de massas de baixa resoluo foram registrados em cromatgrafo com fase gasosa, HP-5880 acoplado a espectrmetro de massas computadorizado HP-5897A de analisador de ons quadrupolo e ionizao por impacto de eltrons, 70 eV, CG/EM Varian Saturn 2000 da UFRRJ. Foi utilizado gel de slica 230 - 400 e 70 - 230 mesh (marca Vetec), como fase estacionria, para a cromatografia em coluna. A cromatografia CCDA foi feita em cromatoplacas de gel de slica 60 PF256 sobre alumnio das marcas Merck e Sorbent. As substncias detectadas atravs de irradiao ultravioleta em 254 ou 365 nm e ou vapores de iodo. A CCDP foi realizada em placas de gel de slica 60 PF 256 das marcas Merck e Vetec sobre suporte de vidro e reveladas com irradiao ultravioleta em 254 ou 365 nm quando necessrio.

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O extrato e a frao hexnica das folhas de T. triangulare foram analisados por CLAE em cromatgrafo modular Waters com detetor PDA UV/Vis. de 300 a 600 nm e coluna C30 YMC Carotenoids. As amostra utilizadas foram solubilizadas em um gradiente metanol e ter metil-terc-butlico (80:20) com fluxo de 0,8 mL/min e os padres utilizados foram: e - Caroteno, violaxantina, lutena, zeaxantina, zeinoxantina, -criptoxantina e licopeno. 3.2 Material Vegetal Usado no Estudo Fitoqumico: O material vegetal para estudo da espcie T. triangulare foi coletado em Seropdica-RJ, identificado pelo Professor Msc. Pedro Germano Filho (Instituto de Biologia, Departamento de Botnica UFRRJ) com auxlio da aluna Ivolanda Magali Rodrigues da Silva (graduanda em Cincias Agrcolas UFRRJ). Uma exsicata desta espcie (SBR 26906) est depositada no Herbrio RBR, IB-UFRRJ. 3.3 Preparao dos Extratos das Folhas, Caule e Raiz de T. triangulare O material vegetal foi coletado nos meses de janeiro e fevereiro de 2008, sendo separados a folha, o caule e a raiz para secagem em estufa a 40C, aps secos foram triturados em liquidificador caseiro. Os extratos foram obtidos por macerao, esquema 1, a frio tendo como solvente extrator hexano (H), diclorometano (D), clorofrmio (C), acetato de etila (A), metanol (M) e metanol:gua (8:2). Todas as solues extrativas foram concentradas em rotavapor (Figura 4) sob uma presso reduzida fornecendo os seus respectivos extratos que receberam os seguintes cdigos: TTFH, TTFD, TTFC, TTFA, TTFM. Os cdigos atribudos consistem em: TTF, que T. triangulare folha + a letra correspondente ao slvente usado na extrao. As quantidades esto relacionadas na tabela Tabela 3.

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Esquema 1: processo de macerao de preparao de extrato. Tabela 3: quantidades dos extratos obtidos das Flolhas de T. triangulare. Extrato Quantidade (g) TTFH TTFD TTFC TTFA TTMF 45,5 36,4 5,0 1,0 291,0

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3.4 Isolamento e Purificao dos Constituintes Qumicos das Folhas de T. triangulare 3.4.1 Estudo Qumico do Extrato Hexnico das Folhas de T. triangulare 3.4.1.1 Processo de Saponificao do Extrato Hexnico das Folhas de T. triangulare O processo de saponificao foi baseado no mtodo RODRIGUEZ-AWAYA com objetivo de promover a retirada de clorofila e outros interferentes, no qual foram pesados 5 g do extrato hexnico seco da folha de T. triangulare e logo aps foram adicionados 90 mL de ter de petrleo e 10 mL de uma soluo 40% de KOH em metanol, a temperatura ambiente. A soluo ficou em repouso durante 24 h na ausncia total de luz (INBARAJ et al., 2008). 3.4.1.2 Processo de Extrao de Carotenides do Extrato Hexnico das Folhas de T. triangulare Aps a saponificao a soluo foi transferida para um funil de partio, na qual foram adicionados 100 mL de gua. A soluo de T. triangulare formou trs fases: 1- fase aquosa (verde), 2- fase com emulso (amarela clara), 3- fase etrea (amarela). A fase 1 foi descartada. As fases 2 e 3 foram adicionados NaCl, para diminuir a emulso, sendo a fase etrea extrada com ter de petrleo at a diminuio da colorao amarela. O rendimento obtido no processo de saponificao foi de 60%. 3.4.1.3 Anlises Espectofotomtrica no Ultravioleta do Extrato e Frao Hexnica das Folhas de T. triangulare Foram preparadas solues padro do extrato e frao de Talinum triangulare,onde pesou-se 10 mg das amostras em 10 mL de hexano, que posteriormente foi submetida a anlise no UV-Vis. (Shimadzu), fazendo-se uma varredura com de 400 nm a 500 nm no intuito de detectar a presena de carotenides. 3.4.1.4 Anlises Atravs de CLAE do Extrato e Frao Hexnica das Folhas de T. triangulare A anlise cromatogrfica foi feita com o extrato e a frao hexnica de T.triangulare, utilizando Cromatgrafo Lquido com forno para colunas e detector de rede de fotodiodos UV/Vis de 300 a 600 nm, e Coluna Cromatogrfica de fase reversa de modelo C30 YCM Carotenoid S-3 de 4,6 x 250 mm PN CT99S032546WT. Os padres

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utilizados foram: e - Caroteno, violaxantina, lutena, zeaxantina, zeinoxantina, criptoxantina e licopeno. As amostras foram solubilizadas em um gradiente de metanol e ter metil-tercbutlico (80:20), e posteriormente foram injetadas em volume de 25 L em tempo corrido de 28 minutos a um fluxo de 0,8 mL/min. 3.5 Estudo Qumico do Extrato Metanlicos das Folhas de T. triangulare (TTMF). O extrato metanlico das folhas de T. triangulare apresentou aspecto pastoso. O mesmo foi fraciona do por cromatografia em coluna, fornecendo 56 fraes. Em algumas fraes, houve a formao de slidos, os quais foram purificados. Os mesmo apresentamse listados abaixo, na tabela 3. Aps separaos dos slidos das respectivas guas mes, estas foram analisadas por CCDA e as fraes TTMF 8 a 13 (TTMF 8-13) foram reunidas por apresentarem o mesmo perfil cromatogrfico, assim como as fraes TTMF 40 a 50 (TTMF 40-50). Aps esta etapa, a frao TTMF (8-13) foi submetida a cromatografia em camada delgada preparativa, resultando em 6 fraes, TTMF (8-13) de A a F. A fraes TTMF (813) de B a E foram submetidas a anlises espectroscpicas e o resultado est sendo aguardado. A frao TTMF (40-50) foi submetida a cromatografia em coluna e a mesma ainda est em processamento. Abaixo, encontra-se um fluxograma simplificado do estudo do extrato metanlico. Tabela 4: slidos obtidos com suas massas e pontos de fuso Slido TTMF (S) 1 TTMF (S) 3 TTMF (S) 5 TTMF (S) 36 TTMF (S) 37 Massa (mg) 8 3 5 13 20 Ponto de fuso Fundiram na pistola de secagem Fundiram na pistola de secagem Fundiram na pistola de secagem 270C 273C

20

TTMF (S) 39 TTMF (S) 40 TTMF (S) 41

31 157 50

238C Ponto de fuso acima de 300C Ponto de fuso acima de 300C

Fluxograma 2: esquema do estudo do extrato metanlico de T. triangulare.

4. Resultados e Discusso

21

4.1 Substncias Identificadas e Isoladas das Folhas e Caule de Talinum triangulare

28

29 27

Substncia 1: lutena
OH 6' O 5' 4' 2' HO O HO 1' OH 3'

21 18 19 20 11 12 1716 13 15 1 10 9 14 2 8 5 7 3 4 6

22 23

24

25 26

Substncia 3: 3--O-Dglicopiranosilsitosterol

29 28

Substncia 2: caroteno
6' 4' 5' 2' 3'

21 18 20 17 16 15 14

22 23 24 25 26

27

OH O
2 1' 3

19 1 5 4 10

11 9

12 13 8 7

HO HO

O OH

Substncia 4: 3--O-Dglicopiranosilestigmasterol
H O H N N H O N H O NH2

Substncia 5: alantona

4.2 Identificao das substncias isoladas das folhas de T. triangulare 4.2.1 Extrato Hexnico das Folhas de T. triangulare 4.2.1.1 Identificao das Substncias 1 e 2 4.2.1.2 Anlises Espectofotomtrica no Ultravioleta do Extrato e Frao Hexnica das folhas de T. triangulare

22

O teste no UV-visvel (aparelho Shimadzu) foi realizado com extrato e frao hexnica das folhas Talinum triangulare, no qual partiu-se do extrato seco e da frao aps a saponificao em presena de hexano, onde utilizou-se uma soluo padro de 1 mg/mL. A soluo foi submetida anlise espectrofotomtrica no UV-visvel percorrendo uma faixa de 400 a 500 nm. A anlise no UV-visvel revelou sinais caractersticos de componentes do tipo carotenides, na qual puderam ser confirmados atravs dos valores dos max que apresentaram valores em 410, 439 e 469 nm para o extrato e para a frao max em 423, 444 e 475 nm (Figura 14), indicando a presena de -caroteno apresentando-se como componente majoritrio nas duas amostras.

2,5
Absorvncia

2 1,5 1 0,5 0 200 400 600

Ext. Hexnico da folhas de T. triangulare

800

Comprimento de onda em nm

Figura 14: Anlise de UV- visvel de TTFH, apresentando valores de max em 423, 444 e 475 nm caractersticos de -caroteno de T. triangulare

4.2.1.3 Anlises Atravs de CLAE do Extrato e Frao Hexnica das Folhas de T. triangulare Os cromatogramas (figuras 16 e 17) obtidos apresentaram teores de -caroteno e luteina (Figura 15), nos quais foram quantificados em 169,1 mg de -caroteno e 73,179 mg de luteina para o extrato hennico e 165,1 mg de -caroteno e 175,8 mg de luteina para frao etrea por 100 g de extrato seco.
OH

HO

23

Substncia 1: Lutena

Substncia2: -caroteno

Figura 15: -caroteno e lutena identificados no extrato e frao etrea de T. triangulare atravs de HPLC.

24

Figura 16: cromatograma do extrato hexnico das folhas de T. triangulare

Figura 17: cromatograma da frao etrea das folhas de T. triangula

25

4. 2. 2 Extrato Metanlico das Folhas de T. triangulare 4.2.2.1 I dentificao das Substncia 3, 4, 5 4.2.2.1.1 Substncias 3 e 4 No espectro de infravermelho, figura 18, das espcies acima possvel observar o sinal em 3394,51 cm-1, caracterstico da OH. Os Sinais de 2949,07 a 2850,07 cm-1 so correspondentes a C-H de CH, CH2 e CH3, simtricas e assimtricas. 1735,88 de vibrao axial de dupla olefnica. Os sinais de 1465,72 a 1379,06 cm -1 so caractersticos da C-H de CH2 e CH3. Os espectros de RMN 1H, 13C e DEPT 135 das saponinas 3 e 4 foram comparados com dados da literatura (KOJIMA et al.,1990 e CARVALHO, 2001) e permitiriam confirmar a estrutura 3 sendo como um produto natural 3-O--D-glicopiranosilsitosterol e 3-O--D-glicopiranosilestigmasterol sendo o composto 4. O espectro de RMN 1H (Figura 19) apresentou valores de deslocamentos qumicos referentes a metilas entre H 0,64 0,94 de hidrognios vinilicos em H 5,31 (dl), tpico de H-6 de fitosterides. Alm dos sinais da parte da aglicona aparecerem tambm em H 3,61 (m, H-5), 4,19 (d, H-1), 4,44 (tl, H-2 e H-4) e 4,88 (tl, H-3), que podem ser atribudos aos hidrognios da unidade de acar tanto para o composto 3 quanto para o composto 4. A unidade de acar foi atribuda como -glicose, devido a presena do dubleto em H 4,19 (J=8 Hz) que representa o hidrognio anomrico (H-1). A substncia 16 apresentou inda sinais em H 5,01 e 5,11 (d) indicando os H-22 e H-23. Os espectros de RMN 13C e DEPET 135 (Figura 20 e 21) mostraram sinais de carbono olefinco CH 121,7 atribudo ao carbono C-6, um carbono quaternrio olefnico C 140,7 atribudos ao C-5 e ainda um carbono carbinlico CH 79,6 referente ao C-3 comum aos dois esterides. A saponina 4 apresentou tambm sinais de carbonos olefincos CH 129,2 e 138,3 indicando os carbonos C-23 e C-22 do estigmasterol. Os valores dos deslocamentos qumicos atribudos a unidade de acar ajudaram confirmar a proposta para as substncias, pois apresentou sinal caracterstico em CH 101,2 para C-1, caracterstico de carbono carbinlico da -glicose, e os demais deslocamentos qumicos em CH 70,5 (C-4), 73,9 (2), 77,2 (C-3 e C-5) e em CH2 61,4 (C-6). Os valores dos deslocamentos qumicos representados pela tabela abaixo foram concludos atravs de comparao com dados da literatura (KOJIMA et al.,1990 e CARVALHO, 2001).

26

Tabela 5: dados de RMN de 1H (400 MHz) e 13C (100 MHz) da substncia 3 e 4. 3+4 C 1 2 3 4 C 37,2 29,5 79,65 42,3 3,36(m) 2,11 (m) 2,40 (m) 5 6 7 140,9 121,6 31,8 5,31 (dl) 1,43 (m) 1,77 (m) 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 31,8 50,2 36,6 21,0 38,7 42,3 56,6 23,0 29,1 55,8 12,2 19,3 35,9 19,5 33,7/138,5 0,84 (m) 5,11 (d) 0,65 (s) 0,96 (s) 0,94 (m) 1,40 (m) 1,80 (m) 31,4 49,6 36,8 22,5 39,7 42,3 56,2 23,8 28,7 55,4 11,6 19,7 36,1 20,6 33,3 1,02 (d) 0,65 (s) 0,80 (s) 1,55 (m) 140,4 121,2 31,6 5,31 (dl) H KOJIMA et al.,1990 C 36,8 29,3 76,9 41,8 H 3,59 (m) -

27

23 24 25 26 27 28 29 1 2 3 4 5 6

25,8/129,2 45,5 29,7 20,1 19,0 24,3 12,1 101,2 73,9 77,2 70,5 77,2 61,4

5,01 (tl) -

27,8 45,1 29,3 19,1 18,9 25,4 12,1 0,85 (d) 0,80 (d) 0,80 (t) 4,60 (s)

4,19 (d) 4,44 (m) 4,88 (tl) 4,44 (m) 3,61 (m)

100,8 73,4 76,7 68,5 71,5 62,1

28

Figura 18: espectro de infravermelho das substncias 3 e 4 em pastilha de KBr

18 Mar 2010 Acquisition Time (sec) 7.9692 Frequency (MHz) 400.13 Temperature (grad C) 0.000 Comment Nucleus AMOSTRA: C3 (38) S (PROTON) 1H Original Points Count 65536 Date Points Count DMSO-d6 2.49 00/00/1980 00:00:00 65536 Sweep Width (Hz) 8223.68

0.94 4.88 0.89 4.44 1.77 3.11 3.05 2.99 2.87 3.65 3.61 2.34 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.11 2.0 1.93 1.51 1.5 1.21 1.12 4.21 4.19 1.0 0.99 6.5 6.0 5.5 5.11 5.01 4.91 4.90 4.87 5.31 5.0 0.76 0.5 0.77 0.81 0.79 0.64

0.0

-0.5

18 Mar 2010 Acquisition Time (sec) 1.3631 Frequency (MHz) 100.61 Temperature (grad C) 0.000 Comment Nucleus 13C Original Points Count 32768 Date Points Count 00/00/1980 00:00:00 32768 Sweep Width (Hz) 24038.46

Figura 19: espectro de RMN H (400 MHz, DMSO-d6) das sbstncias 3 e 4

31.82 29.56 28.27 29.12 25.83 24.33 23.04 20.18 19.38 19.07 77.21 12.23

73.90

70.50

45.57

101.25

61.49

50.04

42.30

140.90

121.68

56.63 55.87

38.75

138.54

129.27

79.65

35.95 33.78

36.66

29
140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

Figura 20: espectro de RMN 13C (100 MHz, DMSO-d6) da substncia 3 + 4. Figura 20: espectro de RMN 13C (100 MHz, DMSO-d6) da substncia 3 + 4.

18 Mar 2010 Acquisition Time (sec) 1.3631 Frequency (MHz) 100.61 Temperature (grad C) 0.000 Comment Nucleus 13C Original Points Count 32768 77.19 Date Points Count 00/00/1980 00:00:00 32768 Sweep Width (Hz) 24038.46

73.90

70.48

101.25

121.68

56.63 55.86

50.04

45.56

35.96

138.54

Figura 20: espectro de RMN 13C (100 MHz, DEPT 135 C, DMSO-d6) da substncia 3+ 4 4.2.2.1.2 Substncia 5
37.28 38.75 61.48 28.27 21.05 24.34 29.52

145

140

135

130

129.25

125

120

115

110

105

100

95

90

85

80

75

70

65

60

55

50

45

40

35

31.86

30

29.11

25

20.19

20

19.38

15

12.24 10

Figura 21: espectro de RMN substncia 3+ 4

13

C (100 MHz, DEPT 135 C, DMSO-d6) da

4.2.2.1.2 Substncia 5 No espectro de infravermelho, figura 22, da espcie acima possvel observar os sinais em 3438,97 cm-1 e em 3344,46 cm-1 caractersticos da NH2. Os Sinais de 2761,98 cm1

correspondente a C-H de CH, os sinais em 1762,17, 1710,61 e 1685,73 so caractersticos A substncia 5 apresentou sinais, no espectro de RMN de 1H (Figura 23),

das vibraes axiais de dupla de carbonilas. exclusivamente na regio de freqncia alta, sendo sinais referentes a trs singletos em H

30

10,49 (HN-3), H 8,07 (HN-1) e H 5,81(H2N-8), um dubleto em H 6,92 (J = 8,0 Hz, HN-6) atribudos aos cinco hidrognio ligados a tomos de nitrognio, alm do dubleto em H 5,25 (J = 8,0 Hz) referente ao hidrognio metnico H-5. O espectro de RMN de 13C (Figura 24) apresentou sinais correspondentes a quatro tomos de carbono, sendo dois sinais em C 174,04 (C-4) e H 157,82 (C-2), atribudos a dois tomos carboximdicos, e dois sinais em H 157,22 (C-7) e H 62,86 (C-5) referentes a carbonos de grupamento carbonlico de amida e metnico carbinlico, respectivamente. A comparao dos dados de RMN de 1H e de 13C da substncia 5 com os dados de literatura (FERREIRA et al, 2000, POJE & SOKOLIC-MARAVIC, 1981) foi determinante para propor a estrutura da alantona. H

O H

N H

3 2 4 1 5

O N H
6

O
7

NH2
8

Tabela 6: dados de RMN de 1H (400 MHz) e 13C (100 MHz) da substncia 5. C Posio H (mult.; Hz) C FERREIRA et al, 2000 H POJE & SOKOLICMARAVIC, 1981 1 2 3 4 5 6 7 8 8,07 (sl) 10,48 (sl) 5,25 (d; 8,0) 6,91 (d; 8,0) 5,80 (sl) 157,82 174,04 62,86 157,22 8,05 (sl) 10,54 (sl) 5,21 (d; 8,1) 6,91 (d; 8,1) 5,82 (sl) 156,9 173,7 62,5 157,5 -

31

Figura 22: espectro de infravermelho da substncia 5 em pastilha de KBr

19 Mar 2010 Acquisition Time (sec) 3.9846 Frequency (MHz) 400.13 Temperature (grad C) 0.000 Comment Nucleus AMOSTRA: C4hidro(19)S 1H Original Points Count 32768 Date Points Count 5.81 00/00/1980 00:00:00 32768 Sweep Width (Hz) 8223.68

H O H
2 4 1 5

HN-1
O
7
8.07

HN-8

N 3

O N H
6

6.92

5.24

N H

NH2

HN-6

H-5
2.51

HN-3
10.49

1.00 10.5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5

1.00 7.0 6.5 6.0

1.98 5.5

1.02 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0

Figura 23: espectro de RMN de 1H (400 MHz, DMSO-d6) de 5

32

19 Mar 2010 Acquisition Time (sec) 1.3631 Frequency (MHz) 100.61 Temperature (grad C) 0.000 Comment Nucleus C4hidro (19)S (13C DESAC) 13C Original Points Count 32768 Date Points Count 00/00/1980 00:00:00 32768 Sweep Width (Hz) 24038.46

C-5

C-4

180

174.04

170

160

157.23

C-7

157.83

C-2

150

140

130

120

110

100

90

80

70

62.86 60

50

40

Figura 24: espectro de RMN 13C (100 MHz, DMSO-d6) da substncia 5 .

5 Concluso No perodo de estgio, foi possvel adquirir conhecimentos em diversas reas, tais como na rea de cromatografia, obtendo-se alguns resultados satisfatrios, na purificao dos constituintes qumicos da planta estudada. Foi de suma importncia tambm a aquisio de conhecimentos na rea de mtodos fsicos de anlise, pois sem eles no seria possvel a elucidao das estruturas das substncias isoladas. relevante acrescentar como comentrio o fato de o estgio ter me concedido a maturidade de aplicar conhecimentos tericos, discutidos ao longo da graduao, em situaes prticas. Posso dizer, sem sombra de dvidas, que este estgio contribuiu de forma muito significativa na minha formao, fornecendo alguns conhecimentos prticos que no teria aprendido apenas na graduao. 6 Referncias

33

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