Anlises qumicas

Sistemas automatizados para preparo de amostras

Amostra

Deteco

Seletividade e sensibilidade?

Analito

Material desenvolvido pela Profa Dra Ana Cristi Basili Dias

Matriz Estvel? Complexa?

Interferentes Estrutura e propriedade??

Baixas concentraes!!

Etapas
amostragem preparo da amostra preparo de solues calibrao de instrumentos de deteco medidas e anlise dos resultados interpretao e comparao com materiais certificados

Erros em anlise cromatogrfica

Contaminao (4%) Injeo amostra (6%) Integrao (6 %) Cromatografia (7%) Instrumentao (8%) Calibrao (9%) Colunas (11%)
Adaptado de: R. E. Majors, An overview of sample preparation LC-GC, vol.9, n.1, 1991.

Preparo de amostra (30%)

Analista (19%)

Amostras

Desafios no preparo de amostra

isolao do composto/elemento de interesse;

Produtos Farmacuticos

Fluidos biolgicos

minimizao de interferentes matriciais; limpeza da amostra; similaridade ismeros entre componentes: compostos metablitos, instveis, moleculares,

Gasosos Slidos Lquidos

Sangue Plasma Urina Saliva

polimorfismo, etc; ons disponveis, biodisponveis.

Seletividade

Otimizao

Tempo

Robustez

Preparo de amostras automatizado!!!

Confiabilidade

Sensibilidade

Sistemas automatizados
Reduo da interveno humana Aumento do nmero de amostras Simplicidade de operao dos processos

Sistemas analticos
anlises por injeo em fluxo; sistemas explorando multi-comutao; anlises por injeo sequencial; sistemas pulsados (pulsantes); multi-syringe; Lab-on-valve; -FIA. Novas estratgias visando miniaturizao

Objetivos da automao/ mecanizao em anlises qumicas

Tornar factvel uma tcnica ou mtodo analtico Melhorar: -Sensibilidade -Seletividade -Preciso/Exatido -Campo de aplicao Reduzir o consumo de amostras e reagentes

Anlises por injeo em fluxo

A C R B D

Princpios do FIA
Injeo da amostra Controle da disperso

Co

Cmax

Sinal

To

Tmax

tempo

Tempo reprodutvel

Injetor-comutador manual

Sistema por confluncia

ala de amostragem transportador

Barra mvel Percurso analtico

amostra

Descarte

q1+ q2

Barra fixa

q2

q1

confluncia

Injetores/comutadores automticos
Vlvula rotatria de seis vias

Sistemas multi-comutados

Vlvula bi-direcional
off

Bombas solenides melhor gerenciamento das solues; mais flexvel; menor consumo de reagentes; contnuo e/ou descontnuo; automao de todas as etapas analticas.

on inlet inlet on out

Sistema de anlises automatizado

Vantagens no preparo de amostras automatizado

Insero direta da amostra; Controle de todas as etapas; Capacidade de miniaturizao; Integrao da separao, reao e deteco.

Bomba

MDULO

Detector

Colunas Camaras Digestores Reatores Banhos

Acessrios comutadores

Sistema de anlises por injeo seqencial

W HC T R2 RC

Princpio do SIA
amostra produto reagente

Detector

Bomba

R1 R3 A D

Facilidade na insero de componentes e mdulos Descontinuidade promove alta flexibilidade

Vantagens no preparo de amostras em SIA

Analisador comercial FLOPRO-9P

Mdulos de extrao

Sistemas digestores

Cmaras

-FIA/SIA, mdulos complexos, tratamento de amostras, etc.

www.globalfia.com

Sistema comercial Fialab

Software

- verstil e porttil - fluxo continuo, descontinuo e stopped flow - adaptvel em diversos sistemas de deteco
www.flowinjection.com

Lab on Valve
A B C

Princpios SI-BI-LOV

D E

www.flowinjection.com

- SIA miniaturizado - adaptvel na vlvula - injeo de beads e coluna renovvel -D.i.:0,1 mm, volumes (l), vazao (l/seg)

BEADS#1 HC BEADS#2

Plug #1

Cela de fluxo
Plug #2

Descarte

luz

DEVELOPMENT OF SEQUENTIAL INJECTION ENZYMATIC AND BEAD INJECTION ASSAYS IN A LAB-ON-VALVE FORMAT Thesis submitted to the Universidade Catlica Portuguesa to attain the degree of PhD in Biotechnology - with specialization in Chemistry By Susana Maria Socorro de Matos Peixoto Vidigal Under the supervision of Antnio O. S. S. Rangel, Professor. Under the co-supervision of Ildik V. Tth, Ph.D

SIChrom

SIA: ferramenta benfica para tratamento de amostra em linha

A. Economou, Trends Anal. Chem. 24 (2005) 416.

- Cromatografia lquida em SIA - baixa presso e alta velocidade - colunas monolticas de slica porosa (Phenomenex, Merck)
www.flowinjection.com

Tendncias atuais nas anlises qumicas

Simplificao Automao/Mecanizao
Miniaturizao

turizao

Extrao em fase slida (SPE)

Mdulos de tratamento de amostras automatizados

Quimiometria

Extrao em fase slida

Insero de mini-colunas (MC) no mdulo de anlises

Mini-colunas

Resinas MIP, RAM Enzimas PUF, PTFE Reagentes slidos Mat adsorvente

Separao Seletividade Limpeza/ filtrao Especificidade (quirais) Reao qumica Coluna:Tygon Vidro Acrlico Separador: Algodo L de vidro Filtro Nylon

SPE em FIA
MC antes da injeo da amostra

Extrao em fase slida em sistemas de anlises por injeo em fluxo

Interferentes retidos Volume da amostra por loop Recondicionamento simultneo freqncia analtica matriz no sistema de deteco disperso Ex. reteno de Ca2+, Mg2+ e K+ em MC catinica para determinao de SO4 em extratos de solos
M.R. McSwain et al., Anal. Chem. 46 (1974)1329.

SPE em FIA
MC no injetor da amostra

SPE em FIA
MC aps o injetor da amostra alto efeito matricial no sistema deteco injeo seqencial de S e E freqncia analtica anlises seqenciais pouco adequado para preparo de amostras

Separao/concentrao analito Volume amostra: vazo e tempo menor interf matricial: eluio recondicionamento fora do percurso.

Ex. eliminao da interferncia espectral de Fe na determinao de Zn por FAAS.

J.A. Sweileh, E.M. El-Nemma, Anal. Chim. Acta 523 (2004) 287.

Ex. separao e determinao seqencial de Zn e Cd por quimiluminescncia.

J.L. Burguera, et al., Anal. Chim. Acta 127 (1981) 199.

Caractersticas
Etapas de lavagem, eluio e recondicionamento eficientes e simples; Adequada freqncia analtica; Dificuldade para separaes multi-elementares; Geometria da mini-coluna; Empacotamento dos slidos; Alta presso hidrodinmica; Gerao de gradiente de concentrao; um canal para cada soluo; Elevado volume de reagentes e amostra; Elevada disperso/diluio

Extrao em fase slida em Sistemas time-based sistemas automatizados

SPE em sistemas automatizados

M. Knochen, J. Giglio, Talanta 64 (2004) 1226.

SPE em sistemas automatizados

C. Mardones et al., Electrophoresis 22 (2001) 484..

C1 tampo pH 5.9 (T1) C2 gua (T2) C3 eluente (NaOH) C4 4-aminoantipyrine (R1) C5- hexacianoferrato (R2)

Clean-up da amostra e separao de antiinflamatrios no esteroidais

Separao de fenilefrina dos componentes matriciais

MC: resina Dowex 50W X8 - grupo sulfnico; Matriz: xarope e pastilhas efervescentes (metanol 1:3, US e filtrao); Reao de Emerson para compostos fenlicos (500 nm); Resultados: sem SPE rec 103109 %; SPE-FIA 99,7 100%; d.p.r. < 1,0 %, n=5; freqncia analtica: 40 h-1 Comentrios: solues de lavagem e amostragem passam pelo detector pr-etapas em batch MC: C-18 (Varian) limpeza e separao dos analitos; Matriz: urina e soro sangneo; Separao eletrofortica: ibuprofen, fenbufen, tolmetin, ketoprofen, AAS, indometacin; Recuperao: 71,7109,7 % para urina e 77,2-107,1% soro; d.p.r. < 7,7 %, n= 5 (3,0 g ml-1 cada composto) Comentrios: AAS no quantificado interao com a amostra

Resultados
Urina
s/ trat

SPE em sistemas automatizados

M.T.S. Cordeiro et al., J. Anal. At. Spectrom. 19 (2004) 398.

c/ trat

Especiao de cromio

Soro

Amostras adicionadas dos analitos (10 e 5 g ml-1) para urina e sangue

MC: inserida no brao do autoamostrador; Duas mini-colunas para especiao de Cr(VI) e Cr(III); Matriz: urina e formulaes farmacuticas (diludas com gua); Deteco: ETAAS; Comentrios: diluio off-line.

Caractersticas
Maior controle das etapas; Simples acoplamento em outras tcnicas; Boa freqncia analtica; Passvel de anlise multi-elementares; Minimizao das solues; Tempo de operao melhor gerenciado; Disperso mais controlada; Elevado nmero de componentes.

Extrao em fase slida em sistemas de anlises por injeo seqencial

SPE em SIA
J. Huclova et. Al., Anal. Chim. Acta 573 (2006) 376.

Resultados
urina

W E MC

amilorida

branco

A
E 0,01 M HNO3 + 0,1 M KCl T - gua

Separao de amilorida dos componentes matriciais

amostra adicionada 20,0 g l-1 amilorida

urina

amilorida

MC: resina BAKER WCX grupo carboxyl; Matriz: urina (diluio 1:10 H2O); Deteco fluorimtrica (em 385 nm); Recuperao 96,8 99,4 %, d.p.r. < 3,2 %, n=5; limite deteco: 0,05 g l-1 amilorida Comentrios: baixa freqncia analtica ( 7,0 h-1)

Etapa de lavagem

Etapa de eluio

Caractersticas
Controle operacional de todas as etapas; Pouco volume de amostra e reagentes; Verstil; Simples operao; Baixa freqncia analtica; Disperso limitada; Mistura baseada em interfaces; Baixas vazes (depende da MC).

Column Switching

Sistema de cromatografia lquida multidimensionais

Coluna de slica

Coluna monoltica porosa

SPE em flow Baixa presso

Column Swtching Alta presso Cromatografia lquida

partculas individuais de slica alta resistncia e presso baixa vazo menor tempo de uso baixa freqncia analtica maior tempo de corrida

pea monoltica de slica porosa alta vazo baixa presso hidrodinmica menor stress no sistema e coluna menor tempo de corrida elevada freqncia analtica melhor repetibilidade e eficincia maior tempo de uso
www.sichrom.com

Como o sistema multidimensional funciona?

Arranjos instrumentais

Bomba A Descarte Injetor

UV

Coluna analtica RAM

Bomba B

BACKFLUSH

FOREFLUSH

SPE em sistemas automatizados

J.Ou et al., Talanta 69 (2006) 1001.

SPE em sistemas automatizados

W.M. Mullett et. al., J. Chromatog. B 801 (2004) 297.

Estudos de separao de bisfenol A e compostos fenlicos

Separao e caracterizao de verapamil e metablitos (MIP + RAM)

Coluna monoltica com MIP-bisfenol A (4-VP e EDMA); Matriz: guas de rio; Deteco: LC-UV; Espcies: hidroquinona, fenol, 1-metilfenol, 4-terc-butilfenol, 4-tercoctilfenol; Recuperaes: 82 95,2 %, d.p.r.<8 %, (n=5) Comentrios: eficincia na separao dos compostos fenlicos (Fator impresso)

MC: RAM (retirada das protenas) e MIP (separao do analito); Matriz: urina, cultura de clulas, plasma sangneo; Deteco:LC-MS; Anlise: 35 min Comentrios: teor prot complexa o analito reduz a separao no MIP.

Extrao lquido-lquido
duas fases imiscveis; extrao depende: solubilidade, migrao, formao das fases, tipos de extrator, coeficiente de partio, razo volumtrica F1/F2, etc, deteco: fase extratora.

Extrao lquido-lquido (LLE)

Fase 1 gua, solvente Fase 2 orgnicos, lquidos inicos, surfactantes

Fase 1 Fase 2

Analito solvent e

Caractersticas
Melhoria em seletividade: separao do analito/interferentes Melhoria em sensibilidade: concentrao do analito Eficiente mistura entre fases: troca de massa quantitativa

Extrao lquidolquido-lquido em sistemas de anlises por injeo em fluxo

batch

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Sistema de anlises em fluxo explorando LLE

Fase 1 (analito) Fase 2 (extrator) Segmentador Bobina de extrao

Separao de fases

Descarte

Deteco

Segmentos: forma e volume iguais Vazo: adequada extrao Ambiente: fechado Tubos: formao de filme fino Separador de fases: opcional

filme tubo

Forg

Faq

Segmentador de fases em fluxo

fluxo

Extrao
axial radial

faq

forg

filme

- dimetro e forma dos tubos (helicoidal) - volume dos segmentos - material : analito(aq) PTFE, analito(org) ao /vidro -mistura axial: transferncia de massa - catalisadores: temperatura, ultra-som, reator helicoidal
I. Facchin, C. Pasquini, Quim. Nova 21 (1998) 60.

Separadores de fases em fluxo

Consideraes
viscosidade das fases envolvidas; tipo de reator; automao na insero de alquotas; tipo de detector; tipo de fluxo; vazo durante extrao; tipo de injeo de amostra (disperso/diluio).

I. Facchin, C. Pasquini, Quim. Nova 21 (1998) 60.

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LLE em FIA
T. Prez-Ruiz et al., J. Pharm. Biomed. Anal 26 (2001)609.

Sistemas de extrao lquidolquido -lquido automatizados

Separao de ranitidina por par inico com corante

RH+(aq) + D- RH+D- RH+D-(org)

Aaq (300 l) + Azul de bromotimol segmentador + clorofrmio Tubos: PTFE, Seg: em T, FS: (two-block membrana permevel a clorofrmio) Matriz: comprimidos (pr-dissolvidos); Deteco espectrofotomtrica (420 nm); Eficincia de extrao : 95,8 % Recuperao 98,2 101,1% (5,0 20 g ml-1 ranitidina), d.p.r. < 1,5%, n=3 Comentrios: livre de interferncias, robusto, rpido (40 amostras/hora)

LLE em FIA
A.L.D. Comitre, B.F. Reis, Anal. Chim. Acta 479 (2003) 185.

LLE em FIA
F. Canete et al., Anal. Chem. 60 (1988) 2354.

Molibdnio em plantas

Extrao de surfactantes aninico (SDS) em gua

Mo(VI) + KSCN + SnCl2 lcool isoamil como extrator Forg = 200 l Matriz: plantas; Deteco espectrofotomtrica (475 nm); Interferentes em potencial: 20,0mg l-1 Fe(III) - adicionado Freqncia analtica: 25 h-1 Comentrios: livre de interferncias, baixo consumo de reagentes (30 ml/dia).

sem separao de fases loop amostra no detector (652 nm) formao par-ionico (azul metileno) extrao: cloroformio fluxo reverso: 26 seg (n=10) estudo cintico

LLE em FIA
Q. Fang et al., Anal. Chem 73 (2001) 3502.

Formao do filme fino

material do tubo (hidrofbico- Teflon); tipo do solvente (afinidade com a parede do tubo); pelcula interna quase estacionria; segmentos aquosos envoltos pelo solvente; formao e estabilidade: interface tubo/solvente

Extrao de porfirina em urina explorando ponto nuvem

Amostra (urina) + surfactante (Triton X-114) Separao : salting out 2,0 mol l-1 (NH4)2 SO4 Coluna de algodo: coleta da fase rica e eluio do analito (acetonitrila) Deteco quimiluminescncia com peroxi-oxalato (620 nm); Recuperao: 93-108%, 200 g l-1 porfirina, d.p.r. < 1,1%, Freqncia analtica: 30 h-1 Comentrios: ppt de protenas off-line.

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LLE em FIA
C.A. Lucy, K.K.C. Yeung, Anal. Chem. 66 (1994) 2220.

Extrao de

o-nitroanilina / o-nitrobenzoato
em tabletes

Sistemas de extrao lquidolquido -lquido em SIA

Matriz: frmacos Separao: diferena na velocidade de extrao (afinidade com hexanol) Deteco: espectrofotomtrica UV (254 nm); Tubo de extrao: helicoidal (5,0 mm) pH 12: nitroanilina (neutra-extrada) Freqncia analtica: 12 h-1 Comentrios: princpios de cromatografia.

LLE em SIA
R. Burakham et al., Talanta 68 (2005)416.

LLE em SIA: formao de um filme fino

K.L. Peterson et al., Anal. Chim. Acta 337 (1997) 99.

Extrao de difenidramina em frmacos aspirao

CHCl3 Tampo Amostra BCG

ar W H3PO4 NaOH

Lavorg Worg Aaq

Extrao de barbitricos em urina

Cloreto butila Matriz: urina/spiked Separao: migrao diferencial no filme fino Fase organica : 4:1 v/v cloreto butila:octanol Deteco: HPLC/UV(190 400nm) Comp. cido/neutros: fenobarbital, secobarbital, pentobarbital e amobarbital (NaOH); Comp. Bsicos: venlafaxina, paroxetina, sertralina, norsetralina (H3PO4); Comentrios: sem separador e segmentador, deteco off-line.

deteco
Matriz: tabletes Separao: formao de par-inico e extrao em clorofrmio Deteco espectrofotomtrica (415 nm); Recuperao: 101-102%, d.p.r. < 3,6% Freqncia analtica: 5 h-1 Comentrios: fluxo reverso (eficincia da extrao), ausncia de interferentes.

Procedimento

Caractersticas
baixo consumo de reagentes (orgnicos) e amostra; pouca perda do analito durante extrao; alta freqncia analtica; pouca contaminao atmosfrica (solv volteis); pouca manipulao; SIA ausncia de cmara de separao; alta eficincia em extrao; menor volume de solventes; menor gerao de resduos.

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Mdulos de tratamento da amostra em linha

Extrao em fase slida (SPE) Extrao lquido-lquido (LLE) Sistema digesto em linha por microondas Sistema dissoluo em linha por ultra-som

Filtrao Extrao por membrana

Dissoluo de slidos Radiao ultra-violeta

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