NDICE GENERAL TCNICAS DE COLORACIN.............................................................. ................................................................................ ... 3 Coloracin de Gram.............................................................. ................................................................................ .. 3 Fundamento ................................................................. ................................................................................ .. 3 Tcnica de Gram............................................................... .............................................................................

3 Interpretacin................................................................ ................................................................................ .. 4 Forma de Reportar .......................................................... ............................................................................... 4 Limitaciones................................................................ ................................................................................ .... 4 Coloracin de Ziehl Neelsen..................................................... .............................................................................. 5 Tcnica de Ziehl Neelsen ..................................................... .......................................................................... 5 Interpretacin................................................................ ................................................................................ .. 6 Tcnica de la Coloracin de Gram (Esquema) ....................................... ................................................................ 7 Tcnica de la coloracin de Ziehl Neelsen (Esquema) .............................. ............................................................. 8 Tcnicas de Coloracin. Ejercicios de Autoevaluacin................................ ........................................................... 9 TRACTO GENITOURINARIO .......................................................... ................................................................................ ...... 10 Urocultivo.................................................................... ................................................................................ .......... 12 Mtodo del Asa Calibrada (Mtodo Semicuantitativo) ............................. ..................................................... 12 Consideraciones .......................................................... ........................................................................ 12 Lectura de Urocultivos segn el Mtodo del Asa Calibrada...................... ........................................... 12 Criterios para la Cuantificacin de Urocultivos segn el Mtodo del Asa Calibrad a ............................ 13 Mtodo de Dilucin (Mtodo Cuantitativo).......................................... .......................................................... 13 Criterios para la Interpretacin de Urocultivos............................... ............................................................... 14 Mtodo del Asa Calibrada (Mtodo Semicuantitativo). Esquema ...................... ................................................... 15 Mtodo de Dilucin (Mtodo Cuantitativo). Esquema .................................. ......................................................... 16 Tracto Genital Alto .......................................................... ................................................................................

...... 17 Tracto Genital Bajo .......................................................... ................................................................................ ..... 18 Secreciones Uretrales......................................................... ................................................................................ .. 18 Secreciones Vaginales......................................................... ................................................................................ . 19 Tracto Genitourinario. Ejercicios de Autoevaluacin. Casos Clnicos............... .................................................... 20 TRACTO RESPIRATORIO............................................................. ................................................................................ ....... 23 Tracto Respiratorio Inferior ................................................. ................................................................................ .. 24 Esputo ..................................................................... ................................................................................ ..... 24 Clasificacin de las muestras de Esputo..................................... ......................................................... 25 Criterios para la Interpretacin y el Reporte del Frotis Directo de Esputo.. .......................................... 25 1 Patgenos Probables en muestras de esputo................................... ................................................... 26 Criterios de interpretacin............................................... ............................................................. 26 Aspirado/Lavado Bronquial, Cepillado Bronquial Protegido y Secrecin Transtraq ueal ............................... 27 Criterios de Interpretacin de Probables Patgenos en muestras de aspirado/lav ado bronquial y cepillado bronquial protegido .................................................. ............................................................. 27 Secrecin Traqueal y Endotraqueal............................................. ................................................................. 28 Tracto Respiratorio Superior ................................................. ................................................................................ 28 Exudado Faringeo, Nasofaringeo y Exudado/Secrecin Nasal ..................... ............................................... 28 Tracto Respiratorio. Ejercicios de Autoevaluacin. Casos Clnicos ................ ...................................................... 30 TRACTO GASTROPINTESTINAL........................................................ ................................................................................ ... 33 Coprocultivo ................................................................. ................................................................................ ......... 33 Escherichia coli productora de Diarrea...................................... ................................................................... 35 Esquema de Identificacin de Escherichia coli Productoras de Diarrea.......... ............................................. 38 Tracto Gastrointestinal. Ejercicios de Autoevaluacin. Casos Clnicos............. .................................................... 40 LQUIDOS ORGNICOS ESTRILES.......................................................... ........................................................................... 43

Sangre (Hemocultivo) ......................................................... ................................................................................ .. 43 Esquema para el Procesamiento de Hemocultivos (Repique Inicial)............. ............................................... 45 Esquema para el Procesamiento de Hemocultivos (Repique Final) .............. ............................................... 46 Consideraciones Especiales.................................................. ....................................................................... 47 Informe de los Resultados................................................... ......................................................................... 47 Lquido Cefalorraquideo......................................................... ............................................................................... 48 Esquema para el procesamiento de LCR........................................ ............................................................. 50 Informe de los Resultados................................................... ......................................................................... 50 Lquido Pleural, Pericrdico, Peritoneal y Sinovial .............................. .................................................................. 51 Esquema Para el Procesamiento de Otros Lquidos Estriles ...................... ............................................... 51 Informe de los Resultados................................................... ......................................................................... 52 Lquidos Orgnicos Estriles. Ejercicios de Autoevaluacin. Casos Clnicos ............. .......................................... 53 MUESTRAS DE TEJIDO SEO, PIEL, TEJIDOS BLANDOS Y OTROS............................ ............................................................. 56 Tejido seo..................................................................... ................................................................................ ...... 56 Piel ......................................................................... ................................................................................ ............... 57 Tejidos Blandos............................................................... ................................................................................ ...... 57 Conducto Auditivo Externo..................................................... ............................................................................... 58 Secreciones Oculares.......................................................... ................................................................................ . 59 Muestras de Tejido seo, Piel, Tejidos Blandos y Otros. Ejercicios de Autoevalua cin. Casos Clnicos............. 60 2 Tcnicas de Coloracin TCNICAS DE COLORACIN (LIC. MARIBEL CASTELLANO GONZLEZ M.SC) COLORACIN DE GRAM La Tincin de Gram, descrita hace poco ms de cien aos por Hans Christian Gram, se us a con mucha frecuencia para el examen microscpico directo de muestras y subcultivos. FUNDAMENTO: La diferencia fundamental entre una bacteria Gram positiva y una Gram negativa radica fundamentalmente en la

pared celular. Las Gram positiva poseen ms del 60% de su pared celular compuesta por murena (peptidoglucano) y el resto, est representado por los cidos teicicos y otros componentes menos importantes. Esta armazn murenica impide que el decolorante (alcohol-acetona) penetre la pared, y por lo tanto, disuelva la unin salina formada entre el Cristal Violeta y el Yodo con los componentes cidos (ribosomas y cido desoxirribon ucleico del filamento cromosmico). No sucede lo mismo con las bacterias Gram negativa, cuya murena representa menos del 10 % de los componentes de la pared. Actualmente, se conoce la compleja estructura de las bacterias Gram ne gativa, las cuales tienen una pared con gran cantidad de componentes grasos, especialmente lipoprotenas y lipopol isacridos. Estos ltimos son los componentes fundamentales de la llamada membrana externa, la cual es el lmite ext erno del espacio periplasmtico de la pared. Aqu es donde radica la gran diferencia con las Gram positiva. La escas a murena y la abundancia de lpidos, permiten una accin disolvente poderosa del alcohol, slo o mezclado con la acetona. La disolucin de la pared permite que el alcohol llegue a la intimidad del citoplasma bacteriano, llevndo se el colorante violeta y la bacteria queda decolorada. El otro colorante empleado, la safranina, aadido posteriormente en la ltima etapa de la coloracin, teir de rojorosado a las bacterias previamente desteidas. No obstante, ninguna co mposicin qumica exclusiva de la pared bacteriana parece explicar la coloracin con Gram; ya que las gruesas paredes de l as clulas de levadura, que tambin se tien como Gram positiva, tienen una composicin qumica y una estructura diferente de las bacterias Gram positiva. TCNICA DE GRAM Proceda a elaborar un frotis y fjelo al calor. Coloque la lmina que contiene el ex tendido sobre un soporte adecuado para mantenerlo en posicin horizontal. Proceda entonces a: 1. Cubrir la lmina con cristal violeta. Dejar actuar por un minuto. (Este es el colorante primario que se une a la pared celular bacteriana). 2. Lavar con agua corriente. 3. Cubrir la lmina con lugol. Dejar actuar por un minuto. (Acta como mordiente pa ra la unin del colorante). 4. Lavar con agua corriente. 3 Tcnicas de Coloracin 5. Sobre la lmina, deje correr el decolorante orgnico (alcohol-acetona) hasta que la solucin de lavado no salga teida con el colorante violeta. Si lo prefiere, puede mantener la lmina sujeta entre el dedo pulgar e ndice y colocarla de manera que se obtenga un ngulo de 45. Por lo general, el tiempo reque rido para la decoloracin no sobrepasa los 10 segundos. 6. Lavar de nuevo con agua corriente. 7. Cubrir el frotis con una solucin de safranina (colorante de contraste). Dejar actuar por 30 segundos. 8. Lavar con agua corriente. 9. Colocar la lmina con el frotis en posicin vertical para escurrir el exceso de agua y permitir que seque espontneamente al aire. En su defecto, se puede emplear papel secante. 10. Colocar una gota de aceite de inmersin sobre la preparacin y obser

var al microscopio con objetivo de 100X y ocular de 10X, lo cual resulta en un aumento total de 1.000X. INTERPRETACIN En base a ella, las bacterias pueden dividirse en dos grandes grupos: Gram positiva, que se tien con el cristal violeta y aparecen de color azul-violeta intenso y, Gram negativa, las que se tie n con la safranina y aparecen de color rojo-rosado. Aquellas bacterias que carecen de pared celular, como los micoplasm as, no toman la coloracin de Gram y, por lo tanto, no se pueden definir como Gram positivas o negativas; ya que son no reactivos a esta tcnica de tincin. Existen microorganismos que se tien indiferentemente como Gram positivo o Gram ne gativo y son denominados Gram variables. Se cree que son bacterias que han perdido la habilidad de reaccionar en forma diferencial a esta coloracin. Esto generalmente sucede en cultivos viejos (con ms de 48 horas de incubacin). Se asume que este fenmeno ocurre debido a modificaciones en la pared celular provocadas por la edad del cultivo. En consecuencia, se recomienda que los frotis sean elaborados a partir de cultivos de no ms de 24 horas de incubacin. Esta coloracin diferencial permite observar la morfologa, disposicin y afinidad tintorial de las clulas bacterianas. FORMA DE REPORTAR Morfologa: cocos, bacilos y cocobacilos. Afinidad Tintorial: Gram positiva y Gram negativa. Disposicin: cocos en racimos (estafilococos); cocos en cadenas (estreptoc ocos); cocos en pares (diplococos); cocos en grupos de cuatro (tetradas); cocos en grupos de ocho (sar cinas); cocos aislados. LIMITACIONES La coloracin de Gram no permite identificar especficamente ciertas estructuras bac terianas, tales como: la cpsula, los flagelos o las esporas; as como tampoco proporciona buenos resultad os en la investigacin de micobacterias y hongos, salvo en el caso de algunas especies de levaduras. Estas limi taciones no son absolutas y como ya se ha demostrado; en ocasiones pueden observarse la cpsula o esporas; aunque no sean teidas en forma especfica; pero 4 Tcnicas de Coloracin quedan expuestas contra un fondo coloreado o contrastando con el cuerp o bacteriano bien teido. Por otra parte, las micobacterias, pueden ser vistas como bacilos; pero se hace necesario realizar la Coloracin de Ziehl Neelsen o de Kinyoun para demostrar su carcter cido resistente. Finalmente, es conveniente destacar que, existen numerosas modificaciones de las frmulas de las soluciones utilizadas en la tcnica de coloracin e incluso, del tiempo empleado en cada uno de los pasos sealados. Realmente, lo importante, es el empleo de un procedimiento similar en cada laboratorio para ev itar variaciones en los resultados. COLORACION DE ZIEHL-NEELSEN Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen cidos gr asos (cidos miclicos) de cadena larga

(50 a 90 tomos de Carbono). Este grueso material creo, los provee de una cubierta impermeable al Cristal Violeta, y otros colorantes bsicos, lo que hace que sean difciles de colorear. Sin embargo; u na vez teidos, poseen la propiedad de resistir la decoloracin con solventes orgnicos fuertes, como el alcoh ol cido. Por este motivo, a estos microorganismos se les denomina cido Resistentes, un fenmeno descubierto por Ziehl y Neelsen en 1.882. Las micobacterias como Mycobacterium sp. y Nocardia sp.; as como los ooquistes de parsitos coccdeos, tales como: Cryptosporidium sp., Isospora belli y Sarcocystis sp., se caracte rizan por sus propiedades de cido resistencia. Es necesario un tratamiento especial para que la tincin primaria, carbol fucsina, atraviese el material creo de los bacilos cido-alcohol resistentes. En la tcnica convencional de Ziehl-Neels en se usa calor (coloracin en caliente). La modificacin de Kinyoun se denomina mtodo en fro porque se usa un detergente activo de superficie, como tergitol, en lugar de calor. Utiliza un decolorante ms dbil (0.5-1.0 % de H 2 SO 4 ) en lugar de alcohol cido al 3 %. Esto ayuda a diferenciar entre organismos que son dbiles o parcialmente cido resistentes, parti cularmente, Nocardia sp. Cualquiera de los dos mtodos es satisfactorio. TCNICA DE ZIEHL-NEELSEN 1. Elaborar un frotis a partir de un cultivo puro de M. tuberculosis. (Usar por taobjetos nuevos y libres de grasa). 2. Fijar el frotis, utilizando para ello, una plancha de calentamiento (60C durante 10 minutos como mnimo; y dos horas, como mximo). 3. Aplicar un papel de filtro sobre el portaobjetos con el frotis y colocar la lmina sobre un soporte de metal para la coloracin. 5 Tcnicas de Coloracin 4. Cubrir la preparacin con la fucsina fenicada (colorante primario), c alentando a la llama de una lmpara de alcohol por debajo de la lmina (durante 5 a 10 minutos) hasta obtener la emisin de vapor (3 veces). (El vapor acta como mordiente). Evite que la lmina se seque, agregando ms colorante si es nec esario. 5. Retirar el papel de filtro (con ayuda de una pinza) y lavar el portaobjetos con agua hasta que el colorante deje de salir. Sacudir el exceso de lquido. 6. Cubrir el portaobjetos con solucin decolorante (alcohol cido) durante 1 minuto aproximadamente. Comprobar que no se desprende ms color rojo al escurrir el portaobjetos. Decolorar hasta qu e apenas quede una traza de color rosado. 7. Lavar con agua y eliminar el exceso. 8. Cubrir la lmina con el colorante de contraste (Azul de Metileno) y dejar en c ontacto por 1 2 minutos. 9. Lavar con agua corriente. Escurrir y dejar secar al aire. No secar con pape

l absorbente. 10. Observar al microscopio ptico con objetivo de inmersin. INTERPRETACION Los microorganismos cido-alcohol resistentes aparecern de color rojo inten so; mientras que el fondo de los elementos celulares y otras bacterias, se tien de azul, el color del colorante de contraste. Las micobacterias, frecuentemente, aparecen como bacilos ligeramente curvos que muestran la propiedad de cido resistencia (BAR). Pueden presentar grnulos ms oscuros y dar la impresin de estar fragmentados. 6 Tcnicas de Coloracin TCNICA DE LA COLORACIN DE GRAM O O O Cristal Violeta (1) Lavar con agua Lavar con agua

O O Safranina (30 ) Lugol (1) Lavar con agua

Lavar con agua. Observar al microscopio ptico con objetivo de inmersin (100X). Las bacterias Gram positivas aparecern de color violeta intenso y las Gram negativas, de color rojo. O

Decolorar con alcohol-acetona hasta que deje de salir el color violeta.

7 Tcnicas de Coloracin TCNICA DE LA COLORACIN DE ZIEHL NEELSEN O O Lavar con agua Fucsina bsica (15) Calentar 3 veces hasta la emisin de vapores

O O Colorear con azul de metileno por 1 Lavar con agua

O O Decolorar con alcohol cido, hasta que deje de salir el color rojo Lavar con agua

8 Tcnicas de Coloracin TCNICAS DE COLORACIN EJERCICIOS DE AUTOEVALUACIN 1. Investiga los siguientes trminos: - - Murena Peptidoglucano cidos Teicicos cidos miclicos Espacio periplasmtico 2. Si las bacterias pueden ser vistas en el microscopio sin coloracin, entonces, por qu? se recomienda el fijado y coloracin en microbiologa. 3. Supn que al colorear con Gram un extendido a partir de un cultivo puro de bacterias, al observar en el microscopio observas cocos de color rojos y prpura, las clulas adyacente

s, no son siempre del mismo color, Qu puedes concluir?. 4. Si la coloracin de Gram tie clulas humanas, Cmo se observaran en un extendido?. 5. Cules son las estructuras con pared celular deficiente? 6. Cules son las limitaciones de la coloracin de Gram? 7. Asumiendo que la coloracin cido resistente puede colorear cualquier cl ula, puede un organismo cido resistente ser Gram positivo o negativo?. Explique. 8. Cmo se relacionan las propiedades de cido-resistentes con la coloracin de Gram? 9. Cmo se realizara el control de calidad de las tcnicas de Gram y Ziehl Neelsen? 9 Tracto Genitourinario TRACTO GENITOURINARIO El tracto genital y urinario estn estrechamente relacionados desde el p unto de vista anatmico, y algunas enfermedades que afectan un sistema, afectan tambin al otro, especialmente en la mujer. El trato urinario superior y la vejiga son generalmente estriles. La uretra contiene bacterias residentes como Streptococcus, Bacteroides, Mycobacterium, Neisseria y bacilos entricos entre otros. La mayora de la s bacterias encontradas en la orina son el resultado de la contaminacin con la microbiota de la piel a su paso por la uretra . La presencia de bacterias en la orina no se considera indicativo de infeccin del tracto urinario, a menos que s e encuentre en una cantidad significativa en la muestra. Las infecciones que se presentan en el tracto urinario pueden localiza rse desde el rin hasta la uretra. Se presentan generalmente como infecciones simples cuando no estn presentes anormali dades anatmicas o neurolgicas, mientras que los pacientes con procesos obstructivos, clculos o con pro blemas neurolgicos generalmente presentan cuadros complicados. Generalmente las infecciones urinarias se adquieren por va a scendente, es decir, desde la uretra hasta los riones, la va menos usual es la hematgena, a partir de focos spticos a distancia o infecciones generalizadas, los microorganismos que ms frecuentemente utilizan esta va son Staphylococcus aureus y Mycobacterium tuberculosis. El agente etiolgico ms frecuentemente aislado en infecciones urinarias es Escherichia coli, ocasionalmente, se pueden aislar microorganismos Gram positivo de los gneros Staphylococcus y Streptococcus, los cuales son significativos solo si se correlacionan con un contaje alto y un crecimiento pur o del microorganismo. Existen discrepancias acerca de la necesidad o no de evaluar cultivos de orina durante la terapia anti microbiana, algunos autores argumentan que se hace necesario repetir un cultivo de orina de 48-72 horas despus iniciars e la terapia, con el objeto de evaluar la respuesta al tratamiento y justificar su uso por varios das ms, hasta completar un tratamiento efectivo; es importante destacar que estos cultivos debern ser negativos y que la presencia o ausencia de piuria, no es un indice relativo de la enfermedad. La bacteriuria positiva durante el tratamiento generalmente se puede presentar por la aparicin de cepas

resistentes o que fueron sensibles inicialmente; por la reinfeccin de u n organismos resistente a la droga elegida; por insuficiencia renal lo que impide niveles adecuados del antibitico o por la elecc in inadecuada del antibitico. La recuperacin del agente etiolgico es positiva en un alto porcentaje ( 80%-95%), tanto en hombres como en mujeres, cuando la muestra ha sido recolectada correctamente, despus de haber lav ado los genitales externos y haber descargado los primeros mililitros de orina. 10 Tracto Genitourinario Muchas infecciones del tracto urinario como cistitis o pielonefritis, son causad as por patgenos oportunistas y estn relacionadas a contaminacin fecal de la uretra y a procedimientos mdicos como cateterizacin; esta tcnica no est muy indicada, excepto, que debe realizarse para confirmar un diagnstico de etiologa no muy claro o por razones teraputicas, ya que existe un alto riesgo de infeccin despus de la cateterizacin en lo pacientes sometidos a ella; por otro lado, es difcil diferenciar si los microorganismos aislados proceden de la c olonizacin uretral normal o son de origen urinario. La puncin suprapbica es uno de los mtodos ms seguros y simples que exis ten para obviar la contaminacin uretral o del introito, debe ser realizada por personal competente en pacientes donde no se ha establecido un diagnstico de infeccin a pesar de la sintomatologa o en los pacientes que se sospecha bacteri uria anaerbica. La mayora de las infecciones del tracto genital son transmitidas median te la actividad sexual y por lo tanto se denominan enfermedades de transmisin sexual (ETS). La mayora de la enfer medades bacterianas, si se descubren oportunamente, pueden tratarse de manera eficaz con antibiticos. El uso de preser vativos previene de una manera muy efectiva su transmisin. Neisseria gonorrhoeae es el microorganismo que d ebe investigarse prioritariamente en muestras procedentes del tracto genital, as como en cualquier exudado o lesin que presente en individuos con enfermedades de transmisin sexual. Si el paciente es homosexual, deben obtenerse muestras rectales y orofaringeas para cultivo, lo mismo que frotis directo para tincin de Gram. La presencia, en un frotis directo de secrecin uretral coloreado con G ram, de diplococos Gram negativos intra y extracelulares, es diagnstico de uretritis por N. gonorrhoeae en el hom bre, no as en la mujer en quien es necesario procesar el cultivo. La presencia de una descarga cervical en las muj eres a veces puede ser de gran ayuda en el diagnstico, pero un frotis directo coloreado con Gram obtenido de tal descarga no puede determinar la presencia o ausencia de N. gonorrhoeae por la gran cantidad de flora que puede observarse y por tanto los cultivos debern hacerse sin excepcin. En el caso de vaginitis inespecfica, la muestra tomada de fondo de sa

co vaginal, previa colocacin del especulo, resulta satisfactoria para el aislamiento de otros microorganismos difer entes que se involucran con mucha facilidad en este proceso infeccioso. Las muestras deben ser sembradas directamente sobre med ios de placas de agar Thayer Martin o VCN, agar sangre y agar chocolate que se incuban a 35-17C por 48 horas en atmsfe ra del 5 al 10% de CO 2 . Para el aislamiento de Gardnerella vaginalis deben sembrarse placas de agar sangre que s e incuban en CO 2 . 11 Tracto Genitourinario UROCULTIVO 1. MTODO DEL ASA CALIBRADA (MTODO SEMICUANTITATIVO) - Mezclar bien la orina. Esterilizar el Asa Calibrada (0.01 ml.) y dejar enfriar. Introducir el Asa Calibrada en posicin vertical en la orina para asegurar que la cantidad apropiada de muestra se adhiera a la misma. Colocar el Asa cargada con la muestra en la parte superior de la placa, repartir el inculo en lnea recta a todo lo largo del dimetro de la placa. Sin flamear ni introducir de nuevo el asa en la orina, practicar trazados en tod a la placa rayando a partir del trazo central para obtener colonias aisladas. Sin flamear, introducir nuevamente el asa verticalmente en la orina pa ra transferir otra asada a las placas restantes (se repite el procedimiento de los dos pasos anteriores). CONSIDERACIONES En nios menores de cinco aos, se recomienda utilizar el medio de GC p ara la recuperacin de cepas de H. influenzae, ya que en esta poblacin puede comportarse como patgeno. Ante s de descartar las placas se deben reincubar por 24 horas adicionales colocando la placa de MC a temperatura ambien te, y la de SH/GC en microaerofilia a 35C; esto se realiza con el fin de detectar crecimiento en muestras d e pacientes con tratamiento antimicrobiano y favorecer el desarrollo de bacterias cuya temperatura ptima de crecimiento es de 22-25 C (temperatura ambiente). Para el reporte de los resultados se deben utilizar los rangos especificados en la ta bla N 1. LECTURA DE UROCULTIVOS SEGN EL METODO DEL ASA CALIBRADA: 0,01 ml = volumen de orina que dispensa el Asa Calibrada. 0,01 ml x 100 = 1ml (FACTOR = 100) FD UFC ml UFC = / Ejemplos:

a) Si crece una colonia en cualquiera de los medios, equivale a 100 UFC/ml de o rina, ya que: ( ) 3 10 / 100 100 1 dilucin) de (Factor 100 contadas colonias / < = = ml UFC m l UFC Reportar: NEGATIVO.

12 Tracto Genitourinario b) Si crecen 200 colonias; 20 100 200 / = = ml UFC ) ( 5 4 10 10 orina de / 000 . ml UFC Reportar: Gnero: Especie: Contaje: 10.000 - 100.000 UFC/ml de orina. TABLA N 1 CRITERIOS PARA LA CUANTIFICACIN DE UROCULTIVOS SEGN EL MTODO DEL ASA CALIBRADA: Nmero de UFC Nmero de UFC/ml 1-10 < 10 3 (< 1000 = negativo) 10-100 10 3 -10 4 (1000-10000) 100-1000 10 4 -105 (10000-100000) > 1000 > 10 5 (>100000) 2. MTODO DE DILUCIN (MTODO CUANTITATIVO) - Mezclar bien la orina. Tomar dos placas de SH, dos de MC y una de GC y marcarlas orina puro (OP), 10 -2 y 10 -4 ; (como lo muestra el diagrama). Tomar con una pipeta 0,1 ml de la muestra y colocarlos en la placa marcada como OP. Tomar 0,1 ml de la muestra y colocarlos en 9,9 ml de SSF, esta es la dilucin 10 -2 ; mezclar bien y colocar 0,1 ml

de esta dilucin en las placas marcadas 10 -2 . Tomar 0,1 ml de la dilucin 10 -2 y colocarlos en 9,9 ml de SSF, esta es la dilucin 10 -4 , mezcla bien y colocar 0,1 ml de esta dilucin en las placas marcadas 10 -4 . Para el rayado de las placas, utilizar una esptula en L o la punta de una pipeta estril, hacer el rayado de mayor a menor dilucin Incubar las placas de SH y GC en microaerofilia y las de MC en aerobiosis a 35C d e 18 a 24 horas. 13 Tracto Genitourinario CRITERIOS PARA LA INTERPRETACIN DE UROCULTIVOS Situacin Conducta a seguir Cultivo puro en contaje 1000 UFC/ml Procesar Cultivo con dos microorganismos en contajes 10000 UFC/ml Procesar Cultivos puros de S. aureus, Candida sp., Salmonella sp., Haemophilus influenzae, y Gardnerella vaginalis en cualquier contaje Procesar Cultivo con dos o tres microorganismos en contajes de 1000-10000 UFC/ml Repetir la muestra haciendo nfasis en la asepsia. Si se obtienen resultados similares identificar Tres o ms microorganismos Se considera un urocultivo mal tomado o contaminado, excepto que el urocultivo provenga de pacientes con catter permanente (24 horas o ms), en este caso se procesa.

14 Tracto Genitourinario MTODO DEL ASA CALIBRADA (MTODO SEMICUANTITATIVO) O O O

Verifique los datos del paciente y mezcle bien la orina Esteriliza el asa calibrado y

espere que se enfre Introduzca el asa calibrada (0,01ml) verticalmente en la muestra de orina y verifique tomar el volumen correcto

O O O

Incube las placas: SH: 35C; 5-10% CO 2 ; 18-24h MC: 35C; aerobiosis; 18-24 h Realice un trazo central a todo lo largo de la placa en su parte central Realice los trazos laterales de la parte superior a la inferior de la placa

15 Tracto Genitourinario MTODO DE DILUCIN (MTODO CUANTITATIVO) 0,1 ml Mezclar bien la orina, transferir con una pipeta estril 0,1 ml de la muestra a una placa de SH marcada como orina pura (OP) y 0,1 ml a un tubo con 9,9 ml de SSF marcado como 10 -2 . O

0,1 ml 0,1 ml Mezcle bien el tubo con la dilucin 10 -2 y transfiera con una pipeta estril 0,1 ml a una placa de GC y a una de MC marcadas

como 10 -2 ; luego, transfiera 0,1 ml de la dilucin 10 -2 a un tubo con 9,9 ml de SSF marcado como 10 -4 . O

0,1 ml

0,1 ml 0,1 ml O Mezcle bien el tubo con la dilucin 10 -4 y transfiera con una pipeta estril 0,1 ml a una placa de SH y a una de MC marcadas como 10 -4 . 0,1 ml Las placas de SH y GC se incuban de 18 a 24 horas en microaerofilia y MC en aero biosis a 35C. 16 Tracto Genitourinario TRACTO GENITAL ALTO Este tracto comprende diferentes tipos de muestras tales como: material de tromp as de Falopio, ovarios, tero, etc., se deben investigar bacterias anaerbicas en este tipo de muestras. Muestra Realizar un frotis directo coloreado con Gram. Sembrar placas de SH, GC, VCN, MC, SB, SH y SHA, adems un CT.

Las placas de SH y GC se incuban en microaerofilia, MC, SB y CT en aerobiosis a 35C de 18-24 horas, mientras que SHA en anaerobiosis a 35C de 48-72 horas. El frotis directo de la muestra es importante ya que permite enviar al mdico un reporte presuntivo inicial acerca del proceso infeccioso del p aciente, ste se debe reportar, las formas de

reporte son las siguientes: DIRECTO NEGATIVO: Al examen microscpico directo coloreado con Gram no se observ morfologa bacteriana. DIRECTO POSITIVO: Al examen microscpico directo coloreado con Gram se observaron [bacteria s (especificando morfologa, afinidad tintorial, agrupacin y semicuantificacin), clulas (especificando tipo y sem icuantificacin), otros elementos (especificando cada uno y su semicuantificacin)]. En cuanto al cultivo, una vez identificados los diferentes microorganismos se de ben reportar de la siguiente manera: CULTIVO NEGATIVO: No se observo crecimiento bacteriano despus de 48 horas (especificar el tiempo si es mayor) de incubacion. CULTIVO POSITIVO: Gnero: Especie: Cantidad: (escasa, moderada, abundante) Antibiograma: 17 Tracto Genitourinario TRACTO GENITAL BAJO Este comprende muestras de secreciones vaginales, secreciones uretrales, espermo cultivos, etc., en este tipo de muestras no est recomendada la investigacin de bacterias anaerbicas. Muestra Realizar un frotis directo coloreado con Gram. Sembrar placas de SH, GC, VCN, MC y SB.

Las placas de SH ,GC y VCN se incuban en microaerofilia, MC y SB en aerobiosis a 35C de 18-24 horas. El frotis directo de la muestra es importante ya que permite enviar al mdico un reporte presuntivo inicial acerca del proceso infeccioso del paciente. SECRECIONES URETRALES: Los directos de secreciones uretrales procedentes de pacientes masculino s para la investigacin de Neisseria gonorrhoeae, se deben reportar de la siguiente manera: INFORME NEGATIVO: Al examen microscpico directo coloreado con Gram no se observaron diplo cocos gram negativos intra o extra

celulares. INFORME POSITIVO: Al examen microscpico directo coloreado con Gram se observaron diplococo s Gram negativos intra y/o extra celulares en cantidad (abundante, moderada o escasa).

Realizar un examen al fresco (solo en secreciones vaginales). 18 Tracto Genitourinario SECRECIONES VAGINALES: A las secreciones vaginales se les debe hacer un examen al fresco y un extendido coloreado con Gram. Para el examen al fresco, preparar una suspensin fuerte en 0,5 ml de SSF (0,85%), incubar a 37C por 30 minutos, esto se hace para favorecer la motilidad de Trichomonas vaginalis y facilitar su vi sualizacin. El reporte se debe realizar de la siguiente manera: EXAMEN AL FRESCO AL EXAMEN AL FRESCO SE OBSERVARON (Clulas epiteliales, leucocitos, clulas claves, bacterias, Trichomonas vaginalis, levaduras, etc.), especificar cantidad. DIRECTO COLOREADO CON GRAM AL EXAMEN MICROSCOPICO DIRECTO COLOREADO CON GRAM SE OBSERVARON. (Clulas epiteliales, polimorfonucleares, clulas claves, levaduras, bacterias [especificando morf ologa, afinidad tintorial y agrupacin], etc., especificando la cantidad). CULTIVO NEGATIVO: Si es negativo para los potencialmente patgenos investigados, reportar: FLORA VAGINAL NORMAL EN CANTIDAD (Abundante, moderada o escasa). CULTIVO POSITIVO: Si es positivo para los potencialmente patgenos investigados, reportar: Gnero: Especie: Cantidad: Antibiograma:

19 Tracto Genitourinario TRACTO GENITO URINARIO EJERCICIOS DE AUTOEVALUACIN 1. Investiga los siguientes trminos: -

- - - - Microbiota Litiasis renal Pielonefritis Puncin suprapbica Cistitis Bacteriuria Enfermedad inflamatoria plvica Vaginitis Uretritis inespecfica Vaginosis Uretritis gonoccica Vaginitis inespecfica Especulo Thayer-Martin Salpingitis Disuria 2. Qu criterios se deben tomar en cuenta para elegir el mtodo de urocultivo a util izar? 3. Por qu en un urocultivo las placas de SH y GC se incuban en atmsfera microaerofl ica?. 4. Por qu urocultivos con tres o ms microorganismos no se deben procesar en el lab oratorio? 5. Por que urocultivos puros con S. aureus, Candida sp., Salmonella sp ., Haemophilus influenzae, y Gardnerella vaginalis en cualquier contaje se procesan? 6. Cules seran las muestras de orina aptas para la investigacin de bacterias anaerbi cas? 7. Cmo sospechara de una tuberculosis renal y que pruebas realizara para comprobarl a en el laboratorio? 8. Cules son las bacterias que ms frecuentemente producen infecciones urinarias? 9. Si un paciente presenta un cuadro clnico de infecciones urinarias a repeticin y en los urocultivos no se asla ningn microorganismo, de que agentes bacterianos no convencionales sospec hara y como los detectara en el laboratorio? 10. Por qu se utilizan criterios en la interpretacin de un urocultivo y no se proce sa y reporta todo lo que crece en los medios de cultivo? 11. Mencione los agentes bacterianos productores de infecciones genitales no cultivables en el laboratorio de bacteriologa de rutina y las diferentes metodologas diagnsticas que se utilizan par a su deteccin. 20 Tracto Genitourinario Crecimiento en el cultivo Crecimiento en el cultivo CASOS CLNICOS 1. Mujer de 21 aos de edad que se present en el servicio mdico de la universidad refiriendo aumento de la frecuencia urinaria de dos das de evolucin, acompaada de urgencia urinaria y disuria. La orina adquiri un color rosado o sa nguinolento durante 12 horas aproximadamente. La paciente no tena antecedentes de infeccin de vas urinarias, pero haba iniciado su vida sexual activa recientemente y utilizaba diafragma y espermicida. La temperatura de ingreso fue de 37,5 C, frecuencia cardiaca de 105/minuto y presin arterial de 105/70 mmHg. A la exploracin fsica nicamente se encontr como dato anormal dolor leve a la palpacin profunda del rea suprapbica. Las pruebas de laboratorio indicaron una elevacin ligera de la cuenta leucocitaria 10.500/ml, con 66% de PMN. El nitrgeno ureico sanguneo, la creatinina, glucosa y electrolitos sricos se encontra

ron normales. El sedimento urinario contena leucocitos innumerables, eritrocitos en cantidad moderada y muchas bacter ias, sugestivo de infeccin de las vas urinarias. El cultivo revel el crecimiento en contaje de ms de 100.000 UFC/ml de orina de un bacilo Gram negativo que creci en MC. La paciente cur a los tres das de terapia con Trimet oprim-sulfametoxazole. - Que cuadro clnico present la paciente? - De que microorganismo(s) sospecha como productor(es) del cuadro clnico? - Qu factores predisponentes favorecieron la aparicin del cuadro? 2. Hombre de 67 aos de edad que present fiebre y choque a los tres das despus de haberse sometido a una reseccin transuretral de la glndula prosttica. Dos semanas antes el pacie nte haba presentado obstruccin urinaria con retencin secundaria al crecimiento de la glndula; el diagnst ico fue hiperplasia prosttica benigna. Fue necesaria la cateterizacin vesical. Al finalizar la ciruga, se dej u n catter vesical conectado a un sistema cerrado de drenaje. Dos das despus de la ciruga, el paciente present fie bre de 38C, al tercer da del postoperatorio mostr confusin y desorientacin, as com o temblores muy intensos; la temperatura fue de 39C, la frecuencia cardia ca de 120/minuto y la tensin arterial de 90/40 mmHg. A la exploracin fsica el paciente contest correctamente su nombre, pero se encontraba desorientado en tiem po y lugar. La exploracin de la regin cardiopulmonar y del abdomen fue norma l. Se encontr slo ligero dolor en el rea costovertebral del rin izquierdo. Las pruebas de laboratorio indicaron un hematocrito y hemoglobina normales, pero con elevacin de la cuenta leucocitaria de 18.000/ml con 85% de PMN. El nitrgeno ur eico sanguneo, la creatinina, la glucosa y los electrolitos sricos se hallaro n normales. 21 Tracto Genitourinario Frotis directo Crecimiento en el cultivo Se colect una muestra de orina a travs del catter mediante aguja y jer inga. El sedimento urinario contena leucocitos innumerables, algunos eritrocitos y numerosas bacterias, lo c ual indicaba una infeccin de vas urinarias. El urocultivo mostr crecimiento de ms de 100.000 UFC/ml de u n Gram negativo que creci en MC, confirmndose as el diagnstico de infeccin del tracto urinario. Se realiz u n hemocultivo y se aisl el mismo microorganismo. El paciente fue tratado con lquidos, cefalosporinas de t ercera generacin, gentamicina y tobramicina por va intravenosa, logrando recuperarse por completo, La mi sma cepa bacteriana se aisl de otros pacientes en el mismo hospital. - De que microorganismo(s) sospecha como productor(es) del cuadro clnico? - Qu factores predisponentes favorecieron la aparicin del cuadro? - Hubo compromiso renal? - Qu complicaciones sufri el paciente?

- A qu otras conclusiones se puede llegar en este caso? 3. Nio de 8 aos que, desde hace un mes, presenta enrojecimiento de la mucosa del glande y tumefaccin prepucial asociadas a la emisin de una secrecin puru lenta que mancha la ropa interior y que, en las ltimas 24 horas, muestra una coloracin verdosa. Simultneamente se viene quejando de escozor y ligeras molestias no relacionadas con la miccin. Se refieren dos procesos amigdalares en las seis ltimas semanas. A la exploracin se aprecia buen estado general, est febr il y existe una tumefaccin prepucial con eritema veteado de la mucosa del glande. La retraccin completa del prepucio permite la salida de una secrecin espesa y verdosa, alojada en el repliegue balanoprepucial. Un examen directo de la secrec in se puede apreciar en la fotografa, y el cultivo muestra crecimiento de colonias b eta hemolticas, mientras que, en las secreciones farngeas solo crece flora saprofita. El urocultivo es normal as como el sedimento en fresco de la orina, el hemograma y l a velocidad de sedimentacin. Los niveles iniciales de ASLO fueron de 492 U/ml con descenso en el control de convalescencia. Fue tratado con penicilina V durante 7 das aprecindose mejora desde el segundo y aparente curacin desde el cuart o. Cinco semanas ms tarde reaparece la tumefaccin y el exudado purulento e n el que vuelve a cultivarse el mismo microorganismos aislado anteriormente, el pacie nte es tratado con eritromicina durante 10 das, remite el proceso no prese ntado, posteriormente, recadas. - Que cuadro clnico present el paciente? - De que microorganismo sospecha como productor del cuadro clnico? 22 Tracto Respiratorio TRACTO RESPIRATORIO El tracto respiratorio superior comprende la cavidad oral, la nasofarin ge y la orofaringe. La gran cantidad de flora normal presente en la nariz, cavidad oral y faringe hace que los cultivos de tra cto respiratorio deben ser interpretados con mucha precaucin. El aislamiento de algunos patgenos potenciales como S. aureus, H. influenzae, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, algunos miembros de la familia Enter obacteriaceae; as como algunas especies de levaduras, no representan un papel importante en la etiolo ga infecciosa del tracto respiratorio superior (TRS), a menos que, su cantidad predomine sobre la flora normal, se presenten en cultivo puro o se encuentren en pacientes hospitalizados en muy malas condiciones generales o inmunosupr imidos que pueden ser colonizados fcilmente por estos microorganismos. Neisseria meningitidis, Streptococcus pyogenes y Corynebacterium diphtheriae, son los microorganismos que tienen verdadera relevancia en

las infecciones del TRS, an cuando se encuentren en portadores sanos. En pacientes hospitalizados, pacientes en coma o incapaces de recolectar muestra s adecuadas de esputo y en los cuales se sospecha de infecciones pleuropulmonares, producidas por micro organismos aerbicos y anaerbicos, las secreciones del tracto respiratorio inferior (TRI) se deben obtener por aspiracin transtraqueal percutnea, las muestras obtenidas de esta manera previenen la contaminacin con la flora orofarngea. Generalmente las muestras de esputo son recogidas inadecuadamente, presentndose e n la mayora de los casos contaminacin con la flora orofarngea, en estas muestras es muy difcil de terminar cual de los muchos patgenos potenciales aislados es el responsable de una infeccin pulmonar. El cul tivo rutinario para el diagnstico de una neumona bacteriana aguda representa un trabajo difcil, si la muestra no ha sido tomada adecuadamente. Un frotis directo de la muestra coloreado con Gram puede ser de gran ayuda, se dice que un a muestra es adecuada para cultivo, cuando se observan menos de 10 clulas epiteliales por campo y al menos igual o ma yor cantidad de polimorfonucleares con el objetivo de menor aumento. En algunos casos, la etiologa de una infeccin pulmonar podr ser determinada por una biopsia de pulmn obtenida por fibronoscpia, una toracocentesis, aspiracin de un absceso o empiema o biopsia abierta de pulmn.

23 Tracto Respiratorio TRACTO RESPIRATORIO INFERIOR ESPUTO A pesar que las infecciones del tracto respiratorio inferior son una causa importante de morbilidad y mortalidad, el diagnstico de estas infecciones es frecuentemente complicado debido a la contamin acin, durante su recoleccin, de las muestras con microorganismos del tracto respiratorio superior. Debido a que el tracto respiratorio superior puede ser colonizado por microorganismos potencialmente patgenos no involucrados en infecci ones del tracto respiratorio inferior, el laboratorio debe asegurar que la muestra que se procesa sea apropi ada. La muestra debe ser examinada microscpicamente para asegurar su calidad y en la bsqueda de microorgani smos asociados con una respuesta inflamatoria celular. Las muestras aceptables son: esputo, aspirado traqueal y transtraqueal, lavado b ronquial, bronquioalveolar, cepillado bronquial, biopsia bronquial y Aspirado pulmonar o biopsia de pulmn. Las muestras inaceptables son: saliva en lugar de esputo, esputos con 24 horas o ms de tomados e

hisopados. Es importante procesar la muestra lo ms rpidamente posible, ya que una demora en el procesamiento de 1 a 2 horas puede conducir a la prdida de microorganismos patgenos fastidiosos y a un sobrecrecimiento de bacilos Gram negativos. Todas las muestras de tracto respiratorio deben ser procesadas en cab inas de seguridad biolgica, o se debe utilizar mascarilla, para evitar riesgo de contaminacin por aerosoles. Las muestr as mediante un procedimiento invasivo se deben tratar como valiosas ya que, el procedimiento para su toma es un riesgo p ara el paciente, por lo que esta debe ser manejada y evaluada adecuadamente para evitar su repeticin. Cuando es solicit ado, se pueden investigar bacterias anaerbicas en muestras de cepillado bronquial protegido, siempre y cuand o las muestras se hayan tomado y transportado adecuadamente. Los aspirados/lavados bronquiales o cepillados no pr otegidos no son muestras aceptables para el cultivo de bacterias anaerbicas. Al analizar muestras del tracto respiratorio inferior, como esputo, es importante realizar un frotis. Este debe ser observado con objetivo de 10X, esta visualizacin permite verificar la c alidad del esputo, ya que una buena muestra posee una relacin de 2 clulas polimorfonucleares por cada clula epitelial , adems, permite detectar la presencia de estructuras fngicas u otras estructuras no convencionales. Se deben examinar como mnimo 10 campos microscpicos, haciendo especial nfasis, en aquellos con presencia de clulas polimorfonucleares. Posteriormente se debe observar la lmina con objetivo de 100X y semicuantificar las clulas epiteliales, pol imorfonucleares y los microorganismos como: escasos, moderados y abundantes. 24 Tracto Respiratorio CLASIFICACION DE MUESTRAS DE ESPUTO Clulas por campo microscpico* Grupo Leucocitos Celulas epiteliales planas 6 <25 <25 5 >25 <10 4 >25 10-25 3 >25 >25 2 10-25 >25 1 <10 >25 Grupos 4, 5 y 6 aptos para cultivo. *Aumento de 100 (objetivo 10x) Criterios para la Interpretacin y el Reporte del Frotis Directo de Esputo - Microorganismo predominante: si se observa predominio de un microorganismo en r eas de inflamacin, este se debe semicuantificar y reportar, si adems se observan otras bacterias, se deben semicuantificar y reportar conjuntamente como y morfotipos bacterianos mixtos. Microorganismos no predominantes: semicuantificar y reportar morfotipos bacterian os mixtos. Si no se observan microorganismos: reportar no se observaron microorganismos.

Estructuras fngicas y clulas de levadura: semicuantificar y reportar hifas presentes; si es posible describir la apariencia de las hifas (segmentadas, pseudomicelio, etc.). No semicuantificar y reportar levaduras separadamente, a menos que sean el microorganismo predominante o estn presentes en cantidad abundante. Cuando una muestra de esputo es apta para cultivo se debe sembrar en placas de Realizar un frotis directo coloreado con Gram. Sembrar placas de SC, GC, MC, SB y SCK.

Muestra 25 Tracto Respiratorio Las placas de SC y GC se incuban en microaerofilia, MC y SB en aerobiosis a 35C d e 18-24 horas; mientras que la placa de SCK se incuba a 35C en anaerobiosis por 24 horas. Despus del perodo de incubacin se procede a la interpretacin de los probables patgenos Patgenos Probables en muestras de esputo Un patgeno probable (PP) se puede definir como todo microorganismo que ha sido asociado con infecciones del tracto respiratorio inferior. Estos incluyen, patgenos adquiridos en el hospital, tales como miembros de la familia Enterobacteriaceae, Ps. aeruginosa, otros bacilos Gram negativos y hongo s, as como patgenos adquiridos en la comunidad como por ejemplo: S. pneumoniae y H. influenzae, entre otros. Criterios de interpretacin: - Si al interpretar un cultivo, no hay PP presentes, reportar: aislamientos consi stentes con microorganismos presentes en el tracto respiratorio superior. Si uno o dos PP estn presentes; semicuantificar, identificar y realizar pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos (PSA) a cada PP; adems se debe reportar y cuantificar la flora no rmal. Si ms de dos PP estn presentes; semicuantificar, identificar y practicar PSA en lo s dos PP predominantes. Si no hay PP predominantes, semicuantificar y reportar descriptivamente; adems, se debe reportar y semicuantificar la flora normal. Si crecen ms PP que flora normal; cuantificar, identificar y realizar PSA de los PP que crecen en cantidad de moderada a abundante; adems se deben reportar descriptivamente los P P que crecen en cantidad

escasa; reportar y cuantificar la flora normal. Cultivo puro de un microorganismo que forma parte de la flora normal; semicuanti ficar, identificar y reportar. Si no se aslan microorganismos despus de cultivos repetidos, en presenci a de clulas inflamatorias, se debe sospechar de patgenos poco frecuentes como Actinomyces, hongos, virus, Ricke ttsiae, Chlamydia y Mycoplasmas. El reporte del cultivo se realiza de la siguiente manera: CULTIVO NEGATIVO: Si es negativo para los potencialmente patgenos investigados, reportar: FLORA NORMAL DE OROFARINGE EN CANTIDAD (Abundante, moderada o escasa).

26 Tracto Respiratorio CULTIVO POSITIVO: Si es positivo para los potencialmente patgenos investigados, reportar: Gnero: Especie: Cantidad: Antibiograma: ASPIRADO/LAVADO BRONQUIAL, CEPILLADO BRONQUIAL PROTEGIDO Y SECRECIN TRANSTRAQUEAL Sembrar en: Sembrar placas de SH, GC, MC, SB y SHA y SAC, adems de .un CT Realizar un frotis directo coloreado con Gram.

Muestra Las placas de SH y GC se incuban en microaerofilia, MC y SB en aerobiosis a 35C d e 18-24 horas; mientras que la placa de SHA y SHAK se incuba a 35C en anaerobiosis por 48 horas. Despus del perodo de incubacin se procede a la interpretacin de los probables patgenos. Criterios de Interpretacin de Probables Patgenos en muestras de aspirado/ lavado bronquial y cepillado bronquial protegido - Si hay PP presentes, semicuantificar e identificar todos los PP, sin importar la cantidad y realizar PSA a los dos PP predominantes o con crecimiento de moderado a abundante. -

Si hay cultivo puro de un microorganismo de la flora normal identificar. Crecimiento de mltiples tipos de microorganismos, reportar microorganismos mltiples , indicativo de flora normal de tracto respiratorio superior.

27 Tracto Respiratorio SECRECION TRAQUEAL Y ENDOTRAQUEAL: Sembrar en: Realizar un frotis directo coloreado con Gram. Sembrar placas de SH, GC, MC, SB y un tubo de CT

Muestra En este tipo de muestras no se investigan bacterias anaerbicas ya que la contamin acin con flora orofaringea es frecuente, para su interpretacin se utilizan los criterios de muestras contaminadas con flora de orofaringe como en el caso de esputo. LIQUIDO PLEURAL: Los aspectos relacionados al procesamiento de liquido pleural sern trata dos en la seccin de Lquidos Orgnicos Estriles. TRACTO RESPIRATORIO SUPERIOR EXUDADO FARINGEO, NASOFARINGEO Y EXUDADO/SECRECIN NASAL*: Sembrar en:

Sembrar placas de SC, GC, MC, SB, SCK y Leffler**.

* Realizar un frotis directo coloreado con Gram a fin de determinar la importan cia clnica de asilamientos de Moraxella catharralis. Muestra ** Incluir en muestras de Exudados Farngeos y Nasofarngeos de nios menores de 12 aos . 28 Tracto Respiratorio El reporte del cultivo se realiza de la siguiente manera:

CULTIVO NEGATIVO: Si es negativo para los potencialmente patgenos investigados, reportar: FLORA OROFARINGEA (NASOFARINGEA O NASAL) NORMAL EN CANTIDAD (ABUNDANTE, MODERADA O ESCASA). CULTIVO POSITIVO: Si es positivo para los potencialmente patgenos investigados, reportar: Gnero: Especie: Cantidad: Antibiograma: 29 Tracto Respiratorio TRACTO RESPIRATORIO EJERCICIOS DE AUTOEVALUACIN 1. Investiga los siguientes trminos: - - - - - - - - Infeccin pleuropulmonar Absceso Aspirado transtraqueal percutneo Empiema Fibronoscopa Morfotipos Toracocentesis Hifas Pseudomicelio Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crnica (EPOC) Rinorrea Leucocitosis Disnea Diaforsis Anorexia Tonsilitis 2. De todas las muestras que se pueden obtener a partir del tracto respiratorio inferior, mencione las que son aptas para la investigacin de bacterias anaerbicas 3. Por qu se utiliza sangre de carnero en el procesamiento de las muestras de tra cto respiratorio? 4. En el caso de un exudado nasal con Moraxella catharralis por qu es importante la realizacin del frotis directo? 5. Por qu en las muestras susceptibles de contaminacin con flora orofarng ea se utilizan los criterios de interpretacin de probables patgenos? 6. Qu ventajas ofrece la realizacin de un frotis a partir de muestras de esputo an tes de su cultivo? 7. Cules son los microorganismos ms frecuentemente implicados en infecciones del t racto respiratorio? 8. Qu microorganismos de difcil diagnstico producen infecciones en el trac to respiratorio y cuales son las metodologas que se emplean en su diagnstico? CASOS CLNICOS 1. Hombre de 35 aos que llego a la emergencia a causa de fiebre y dolor en el he

mitrax izquierdo al momento de toser. Cinco das antes, haba iniciado un cuadro con signos de infeccin respiratoria superior de origen viral con irritacin farngea, rinorrea y aumento de la tos. Un da antes de presentarse al hosp ital, el paciente comenz con dolor torcico izquierdo al momento de toser o al respirar profundamente ; 12 horas antes de su ingreso se despert con escalofros intensos y diaforsis. El interrogatorio ms detallado revel que el paciente sola beber cantidades de moderadas a muy abundantes de alcohol, y fumaba una caj etilla de cigarros diariamente desde 30 Tracto Respiratorio Frotis directo de la muestra Crecimiento en el cultivo haca 17 aos aproximadamente. El paciente trabajaba como mecnico reparador de automviles; tena antecedentes de dos hospitalizaciones previas, haca cuatro aos debido a un sndrome de abstinencia alcohlica y dos aos atrs debido a bronquitis aguda. Al momento del ingreso present una temper atura de 39C, frecuencia cardiaca de 130/minuto y tensin arterial de 120/80 mmHg. Durante la exploracin fsic a se encontr a un individuo con un sobrepeso ligero, con tos constante y que oprima su trax izquierdo co n cada acceso de tos. La tos era productiva, con un esputo no muy viscoso de color amarillo rojizo (herrumbroso). La exploracin del trax mostr un diafragma con movimientos normales; a la percusin se encontr matidez del campo pulmona r izquierdo en su regin lateral posterior, dato sugestivo de un sndrome d e consolidacin pulmonar. Los ruidos respiratorios (bronquiales) se auscultar on en la misma regin de la matidez junto a estertores crepitantes secos, com patibles con una consolidacin pulmonar y presencia de moco viscoso en la va area. El resto de la exploracin fsica fue normal. Las placas radiolgicas del trax revelaron una consolidacin densa del lbulo basal izquierdo correspondiente a una neumona bacteriana. El hematocrito fue del 45%; la cuenta leucocita ria fue de 16.000/ml con 80% de clulas PMN y una cuenta total de PMN de 12.800/ml, 12% de linfocitos y 8% de monocitos. La qumica sangunea incluyendo electrolitos sricos result normal. El esputo era espeso, de color amaril lento a rojizo, de aspecto purulento. La tincin de Gram del esputo revel la presencia de muchas clulas PMN y bacterias, el cultivo revel el crecimiento de colonias alfahemolticas, se realizaron hemocultivos y se aisl el mismo microorganismo. Se inici terapia antimicrobiana con penicilina G por va parenteral y la administracin de lquidos intravenosos, a las 48 horas, la temperatura del paciente se normaliz y el paciente comenz a toser arrojando grandes cantidades de esputo purulento. El rgimen con penicilina se continuo durante siete das, al realizar el seguimiento del paciente, a las cuatro semanas desde su ingreso al hospital, se observ la remisin total de la consolidacin pulmonar. - De que microorganismo sospecha como productor del cuadro clnico?

- Qu factores predisponentes favorecieron la aparicin del cuadro? - Qu otras complicaciones sufri el paciente? - Si despus de aplicar el tratamiento el paciente no mejora, a que puede deberse e sto?

31 Tracto Respiratorio 2. Paciente de 76 aos de edad, varn, con criterios de EPOC desde hace 10 aos y en tratamiento con esteroides sistmicos e inhalados desde hace 7. Actualmente presenta disnea de pequeos esfuerzos. Desde hace 13 das presenta fiebre (38C) y empeoramiento de su funcin respiratoria (disnea en reposo) con tos productiva purulenta que no mejora con el tratamiento antibitico que habitualmente utiliza para las exacerbaciones infecciosas de su proceso respiratorio (ciprofloxacina 750 mg/12 horas). Los anlisis de sangre muestran leucocitosis con desviacin izquierda y en la radiografa de trax se aprecian infiltrados difusos que son difciles de evaluar ya que probablemente se apreciaban en radiografas previas. Se obtuvieron esputos para examen microscpico directo y cultivo. En la fotografa se muestra l a tincin de Gram del esputo. - De que microorganismo sospecha como productor del cuadro clnico? Es este microorganismo frecuente produciendo enfermedad respiratoria? Indique las metodologas diagnsticas que se utilizan para su deteccin e identificacin . 3. Una nia de 3 aos visita el hospital presentando anorexia, molestia en la garga nta, y malestar general. El examen fsico revela una membrana gris extensa que recubre las amgdalas, la vula, el palada r blando y las paredes de la faringe, los intentos por remover la membrana produjeron sangrado, la madre indica que la nia no ha recibido ninguna de las inmunizaciones obligatorias para su edad. - Cul sera el diagnstico ms acertado? Mononucleosis infecciosa Tonsilitis herptica Difteria Tonsilitis estreptoccica Asumiendo que el microorganismo es no hemoltico en placas de AS, cual sera el agent e etiolgico? Cul seria el tratamiento ms adecuado en este caso? Qu muestra se tomara para el diagnstico? Describa la metodologa diagnstica para su aislamiento e identificacin.

32 Tracto Gastrointestinal TRACTO GASTROINTESTINAL La alta incidencia de los procesos infecciosos entricos en la poblacin general, ju nto con sus elevados ndices de morbi-mortalidad entre determinados grupos etarios (nios y ancianos) hace n que este tipo de patologa constituya un motivo de especial inters, tanto desde el punto de vista clnico como m icrobiolgico. El nmero de microorganismos implicados en cuadros entricos se ha ampliado durante los ltimos aos deb ido, entre otros factores, al mejor conocimiento de la clasificacin taxonmica de los diferentes agentes etiolgicos y al desarrollo de mtodos diagnsticos cada vez ms sensibles. La aparicin de agentes infecciosos que en antao eran raros o casi desconocidos en nuestro entorno, se ha visto favorecida por la mayor frecuencia de viajes int ercontinentales y el aumento de los movimientos migracionales. Finalmente, el incremento del nmero de pacientes inmunocom prometidos (SIDA y tratamientos inmunosupresores) ha supuesto un elemento de importancia capital en rel acin con este grupo de enfermedades infecciosas. Ante la sospecha de un cuadro de infeccin gastrointestinal debe hacerse una detal lada historia clnica y un correcto estudio microbiolgico. Los antecedentes epidemiolgicos (edad, historia reciente de viajes, aparicin espordica o como parte de un brote, tipo de alimento sospechoso, perodo de incubacin), l a existencia de factores predisponentes (inmunosupresin), la presencia de signos y sntomas clnicos (fiebre, dolor abdominal, manifestacin de nauseas y vmitos) y el tipo de diarrea (acuosa, mucosa o sanguinolenta) pueden orientar ace rca del microorganismo implicado. No obstante, el diagnstico definitivo clnicamente se puede obtener mediante pruebas d e laboratorio COPROCULTIVO Las muestras de heces o de hisopados rectales se siembran en:

Sembrar placas de CBM, TCBS, SSA, XLD, MC y ANG. Sembrar adems los siguientes caldos de enriquecimiento Cthio, APA y Selenito.

Incubar las placas de 18 a 24 horas a 35C en aerobiosis, el caldo s elenito y el APA se incuban en las mismas condiciones pero de 6 a 12 horas, mientras que, la placa de CBM se incuba por 48 horas a 42C en atmsfera microaeroflica, el Cthio se incuba a 4C por 24 horas. Una vez incubado s, los caldos de enriquecimiento se repican a placas, de la siguiente manera: 33 Tracto Gastrointestinal

Repicar en placas de MC, SSA y XLD Caldo Selenito

Repicar en placas de TCBS y ANG Agua Peptonada Alcalina

Repicar en CBM

Campy-Thio

CULTIVO NEGATIVO: Si no se aslan enteropatgenos, reportar: NO SE AISLARON BACTERIAS ENTEROPATGENAS CULTIVO POSITIVO: Si se asla algn enteropatgeno, reportar: Gnero: Especie: Antibiograma: Grupo Serolgico (si es el caso)

34 Tracto Gastrointestinal ESCHERICHIA COLI PRODUCTORA DE DIARREA Escherichia coli es un bacilo Gram negativo que pertenece a la famili a Enterobacteriaceae; coloniza el tracto gastrointestinal de los nios durante las primeras horas de su vida y permanece co nfinada al lumen intestinal sin causar ningn tipo de dao; sin embargo, en hospedadores debilitados e inmunocomp rometidos o cuando las barreras intestinales son violadas, an las cepas de la flora normal no patgenas pueden causar infeccin. Por otra parte, existen clones altamente adaptados de E. coli que son capaces de causar infeccin an en los hospedadores ms resistentes, estos clones han evolucionado y adquirido ciertos determinantes de patogenicidad que le dan la capacidad de causar un gran nmero de infecciones en el hombre. Las infecciones producidas en el humano por E. coli estn limitadas a las superficies mucosas (infecciones urinarias y entricas) o se pueden disem inar a travs del organismo provocando cuadros sistmicos (sepsis/meningitis). Generalmente tres sndromes clnicos es

tn asociados a la infeccin por cepas patgenas de E. coli: a) infecciones del ngitis; c) enfermedad entrica/diarrea. De infecciones, las del tracto urinario son ue en algn punto de sus vidas al menos el 12% de los hombres y del 10-20% de las mujeres ntomtica.

tracto urinario; b) sepsis/meni estas las ms frecuentes, encontrndose q experimentan bacteriuria aguda si

Existen algunas cepas de E. coli capaces de producir cuadros diarreico s; la clasificacin de estas categoras enteropatgenas se hace en base a su mecanismo de patogenicidad. En la actualidad existen seis categoras enteropatgenas: E. coli enteropatognica (ECEP), E. coli enterohemorrgica (ECEH), E. coli enteroagregativa (ECEA); E. coli enteroinvasiva (ECEI), E. coli enterotoxignica (ECET) y E. coli enteroadherente difusa (ECAD). Para causar infeccin, E. coli sigue la misma estrategia de infeccin utilizada por l a mayora de los patgenos que atacan las mucosas: a) colonizacin de las mucosas, b) evasin de las defensas del hospedador, c) multiplicacin y d) dao al hospedador. Las caractersticas ms resaltantes de las cepas de E. coli q ue causan diarrea es la colonizacin de la superficie de la mucosa intestinal a pesar de los movimientos peristlticos y de l a competencia por los nutrientes con las bacterias de la flora normal (incluyendo otras cepas de E. coli). La presencia de fimbrias de adherencia a las superficies es virtualmente una car acterstica de todas las cepas de E. coli, incluyendo las variedades no patgenas; sin embargo, las cepas de E. coli pr oductoras de diarrea poseen antgenos fimbriales especficos que potencian su capacidad de colonizar el intesti no y le permiten adherirse a la mucosa del intestino delgado, un sitio que en condiciones normales no es colonizado. Otro a specto importante en la patogenicidad de E. coli es su versatilidad gentica. Esta versatilidad es conferida por dos config uraciones genticas: plsmidos con genes de virulencia e islas de patogenicidad cromosmica. Las seis categoras en teropatgenas de E. coli han demostrado poseer al menos una propiedad relacionada con virulencia unida a un p lsmido. Las cepas de ECEI, ECEP, ECEH y ECEA generalmente poseen familias de plsmidos altamente conservadas que codifican mltiples factores de virulencia. Las implicaciones epidemiolgicas y los estudios realizados en voluntarios a principio de la dcada de los 50 establecieron el papel patgeno de los serogrupos clsicos de E. coli com o causa de diarrea, especialmente los 35 Tracto Gastrointestinal serogrupos O55, O111 y O127. Una vez establecido el papel patgeno de ECEP su deteccin e identificacin se bas nicamente en el serotipo O:H. Actualmente, ECEP se detecta e identifica en base a su mecanismo de patogenicidad y no por su serologa. ECEP se define como toda cepa de E. coli capaz de producir el fenmeno de adhesin/destruccin (attaching/effacing) y que no produce la toxina Shiga (Stx). La caracterstica ms importante de la infeccin por ECEP es el fenmeno his topatolgico de attaching/effacing

(A/E) que se observa en muestras de biopsia intestinal de pacientes y animales i nfectados. Este fenmeno se caracteriza por una destruccin de las microvellosidades y adherencia ntima entre las bacterias y la membrana de las clulas epiteliales. Esta adherencia incluye cambios marcados a nivel del citoe squeleto de la clula intestinal y acumulacin de actina polimerizada que se sita en una estructura en forma de pedestal, esta se p uede extender hasta 10m hacia fuera de la clula epitelial en estructuras semejantes a pseudpodos. Otra categora importante de E. coli asociada a la produccin de diarreas es ECET, este patgeno se hizo importante a finales de la dcada de los 60 y principios de los 70, principalmente por los trabajos desarrollados por Gorbach y Sack en Calcuta. ECET ha demostrado ser una causa important e de diarrea en pases poco desarrollados, atacando principalmente a nios; adems, ECET es el agente etiolgico ms frecuentemente implicado en la diarrea del viajero, mientras que la diarrea por ECET en Estados Unidos y otros pases desarrollados es rara, presentndose solo brotes ocasionales. La infeccin por ECET es adquirida por la ingestin d e agua y alimentos contaminados, la bacteria coloniza el extremo proximal del intestino delgado, sitio crtico para la interacc in hospedador-parsito, donde la bacteria elabora sus toxinas: enterotoxina termolbil (LT) y enterotoxina termoesta ble (ST). La diarrea se presenta con las siguientes caractersticas clnicas: diarrea acuosa, nuseas, dolor abdominal y fiebre de bajo grado. Las cepas de ECET pueden producir una de las dos toxinas o ambas a la vez. En 1971, DuPont y col. describieron ciertas cepas de E. coli que causaban una di arrea del tipo disentera invasiva en voluntarios, estas cepas de serotipos distintos a los de ECEP y E CET eran muy similares a Shigella en muchos aspectos: eran no mtiles, no fermentaban la lactosa y los antgenos O mos traban reacciones cruzadas con los de Shigella y su caracterstica patognica principal era la de invadir y pro liferar dentro de las clulas epiteliales y causar eventual muerte de esta, esta nueva categora se denomin ECEI. ECEI tiene predilecc in por la mucosa del colon como sitio favorito para la interaccin hospedador-parsito. Clnicamente la enferm edad est caracterizada por fiebre, dolor abdominal severo, malestar, toxemia y diarrea acuosa seguida por una d isentera severa con grandes cantidades de heces con sangre y moco, una coloracin del moco fecal revela una gran cantidad de polimorfonucleares (PMN). El esquema preciso de patogenicidad de ECEI hasta ahora no ha sido eluci dado. Estudios de la patognesis de ECEI sugieren que sus caractersticas patognicas son virtualmente idnticas a las de Shigella sp., ambos microorganismos han demostrado invadir el epitelio del colon y elaboran una o ms enterotoxinas se cretoras que pueden jugar roles en la patognesis de la diarrea. 36 Tracto Gastrointestinal El modelo actual de patognesis de Shigella sp. y ECEI comprende: a) penetracin de la clula epitelial, b) lisis de la vacuola endoctica, c) multiplicacin intracelular, d) movimiento a travs

del citoplasma y e) extensin a las clulas adyacentes, cuando la infeccin es severa, esta secuencia de eventos produce una f uerte reaccin inflamatoria la cual se manifiesta por la formacin de lceras a nivel de la mucosa intestinal. ECEI produce principalmente brotes epidmicos, los casos espordicos son pocos debido quizs a mal diagnstico de laboratorio, posibl emente las cepas de ECEI sean mal identificadas como Shigella sp. o como cepas de E. coli de la flora normal. Las epidemias documentadas de ECEI usualmente tienen origen en agua o alimentos contaminados, la incidenci a de este microorganismo en pases desarrollados es baja, pero se presentan ocasionalmente epidemias de origen alim entario, los casos espordicos ocurren en algunas reas, generalmente, donde Shigella tambin es prevalente, la transmisin p ersona-persona tambin ha sido documentada. El reconocimiento de una nueva categora enteropatognica de Escherichia co li (ECEH) result de dos observaciones epidemiolgicas claves, la primera fue reportada por Riley y col. en 1983 quien investig dos epidemias de una enfermedad gastrointestinal distintiva, caracterizada por un severo dolor abdominal, diarrea acuosa seguida por diarrea con sangre y en ocasiones fiebre de bajo grado. Esta enfermed ad denominada colitis hemorrgica (HC) estuvo asociada con la ingestin de hamburguesas poco cocidas en una cadena de restaurantes de comida rpida. En los coprocultivos de estos pacientes se aisl un serotipo de E. coli raramente aislado con anterioridad O157:H7. La segunda observacin clave fue hecha por Karmali, tambin en 1983, quien report la asociacin de casos espordicos de sndrome urmico hemoltico (HUS) con citotoxina fecal y cepas de E. coli productoras de citotoxina en las heces. El HUS es definido por la trada de falla renal aguda, trombocitopenia y anemia hemolt ica microangioptica. Este sndrome est precedido tpicamente por una diarrea hemorrgica indistinguible de la HC; de esta manera dos observaciones microbiolgicas, una basada en un serotipo raro de E. coli y otra basada en la pr oduccin de una citotoxina especfica, condujo al reconocimiento de una nueva e importante clase de patgeno e ntrico que causa enfermedad intestinal y renal. La aparicin sbita de casos producidos por ECEH O157:H7 llevaron a que se le denominara patgeno emergente y surgi la pregunta de si este microorganismo siempre estuvo presente y simplemente no se diagnostic como ocurri con Legionella sp. o es verdaderamente un patgeno nuevo. Despus que E. coli O157:H7 fue reconocida como causa de HC y HUS el centro para l a prevencin y el control de enfermedades (CDC) en Atlanta, revis ms de 3.000 cepas de E. coli serotipiadas ent re 1973 y 1983, encontrando que solo un aislado perteneca al serotipo O157:H7. El laboratorio de salud pblica del Reino Unido tambin encontr un solo aislamiento de O157:H7 entre 15.000 cepas de E. coli serotipiadas entr e 1978 y 1982, mientras que el laboratorio del centro para el control de enfermedades en Canad encontr 6 cepas de O157:H7 entre 2 .000 aislamientos de pacientes con diarrea entre 1978 y 1982. Lo anterior demuestra que la presencia de cepas d e E. coli O157:H7 se ha incrementado

37 Tracto Gastrointestinal verdaderamente en aos recientes y no que fue mal identificada antes de 1982. Sin embargo, el HUS es una entidad clnica bien reconocida desde antes de 1982. ESQUEMA DE IDENTIFICACIN DE ESCHERICHIA COLI PRODUCTORAS DE DIARREA Muestra de Heces Mc I M ANp Tomar de 5 a 10 colonias fermentadoras de la lactosa

Serologa de ECEP-ECET (-) Descartar (+) Serologa Individual ECEP Titulacin Adherencia a clulas Hep-2 Bioqumica ECET Hibridacin Elisa RPLA Bioqumica ANp

I (+) M (+)

38 Tracto Gastrointestinal

ESQUEMA DE IDENTIFICACIN DE ESCHERICHIA COLI PRODUCTORAS DE DIARREA (CONT....) Lisina (+) Descartar (-) Serologa de ECEI

ANp I (+) M (-) ECEI Invasin a clulas Hep-2 Bioqumica ECEH Muestra de Heces McS I S ANp Tomar de 5 a 10 colonias no fermentadoras del Sorbitol

(-) Descartar Serologa de ECEH O157:H7 (+) Inmovilizacin H7 Toxicidad en clulas VERO Pruebas bioqumicas

ANp I (+) S (-)

39

Tracto Gastrointestinal TRACTO GASTROINTESTINAL EJERCICIOS DE AUTOEVALUACIN 1. Investiga los siguientes trminos: - - - - - - - Sepsis Movimientos peristlticos Meningitis Plsmido Transposn Bacterifago Toxemia Vacuola endoctica Citotoxina Anemia hemoltica microangioptica Trombocitopenia Colitis hemorrgica Patgeno emergente Sndrome urmico hemoltico 2. Mencione los enteropatgenos ms frecuentemente involucrados en cuadros gastroin testinales. 3. Cules son los microorganismos capaces de producir intoxicacin alimentar ia y cual es la metodologa que se utiliza para su deteccin y diagnstico? 4. Indique el brevemente el mecanismo de patogenicidad de los enteropatgenos ms frecuentemente involucrados en cuadros diarreicos. CASOS CLNICOS 1. Paciente de 45 aos que refiere desde hace 10 aos cuadros de dolor epigstrico tpicamente ulceroso de aparicin ocasional, unas 3-4 veces al ao. Varios estudios radiolgicos con contraste demostraron la presencia de una lesin ulcerosa duodenal con deformacin bulbar. En la actualidad consulta por un nuevo brote de dolor acompaado por nauseas y vmitos de contenido alimentario. En la exploracin no se encuentra ningn hallazgo de inters excepto un discreto dolor a la palpacin en epigastrio. La analtica fue normal y en el estudio radiolgico no se aprecian cambios con respecto a radiografas previas. Se realiz una endoscopia digestiva alta, tomando muestras de biopsia de antro. Se realiz tincin de Gram de una de dich as biopsias, mostrndose en la fotografa el resultado de la misma, se observaron bacilos Gram negativos curvos. Se realiz adems una prueba de ureasa rpida de dicha muestra, que result positiva. Directo de la muestra 40 Tracto Gastrointestinal A B C Crecimiento en SSA Crecimiento en XLD - De qu microorganismo sospecha como productor del cuadro clnico? - Qu otras pruebas de laboratorio realizara para confirmar el diagnstico? - Cul es el mecanismo de patogenicidad, mecanismo de transmisin y la epi

demiologa de este microorganismo? 2. Cuatro miembros de una familia de granjeros emigrantes ingresaron a l hospital a causa de diarrea y fiebre, las cuales se haban iniciado de 6 a 12 horas previas a la admisin. El padre de la familia tena 28 aos de edad, la madre 24 y los nios seis y cuatro aos. El da anterior la familia haba ingerido en una comida ensalada mixta de vegetales verdes, carne picada, frijoles y tortillas preparadas por otr a persona del campamento. Otro nio de la familia de ocho meses de edad, no haba con sumido estos alimentos y no present la enfermedad. Aproximadamente 24 horas de spus de la comida, los nios presentaron retortijones abdominales, fiebre y diarrea acu osa. Estos sntomas persistieron durante 12 horas previas al ingreso y en ambos nios la diarrea se volvi sanguinolenta. Los padres de los nios presentaron sntoma s similares 6 y 8 horas previas, pero no evacuaron heces con sangre vi sible. Los padres refirieron que muchas otras personas del campamento tambin desarrollaron una enfermedad similar durante las dos semanas anteriores. Las medidas de higien e y de saneamiento del campamento eran precarias. A la exploracin fsica presentaron temperaturas de 39 a 39,5C y sus padres de 38C. Todos desarrollaron taquicardia y su aspecto era evidentemente de enfermedad aguda. Ambos nios parecan deshidratados. Las cuentas leucocitarias variaron desde 12.000 hasta 16.000/ml, con 55 a 76% de clulas PMN. En el examen de materia fecal en fresco se identificaron mltiples leucocitos. Las heces de los nios macroscpicamente contenan sangre y moco. Se realizaron coprocultivos obtenindose crecimiento en las placas de MC, SSA y XLD. Ambos nios se hospitalizaron para rehidratarlos con lquidos va intravenosa y administrarles ampicilina. Los padres se trataron de mane ra ambulatorio con lquidos orales y ciprofloxacina por va oral. Todos se r ecuperaron sin complicaciones. El departamento de salud pblica promovi la implantacin de mejores condiciones de saneamiento en el campamento. - De qu cuadro(s) clnico(s) sospecha? - Cul o cules serian los agentes etiolgicos? - Qu colonias seleccionara de cada medio de cultivo? - Por qu hay diferencias en el tratamiento de los padres con respecto a los nios? Crecimiento en MC 41 Tracto Gastrointestinal -

Cules seran las medidas a implementar en el campamento para mejorar las condiciones de saneamiento? 3. Un hombre de negocios de 50 aos de edad desarroll un cuadro diarreico 24 horas despus de haber llegado de Asia, present diarrea intensa, las heces eran acuosas tipo agua de arroz. El cult ivo revel rpido crecimiento de un cultivo casi puro en la superficie de un agar TCBS. - El probable diagnstico es? Fiebre tifoidea Clera Intoxicacin alimentaria por Staphylococcus aureus Shigelosis Amibiasis Asumiendo que un bacilo Gram negativo no motil se asla de las heces, el diagnstico probable sera? Fiebre tifoidea Clera Intoxicacin alimentaria por Staphylococcus aureus Shigelosis Amibiasis Asumiendo que la enfermedad fue adquirida por el consumo de huevos cru dos infectados, cul de los siguientes microorganismos sera el patgeno ms probable? Salmonella sp. Vibrio sp. Staphylococcus aureus Shigella sp. Entamoeba histolytica Asumiendo que el agente etiolgico sea Vibrio cholerae, cuales seran sus caracterstic as morfolgicas y de crecimiento en el laboratorio? Cul sera la terapia ms efectiva? 42 Lquidos Orgnicos Estriles LQUIDOS ORGNICOS ESTRILES Sangre (Hemocultivo) El pronto y seguro aislamiento e identificacin de microorganismos presentes en un proceso de septicemia es una de las funciones ms importantes de un laboratorio de microbiologa. Las indicaciones para obtener cultivos representativos de sangre estn relacionados con las condiciones clnicas d el paciente. Las bacteriemias continuas se presentan en endocarditis, fiebre tifoidea y brucellosis; mientras que las inter mitentes se presentan usualmente en otras infecciones. En cuadros donde se sospecha una endocarditis bacteriana p or ejemplo deben tomarse tres hemocultivos separadamente y en intervalos que no superen las 24 horas. Este procedimiento se r suficiente para recuperar el agente etiolgico. En bacteriemias intermitentes como las que se pueden presenta r en cuadros de infeccin urinaria, gastrointestinal o epiglotitis, tres cultivos de sangre colectados en u n perodo de 24 a 48 horas son usualmente suficientes para aislar del agente causal. Si el paciente ha recibido algn agente antimicrobiano antes de la toma de la mues tras deben tomarse un total de 4-

5 muestras de sangre separadamente en un tiempo no mayor de 48 horas. Las condic iones en la toma de la muestra de sangre deben ser aspticas, limpiando primero la zona de la piel con agua y jabn, a lcohol de 80-95% y aplicando luego una solucin de yodo al 2% en forma concntrica de adentro hacia afuera, alrededor d el sitio de la puncin. Esta solucin deber permanecer sobre la piel al menos un minuto para que ocurra una verdadera antisepsia. No deber tocarse la superficie de la piel con los dedos a menos que estos hayan sido desinfectados p reviamente. Se recomienda colectar de 5-10 ml de sangre en cada toma, pues un volumen menor reducir el porcentaje de re cuperacin de los microorganismos presentes en algunas bacteriemias. En neonatos y nios menores de 6 aos. La coleccin de 1-5 ml de sangre puede resultar satisfactoria y la sangre deber ser inoculada directamente sobre e l medio de cultivo, al lado del paciente, bien sea con jeringa estril o con un equipo de extraccin desechable. Una concentracin ptima de sangre en el medio de cultivo puede relacionarse en prop orcin del 10% de sangre por cantidad de medio de cultivo: para 50 ml de medio 5 ml de sangre son suficientes con el fin de reducir la actividad normal bactericida de los mediadores qumicos y celulares de la inmunidad. Cualquier efec to bactericida remanente, despus de diluir la sangre en el medio de cultivo puede ser abolido mediante la adicin de s ulfonato sdico de polianetol (SPS), el cual adems de ser anticoagulante posee actividad antifagoctica y anti-com plementaria. Los medios para hemocultivos que pueden obtenerse comercialmente son: Caldo de Tripticasa de Soya, Caldo Columbia, caldo de Infusin Cerebro Corazn o el tradicional medio de Ruiz-Castaeda que son satisfactorios cu ando son envasados bajo condiciones de vaco, con atmsfera de C0 2 y con un contenido adecuado de SPS y sacarosa. Algunos de estos medi os obtenidos comercialmente pueden ser tiles para el aislamiento de microorganismos a naerobios presentes en la sangre, como el Caldo Columbia preparado bajo condiciones anaerbicas. 43 Lquidos Orgnicos Estriles Cuando se quiere descartar la presencia de cualquier clase de microorg anismos aerbicos (Streptococcus spp., Enterobacterias), anaerbicos (Bacteroides spp., Fusobacterium spp.) o microorgani smos exigentes (Brucella spp., Listeria spp.) deben tomarse diferentes botellas de hemocultivo que provean las diferentes atmsferas necesarias segn los requerimientos de cada microorganismo que puedan encontrarse en una bacteriemia ya sea monomicrobiana polimicrobiana. Una vez tomadas las muestras de sangre, las botellas de hemocultivo s e deben incubar a 35-36C y deben ser examinadas diariamente hasta el dcimo da para evidencia de crecimiento. Los microo rganismos de importancia clnica son recuperados en este periodo hasta en un 95% de los casos. Sin embargo, perodo s de incubacin ms prolongados pueden ser necesarios, en el caso de pacientes con enfermedad repetitiva, que ha

n recibido tratamientos antimicrobianos o en entidades como la endocarditis o la endarteritis causadas por microorganism os de crecimiento lento y exigente. Inmediatamente se visualice alguna positividad en el cultivo debe obtenerse una pequea muestra del hemocultivo para hacer una preparacin directa y subcultivos en placas en condiciones aerbicas y/o anaerbicas y en atmsfera de C0 2 . El frotis directo de Gram proveer una informacin preliminar del micro organismo aislado y deber ser reportado rpidamente al mdico tratante. Cuando el hemocultivo permanece macroscpicame nte negativo deben hacerse subcultivos sobre placas a las 24 y 48 horas as como al 8 da. Estos subcultivos son necesarios para asegurar la recuperacin de ciertos microorganismos como Pseudomonas aeruginosa, Haemop hilus spp, N. meningitidis, N. gonorrhoeae, levaduras, etc. La recuperacin de microorganismos como Corynebacterium spp., Bacillus spp . y estafilococos coagulasa negativa entre otros, pueden considerarse contaminantes, a no ser que sean aislados en varias de las muestras. Las Enterobacterlas, Bacteroides spp., Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Haemophllus spp. y Pseudomonas aeruginosa son siempre hallazgos clnicamente importantes. Cier tos microorganismos como Brucella son fcilmente aislados cuando se inocula el medio bifsico de Ruiz-Castaeda; este de be ser incubado hasta por cuatro semanas con subcultivos hasta dos veces por semana sobre medios de ag ar Brucella o agar suero dextrosa con antibitico para tratar de recuperar el microorganismo. Este medio difsico tambin es til en la recuperacin de las Neisserias patgenas presentes en la sangre. Por ltimo, una bacteriemia polimicrob iana ha sido reportada en un 18% de los cuadros spticos y presenta una ms alta mortalidad que las infecciones monom icrobianas.

44 Lquidos Orgnicos Estriles ESQUEMA PARA EL PROCESAMIENTO DE HEMOCULTIVOS (REPIQUE INICIAL)

Si el frasco muestra signos macroscpicos de positividad, realizar un examen directo coloreado con Gram y enviar informe provisional Frasco B: Sembrar placas de SH, GC, MC, SHA y un tubo de CT Frasco A: Sembrar placas de SH, GC, MC y un tubo de CST Mezclar el frasco, transferir 5 ml de sangre a un tubo estril, centrifugar y descartar el sobrenadante, resuspender bien el sedimento y sembrar los medios de cultivo Incubar 48 horas a 35C Realizar Repique Inicial Incubar 24 horas a 35C Realizar Repique Inicial Frasco A Frasco B Las placas de SH y GC se incuban a 35C por 18-24 horas en microaerofilia, la plac a de MC y los caldos se incuban en aerobiosis, mientras que SHA en anaerobiosis por 48 horas. Las placas y caldo s se deben incubar como mnimo por 48 horas antes de descartarlos como negativos. 45 Lquidos Orgnicos Estriles ESQUEMA PARA EL PROCESAMIENTO DE HEMOCULTIVOS (REPIQUE FINAL)

Revisar diariamente y el 8 da realizar el repique final Revisar diariamente y el 8 da realizar el repique final Mezclar el frasco, transferir 5 ml de sangre a un tubo estril, centrifugar y descartar el sobrenadante, resuspender bien el sedimento y sembrar los medios de cultivo Frasco A: Sembrar placas de SH, GC y un tubo de CST

Frasco A

Si el frasco muestra signos macroscpicos de positividad, realizar un examen directo coloreado con Gram y enviar informe provisional

Frasco B: Sembrar placas de SH, GC, SHA y un tubo de CT

Frasco B Las placas de SH y GC se incuban a 35C por 18-24 horas en microaerofilia, los cal dos se incuban en aerobiosis, mientras que SHA en anaerobiosis por 48 horas. Las placas y caldos se deben incu bar como mnimo por 48 horas antes de descartarlos como negativos. 46 Lquidos Orgnicos Estriles CONSIDERACIONES ESPECIALES: - Revisar los hemocultivos diariamente, si se detectan signos de positividad sem brar en los medios respectivos y realizar frotis. Si se observa crecimiento a las 24 horas en el frasco B, este se d ebe repicar y se debe realizar un frotis coloreado con Gram. Si los frascos de hemocultivo continan negativos, hacer el repique final al 8 da de incubacin. Si se observa crecimiento de algn microorganismo identificar y realizar pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos. Siempre que se observe un directo positivo se debe enviar un reporte provisional al mdico. INFORME DE LOS RESULTADOS INFORME PROVISIONAL POSITIVO DE DIRECTO COLOREADO CON GRAM, Generalmente se enva a las 24-48 horas, a fin de informar al mdico so bre la morfologa, agrupacin y afinidad

tintorial del microorganismo. Ejemplo: FRASCO (A B): Al examen microscpico directo coloreado con Gra m, se observaron (describir la morfologa, afinidad tintorial y agrupacin bacteriana). INFORME PROVISIONAL DE CULTIVO NEGATIVO Se enva a las 96 horas, reportar: FRASCO (A, B A=B): No se ha observado crecimiento de bacterias (aerbi cas, anaerbicas o aerbicas y anaerbicas) despus de 96 horas de incubacin. INFORME PROVISIONAL DE CULTIVO POSITIVO Se enva a las 96 horas cuando solo se conoce el gnero o grupo al que pertenece el microorganismos, reportar: Frasco (A, B A=B): Gnero: Especie: en estudio Antibiograma: en estudio INFORME DEFINITIVO DE CULTIVO NEGATIVO Se enva a los 10 das de incubacin y despus del repique inicial y final, reportar: FRASCO (A, B A=B): No se observ crecimiento de bacterias (aerbicas, anaerbicas o ae rbicas y anaerbicas) despus de 10 das de incubacin.

47 Lquidos Orgnicos Estriles INFORME DEFINITIVO DE CULTIVO POSITIVO Se enva a los 10 das de incubacin, despus de conocer la identificacin de finitiva del microorganismo y la susceptibilidad a los antimicrobianos, reportar: Frasco (A, B A=B): Gnero: Especie: Antibiograma: Si solo uno de los frascos (A B) presenta crecimiento, entonces reportar de acue rdo con los resultados obtenidos en cada uno de los frascos. LQUIDO CEFALORRAQUIDEO El examen de LCR en aquellos pacientes sospechosos de tener un proceso infeccios o del SNC representa uno de los ms importantes procedimientos de urgencia que debe realizar el labo ratorio de microbiologa clnica, debido a la necesidad urgente de administrar una terapia antimicrobiana apropiada cu ando se identifica el verdadero agente etiolgico y reducir las serias complicaciones que pueden ser fatales en muchas oc asiones. Las infecciones bacterianas del SNC son en general de curso agudo y rpidamente progresivas, mientr as que las ocasionadas por micobacterias, hongos, leptospiras o protozoos son generalmente insidiosas en su evolu cin. La puncin lumbar es el mtodo de eleccin para el diagnstico de las infecciones del SNC; debe ser realiza da por personal competente y bajo estrictas condiciones de asepsia para evitar contaminacin de la muestra y confusin en la ide ntificacin del agente etiolgico. El LCR debe colectarse en tubos estriles con tapa rosca, no deben utilizarse tubos c on tapones de algodn o de caucho. Hay diferentes procedimientos para detectar la presencia de microorganis

mos, as como la presencia de antgenos o sustancias bacterianas en el LCR. Bsicamente un frotis directo coloreado con Gram y un cultivo detectar la presencia del agente patgeno, pero es posible obtener comercialmente algunos tipos de reactivos con el objeto de detectar antgenos microbianos cuando el cultivo del LCR permanece negativo o para confirmar la identidad del microorgani smo aislado. El transporte inmediato de la muestra al laboratorio para su procesamiento es esencial pues algun os microorganismos exigentes como H. influenzae. o N. meningitidis pueden no sobrevivir mucho tiempo. Una m uestra suficiente de 5 ml de LCR deber ser obtenida para anlisis microbiolgico, para el examen citoqumico y/o serolgico. Cuando la muestra llega al laboratorio inmediatamente se debe sembrar en los medios de cultivo y realizar el frotis dir ecto. El LCR debe centrifugarse para concentrar los microorganismos, el sobrenadante s e retira con una pipeta estril y se coloca en un tubo estril, el sedimento se debe resuspender bien y con ayuda de una pipeta sembrar los medios de cultivo y realizar el frotis directo. Algunos microorganismos como H. influenzae requieren de hasta 60 minutos de 48 Lquidos Orgnicos Estriles centrifugacin cuando se presenta un escaso nmero de bacterias en el LCR. Las prepa raciones directas coloreadas con Gram o Ziehl Neelsen deben examinarse cuidadosamente tratando de cubrir un gran nmero de campos microscpicos. La respuesta inflamatoria puede ser de ayuda en el diagnstico de una meningitis. La respuesta leucocitaria es generalmente de PMN en meningitis bacteriana, mientras que en una tuberculosa, m ictica, leptospiral o por protozoos es de linfocitos. Los cambios citoqumicos pueden ocurrir en pacientes con abscesos cerebrales, sin embargo los frotis directos coloreados con Gram y los cultivos del LCR son generalmente negativos e n estos casos a menos que haya una ruptura al espacio subaracnoldeo o ventricular. En el caso de las men ingitis bacterianas parcialmente tratadas, pueden desarrollarse cambios en el aspecto citoqumico del LCR y la tasa de recuperacin de l agente etiolgico disminuye. Si se sospecha una meningitis por Criptococcus, una gota del sedimento del LCR es mezc lada con una gota de tinta china o una solucin de nigrosina sobre un portaobjeto limpio, se cubre con una laminilla y se observa con una baja intensidad de luz al microscopio, con objeto de 40X. La presencia de clulas con apariencia de l evaduras, en gemacin y encapsuladas son presuntamente diagnsticas de Criptococosis. Debe tener cuidado en la diferenciacin de levaduras no encapsuladas, eritrocitos, leucocitos o burbujas de aire. En algunos casos de meningitis por Cryptococcus neoformans. puede haber o no una pequea respuesta celular y disminucin en los valores de la glucosa. La positividad del examen directo de t inta china puede llegar a un 80-85% y la positividad de la reaccin con partculas de ltex puede ser hasta de un 95-100% en un paciente con Criptococosis. En

cuadros clnicos de meningoencefalitis de dudosa etiologa, en pacientes co n antecedentes de haber nadado en estanques o piscinas de agua dulce antes de la aparicin de sntomas, deber realizars e un examen de LCR para amibas de vida libre. Una gran variedad de procedimientos Inmunolgicos han sido desarrollados para el d iagnstico rpido de meningitis bacteriana. La inmunofluorescencla, hinchamiento de cpsula, contrainmunoele ctroforesls, coaglutinacln y aglutinacin con partculas de ltex son algunas de las tcnicas ms conocidas. La utiIid ad de estas tcnicas puede aplicarse en aquellos casos cuando un diagnstico presuntivo inmediato y confiable es necesario , para aplicar una terapia antibitica adecuada.

49 Lquidos Orgnicos Estriles ESQUEMA PARA EL PROCESAMIENTO DE LCR

Sembrar placas de SH, GC, MC, SB, SHA y tubos de CST-sup y CT Realizar un directo coloreado con Gram y reportar al mdico Muestra INFORME DE LOS RESULTADOS INFORME PROVISIONAL NEGATIVO DE DIRECTO COLOREADO CON GRAM, AL EXAMEN MICROSCPICO DIRECTO COLOREADO CON GRAM NO SE OBSERV MORFOLOGA BACTERIANA Y POLIMORFONUCLEARES (en el caso de estar presentes se debe reportar la cantidad). INFORME PROVISIONAL POSITIVO DE DIRECTO COLOREADO CON GRAM, AL EXAMEN MICROSCPICO DIRECTO COLOREADO CON GRAM, SE OBSERVARON (describir la mor fologa, afinidad tintorial y agrupacin bacteriana) Y POLIMORFONUCLEARES (en el c aso de estar presente se debe reportar la cantidad). CULTIVO NEGATIVO NO SE OBSERV CRECIMIENTO BACTERIANO DESPUS DE 48 (especificar si es mayor el tiemp o) HORAS DE INCUBACIN. CULTIVO POSITIVO Gnero: Especie:

Antibiograma:

50 Lquidos Orgnicos Estriles LQUIDO PLEURAL, PERICRDICO, PERITONEAL Y SINOVIAL Las aspiraciones percutneas de liquido pleural, pericrdico, peritoneal y sinovial debern ser hechas con absoluta asepsia para evitar la contaminacin de las muestras y prevenir la introduccin de c ualquier microorganismo en espacios anatmicos estriles. Las muestras debern ser recolectadas directamente en u n tubo estril con tapa de rosca. Si se sospecha de una infeccin por bacterias anaerbicas, se colocar la muestra rpidamente en un tubo de transporte para muestras anaerbicas o en caldo de carne con glucosa para ser procesada s posteriormente en el aislamiento de microorganismos anaerbicos. Las muestras de lquido pleural y sinovial frecuentemente se coagulan, l os cogulos que se forman atrapan en su interior a los microorganismos presentes en la muestra, lo que dificulta su dete ccin. Para evitar esto se puede agregar al tubo una pequea cantidad de sulfonato sdico de polianetol (SPS) o de heparina estri l antes de la toma de la muestra, para emulsificarla y procesarla adecuadamente. Los lquidos claros o ligeramente turbios deben centrifugarse, procesando luego el sedimento; las muestras francamente purulentas debern examinarse directamente. Se debe realizar u n frotis directo coloreado con Gram y sembrar la muestra en SH, GC, MC, SB, SHA, CT y CSTsup. Las placas de SH y GC de ben incubarse en microaerofilia para favorecer la recuperacin de microorganismos exigentes como Neisseria s patgenas, Streptococcus spp., Haemophilus spp. y Listeria spp. En el caso de lquido peritoneal se aconseja util izar una placa de ASAK ya que esta muestra puede contaminarse fcilmente con el contenido intestinal. ESQUEMA PARA EL PROCESAMIENTO DE OTROS LQUIDOS ESTRILES

Sembrar placas de SH, GC, MC, SB, SHA y tubos de CSTsup y CT Realizar un directo coloreado con Gram y reportar al mdico Muestra

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Lquidos Orgnicos Estriles INFORME DE LOS RESULTADOS INFORME PROVISIONAL NEGATIVO DE DIRECTO COLOREADO CON GRAM, AL EXAMEN MICROSCPICO DIRECTO COLOREADO CON GRAM NO SE OBSERV MORFOLOGA BACTERIANA Y POLIMORFONUCLEARES (en el caso de estar presentes se debe reportar la cantidad). INFORME PROVISIONAL POSITIVO DE DIRECTO COLOREADO CON GRAM, AL EXAMEN MICROSCPICO DIRECTO COLOREADO CON GRAM, SE OBSERVARON (describir la mor fologa, afinidad tintorial y agrupacin bacteriana) Y POLIMORFONUCLEARES (en el c aso de estar presente se debe reporta la cantidad). CULTIVO NEGATIVO NO SE OBSERV CRECIMIENTO BACTERIANO DESPUS DE 48 (especificar si es mayor el tiemp o) HORAS DE INCUBACIN. CULTIVO POSITIVO Gnero: Especie: Antibiograma:

52 Lquidos Orgnicos Estriles LQUIDOS ORGNICOS ESTRILES EJERCICIOS DE AUTOEVALUACIN 1. Investiga los siguientes trminos: - - - - - - - Septicemia Bacteriemia Cultivo monomicrobiano Cultivo polimicrobiano Endocarditis Endarteritis Espacio subaracnoideo Espacio ventricular Citoqumica Meningoencefalitis Inmunofluorescencia Contrainmunoelectroforesis Coaglutinacin Aglutinacin 2. Describa los pasos a seguir para la toma de una muestra de sangre para hemoc ultivo. 3. Cules son los microorganismos ms frecuentemente involucrados en bacteriemias? 4. Para qu se utilizan los caldos de enriquecimiento en las muestras de lquidos or gnicos estriles? 5. Qu utilidad tiene agregar sucrosa a los frascos de hemocultivo? 6. Cules son los microorganismos ms frecuentemente aislados en muestras de LCR? 7. Cmo realizara el diagnstico de una tuberculosis menngea? 8. Qu utilidad tiene realizar un frotis directo en muestras de lquidos estriles, ex plique su importancia?

9. Indique como se toman las muestras de LCR, lquido sinovial y lquido peritoneal o ascitico. CASOS CLNICOS 1. Paciente de 72 aos que ingresa por un cuadro de un mes de fiebre , escalofros, sndrome constitucional, disuria y polaquiuria. Posteriormente apareci disnea, tos, edemas perifricos y desorientacin. En la exploracin destacaba fiebre de 38.5C, cianosis, taquipnea, disminucin global del murmullo vesicular y crepitantes bibasales, hepatomegalia dolorosa a 4 cm, y edemas maleolares. En la analtica destacaba 7800 leucocitos (81.1% neutrfilos, 13.7% linfocitos). La gasometra mostraba pH 7,47, pO 2 46 y pCO 2 36. La radiografa de trax mostraba un patrn intersticial micronodular difuso y bilateral, con tendencia confluente en LSI. En hemocultivos en medios 53 Lquidos Orgnicos Estriles para micobacterias creci el organismo que se muestra en la fotografa. D icho organismo creci tambin en muestras de orina y esputo procesadas para investigacin de micobacterias. - Cul es el probable diagnstico? Esta infeccin es sistmica o localizada? Qu metodologas utilizara para aislar este microorganismo de muestras de sangre y ori na? 2. Paciente de 17 aos de edad, mujer, sin antecedentes de inters, que acude a urgencias por presentar de forma brusca un cuadro de 16 horas de evolucin de fiebre de 39-40C, escalofros, malestar general, cefalea, obnubilacin y sensacin de debilidad. En el momento del ingreso, la exploracin fsica evidenci fiebre de 39.7C, tensin arterial de 80/40, rigidez de nuca y aparicin de mltiples lesiones petequiales por toda la superficie del cuerpo, siendo las mismas confluentes en algunas localizaciones. La analtica de sangre mostr leucocitosis (18000 clulas/ml) con neutrofilia (85 % polimorfonucleares). Se realizaron hemocultivos y una puncin lumbar. El estudio citoqumico del lquido cefalorraqudeo demostr 13000 clulas/ml, con predominio de polimorfonucleares (90 %), 14 mg/dl de glucorraquia y ms de 400 mg/dl de proteinorraquia. No se visualizaron bacterias en la tincin de Gram del lquido. Sin embargo, a las 24 hora s de incubacin, tanto los hemocultivos como el cultivo del lquido se positivizaron, observndose en la tincin de Gram de los frascos de hemocultivo el microorganismo de la imagen, que result ser el mismo que apareci en el LCR. - Cul es el probable diagnstico? Cul es el microorganismo responsable? 3. Un soldado de 20 aos de edad se enferma repentinamente, presentando escalofros , vmitos, malestar general y fiebre alta. Horas despus se quejaba de rigidez en la nuca y posteriormente convu lsion, se observ el desarrollo

de petequias sobre el abdomen. En horas de la tarde del mismo da, tr es soldados ms fueron admitidos al hospital de la base con la misma sintomatologa. - Cul es el diagnstico ms probable? Poliomielitis Meningitis tuberculosa Meningitis por H. influenzae Meningitis meningoccica Ttano 54 Lquidos Orgnicos Estriles Si el directo de LCR revelo la presencia de cocobacilos pleomrficos Gram negativo s pequeos, entonces el probable agente etiolgico es: Haemophilus influenzae Klebsiella pneumoniae Escherichia coli Proteus vulgaris Yersinia pestis Asumiendo que el microorganismos aislado del LCR del paciente da la pr ueba de la oxidasa positiva, cuando crece en medios slidos, el diagnstico ms probable es:? Poliomielitis Meningitis tuberculosa Meningitis por H. influenzae Meningitis meningoccica Ttano Si el diagnstico se encuentra ubicado entre meningitis por H. Influenzae y mening itis tuberculosa, cul de las siguientes pruebas diferenciara ms rpidamente los cuadros clnicos? Prueba de la tuberculina Coloracin de Ziehl Neelsen del LCR Inoculacin en conejos. Mtodo de fijacin rpida en Bordet-Gengou. De los diagnsticos presuntivos listados a continuacin, cual se beneficiara ms con un rgimen de Penicilina G? Poliomielitis Meningitis tuberculosa Meningitis por H. influenzae Meningitis meningoccica Ttano

55 Muestras de Tejido seo, Piel, Tejidos Blandos y Otros MUESTRAS DE TEJIDO SEO, PIEL, TEJIDOS BLANDOS Y OTROS TEJIDO SEO La muestra colectada en cuadros infecciosos que se presentan en procedimientos o rtopdicos deben ser colocados en un medio de transporte de Stuart si hay exudado supurativo y la muestra se ha tomado con hisopos, para evitar su desecacin. Si se trata de una biopsia de tejido seo debe utilizarse un tubo de ros ca con 5 ml de CST o caldo infusin

cerebro corazn para colocar la muestra de hueso. Llevar los tubos al laboratorio rpidamente para su procesamiento. El tubo con la muestra de biopsia debe incubarse por 24-48 horas a 36-37 C. Luego repicar en placas de SH, GC, MC, SB y SHA. La muestra transportada en medio de Stuart debe sembrarse en los mismos med ios de cultivo y adicionalmente en CT. Observar el crecimiento obtenido para tratar de aislar el microorg anismo implicado. Si las muestras han sido obtenidas por aspiracin de material supurativo en procesos de osteomieli tis, deben ser colocadas en un tubo de rosca estril, llevadas al laboratorio y procesadas para aislamiento de microorganismos aerbicos (S. aureus, Streptococcus spp, Enterobacterias) y microorganismos anaerobios (Clostrldlum spp, Fuso bacterium spp, Bacteroldes spp.), tratando de clarificar la etiologa de estos cuadros infecciosos, donde pueden involucrarse diferentes tipos de microorganismos. Debe hacerse al mismo tiempo un frotis directo para colorear co n Gram; el frotis directo puede servir de ayuda si la muestra no ha sido contaminada con flora normal de la p iel y se observa una morfologa bacteriana predominante, acompaada de polimorfonucleares.

Sembrar placas de SH, GC, MC, SB y un tubo de CT Si la muestra fue tomada por aspiracin de un sitio donde se sospeche infeccin por bacterias anaerbicas, incluir SAH y SHAK Realizar un directo coloreado con Gram y reportar al mdico Hisopado o Aspirado CT incubar de 18 a 24 horas a 35C Repicar a placas de SH, GC, MC, SB y SHA. Realizar un directo coloreado con Gram y reportar al mdico Biopsia de tejido seo 56 Muestras de Tejido seo, Piel, Tejidos Blandos y Otros PIEL Las muestras de piel deben ser obtenidas de varias de las lesiones q ue se observen, una vez que hayan sido correctamente desinfectadas. Si las lesiones son cerradas la muestra debe ser co lectada por aspiracin con una jeringa

estril. Si se presentan exudados debe descartarse el material de la su perficie y los exudados del interior deben ser utilizados para anlisis bacteriolgico. Siempre debe examinarse una preparacin direc ta coloreada con Gram con el fin de observar una morfologa bacteriana predominante que pueda ayudar a clarificar l a etiologa de la lesin. La presencia de abundantes cocos Gram-positivos acompaados de abundantes polimorfonucle ares en pacientes con furunculosis podra sugerir aislamiento positivo de Streptococcus spp. o Staphylococcus aureus.

Sembrar placas de SH, GC, MC, SB y un tubo de CT Si la muestra fue tomada por aspiracin de un sitio donde se sospeche infeccin por bacterias anaerbicas, incluir SAH y SHAK Realizar un directo coloreado con Gram y reportar al mdico Hisopado o Aspirado TEJIDOS BLANDOS La presencia de abscesos, heridas y ulceras supurativas constituyen los principales focos infecciosos que pueden producirse a nivel de tejido blando. El uso de hisopos de algodn para la toma de muestras procedentes de estas lesiones es impropio e inadecuado, pues adems de facilitar una contaminacin con f lora microbiana de piel, mucosa o grmenes del medio ambiente, es una muestra que no puede ser procesada para investigar microorganismos anaerbicos frecuentemente implicados; la forma ms conveniente para obtener muestra s adecuadas en la formacin de abscesos debe ser por puncin aspirativa con jeringa y aguja estriles. Cuando se pr esentan lesiones en piel y mucosa que no muestran material supurativo, la mejor manera de obtener una muestra repr esentativa es realizando una biopsia abierta del tejido comprometido. Una vez que la muestra ha sido tomada debe ser transportada rpidamente al laboratorio especialmente si se quiere investigar la presencia de microorganismos a naerbicos. Los microorganismos que rutinariamente pueden aislarse comprenden: S. aureus, Streptococcus spp, Enterobacterlas y Pseudomonas spp, pero debe investigarse la presencia de Actinomicetos, Brucella spp, mic obacterias, hongos, parsitos y bacterias anaerbicas si se desea clarificar la completa etiologa del cuadro para un tratamie nto antimicrobiano adecuado. El frotis directo coloreado con Gram es representativo si se visualiza un nmero suficiente de microorganismos de morfologa caracterstica y podra, de alguna forma servir de indicativo para sospechar la pres encia de determinado microorganismo.

57 Muestras de Tejido seo, Piel, Tejidos Blandos y Otros Sembrar placas de SH, GC, MC, SB y un tubo de CT Si la muestra fue tomada por aspiracin de un sitio donde se sospeche infeccin por bacterias anaerbicas, incluir SAH y SHAK Realizar un directo coloreado con Gram y reportar al mdico Hisopado o Aspirado CT incubar de 18 a 24 horas a 35C Repicar a placas de SH, GC, MC, SB y SHA. Realizar un directo coloreado con Gram y reportar al mdico Biopsia CONDUCTO AUDITIVO EXTERNO Los hallazgos bacteriolgicos encontrados en pacientes con cuadros de otitis media han sido consistentemente los mismos en muchos estudios realizados. De all que no se justifica reali zar una timpanocentesis excepto en aquellos cuadros de infecciones recidivantes o en nios recin nacidos, quienes pue den presentar una etiologa diferente a la hallada en nios mayores de cinco aos. Una muestra de secrecin purulenta tomada con un hisopo de algodn estril, despus de haber desinfectado convenientemente la zona adyacente al conducto audit ivo puede ser representativa para el aislamiento del agente causal. Colocar la muestra en el medio de transporte d e Stuart o sembrar en medios primarios de cultivo teniendo en cuenta que los agentes etiolgicos ms frecuentes en otitis media aguda pueden ser: Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae y Streptococcus pyogenes. Sin embargo, algunas veces Branhamella catharralis, Ps. aeruginosa, E. coli, K. pneumoniae y S. aureus pued en aislarse a partir de secreciones de odo medio en infantes. La realizacin de un frotis directo coloreado con Gram no es de mucha utilidad, a menos que se observe un solo tipo de microorganismo y presencia de polimorfonucleares abun dantes.

58 Muestras de Tejido seo, Piel, Tejidos Blandos y Otros Si es una muestra de odo medio tomada por timpanocentesis o de odo interno, incluir placas de anaerobiosis Realizar un directo coloreado con Gram y reportar al mdico Sembrar placas de SH, GC, MC, SB y un tubo de CT

Hisopado SECRECIONES OCULARES Cuando se presentan procesos infecciosos como conjuntivitis o queratitis general mente hay problemas para la toma adecuada de la muestra. El uso de hisopos de cualquier tipo no est recomendado po r el problema de la poca cantidad de muestra que se puede obtener. Un inconveniente adicional es la act ividad antimicrobiana de los anestsicos locales que se deben aplicar. La queratoconjuntivitis puede ser producida por bacterias, actinomicetos, hongos o virus y se recomienda que la muestra sea tomada con el asa bacteriolgica antes de la aplicacin del anestsico local y la raspadura de la crnea sea tomada despus de la aplicacin del mismo. La muestra debe ser tomada, de preferencia por el oftalmlogo y procesada rpidamente, se debe realizar un frotis coloreado con Gra m y cultivo. En algunas ocasiones deben realizarse coloraciones hmedas con hidrxido de potasio para observar estruct uras de hongos, si tal preparacin es requerida por el mdico tratante. Los medios de cultivo que se debe n sembrar son ASH, GC, MC, SB y un CT, las placas se deben incubar hasta 48 horas para buscar microorganismos exi gentes como Haemophilus spp., S. pneumoniae, N. gonorrhoeae, Corynebacterium spp. y Streptococcus spp. qu e pueden involucrarse en estos procesos infecciosos con mayor o menor frecuencia. Las preparaciones di rectas coloreadas con Gram son tiles en casos de oftalma purulenta por N. gonorrhoeae, donde se observarn diplococos Gram negativos intra y extra celular de morfologa caracterstica.

Sembrar placas de SH, GC, MC, SB y un tubo de CT Realizar un directo coloreado con Gram y reportar al mdico Muestra

59 Muestras de Tejido seo, Piel, Tejidos Blandos y Otros MUESTRAS DE TEJIDO SEO, PIEL, TEJIDOS BLANDOS Y OTROS EJERCICIOS DE AUTOEVALUACIN 1. Investiga los siguientes trminos: - - - - - - - Desecacin Osteomielitis Furunculosis Tmpanocentesis Recidiva Conjuntivitis Queratitis Queratoconjuntivitis Oftalma Metfisis Eritema Pltora Febrcula Megalia 2. Indique los microorganismos ms frecuentemente involucrados en infecciones del tejido seo. 3. Para qu se utilizan los caldos de enriquecimiento en este tipo de muestras? 4. Cules son los microorganismos ms frecuentemente involucrados en infecciones de la piel? 5. Qu utilidad tiene realizar un frotis directo en este tipo de muestras? 6. Cules son los microorganismos ms frecuentemente involucrados en infecciones del odo? 7. Cmo procesara una muestra de secrecin de quemadura? CASOS CLNICOS 1. Paciente de 15 aos que acude por fiebre de 38-39C, dolor, hinchazn e impotencia funcional en tobillo izquierdo de 10 das de evolucin. No refiere ningn antecedente de inters. La exploracin general era normal. El tobillo estaba hinchado, caliente y enrojecido, y era doloroso a los movimientos pasivos y activos. La analtica de sangre elemental fue normal. La radiografa del tobillo mostr una lesin osteoltica en la metfisis. Se extrajeron 10 ml de lquido articular que contena abundantes polimorfonucleares. Se realiz un abordaje quirrgico de la lesin, extrayndose un material purulento. Se realiz una tincin de Gram de dicho material, cuyo resultado se muestra en la fotografa. Los hemocultivos y el cultivo de lquido 60 Muestras de Tejido seo, Piel, Tejidos Blandos y Otros articular fueron negativos. En el cultivo del material extrado del hueso creci el organismo responsable del cuadro. - Cul es el probable diagnstico? De qu microorganismo sospecha como productor del cuadro clnico? Cmo procesara en el laboratorio la muestra? 2. Nia de 10 das de edad, que acude al servicio de urgencias por febrcula, irritab ilidad y ligera descamacin facial acompaada de lesiones cutneas vesiculosas en piernas. Los padres de la criatura no

taron que la descamacin facial haba comenzado pocos das despus de ser dada de alta del hospital y que su inicio fue peribucal. En este momento es diagnosticada de "descamacin fisiolgica del recin nacido" pero su asociacin con algo de "fiebre" y la erupcin vesiculosa en piernas 2 das despus, les oblig a consultar de nuevo. Antecedentes obsttricos: Embarazo controlado y sin incidencias de inters. Nacida a trmino de parto vaginal y con sufrimiento fetal agudo. Peso 3.100 g, talla 49 cm. Antecedentes Familiares: Sin inters. Padres no consanguneos. En la exploracin fsica: Peso 3.250 g, talla 49 cm. Temperatura de 37,9C. Buen estado general. Coloracin cutnea que impresiona de pltora vs. eritema con descamacin cutanea perioral y de frente. Es fcil despegar la piel al traccionar de los bordes descamados e incluso, con el simple roce, zonas de piel sana. En miembros inferiores la lesin cutnea consiste en mltiples vesculas milimtricas y agrupadas de forma homognea que afecta exclusivamente a mu slos, rodillas y parte superior de tobillos. Se consigue, tambin mediante roce, despegar parte de epidermis en tiras largas. No se encuentran lesiones a otros niveles. La auscultacin cardiopulmonar es normal y el abdomen, blando, depresible y sin megalias. Neurolgico normal. Se realiz un hemocultivo y se aisl una cepa de Staphyl ococcus aureus. - Cul es el probable diagnstico? Qu pruebas realizara para confirmar el diagnstico? Cul sera el tratamiento a indicar? 3. Hombre de 57 aos de edad que se present al hospital con una crisi s convulsiva. Tres semanas previas al ingreso haba presentado cefaleas frontales que remitan con aspirinas. Las cefaleas se presentaron de manera recurrente, incluso el da anterior a su admisin. En la maana del ingres o, el paciente haba sufrido de convulsiones focales al presentar movimientos involuntarios del lado der echo de la cara y el brazo. Durante su estancia en la emergencia, el paciente present una crisis convulsiva generalizada que se control con diazepam, fenitona y fenobarbital por va intravenosa. La informacin proporcionada por la espo sa revel que el paciente se 61 Muestras de Tejido seo, Piel, Tejidos Blandos y Otros haba sometido a una extraccin dental y colocacin de un puente cinco sem anas antes. El paciente no tena antecedentes de tabaquismo, era bebedor social nicamente y no reciba tratamiento f armacolgico. El resto de la historia clnica no arroj ms datos de utilidad. La temperatura al ingreso fue de 37C, frecuencia cardiaca de 110/minuto y tensin arterial de 140/80 mmHg. A la exploracin fsica el p aciente se encontr somnoliento y con disminucin de su capacidad de atencin. El paciente poda mover todas las extremidades, aunque el brazo derecho lo mova menos que el izquierdo, sugestivo de posible aumento de la presin intracraneal. El resto de la exploracin fsica result normal. Las pruebas de laboratorio resultaron normales. La puncin lumbar no se llev a cabo ni se examino el LCR, debido al posible aumento de la presin in tracraneal secundaria a una lesin

ocupativa. Los hemocultivos resultaron negativos. El anlisis con tomografa computarizada de la cabeza del paciente identific una lesin localizada de aspecto anular y 1,5 cm de dimetro en el hemisfrio parietal izquierdo, sugestiva de absceso cerebral. El paciente se someti a un proceso de neurociruga con toma de biopsia de la lesin, la cual se extrajo por completo. El cultivo del material necrtic o de la lesin revel la presencia de Prevotella melaninogenica y Streptococcus anginosus. El examen patolgico del tejido sugiri que la lesin tena varias semanas de evolucin. El paciente recibi terapia antimicrobiana durante cuatro semanas, no volvi a presentar convulsiones ni mostr dficit neurolgico subsecuente. Un ao despus, se descontinuaron los medicamentos anticonvulsivos. - Qu factor predisponente favoreci a que este paciente desarrollara un absceso cere bral? Los microorganismos aislados forman parte de la flora normal del cuerpo? Qu importancia tiene el cultivo del material del absceso despus del proceso quirrgic o? Qu condiciones favorecen el desarrollo de abscesos cerebrales? 62 Bibliografa Consultada BIBLIOGRAFA CONSULTADA Brooks, G.; Butel, J.; Morse, S. Microbiologa Mdica de Jawetz, Melnick y Adelberg. 17 Edicin. Editorial El Manual Moderno. Mxico. 2002. Charles, K. Microbiology Review. Sixth Edition. Medical Examination Publ ishing Company. INC. USA. 1977. De la Maza, L.; Pezzlo, M.; Jo Baron, E. Color Atlas of Diagnostic Microbiology. Mosby. USA. 1997. Edmond, R.; Rowland, H.; Welsby. P. Color Atlas of Infectous Diseases. Third Edition. Mosby-Wolfe. Espaa. 1995 Inglis, T. Microbiology. Second Edition. Churchill Livinstone. 1999. Manual de Tcnicas Bsicas para un Laboratorio de Salud. OPS. Publicacin Cientfica N 43 9. 1983. Miller, J. A Guide to Specimen Management in Microbiology. ASM Press.1996. Steve, A.; Dennis, S. Microbiology. A Photographics Atlas for the Labo ratory. Benjaming Cummings Editors. 2001.

63 LA UNIVERSIDAD DEL ZULIA FACULTAD DE MEDICINA ESCUELA DE BIOANLISIS PRCTICA PROFESIONAL DE BACTERIOLOGA

REALIZADO POR: LIC. ARMINDO PEROZO MENA M.SC

MARACAIBO, ABRIL 2003