ISOENZIMAS.

Isoenzimas o Isoenzimas son protenas con diferente estructura pero que catalizan la misma reaccin. Con frecuencia, las isoenzimas son oligomeros de diferentes cadenas peptidicas, y usualmente difieren en los mecanismos de regulacin y en las caractersticas cinticas. Desde el punto de vista fisiolgico, la existencia de isoenzimas permite que haya enzimas similares con diferentes caractersticas, personalizadas de acuerdo a los requerimientos especficos del tejido o a determinadas condiciones metablicas. Un ejemplo de las ventajas que ofrecen las isoenzimas al permitir un ajuste fino del metabolismo, en diferentes condiciones metablicas y en diferentes rganos, es el siguiente: Glucoquinasa y Hexokinasa son ejemplos tpicos de isoenzimas. De hecho, hay cuatro Hexoquinasas: I, II, III y IV. Hexokinasa eI est presente en todos los tejidos, y la Hexoquinasa IV, tambin conocida como Glucoquinasa, est presente principalmente en el hgado, el pncreas y el cerebro. Ambas enzimas catalizan la fosforilacin Glucosa + ATP Glucosa 6 (P) + ADP. de la glucosa:

Hexokinasa I tiene un bajo Km y es inhibida por Glucosa 6 (P). Glucokinasa no es inhibida por Glucosa 6 (P) y tiene un alto Km. Estos dos hechos indican que la actividad de Glucoquinasa depende de la disponibilidad de substrato y no de la demanda del producto. Debido a que la Glucoquinasa no es inhibida por Glucosa 6 (P). en condiciones en que la concentracin de glucosa es alta, esta enzima continua fosforilando glucosa, la cual puede ser usada para la sntesis de glucgeno en el hgado. Adems, debido a que la Glucoquinasa tiene un alto Km, su actividad no compromete el suministro de glucosa a otros rganos; en otras palabras, ya que la Glucoquinasa no es inhibida por glucosa 6 (P), si esta enzima tuviera un bajo Km, continuara convirtiendo glucosa a glucosa 6 (P) en el hgado, haciendo que la glucosa no estuviera disponible para otros rganos (recuerde que despus de las comidas, la glucosa llega primero al hgado antes que a los otros rganos, a travs del sistema porta.) _______________________ Las isoenzimas son distintas formas moleculares de una misma enzima que presentan o muestran especificidad por el mismo sustrato. Las distintas formas moleculares de alcohol deshidrogenasa (ADH) se diferencian en la carga elctrica neta, en el peso molecular o en ambas simultneamente, pero todas ellas deshidrogenan el alcohol

(sustrato) convirtindolo en aldehdo. La principal caracterstica de las isoenzimas es que deben tener la misma especificidad de sustrato.

____________________ Fosfatasa alcalina (ALP). Incluye isoenzimas que hidrolizan fosfatos a pH alcalino. Se encuentran en hueso, hgado, pared intestinal, glndula mamaria lactante y placenta. En huesos se localiza en los osteoblastos (la enzima es necesaria para los depsitos de fosfato en hueso). Los niveles normales en el adulto provienen especficamente de hgado, en nios de la fraccin sea por la actividad osteoblstica. En el embarazo se elevan los niveles normales debido a la isoenzima termoestable de la placenta. El mtodo usado en la valoracin es el de Bassey Lowry-Brock que utiliza la siguiente reaccin. pH 8.5-10 p-NITROFENOLFOSFATO p-NTTROFENOL + Pi _____________________________4.2.4. Enzimas oligomricas e isoenzimas. Existen enzimas que constan de una sola cadena polipeptdica integrando un monmero. A este grupo pertenecen la lisozima, ribonucleasa, tripsina y otras. Otro grupo de enzimas contienen dos o ms subunidades asociadas por enlaces no covalentes. A este grupo pertenecen algunas enzimas de la gliclisis, las isoenzimas y las enzimas alostricas (Tabla 4.2). Las isoenzimas o isozimas son diferentes protenas con la misma actividad enzimtica que se originan en diferentes tejidos y presentan un desplazamiento electrofortico diferente. Las isoenzimas difieren en su composicin de aminocidos por lo que sus diferencias estn determinadas genticamente. Las isoenzimas ms estudiadas por sus aplicaciones clnicas son la deshidrogenasa lctica, la creatina fosfocinasa y la fosfatasa alcalina. El caso ms ilustrativo es el de la deshidrogenasa lctica, enzima tetramrica, que posee dos subunidades distintas: H (de corazn) y M (de msculo). Estas dos subunidades se combinan de cinco formas diferentes para formar cinco isoenzimas: H4, H3M, H2M2, HM3 y M4. La isoenzima M4 predomina en msculo esqueltico y en hgado, la isoenzima H4 predomina en miocardio (Tabla 4.3). La diferencia cintica entre estas dos isoenzimas se explica en otros captulos. ____________________________ Existen dos isoenzimas particulares: en el msculo predomina la isoenzima M4, que no es inhibida por producto; en corazn predomina la isoenzima H4 que es inhibida por producto (lactato). Esta

particularidad permite que en corazn se inhiba la LDH por lactato y el piruvato se derive al ciclo de Krebs, productor de energa. Esta es una ventaja fisiolgica que garantiza que el corazn tenga un aporte constante de energa para la contraccin ___________ La enzima CPK, es un dmero que consta de 3 isoenzimas: CPK-1 (BB) de cerebro; CPK-2 (MB) y CPK-3 (MM) de msculo. Se eleva marcadamente en infarto de miocardio, en la misma proporcin que la TGO y en distrofias musculares sobre todo la de tipo Duchenne; moderadamente en lesiones musculares, ciruga, ejercicio fsico intenso, accidentes cerebrovasculares, hipotiroidismo (la tiroxina afecta el catabolismo de la enzima) alcoholismo (miositis alcohlica) episodios psicticos agudos, y artificialmente en muestras hemolizadas. _____________________________ La HK tiene cuatro isoenzimas. HKI, HKII y HKIII tienen un peso molecular de 100 kDa y la glucocinasa (HKIV) un peso de 50 kDa; la diferencia entre las isoenzimas es su afinidad (Km) por la glucosa (HKIII >HKI > HKII>HKIV), que va de 0.003 hasta 5 mM. La actividad de las isoenzimas I-III es regulada por la concentracin de la glucosa 6-fosfato (G6P) que ejerce mientras que la HKIV es insensible a esta inhibicin. La sobre-expresin de la HKII ocurre en la mayora de los tumores, en tanto que en tumores cerebrales se encuentra preferentemente la HKI. Con el incremento en la actividad de ambas isoenzimas de la HK se propicia un aumento en la velocidad de la gluclisis en las clulas tumorales, debido a que ejercen un control significativo sobre esta va. Otra caracterstica que comparten las dos enzimas es que pueden unirse a la membrana externa mitocondrial, a travs de un segmento de 15 aminocidos hidrofbicos del extremo amino terminal. La asociacin de la HK es preferentemente con el canal dependiente de voltaje (VDAC); a travs de esta unin se puede impedir la salida del citocromo c mediado por Bax y Bid (protenas pro-apoptticas) con lo cual la clula tumoral se protege contra la apoptosis. Hexosa fosfato isomerasa (HPI) Esta enzima es un homodmero con dos subunidades de 63-kDa de la cual no se conocen isoenzimas. La HPI (tambin conocida como AMF, autocrine motility factor) adems de participar en la gluclisis, puede promover la migracin, la proliferacin celular y la metstasis. Es factible que esta sea la razn por la cual la hipoxia1 incrementa la expresin de esta enzima y se encuentre elevada en los tumores.

Fosfofructocinasa tipo I (PFKI) La PFKI es un homo-heterotetrmero con un peso aproximado de 380 kDa, con tres isoenzimas. La PFK-M que se encuentra en el msculo, la PFK- L que se localiza en el hgado y la PFK-P o C que se encuentra preferentemente en las plaquetas. La combinacin de las tres isoenzimas se encuentra en el resto de los tejidos. La PFK-M tiene mayor afinidad por la fructosa 6-fosfato (F6P) (K0.5 = 0.6-2 mM) y es menos sensible a la inhibicin inducida por el ATP; la PKF-L es menos susceptible a la inhibicin por el citrato (Ki aparente = 0.18 mM); la PFK-P es la isoenzima que tiene la afinidad ms baja por F6P (K0.5=1.4-4 mM) y es la ms susceptible al efecto inhibitorio del citrato (Ki aparente = 0.08 mM) (17). Consecuentemente, resulta comprensible que en los tumores las isoenzimas PFK- L y PFK-M sean las que se expresan preferentemente, por su baja sensibilidad a sus inhibidores fisiolgicos (aunque el HIF-1 solo afecta la expresin de la PFK-L). Por lo que en las clulas tumorales la PFK se mantiene muy activa contribuyendo as al incremento de la gluclisis. Adems, cabe sealar que en las clulas tumorales se mantienen niveles elevados de la fructosa 2,6 bifosfato (F2-6BP), el activador mas potente que se conoce de la PFK tipo I (aspecto abordado en la seccin de la PFKII) y que reduce significativamente el efecto inhibitorio del ATP y el citrato. Aldolasa (ALD) La ALD es un tetrmero de subunidades de 40 KDa, de la cual existen tres isoenzimas (Tabla 1), la ALDA que se encuentra predominantemente en el msculo, la ALD-B que se encuentra el hgado y la ALD-C en el cerebro, y combinaciones de ellas se distribuyen en todos los tejidos. Las ALDs A y C son ms eficientes en catalizar la reaccin de la fructosa 1,6 bifosfato (F1-6BP) a gliceraldehdo 3-fosfato (G3P) y dihidroxi acetona fosfato (DHAP) (F1-6BP > G3P + DHAP) de10 a 20 veces que la isoenzima B, en tanto que la ALD B presentan una mayor afinidad por G3P y DHAP que le permite generar fcilmente F1-6BP (reaccin reversa, G3P + DHAP > F1-6BP). Debido a esto, la ALD-A y C se encuentran preferentemente en los tejidos con activa gluclisis como el msculo, en cambio la ALD- B se encuentra preferentemente en los tejidos gluconeognicos como el hgado y el rin. El HIF-1 incrementa la expresin de las ALD- A y ALD-C, lo que favorece el incremento de la gluclisis. De manera interesante, la isoenzima A es la que se encuentra expresada predominantemente en los tumores, aunque cabe sealar que tambin se ha reportado el aumento en la expresin de las isoenzimas B y C. Gliceraldehdo 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH)

Esta enzima es un homo-tetrmero de subunidades de 37 KDa (14) (Tabla 1, la reaccin que cataliza se indica en la Fig. 2). Al igual que otras enzimas de la gluclisis, la GAPDH ejerce otras funciones. Por ejemplo, participa en la endocitosis, en la reparacin del ADN (debido a que es una uracil ADN glucosilasa y remueve uracilos), en la transcripcin, en la exportacin de tARN al ncleo y al parecer puede participar tambin en la apoptosis (15). En los tumores su incremento es inducido por el HIF-1 lo que puede favorecer alguna de las actividades antes descrita. Fosfoglicerato cinasa (PGK) La PGK es un monmero de 48 kDa que tiene dos isoenzimas; la PGK1 que se expresa en todas las clulas somticas y la PGK2 que se expresa solamente en el espermatozoide. El HIF-1 induce la expresin de la PGK1 y es la isoenzima que se ha encontrado sobre expresada en los tumores. La sobre-expresin de la PGK1 puede tener mayor relevancia en otros procesos que en la misma gluclisis, pues se ha determinado que la PGK1 participa en la generacin de la angiostatina (inhibidor de la angiognesis y la metstasis) que es un producto de la proteolsis de la plasmina. Despus de ser secretada por el tumor, la PGK1 reduce los enlaces disulfuro de la plasmina con lo cual quedan expuestas secciones que son eliminadas por proteasas, originando la angiostatina. Sin embargo, se desconoce la contribucin que puede tener la angiostatina en el desarrollo tumoral. Fosfoglicerato mutasa (PGAM) Esta enzima cataliza la conversin del 3-fosfoglicerato (3PG) a 2fosfoglicerato (2PG) (Fig. 2) y tiene como cofactor al 2,3bifosfoglicerato (2,3BPG). La PGAM es un dmero (Tabla 1) compuesto por las isoenzimas A y B (AA, BB y AB) las cuales estn codificadas por dos genes diferentes. Los parmetros cinticos determinados en las isoenzimas de ratn indican que la afinidad de la PGAM-B por el 3PG (Km= 0.5 mM) y el 2,3BPG (Km = 25 M) es mayor con respecto a la PGAM-A (Km= 0.8 mM y 60 M). En tanto que la afinidad por el 2PG de ambas isoenzimas es similar (Km = 0.28 mM). En estudios realizados con fibroblastos de ratn se encontr que el incremento de ambas isoenzimas favoreca la proliferacin e inmortalizacin de estas clulas, en tanto que cuando se disminua su transcripcin con ARN de interferencia se induca una senescencia prematura. Por ello se les ha relacionado con la inmortalizacin de las clulas tumorales. La sobreexpresin de la PGAM-B se ha encontrado en diversos tipos de cncer (hgado, pulmn, colon y glndula mamaria). El HIF-1 regula la expresin de la PGAM-B.

Enolasa (ENO) Es una metaloenzima dmerica (Tabla 1, la reaccin que cataliza se indica en la Fig. 2); cada subunidad tiene un peso molecular de 82100 KDa. Puede estar constituida por la combinacin de tres isoenzimas , , , encontrndose solo las siguientes combinaciones , , , , . La ENO- se encuentra en la mayora de los tejidos incluyendo el hgado, la ENO- se encuentra preferentemente en el msculo y la ENO- se encuentra en los tejidos cerebrales. La caracterizacin parcial indica que las isoenzimas tienen una afinidad similar por el 2PG (Km = 30 M). El gen de la ENO- es blanco del HIF1 y se ha observado el aumento en su transcripcin en diversos tipos de cncer. Esta isoenzima puede favorecer el crecimiento y la diseminacin de los tumores (metstasis), debido a que acta como receptor del plasmingeno. El sistema del plasmingeno se encarga de degradar los cogulos de fibrina que se generan en el organismo, as como de favorecer la migracin celular debido a que facilita la penetracin a travs de las barreras proteicas. Piruvato cinasa (PYK) Esta enzima es un tetrmero con cuatro isoenzimas. La PYK-L que se encuentra en hgado y rin (tejidos gluconeognicos) y la PYK- R que se expresa en eritrocito son codificadas por el mismo gen (compuesto de 12 exones), pero por el uso de promotores alternativos se transcribe una u otra isoforma. El promotor especfico para PYK-R se localiza en el exn 1 y para PYK-L en el exn 2. La isoenzima PYK-M1 se encuentra en cerebro, corazn y msculo y la PYK-M2 se expresa en las clulas con activa proliferacin como clulas embrionarias, clulas stem, leucocitos, plaquetas y clulas tumorales. Las isoenzimas M1 y M2 son productos de un mismo gen sometido a splicing alternativo. La PYK-M1 es la nica isoforma que no presenta cooperatividad con respecto al fosfoenolpiruvato (PEP). La PYK-M1 tiene la mayor afinidad por PEP (Km = 0.08 mM), mientras que la PYK-R tiene la menor afinidad (Km = 1.4 mM). Tres de las cuatro isoenzimas (R, L y M2) se activan por F1-6BP (Ka = 0.06 a 0.4 M). El ATP ejerce una potente inhibicin sobre las isoformas L y R (Ki = 0.1 y 0.04 mM, respectivamente) y una ligera inhibicin sobre las isoformas M1 y M2 (Ki= 3 y 2.5 mM, respectivamente). La actividad de la PYK- L y PYK- R tambin se regula por fosforilacin/desfosforilacin en cambio, las isoenzimas M1 y M2 no son fosforiladas y por lo tanto no son reguladas por accin hormonal. El HIF-1 incrementa la expresin de la isoenzima M2, que es la principal isoenzima que se encuentra en tumores. Esto puede favorecer a la gluclisis por ser poco sensible al efecto inhibitorio del

ATP y no ser regulada por fosforilacin. Adems, la PYK-M2 se encuentra como dmero (poco activa) y como tetrmero (activa). Lactato deshidrogenasa (LDH) Esta enzima es un tetrmero con 2 isoenzimas, LDH-A (isoenzima de msculo) y LDH-B (isoenzima de corazn) y con cinco combinaciones formadas a partir de las dos isoformas; LDH1(B4), LDH-2 (B3A), LDH-3 (B2A2), LDH-4 (BA3) y LDH-5 (A4), las cuales difieren en sus propiedades cinticas. En testculo y en los espermatozoides se expresa exclusivamente otra isoenzima de la LDH conocida como LDH-C4. En los tejidos en donde se generan grandes cantidades de lactato (hgado y msculo esqueltico) se encuentra predominantemente LDH-5 y LDH-4, isoenzimas con alto contenido subunidad A que preferentemente genera lactato a partir del piruvato. En cambio en aquellos tejidos que consumen lactato (corazn, eritrocito y rin) se encuentran predominantemente las isoenzimas con mayor proporcin de la subunidad B (LDH-1 y LDH-2) que tienen mayor afinidad por lactato (Km = 4 mM) con respecto a la isoenzima A (Km = 7 mM). Es claro que para favorecer el aumento en la velocidad de gluclisis y por lo tanto la produccin de lactato, el HIF-1 induce la sobreexpresin de la LDH- A (Fig. 2). Sin embargo, puede que el incremento en la cantidad de esta enzima tambin sea para favorecer otras de las actividades que realiza. Diversos reportes indican que la enzima se une a ADN de una sola cadena por lo cual se especula sobre su participacin en la transcripcin. Fosfofructocinasa tipo II (PFK-II) Esta es una enzima homodimrica bifuncional con actividad de cinasa y bifosfatasa que se localizan en los extremos carboxilo y amino terminal, respectivamente (31). Regula las concentraciones de F2-6BP (el activador ms potente de la PFK-I ), ya que la cinasa sintetiza F26BP a partir de F6P y ATP, en tanto que la bifosfatasa degrada la F26BP a F6P y fosfato inorgnico (Fig. 2).As, la relacin cinasa/bifosfatasa determina que reaccin se favorece y por lo tanto el contenido de F2-6BP en la clula. A su vez, las dos actividades en la enzima se regulan por algunos metabolitos (PEP, -glicerol fosfato y citrato) y por fosforilacin en la serina 32 por la protena cinasa A, que inhiben la actividad de cinasa y favorecen la de fosfatasa. ____________________________________ Isoenzimas que participan en la Gluconeognesis Gluconeognesis y glicolisis estn coordinadas: una de las vas est relativamente inactiva y la otra funciona a velocidad elevada.

Razn: ambas rutas son altamente exergnicas y podran estar funcionando al mismo tiempo, con un resultado final de consumo de 2 ATP y 2 GTP por cada ciclo de reaccin. Sistema de control: las CANTIDADES Y ACTIVIDADES de los enzimas caractersticos de cada ruta estn controlados de tal manera que no pueden ser ambas rutas activas simultneamente: -Velocidad de la glicolisis: controlada por concentracin de glucosa. -Velocidad de la gluconeognesis: controlada por concentracin de lactato y otros precursores. ___________________________________ Gluclisis. La gluclisis, es la va metablica encargada de oxidar la glucosa con la finalidad de obtener energa para la clula. Consiste en 10 reacciones enzimticas consecutivas que convierten a la glucosa en dos molculas de piruvato, el cual es capaz de seguir otras vas metablicas y as continuar entregando energa al organismo. El tipo de gluclisis ms comn y ms conocida es la va de EmbdenMeyerhof, explicada inicialmente por Gustav Embden y Otto Meyerhof. El trmino puede incluir vas alternativas, como la va de Entner-Doudoroff. No obstante, gluclisis se usa con frecuencia como sinnimo de la va de Embden-Meyerhof. Es la va inicial del catabolismo (degradacin) de carbohidratos. Sin embargo, a pesar de que algunas de las enzimas de la gluclisis tienen varias isoformas. Hexocinasa (HK) La HK tiene cuatro isoenzimas (Tabla 1, la reaccin que cataliza se indica en la Fig. 2). HKI, HKII y HKIII tienen un peso molecular de 100 kDa y la glucocinasa (HKIV) un peso de 50 kDa; la diferencia entre las isoenzimas es su afinidad (Km) por la glucosa (HKIII >HKI > HKII>HKIV), que va de 0.003 hasta 5 mM. La actividad de las isoenzimas I-III es regulada por la concentracin de la glucosa 6fosfato (G6P) que ejerce mientras que la HKIV es insensible a esta inhibicin. La sobre-expresin de la HKII ocurre en la mayora de los tumores, en tanto que en tumores cerebrales se encuentra preferentemente la HKI. Con el incremento en la actividad de ambas isoenzimas de la HK se propicia un aumento en la velocidad de la gluclisis en las clulas

tumorales, debido a que ejercen un control significativo sobre esta va. Otra caracterstica que comparten las dos enzimas es que pueden unirse a la membrana externa mitocondrial, a travs de un segmento de 15 aminocidos hidrofbicos del extremo amino terminal. La asociacin de la HK es preferentemente con el canal dependiente de voltaje (VDAC); a travs de esta unin se puede impedir la salida del citocromo c mediado por Bax y Bid (protenas pro-apoptticas) con lo cual la clula tumoral se protege contra la apoptosis. Hexosa fosfato isomerasa (HPI) Esta enzima es un homodmero con dos subunidades de 63-kDa de la cual no se conocen isoenzimas. La HPI (tambin conocida como AMF, autocrine motility factor) adems de participar en la gluclisis, puede promover la migracin, la proliferacin celular y la metstasis. Es factible que esta sea la razn por la cual la hipoxia1 incrementa la expresin de esta enzima y se encuentre elevada en los tumores. Fosfofructocinasa tipo I (PFKI) La PFKI es un homo-heterotetrmero con un peso aproximado de 380 kDa, con tres isoenzimas. La PFK-M que se encuentra en el msculo, la PFK- L que se localiza en el hgado y la PFK-P o C que se encuentra preferentemente en las plaquetas. La combinacin de las tres isoenzimas se encuentra en el resto de los tejidos. La PFK-M tiene mayor afinidad por la fructosa 6-fosfato (F6P) (K0.5 = 0.6-2 mM) y es menos sensible a la inhibicin inducida por el ATP; la PKF-L es menos susceptible a la inhibicin por el citrato (Ki aparente = 0.18 mM); la PFK-P es la isoenzima que tiene la afinidad ms baja por F6P (K0.5=1.4-4 mM) y es la ms susceptible al efecto inhibitorio del citrato (Ki aparente = 0.08 mM) (17). Consecuentemente, resulta comprensible que en los tumores las isoenzimas PFK- L y PFK-M sean las que se expresan preferentemente, por su baja sensibilidad a sus inhibidores fisiolgicos (aunque el HIF-1 solo afecta la expresin de la PFK-L). Por lo que en las clulas tumorales la PFK se mantiene muy activa contribuyendo as al incremento de la gluclisis. Adems, cabe sealar que en las clulas tumorales se mantienen niveles elevados de la fructosa 2,6 bifosfato (F2-6BP), el activador ms potente que se conoce de la PFK tipo I (aspecto abordado en la seccin de la PFKII) y que reduce significativamente el efecto inhibitorio del ATP y el citrato. Aldolasa (ALD) La ALD es un tetrmero de subunidades de 40 KDa, de la cual existen tres isoenzimas (Tabla 1), la ALDA que se encuentra predominantemente en el msculo, la ALD-B que se encuentra el

hgado y la ALD-C en el cerebro, y combinaciones de ellas se distribuyen en todos los tejidos. Las ALDs A y C son ms eficientes en catalizar la reaccin de la fructosa 1,6 bifosfato (F1-6BP) a gliceraldehdo 3-fosfato (G3P) y dihidroxi acetona fosfato (DHAP) (F1-6BP > G3P + DHAP) de10 a 20 veces que la isoenzima B, en tanto que la ALD B presentan una mayor afinidad por G3P y DHAP que le permite generar fcilmente F1-6BP (reaccin reversa, G3P + DHAP > F1-6BP). Debido a esto, la ALD-A y C se encuentran preferentemente en los tejidos con activa gluclisis como el msculo, en cambio la ALD- B se encuentra preferentemente en los tejidos gluconeognicos como el hgado y el rin. El HIF-1 incrementa la expresin de las ALD- A y ALD-C, lo que favorece el incremento de la gluclisis. De manera interesante, la isoenzima A es la que se encuentra expresada predominantemente en los tumores, aunque cabe sealar que tambin se ha reportado el aumento en la expresin de las isoenzimas B y C. Gliceraldehdo 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) Esta enzima es un homo-tetrmero de subunidades de 37 KDa (14) (Tabla 1, la reaccin que cataliza se indica en la Fig. 2). Al igual que otras enzimas de la gluclisis, la GAPDH ejerce otras funciones. Por ejemplo, participa en la endocitosis, en la reparacin del ADN (debido a que es una uracil ADN glucosilasa y remueve uracilos), en la transcripcin, en la exportacin de tARN al ncleo y al parecer puede participar tambin en la apoptosis (15). En los tumores su incremento es inducido por el HIF-1 lo que puede favorecer alguna de las actividades antes descrita. Fosfoglicerato cinasa (PGK) La PGK es un monmero de 48 kDa que tiene dos isoenzimas; la PGK1 que se expresa en todas las clulas somticas y la PGK2 que se expresa solamente en el espermatozoide. El HIF-1 induce la expresin de la PGK1 y es la isoenzima que se ha encontrado sobre expresada en los tumores. La sobre-expresin de la PGK1 puede tener mayor relevancia en otros procesos que en la misma gluclisis, pues se ha determinado que la PGK1 participa en la generacin de la angiostatina (inhibidor de la angiognesis y la metstasis) que es un producto de la proteolsis de la plasmina. Despus de ser secretada por el tumor, la PGK1 reduce los enlaces disulfuro de la plasmina con lo cual quedan expuestas secciones que son eliminadas por proteasas, originando la angiostatina. Sin embargo, se desconoce la contribucin que puede tener la angiostatina en el desarrollo tumoral. Fosfoglicerato mutasa (PGAM)

Esta enzima cataliza la conversin del 3-fosfoglicerato (3PG) a 2fosfoglicerato (2PG) (Fig. 2) y tiene como cofactor al 2,3bifosfoglicerato (2,3BPG). La PGAM es un dmero (Tabla 1) compuesto por las isoenzimas A y B (AA, BB y AB) las cuales estn codificadas por dos genes diferentes. Los parmetros cinticos determinados en las isoenzimas de ratn indican que la afinidad de la PGAM-B por el 3PG (Km= 0.5 mM) y el 2,3BPG (Km = 25 M) es mayor con respecto a la PGAM-A (Km= 0.8 mM y 60 M). En tanto que la afinidad por el 2PG de ambas isoenzimas es similar (Km = 0.28 mM). En estudios realizados con fibroblastos de ratn se encontr que el incremento de ambas isoenzimas favoreca la proliferacin e inmortalizacin de estas clulas, en tanto que cuando se disminua su transcripcin con ARN de interferencia se induca una senescencia prematura. Por ello se les ha relacionado con la inmortalizacin de las clulas tumorales. La sobreexpresin de la PGAM-B se ha encontrado en diversos tipos de cncer (hgado, pulmn, colon y glndula mamaria). El HIF-1 regula la expresin de la PGAM-B. Enolasa (ENO) Es una metaloenzima dmerica (Tabla 1, la reaccin que cataliza se indica en la Fig. 2); cada subunidad tiene un peso molecular de 82100 KDa. Puede estar constituida por la combinacin de tres isoenzimas , , , encontrndose solo las siguientes combinaciones , , , , . La ENO- se encuentra en la mayora de los tejidos incluyendo el hgado, la ENO- se encuentra preferentemente en el msculo y la ENO- se encuentra en los tejidos cerebrales. La caracterizacin parcial indica que las isoenzimas tienen una afinidad similar por el 2PG (Km = 30 M). El gen de la ENO- es blanco del HIF1 y se ha observado el aumento en su transcripcin en diversos tipos de cncer. Esta isoenzima puede favorecer el crecimiento y la diseminacin de los tumores (metstasis), debido a que acta como receptor del plasmingeno. El sistema del plasmingeno se encarga de degradar los cogulos de fibrina que se generan en el organismo, as como de favorecer la migracin celular debido a que facilita la penetracin a travs de las barreras proteicas. Piruvato cinasa (PYK) Esta enzima es un tetrmero con cuatro isoenzimas. La PYK-L que se encuentra en hgado y rin (tejidos gluconeognicos) y la PYK- R que se expresa en eritrocito son codificadas por el mismo gen (compuesto de 12 exones), pero por el uso de promotores alternativos se transcribe una u otra isoforma. El promotor especfico para PYK-R se localiza en el exn 1 y para PYK-L en el exn 2. La isoenzima PYK-M1 se encuentra en cerebro, corazn y msculo y la PYK-M2 se expresa en las clulas con activa proliferacin como clulas embrionarias,

clulas stem, leucocitos, plaquetas y clulas tumorales. Las isoenzimas M1 y M2 son productos de un mismo gen sometido a splicing alternativo. La PYK-M1 es la nica isoforma que no presenta cooperatividad con respecto al fosfoenolpiruvato (PEP). La PYK-M1 tiene la mayor afinidad por PEP (Km = 0.08 mM), mientras que la PYK-R tiene la menor afinidad (Km = 1.4 mM). Tres de las cuatro isoenzimas (R, L y M2) se activan por F1-6BP (Ka = 0.06 a 0.4 M). El ATP ejerce una potente inhibicin sobre las isoformas L y R (Ki = 0.1 y 0.04 mM, respectivamente) y una ligera inhibicin sobre las isoformas M1 y M2 (Ki= 3 y 2.5 mM, respectivamente). La actividad de la PYK- L y PYK- R tambin se regula por fosforilacin/desfosforilacin en cambio, las isoenzimas M1 y M2 no son fosforiladas y por lo tanto no son reguladas por accin hormonal. El HIF-1 incrementa la expresin de la isoenzima M2, que es la principal isoenzima que se encuentra en tumores. Esto puede favorecer a la gluclisis por ser poco sensible al efecto inhibitorio del ATP y no ser regulada por fosforilacin. Adems, la PYK-M2 se encuentra como dmero (poco activa) y como tetrmero (activa). Lactato deshidrogenasa (LDH) Esta enzima es un tetrmero con 2 isoenzimas, LDH-A (isoenzima de msculo) y LDH-B (isoenzima de corazn) y con cinco combinaciones formadas a partir de las dos isoformas; LDH1 (B4), LDH-2 (B3A), LDH3 (B2A2), LDH-4 (BA3) y LDH-5 (A4), las cuales difieren en sus propiedades cinticas. En testculo y en los espermatozoides se expresa exclusivamente otra isoenzima de la LDH conocida como LDH-C4. En los tejidos en donde se generan grandes cantidades de lactato (hgado y msculo esqueltico) se encuentra predominantemente LDH-5 y LDH-4, isoenzimas con alto contenido subunidad A que preferentemente genera lactato a partir del piruvato. En cambio en aquellos tejidos que consumen lactato (corazn, eritrocito y rin) se encuentran predominantemente las isoenzimas con mayor proporcin de la subunidad B (LDH-1 y LDH-2) que tienen mayor afinidad por lactato (Km = 4 mM) con respecto a la isoenzima A (Km = 7 mM). Es claro que para favorecer el aumento en la velocidad de gluclisis y por lo tanto la produccin de lactato, el HIF-1 induce la sobreexpresin de la LDH- A (Fig. 2). Sin embargo, puede que el incremento en la cantidad de esta enzima tambin sea para favorecer otras de las actividades que realiza. Diversos reportes indican que la enzima se une a ADN de una sola cadena por lo cual se especula sobre su participacin en la transcripcin.

Fosfofructocinasa tipo II (PFK-II) Esta es una enzima homodimrica bifuncional con actividad de cinasa y bifosfatasa que se localizan en los extremos carboxilo y amino terminal, respectivamente (31). Regula las concentraciones de F2-6BP (el activador ms potente de la PFK-I), ya que la cinasa sintetiza F26BP a partir de F6P y ATP, en tanto que la bifosfatasa degrada la F26BP a F6P y fosfato inorgnico (Fig. 2).As, la relacin cinasa/bifosfatasa determina que reaccin se favorece y por lo tanto el contenido de F2-6BP en la clula. A su vez, las dos actividades en la enzima se regulan por algunos metabolitos (PEP, -glicerol fosfato y citrato) y por fosforilacin en la serina 32 por la protena cinasa A, que inhiben la actividad de cinasa y favorecen la de fosfatasa. Isoenzimas que participan en la Gluconeognesis Gluconeognesis y glicolisis estan coordinadas: una de las vas est relativamente inactiva y la otra funciona a velocidad elevada. Razn: ambas rutas son altamente exergnicas y podran estar funcionando al mismo tiempo, con un resultado final de consumo de 2 ATP y 2 GTP por cada ciclo de reaccin. Sistema de control: las CANTIDADES Y ACTIVIDADES de los enzimas caractersticos de cada ruta estn controlados de tal manera que no pueden ser ambas rutas activas simultaneamente: -Velocidad de la glicolisis: controlada por concentracin de glucosa. -Velocidad de la gluconeognesis: controlada por concentracin de lactato y otros precursores. Glucosa 6 fosfatasa La familia de la glucosa-6-fosfatasa incluye dos fosfohidrolasas funcionales: G6Pase- (del gen G6PC) y G6Pase- (del gen G6PC3). La primera de ellas es el prototipo. G6Pase- y G6Pase- comparten estructura similar del sitio activo, topologa, mecanismo de accin y propiedades cinticas con respecto a la hidrlisis de la glucosa-6fosfato. Fructosa-1,6-bisfosfato

La fructosa-1,6-bisfosfato es una molcula de fructosa fosforilada en los carbonos 1 y 6. La forma -D de este compuesto es muy comn en las clulas. La gran mayora de las molculas de glucosa y fructosa que entran en la clula son rpidamente convertidas a sus respectivas formas fosforiladas, glucosa-6-fosfato y fructosa-6-fosfato, con el fin de impedir que puedan atravesar la membrana plasmtica y difundir al medio extracelular, algo muy difcil al poseer un grupo cargado como es el fosfato en su estructura. La fructosa-6-fosfato tiene solo un ismero biolgicamente activo, la forma -D. El resto de ismeros, si bien existen, no pueden participar en ningn proceso biolgico. Glucogenlisis Glucgeno Est presente en la mayora de las clulas animales. Abunda en el hgado (10% peso) y en msculo esqueltico (fibra muscular blanca, 3% peso). Es un polmero de la glucosa y, por tanto, una forma de almacenamiento de glucosa dentro de la clula que le sirve de reservorio energtico. Es de elevado peso molecular, y sin embargo es soluble en agua. Una funcin similar la desempea el almidn en el mundo vegetal. __________________________________ Las Isoenzimas son enzimas que difieren en la secuencia de aminocidos, pero que catalizan la misma reaccin qumica. Estas enzimas suelen mostrar diferentes parmetros cinticos (i.e. diferentes valores de KM), o propiedades de regulacin diferentes. La existencia de las isoenzimas permite el ajuste del metabolismo para satisfacer las necesidades particulares de un determinado tejido o etapa del desarrollo. En bioqumica, las isoenzimas son isoformas (variantes estrechamente relacionadas) de las enzimas. En muchos casos, son codificadas por genes homlogos que han divergido con el tiempo. Aunque de forma estricta, las aloenzimas representan enzimas de diferentes alelos de un mismo gen y las isoenzimas representan enzimas de diferentes genes cuyos productos catalizan la misma reaccin, los dos trminos se suelen usar indistintamente. Conclusin. Las isoenzimas son utilizadas en los procesos anteriores cuando se requiere de alguna en especial, o en diferentes sitios donde se lleve a cabo el proceso.

Un ejemplo de una isoenzima es la glucoquinasa, una variante de hexoquinasa que no es inhibida por la glucosa-6-fosfato. Sus diferentes funciones de regulacin y su menor afinidad por la glucosa (en comparacin con otros hexoquinasas), le permiten tener diferentes funciones en las clulas de determinados rganos, como el control de la liberacin de insulina por las clulas beta del pncreas, o la iniciacin de la sntesis de glucgeno por las clulas del hgado. Ambos procesos deben ocurrir solamente cuando la glucosa es abundante, u ocurre algn problema.

Abzimas
La mayora de los anticuerpos se diferencian de otras protenas por no presentar catlisis enzimtica en su funcin, por lo que tradicionalmente se consideran protenas de reconocimiento de superficies moleculares. Sin embargo, en la dcada de los aos 90 del siglo y principios del siglo XXI diversos estudios de inmunologa encontraron anticuerpos con propiedades catalticas, dichos anticuerpos han recibido el nombre de Abzimas. Dichas inmunoglobulinas se encuentran en cantidades bajas en el suero de personas sanas. Un ejemplo de la existencia de las abzimas en el cuerpo humano fue la deteccin de Abzimas contra ADN en la leche materna. Entre algunas otras de estas actividades catalticas detectadas estn las de peptidasas inespecficas y amilolticas (degradacin de almidn). Por otro lado se ha observado un incremento en el nivel de abzimas en enfermedades de tipo autoinmune. _____________________________ 1. CONCEPTO DE ABZIMAS La habilidad de los anticuerpos para complementar al antgeno ha sido explotada exitosamente para producir anticuerpos catalticos. Debido a la actividad cataltica de estos anticuerpos, se les denomina abzimas. Por tanto, las abzimas son anticuerpos monoclonales con actividad cataltica. Tambin reciben el nombre de catmab, abreviatura en ingls de catalytic monoclonal antibody (anticuerpo cataltico monoclonal). Estos anticuerpos catalticos estn inhibidos fuertemente por los haptenos, que son sustancias qumicas de pequeo peso molecular que no inducen por s solos la formacin de anticuerpos, pero que al unirse a una protena transportadora estimulan una respuesta inmunitaria.

Algunas caractersticas importantes de la abzimas: * Son muy especficas y eficientes. * Son inhibidas fuertemente por el producto de reaccin. * Sus anlogos en el estado de transicin (haptenos) deben de ser estables. * Poseen actividad cataltica. Las abzimas son potenciales herramientas de la biotecnologa, por ejemplo, pueden usarse para algunas manipulaciones en el ADN. Las enzimas funcionan disminuyendo la energa de activacin del estado de transicin y catalizando as la formacin de un intermediario que de otro modo sera menos favorable entre reactivos y productos. Si se desarrolla un anticuerpo contra una molcula estable, que es semejante a un intermediario inestable de otra reaccin (que potencialmente no est relacionada), el anticuerpo desarrollado se unir enzimticamente a l y estabilizar el estado intermediario, catalizando as la reaccin. De este modo se produce un tipo nuevo de enzimas. Las abzimas normalmente se sintetizan de forma artificial, aunque en ocasiones se encuentran en algunos organismos y en humanos, como en el caso de los auto-anticuerpos anti-pptido vasoactivo intestinal, y en el caso del lupus eritematoso en el que los autoanticuerpos se pueden unir al ADN e hidrolizarlo. A lo largo de los aos y tras varias investigaciones, se descubri que las abzimas eran capaces de catalizar ms de 100 reacciones diferentes. En algunos casos, las tasas de las reacciones qumicas catalizadas por abzimas son cercanas e incluso a veces superiores a las de las reacciones catalizadas por las enzimas anlogas. Un ejemplo de la existencia de abzimas en el cuerpo humano fue la deteccin de abzimas contra ADN en la leche materna. Entre otras de estas actividades catalticas detectadas, estn las de peptidasas inespecficas y amilolticas (degradacin de almidn). Por otro lado se ha observado un incremento en el nivel de abzimas en enfermedades de tipo autoinmune. 2. DESCUBRIMIENTO HISTRICO Linus Carl Pauling fue un qumico estadounidense de renombre del siglo XX que, entre otras investigaciones y hallazgos, estudi las reacciones enzimticas. Pauling form parte del grupo de los primeros cientficos que demostraron que las enzimas actan estabilizando los estados de transicin de las reacciones qumicas, razn fundamental para poder comprender sus mecanismos de accin. Adems de esto, Pauling fue tambin pionero en proponer que los anticuerpos se enlazan a los antgenos gracias a una compatibilidad entre sus estructuras. Contribuy, junto con otros

investigadores, a la fabricacin de anticuerpos artificiales, y a la de un sustituto del plasma sanguneo. La posibilidad de la induccin de anticuerpos catalticos (abzimas) fue sugerido inicialmente por Pauling en 1948, que seal las caractersticas entre los mecanismos de reconocimiento antgenoanticuerpo y la interaccin de un estado de transicin con una enzima. A continuacin fue Jencks, en el ao 1969, quien propuso la hiptesis de que los anticuerpos obtenidos durante la inmunizacin en el estado de transicin podran catalizar las reacciones qumicas correspondientes. Finalmente esto fue confirmado de forma independiente por el grupo de Lerner y Schultz en 1986, qumicos de la Universidad de California (Berkeley), describiendo la manera de combinar anticuerpos y abzimas para crear productos teraputicos. 3. PROCESO DE OBTENCIN DE ABZIMAS La tcnica que se usa para la produccin de anticuerpos monoclonales ser realiza mediante hibridomas, que son clulas hbridas resultantes de la fusin de clulas extradas del bazo de un animal (linfocitos) con clulas cancerosas inmortales y de reproduccin rpida (mielomas). La ventaja ms importante de esta tcnica es que se pueden seleccionar clones de hibridomas individuales que produzcan un anticuerpo en particular dentro de una gran mezcla de clulas hbridas diferentes (anticuerpos policlonales), que producen una variedad de anticuerpos diferentes. El proceso de produccin de anticuerpos monoclonales (AcM) es complejo. Bien pueden ser producidos en cultivos celulares o bien en animales. Las fases en el proceso de produccin son las siguientes: 1. Primero se extraen clulas B del bazo del animal que ha sido expuesto al antgeno. 2. Las clulas B se fusionan con las clulas tumorales de mieloma mltiple en presencia de polietilenglicol, que pueden crecer indefinidamente en cultivo celular. Esta fusin hace a las membranas celulares ms permeables. 3. Las clulas fusionadas hbridas (hibridomas), pueden multiplicarse rpida e indefinidamente. Estn lo suficientemente diluidos y cultivados para obtener un nmero diferente de determinadas colonias, las cuales producen un slo tipo de anticuerpo. 4. Los anticuerpos de diferentes colonias son analizados para conocer su capacidad de unirse a un antgeno determinado, por ejemplo mediante tcnicas de inmunoensayo como ELISA

(Ensayo por inmunoabsorcin ligado a enzimas). De este modo pueden seleccionarse y aislarse de la manera ms efectiva. Las clulas hbridas obtenidas tras el proceso de fusin contienen un nmero elevado de cromosomas (72 del mieloma y 40 del linfocito B) que en las sucesivas divisiones celulares se irn perdiendo hasta oscilar entre 70 y 80 cromosomas. Como consecuencia de dicho proceso, algunas clulas pierden la capacidad de secrecin de anticuerpos o bien funciones bsicas para la viabilidad celular. Por ello tan pronto como se identifica como positivo un pocillo se somete a un proceso de clonacin para evitar el crecimiento de clulas no productoras que al ser metablicamente ms eficientes acabaran por dominar el cultivo. 4. RELACIN DEL CONCEPTO DE ABZIMA CON LA TEORA DE ESTABILIZACIN DEL ESTADO DE TRANSICIN DE PAULING Como hemos comentado anteriormente, la profundizacin en el mecanismo de accin de las enzimas, como complementarias del estado de transicin de los sustratos, tal y como haba sugerido Pauling en 1948, llev a varios investigadores en la dcada de los 80 a producir anticuerpos monoclonales frente a haptenos, que no son ms que los anlogos estructurales al estado de transicin de algunos sustratos. Estos anti-cuerpos son las abzimas, propiamente dichas. Sabemos que las enzimas actan estabilizando los estados de transicin de los sustratos, tal y como haba postulado Pauling en 1948, funcionan disminuyendo la energa de activacin del estado de transicin. Si se desarrolla un anticuerpo contra una molcula estable que sea semejante al estado de transicin, hapteno, el anticuerpo desarrollado se unir enzimticamente al sustrato de la reaccin y establecer mltiples interacciones, estabilizando el estado intermediario y catalizando de ese modo la reaccin. Se sabe que los ribozimas, que son molculas de RNA, pueden tener la capacidad cataltica semejante a las protenas. El concepto de enzima se amplifica con las ribozimas y los anticuerpos catalticos o abzimas. Los anticuerpos monoclonales catalticos muestran una especificidad para el sustrato an mayor, si cabe, que las enzimas. Las constantes de disociacin para los haptenos, anlogos a los sustratos en el estado activado, son del orden de 10-11 M. Debe tenerse en cuenta, que como consecuencia puede darse una mayor susceptibilidad a la inhibicin por los productos de la reaccin, una de las caractersticas comentada en el primer apartado de este escrito. En su lugar, discutimos tambin los factores causantes del aumento de velocidad de una reaccin catalizada por enzimas frente a la misma reaccin no catalizada. Desde el punto de vista terico, a partir de una aproximacin

cintica, hemos deducido que el poder cataltico de una enzima era proporcional a la constante de equilibrio terica de la unin del complejo enzima-sustrato activado, Kt. As pues, desde el punto de vista terico, resulta relativamente fcil predecir el mecanismo de accin de las abzimas, sin embargo, el desarrollo de anticuerpos capaces de unir a un hapteno anlogo estructural del sustrato activado, y que, consecuentemente, puedan bajar la energa de activacin necesaria para llevar al sustrato al estado de transicin, presenta numerosos problemas en la prctica. Las primeras reacciones que se estudiaron donde intervenan los anticuerpos catalticos fueron procesos de hidrlisis, ya que la barrera energtica a superar en estos procesos es relativamente baja. La hidrlisis de un ster supone un estado de transicin, o intermedio de reaccin (postulado por Ammn), por la adicin de una molcula de agua. El enlace ster es complanar, la adicin de una molcula de agua origina un estado de transicin que tiene una estructura tetradrica en la que el carbono ocupa la el centro del tetraedro. En el estado de transicin los enlaces no slo cambian de orientacin, sino que tambin se un 20% con respecto a su longitud normal. Este compuesto altamente inestable indica claramente que el ster, por si mismo no puede servir de antgeno para producir anticuerpos catalticos. Sin embargo, un anlogo del estado de transicin que fuera estable s que podra utilizarse como hapteno. En la siguiente figura podemos distinguir: A) La hidrlisis de un ster, donde el estado de transicin supone la adicin de una molcula de agua formndose un estado intermedio tetradrico y polarizado. B) En el anlogo estructural en el estado de transicin, el carbono central se ha sustituido por un tomo de fsforo. El fosfeno es estable y simula la geometra y distribucin de carga del estado de transicin. Los anticuerpos frente al hapteno resultaron poseer capacidad cataltica para hidrolizar steres. Como se haba postulado, el hapteno result ser un fuerte inhibidor de la hidrlisis del ster. Las abzimas son muy especficas y eficientes. Poseen capacidad para distinguir las formas estereoqumicas de una molcula. La estereoespecifidad del anticuerpo es probablemente debida a que la cavidad de unin se genera para reconocer una nica forma del estado de transicin de la reaccin. La estereosespecifidad de los anticuerpos, los hace potencialmente capaces de desempear un papel muy importante como catalizadores artificiales en procesos industriales. Adems de las reacciones de hidrlisis, otra serie de reacciones como transacilacin, isomerizacin, procesos asociativos y reacciones redox han sido estudiadas.

Las abzimas muestran una cintica de Michaelis-Menten, cintica de tipo hiperblico. En la siguiente tabla se resaltan algunos parmetros cinticos de algunos anticuerpos monoclonales. 5. APLICACIONES Los anticuerpos monoclonales catalticos son una herramienta inmunoqumica muy poderosa. Este hecho se debe a sus caractersticas especiales: * Especificidad de unin. * Homogeneidad. * Capacidad para ser producidos en cantidades ilimitadas. En el campo de la medicina, los anticuerpos catalticos han ido sustituyendo a los antisueros convencionales (mezcla variable de especies qumicas que nunca se pueden reproducir cuando se agota el material original), en ciertos mtodos, radioinmunoensayo, y muchas empresas ya los estn comercializando. Otra aplicacin puede ser la interactuacin con protenas para el marcaje y localizacin de la misma en una clula especfica de un rgano o dentro de la clula en un compartimiento subcelular especfico. En el campo de la clnica, en el diagnstico y la teraputica, se unen e inactivan protenas txicas (toxinas) secretadas por bacterias patgenas. Se est trabajando en la posible utilizacin de estos anticuerpos monoclonales en la terapia directa, por ejemplo la inmunizacin pasiva, como una inyeccin directa de un anticuerpo al paciente. Otras posibilidades de uso, en el mbito de las enfermedades y los frmacos: * En la desintoxicacin de la cocana se utilizan anticuerpos anticocana (abzimas) como tratamiento en pacientes adictos a sta para evitar los efectos letales de la sobredosis. La abzima acta rompiendo la molcula de cocana en enlaces especficos, eliminando sus efectos txicos. * Como frmacos antitumorales las clulas cancerosas contienen determinantes nicos en su superficie, que no tienen las clulas normales, llamados antgenos de clulas tumorales. Las abzimas se unen especficamente a los antgenos de las clulas tumorales, as los frmacos usados para tratar el cncer se pueden dirigir directamente al tumor. Por ejemplo, el HERCEPTIN, que es una abzima que acta sobre las clulas cancerosas de las mamas. Indagaremos un poco ms en estos dos interesantes ejemplos, para conocer mejor la accin de las abzimas en diferentes mbitos de la ciencia. Anticuerpos de la cocana La cocana posee un problema principal: es un bloqueador. Por lo tanto, si se crean anlogos de esta sustancia seguiran teniendo esta caracterstica, lo que supone un problema. Como solucin a este problema, se pens en buscar un bloqueador de la cocana que actuara a nivel de circulacin sangunea, antes

de que sta llegara al sistema central, que es su dominio de actuacin. Se escogieron como bloqueadores a los anticuerpos catalticos, debido a su larga vida media cuando estn presentes en la sangre. Se hicieron experimentos con cocana (+) y cocana (-) para ver si la unin era estereoespecfica, pero para sorpresa de los investigadores no se obtuvieron seales de la cocana (+). Por qu? Despus de ms indagaciones se vio que era debido a la presencia de una esterasa en la sangre: la butirilcolinesterasa (BuChE), responsable de la degradacin de la cocana (+). Esta esterasa ataca a ambos estereoismeros pero con distinta afinidad, siendo la vida media en sangre para el estereoismero (-) de 10-20 minutos y para el otro, es de 5 segundos. La enzima tiene una vida media de das. Por esta razn se eligieron a los anticuerpos catalticos, para aumentar la especificidad y la vida media. La hidrlisis de un ster, como comentamos anteriormente, se produce a travs de un compuesto intermediario tetradrico y da como producto un cido carboxlico y un alcohol. Este compuesto es el estado de transicin de la reaccin. La enzima estabiliza este estado unindose a l, y estabilizando las cargas y favoreciendo la reaccin, disminuyendo la energa del compuesto intermedio. Por lo que, si un anticuerpo se une al estado de transicin disminuyendo su energa actuar como un catalizador y acelerar la reaccin. El ster benzoilo proporciona el eptopo del anticuerpo proporcionando especificidad, y la reaccin de hidrlisis es una de las ms simples. Estas dos caractersticas hacen posible una degradacin rpida de la cocana. Otras de las aplicaciones importantes de las abzimas es la obtencin de catalizadores de diseo especficamente para reacciones en las que no se dispone de enzimas adecuadas. Por ejemplo, en reacciones de rotura de enlaces ster, en adiciones, eliminaciones, condensaciones aldlicas, oxidoreducciones e incluso en algunas transformaciones dependientes de cofactor. Como caso particular se estudiar la sntesis de epotilonas y las metalo-protenas. Sntesis de epotilonas Se han creado anticuerpos catalticos para la completa va de sntesis de estas molculas, por reaccin inmunolgica con el compuesto 6-(4-glutaramidofenil) hexan-2,4-dieno. Se purificaron dos aldolasas: 38C2 y 33F12. Los epotilenos son molculas con gran inters debido a su importancia mdica. El tipo A y B son un potente agente citotxico aislados de myxobacterias. Su modo de accin se basa en la estabilizacin de los microtbulos celulares. Los precursores de A y B, es decir, C y D, tienen efecto en la polimerizacin de la tubulina.

Muchos derivados de estos han sido sintetizados para estudios in vivo e in vitro de la polimerizacin de tubulina.

RIBOZIMAS.
Al igual que las enzimas, las Ribozimas actan como catalizadores, poseen sitios activos que se unen a sustratos y no se consumen durante la reaccin qumica que catalizan. Las Ribozimas actan especficamente sobre cadenas de RNA de las que eliminan segmentos para luego empalmar los segmentos residuales. En este aspecto las Ribozimas cumplen funciones ms limitadas que las de las enzimas debido a que actan sobre un espectro de sustrato ms estrecho. Caractersticas: Molculas de ARN que catalizan una reaccin qumica. Las Ribozimas aumentan sustancialmente la velocidad de reaccin (3,4,5,6). Asi las constantes cinticas son comparables a la de las enzimas protecas. Han sido definidas como falsas enzimas dado que las mismas no permanecen inalteradas o recuperan su estructura molecular despus de la reaccin. (hay un solo ciclo de reaccin). Pueden usar cofactores como imidazol y presentar regulacin alostrica Las versiones sintticas son ms parecidas a las enzimas verdaderas y en algunos casos, como la ribonucleasa P, la actividad cataltica del ARN puede observarse in vitro, en ausencia de protenas, promoviendo varios ciclos de reaccin. Tambin el ADN puede tener este tipo de actividad y se las llama deoxiribozimas. Estructura: Su estructura molculas a semejanza de los catalizadores proteicos presenta pliegues dando origen a estructuras tridimensionales que forman sitios activos como hendiduras profundas, protegidas, e inaccesibles a solventes. Mediante esta estructura terciaria se facilita la catlisis orientando los sustratos al sitio cataltico.

Ribozima grupo I intrn Diagrama de cintas de la estructura terciaria. El sitio cataltico est formado por dos dominios P4-P6 y P3-P9 RIBOZIMAS NATURALES: Las Ribozimas que estn presentes en la naturaleza son de distinto tipo, se conocen: * Grupo I intrn (3,4,5,6): Remueven intrones mediante dos transesterificaciones produciendo uniones 3-5 y un 3-OH. El mecanismo de accin involucra el sitio de unin al nucletido, ataque nucleoflico (3-OH de una guanosina exgena) y catlisis mediada por metales. Se encontraron en los ncleos de protozoos, mitocondrias de hongos, cloroplastos de algas, bacterias y sus fagos. * Grupo II intrn (3,4,5): Producen el autoclovaje de intrones via dos transesterificaciones, produciendo una unin inicial 2-5 y un 3-OH. El mecanismo involucra ataque nucleofilico por un 2 OH de una adenosina especial dentro del intron que produce un cambio en la estructura del RNA (formando un lazo). Se cree que los iones de Mg estn dentro del intrn partipando de la catlisis. Esta clase se encontr en basterias y genes de organelas de levaduras de clulas eucariota. Reacciones catalizadas por las Ribozimas: grupo I intrn (NOH: 3-OH de una guanosina), grupo II intrn (NOH: 2-OH de una adenosina dentro del intrn) y RNasaP (NOH: H2O) * Ribonucleasa (Rnasa) P (3,4,5): Cataliza la hidrolisis sitio especifica de precursores de RNA incluyendo tRNA, RNa5S y la partcula de reconocimiento de RNA (SRP). Estos sustratos comparten probablemente caractersticas estructurales que permiten el reconocimiento especifico por RnqasaP posicionando los fosfatos reactivos en el sitio de unin para el ataque nucleofilico por una molcula de agua. Acta como una endorinonucleasa hidrolitica que cliva el extremo 5 de RNA para producir 5 fosfato y 3-OH RnadaP es un complejo RNA- protena cuya actividad cataltica en bacterias reside en el componente RNA, en humanos no es activa sin el clivaje de mltiples sustratos. Tiene 300 a 400 nucletidos de largo, forma dos dominios uno de los cuales tienen el sitio de reconocimiento del sustrato y el otro el sitio activo. * Cabeza de martillo (hammerhead) (3,4,8): Es la ribozima ms pequea, consiste en un RNA de 40 nucletidos que se autocliva, contienen un motivo altamente conservado que ha sido encontrado en varios viroides y virus satlites de RNA que se autoreplican a travs de un mecanismo de circulo rodante (rolling-circle). Su estructura involucra tres ramas cortas I,II y III tienen una conformacin en Y las ramas estn conectadas en una secuencia

altamente conservada, donde se encuentran los nucletidos esenciales para catlisis. La rama I contiene el residuo citosina 17 que contiene la unin que se cliva. Cataliza el clivaje sitio especifico de sus propias uniones fosfodiester por un ataque nucleofilico del 2-OH al fosfato a ser escindido. Se cree que hay iones divalentes que participan en el mantenimiento de la estructura. Estructura de la ribozima cabeza de martillo. En azul se indica un DNA inhibidor de la ribozima. El sitio cataltico est en color rojo. La rama I y II en verde y la II en prpura * El virus de hepatitis delta (HDV) y horquilla (Hairpin): Catalizan la misma reaccin que la ribozima tipo cabeza de martillo y son los responsables de clivar intermediarios generados durante la replicacin de HDV y de virus satlites de RNA de las plantas. Ribozimas sintticas. Ribozimas in vitro (6,8,9) parten de secuencias de RNA seleccionadas al azar, luego separan a las molculas en base a su habilidad para realizar funciones bioqumicas, el material seleccionado es amplificado y el ciclo de seleccin y amplificacin es repetido hasta que las secuencias activas dominan el conjunto. Por ltimo se puede introducir mutaciones para ampliar la diversidad de secuencias. Incorporando de esta manera las caractersticas ms relevantes de la evolucin. Mediante est tcnica lograron sintetizar catalizadores de RNA ms eficientes que pueden intervenir en otro tipo de reacciones, tal como formar nucletidos a partir de un azcar y una base, o sintetizar uniones amida. Se disean Ribozimas para cortar determinadas RNA con fines teraputicos, remedando la estructura y la actividad cataltica de las Ribozimas naturales conocidas. PUEDEN SER APLICADAS PARA VARIOS PROBLEMAS MDICOS, COMO EL CNCER Y EL SIDA, TENIENDO EN CUENTA QUE SI LA MOLCULA DE RAN ES CLIVADA ANTES DE LLEGAR AL RIBOSOMA, LA CODIFICACIN QUE ENCIERRA ESA CADENA NUNCA SE EXPRESAR COMPLETAMENTE. ABZIMAS. Son anticuerpos con actividad cataltica que se han sintetizado artificialmente. El diseo de Abzimas se basa en dos principios. El primero es la capacidad del sistema inmunitario para reconocer cualquier ordenacin de tomos en al antgeno extrao y producir un lugar de unin en la inmunoglobulina resultante exquisitamente adaptado para unirse a dicho antgeno. El segundo es que la unin fuerte a sustratos similares al estado de transicin reduce la barrera energtica a lo largo del curso de la reaccin.

En los Abzimas se utiliza como hapteno un anlogo del estado de transicin. Caractersticas: Son muy especficas y eficientes, mayor sensibilidad a la inhibicin por el producto de la reaccin. Los anlogos deben ser estables. Las Abzimas son normalmente constructos artificiales, pero tambin se encuentran en los organismos normales y en humanos, como en el caso de los autoanticuerpos antipptido vasoactivo intestinal, y en el caso del lupus eritematoso en el que los autoanticuerpos se pueden unir al ADN e hidrolizarlo. Las abzimas son potenciales herramientas de biotecnologa, por ejemplo, para efectuar determinadas manipulaciones en el ADN. Las enzimas funcionan disminuyendo la energa de activacin del estado de transicin y catalizando as la formacin de un intermediario que de otro modo sera menos favorable entre reactivos y productos. Si se desarrolla un anticuerpo contra una molcula estable que es semejante a un intermediario inestable de otra reaccin (que potencialmente no est relacionada), el anticuerpo desarrollado se unir enzimticamente a l y estabilizar el estado intermediario, catalizando de ese modo la reaccin. De este modo se produce un tipo nuevo de enzimas.

GRANZIMAS
Las protenas responsables de esta citotoxicidad son la perforina y las granzimas, de las cuales las dos ms importantes son la granzima A y la granzima B. La perforina, que interacciona con las membranas celulares, permite el acceso de las granzimas al interior de la clula diana. Las granzimas son proteasas que, una vez en el citoplasma de la clula diana, inducen muerte celular por apoptosis. Hasta el momento, los mecanismos bioqumicos por los cuales las granzimas inducan apoptosis se basaban en experimentos en los cuales estas protenas recombinantes o purificadas, se aadan en grandes cantidades sobre las clulas diana en presencia de dosis sublticas de perforina. Estos estudios, que no son reflejo de la

situacin fisiolgica, en la que el CTL concentra la carga de sus grnulos en el pequeo espacio de contacto con la clula diana, haban conducido a resultados a veces contradictorios. En el estudio mencionado, se utiliz una coleccin de ratones knockout o deficientes para las molculas relevantes en este proceso, realizados todos sobre el mismo fondo gentico B6, y que slo estn disponibles en el laboratorio del Dr. Markus M. Simon. Para estudiar cmo inducan muerte celular los sistemas perforina/granzima A o perforina/granzima B separadamente, se utilizaron respectivamente CTL procedentes de ratones knockout para la granzima B(gzmB-/-) o para la granzima A (gzmA-/-). Como control de que stas eran las nicas vas apoptticas que estaban funcionando se utilizaron tambin ratones knockout para la perforina (perf-/-) o doble knockout para ambas granzimas (gzmAxB-/-). De hecho, se demostr que los CTL de ratones perf-/- o gzmAxB-/- eran incapaces de inducir muerte sobre la clula diana escogida, el linfoma de ratn EL4.F15.

En la parte superior de la Figura anterior , tanto los CTL de ratones normales (B6) como de ratones gzmA-/- o gzmB-/- son capaces de inducir dao a la membrana plasmtica, como puede verse por el aumento de clulas permeables al ioduro de propidio (PI) y en las que se observa exposicin de fosfatidilserina en la membrana externa, detectada por tincin con anexina-V-FITC. Por otra parte, como se muestra en la parte inferior de la anterior figura, CTL procedentes de esos mismos ratones son capaces de inducir dao mitocondrial, como puede verse por la cada de potencial mitocondrial estimada con la sonda fluorescente DiOC 6(3) y por la produccin de radicales libres de oxgeno (ROS), estimada mediante la oxidacin del 2-hidroxietidio (2-HE). Estos datos indican que ambas granzimas son capaces de inducir muerte celular por apoptosis. Sin embargo, las vas apoptticas

activadas por ambas granzimas son diferentes, ya que mientras que los CTL procedentes de ratones normales o gzmA-/- inducen la activacin de las caspasas-3 y -9, proteasas intracelulares cuya activacin est implicada en diversos procesos apoptticos, los procedentes de ratones gzmB-/- no son capaces de activarlas.

En la parte superior de la figura anterior, en la que vemos el nivel de activacin de la caspasa-3 por tincin con un anticuerpo especfico unido a fluorescena en clulas EL4.F15 no tratadas con los CTL (histogramas en negro) o tratadas con CTL especficos (histogramas en rojo). Por otra parte, el inhibidor general de caspasas Z-VAD-fmk previene totalmente el dao en la membrana inducido por CTL de ratones gzmA-/- pero no el inducido por ratones B6 o gzmB-/-, como puede verse en la parte inferior.

La activacin de las caspasas no es afectada por el inhibidor de radicales libres N-acetil-cistena (NAC; panel superior, histograma azul). El dao a la membrana inducido por Linfocitos T Citotxicos (CTL) de ratones GzmB-/- es prevenido totalmente por NAC (panel inferior, barras negras). Por otra parte, el NAC no afecta a la activacin de la caspasa-3, como puede verse en los histogramas azules de la parte superior de la Figura 4. Sin embargo, a pesar de inhibirse el dao a la membrana y

la fragmentacin del DNA en las situaciones descritas, la muerte celular sigue producindose en todos los casos cuando se juzga mediante un ensayo de recrecimiento Estos datos indican que: 1. El sistema perforina/granzima B induce apoptosis a travs de la activacin de las caspasas, implicando a la va mitocondrial. 2. El sistema perforina/granzima A induce apoptosis a travs de la generacin de radicales libres (ROS), implicando tambin a la mitocondria, pero en ausencia de activacin de caspasas 3. Las granzimas A y B activan mecanismos alternativos de induccin de muerte celular que no dependen de las vas descritas hasta el momento.

Ni los inhibidores de caspasas ni el NAC son capaces de prevenir la muerte inducida por Linfocitos T Citotxicos (CTL) procedentes de ratones B6 o de ratones GzmA-/- o GzmB-/- en un ensayo de recrecimiento a largo tiempo. Estas conclusiones se esquematizan en siguiente figura:

Primer estudio con ensayos de citotoxicidad con CTL enteros Este es el primer estudio sobre este tema realizado en condiciones fisiolgicas, esto es, utilizando ensayos de citotoxicidad con CTL enteros y no molculas aisladas, poniendo de manifiesto las diferencias entre ambas granzimas. La gran capacidad de las granzimas para activar diferentes vas de muerte celular puede ser reflejo de la adaptacin del sistema inmunitario para evitar los mecanismos de escape de los patgenos o de los tumores. Estos resultados pueden tener relevancia en el tratamiento de infecciones virales, as como en la inmunoterapia del cncer o en la prevencin del rechazo crnico de transplantes, que tambin se produce por la accin de los CTL. Este estudio ha sido publicado recientemente en la prestigiosa revista Journal of Cell Biology, una de las revistas punteras a nivel internacional en el campo de la Biologa Celular, con un factor de impacto de 12. sta y otras Referencias de este estudio Composicin y objetivos del Grupo AApoptosis, inmunidad y cncer Reconocido como Grupo de Excelencia Investigadora por el Gobierno de Aragn (2005), incluye a unas 20 personas del Departamento de Bioqumica de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Zaragoza y del Servicio de Inmunologa del Hospital Clnico Universitario. Pretende avanzar en el conocimiento de los mecanismos de muerte celular implicados tanto en la funcin efectora y la regulacin del sistema inmunitario como en la etiologa y desarrollo del cncer. El trabajo del grupo se subdivide en cuatro lneas de investigacin, que estudian la relacin entre la muerte celular y, respectivamente, el cncer, las protenas de fase aguda, la regulacin y la funcin efectora del sistema inmunitario. El objetivo concreto de esta ltima lnea sera la caracterizacin de los mecanismos por los que los linfocitos T citotxicos (CTL) ejercen su funcin, para aplicar este conocimiento al tratamiento de infecciones virales, a la inmunoterapia del cncer o a la prevencin del rechazo crnico de transplantes, procesos todos ellos dependientes de la accin de los CTL.

Son varios los mecanismos por los cuales los CTL inducen muerte en las clulas tumorales o infectadas por virus, y nuestro trabajo desde 1995 ha realizado aportaciones al conocimiento de todos ellos. En concreto, describimos ya en 1996 que la muerte inducida por los CTL a travs de la ligacin de receptores de muerte era dependiente de la activacin de unas proteasas intracelulares llamadas caspasas. Fuimos tambin pioneros en la caracterizacin de un novedoso mecanismo de muerte celular inducido por una molcula citotxica de estos CTL descubierta en 1997, llamada granulisina, en colaboracin con el grupo del Dr. Alan Krensky, de la Universidad de Stanford. Y finalmente, esta vez en colaboracin con el grupo del Dr. Markus M. Simon, del Instituto de Inmunobiologa de Friburgo, hemos realizado varias aportaciones en el estudio del tercer mecanismo que los CTL puden utilizar para matar a otras clulas, el sistema perforina/granzimas. Para ello se han utilizado CTL procedentes de ratones knockout o deficientes para la perforina y/o las granzimas A o B.

ENZIMAS PLASMATICAS
Son elementos escenciales para que se lleven a cabo rx importantes por lo tanto cuando cambia su concentraciion en los tejidos es importante hacer su determinacion. Todas las determinaciones de las enzimas se hacen en plasma o suero. Lo que encontramos en plasma o suero se relaciona con lo que est ocurriendo en algunos organos en el interior de las clulas. Las enz se clasifican de acuerdo a la ubicacin. 1. Enzimas especificas del plasma Son aquellas q tienen una funcion bien definida en el plasma. Ah se encuentran en altas concentraciones. Su interes clinico es cuando estan disminuidas en el plasma. Se sintetizan en el higado.. Y son liberadas constantementes al plasma. Ejemplos: Enzimas de la coagulacin Celuloplasmina Pseudo.colinesterasa Serinas.proteasas 2. Enzimas Secretadas Estan en el plasma en bajas concentraciones (en comparacion con sus concentraciones en algunos tejidos). En algunas ocasiones no se encuentran en el plasma, o se carece de los activadores o coenzimas especficas para estas enzimas. Se secretan a una alta velocidad pero el organismo dispone rapidamente de ellas ya se eliminandolas por la orina, bilis, o aparato gastrointestinal.

Muchas veces estan aumentadas porque algunos de estos caminos de eliminacion estan bloqueados. Ejemplo Amilasa Lipasa Fosfatasa Acida Prostatica 3. Enzimas celulares Son enzimas situadas en el interior de la celula (likido celular o organelas celulares) Su interes clinico es cuando estan aumentadas en el plasma (porque salen al haber una ruptura de la membrana o muerte celular) Ejemplo: Transaminasas Lactato deshidrogenasa Factores que producen una muerte celular o destruccion de la membrana celular: Hipoxia por bloqueo de arteria o venas - falta de oxigenacin Agentes fisicos (frio, calor, radiacion, descarga electrica) Compuestos quimicos y drogas - envenenamientos con plomo, mercurio, alcohol, tabaco. Agentes microbiologicos: bacterias, virus, hongos, protozoos, elemento defectos geneticos, ciertas enfermedades cmo la GOTA, la Diabetes, enfermedades ligadas al sexo (al cromosoma X) Por desordenes nutricionales (deficiencia de vitaminas, minerales) Por desordenes inmunes (citotoxicidad) 4. Enzimas Organo.Especificas ..> que estan en algunos organos especficos Fosfatasa Acida Prostatica (en la prostata) Alcohol deshidrogenasa ( en higado) Acetil.colinesterasa eritrocitaria (en el globulo rojo) 5. FACTORES QUE PUEDEN AFECTAR LOS VALORES DE REFERENCIA DE LAS ENZIMAS Edad (no es lo mismo hacer una determinacin en un nio y en un adulto --- hay variacin en las concentraciones) Sexo (hay enzimas que son mas elevadas en hombres q en mujeres, por ejemplo la enzima del musculo esqueletico - debido a que el hombre tiene mas masa muscular. La Raza El ejercicio fisico (ej. Aldolasa puede estar mas aumentada) 6. ASPECTOS IMPORTANTES de ENZIMAS en general No se mide concentracion, lo q se mide es la ACTIVIDAD ENZIMATICA (ya estan llegando algunos metodos de laboratorio para determinar la concentracion de enzimas como la CREATINA QUINASA (MB) que es la enzima del corazn) U/L --- es la unidad internacional en la que se

reportan las enzimas plasmticas (Unidad /Litro) unidad internacional = se puede definir como: cantidad de enzima que produce un micromol de producto por minuto o cantidad de enzima que cataliza la Rx de un micromol de sustrato por minuto 7. TRANSAMINASAS Son enzimas que se encargan de la transferencia de grupos aminos, de un aminoacido a un alfa.ceto.acido para formar un nuevo aminocido. En las rx de transaminacion hay una coenzima bien importante: PLP (fosfato de piridoxal) PLP es el que toma el grupo amino y forma una PIRIDOXAMINA.. Y luego le pasa el grupo amino a un alfacetoacido para formar un nuevo aminocido. Luego se regenera el PLP para seguir trabajando Las rx de transaminacion mas frecuentes son aquellas en las que el aceptor del grupo amino es el ALFA.CETO.GLUTARATO para formar el Acido Glutamico Estas son enzimas q se encuentran en diferentes tejido y liquidos del cuerpo (ej, plasma, liquido cefalorraquideo, bilis, saliva) Sin embargo NO APARECEN EN LA ORINA A MENOS QUE HAYA UN DAO RENAL Hay dos transaminasas muy importantes: AST (Aspartato.Amino.Transferasa) --antes llamada GOT (transaminasa glutamica oxaloacetica) Es una enzima citoplasmatica y mitocondrial (el 80% es mitocondrial) Vida media de aprox 17 horas. Importante en el ciclo de KREBS (para la produccion de energia) Se encuentra en diferentes tejidos Aumentada en infartos, hepatitis viral, hipoxia, necrosis heptica Aumentos moderados en cirrosis, anemia hemolitica grave, neoplasias del hgado Aumentos fisiologicos en recien nacidos que tienen una inmadures hepatica (porque el higado es permeable, y puede salir) NO ES ORGANOESPECIFICA (porque esta en diferentes tejidos), pero se ha encontrado una correlacion entre el infarto al miocardio y el aumento de la AST ALANINA AMINO TRANSFERASA (ALT) Es citoplasmatica y heptica Aumenta en los mismos rganos que la AST Sin embargo es especifica para Lesin Hepato-celular Puede estar aumentada cuando hay cierta toxicidad hacia el higado (por plomo, tetracloruro de carbono, alcohol) TANTO ALT COMO AST se envian al sospechar daos hepaticos. 8. LACTATO DESHIDROGENASA Importante en tejidos que utilizan glucosa (en el musculo eskeletico , en la glicolisis) ES UNA OXIDORREDUCTASA

Cataliza rx que va Acido Lactico a Piruvato (o la rx inversa tambien xq es una reaccin reversible) Ac piruvico + NADH + H --> Lactico + NAD Esta es una enzima muy importante porque tiene 5 isoenzima formada por 4 cadenas polipeptidicas H y M HHHH: LDH-1 (tejidos aerobicos: Corazon y rion, Se aumenta en anemia hemolitica) HHHM: LDH-2 (tejidos aerobicos: Corazon y rion, Se aumenta en anemia hemolitica) HHMM: LDH-3 (se encuentra en procesos malignos cmo Linfomas, Enfermedades Pulmonares) HMMM: LDH-4 ( se encuentra en tejidos Anaerobicos: higado y musculos) MMMM: LDH-5 ( se encuentra en tejidos Anaerobicos: higado y musculos) En el suero normal, se deben encontrar en un orden de mayor a menor concentracin: LDH-2, LDH-1, LDH-3, LDH-4 y LDH-5. Tambien se usa en la determinacion de infarto al miocardio: En ese caso se invierte el orden, y la concentracion de LDH-1 es mayor que LDH-2. Cuando se encuentra esta alteracion en la concentracion, hay 80% de probabilidad de que haya habido un AMI (infarto Agudo al Miocardio) 9. CREATINA KINASA (CK) o Creatina Fosfo.Kinasa (CPK) Es una Kinasa , por lo tanto fosforila Creatina + ATP --> Fosfocreatina + ADP (rx reversible) Las kinasas necesitan cofactores, como el Magnesio Es una enzima citoplasmatica y mitocondrial Se conocen 3 isoenzimas: CK-1 (BB) = Brain (AUSENTE--- porque no atraviesa la barrera hematoencefalica) CK-2 (MB) = Cardiaca ( 2-3% del total) -----aumenta en infarto al miocardio (con un 5% ya se puede diagnosticar)--- es la 1 q aumenta Prueba de Staff (es la mejor prueba de infarto al miocardio) CK-3 (MM) = Muscular (representa el 97% del total) Troponinas (no son enzimas, SON PROTEINAS). Estan compitiendo con la CK-MB en la determinacion de infarto al miocardio. 10. GLUCOSA 6 FOSFATO DESHIDROGENASA Es una OXIDORREDUCTASA Rx: GLUCOSA 6P + NADP ---------> FOSFOGLUCONATO + NADPH + H NADH + H (NAD fosfato reducido) usa ekivalentes reductores y mantiene al glutation reducido Rx muy importante para proteger a la Hemoglobina y membranas del dao oxidativo (actua sobre el peroxido) Esta enzima se encuentra en ERITROCITOS, timo, bazo, etc.

Puede estar alterada por defector genticos, esta ligada al cromosoma X (enfermedades del cormosoma X: le aparece al hombre.. Pero la porta la mujer) Mayor incidencia de deficiencia de estas enzimas en personas de piel oscura Se ha encontrado q la ingestion de ciertos farmacos oxidativos. Aumentan la crisis hemolitica por deficiencia de glucosa 6 fosfato deshidrogenasa (antipaludicos) o en personas con cetoacidosis diabtica. 11. GAMA GLUTAMIL TRANSFERASA Cataliza la transferencia de un grupo gama glutamil de un aminoacido a un peptido. A travs de la membrana. Es un indicador mas exacto q la AST de necrosis heptica. Se encuentra alterada en ALCOHOLICOS Se utiliza para monitorear pacientes en etapa de curacion del alcoholismo (xq si ha dejado de tomar la enzima empieza a disminuir) El alcohol produce un dao al higado y esta es una enzima microsomal hepatica. Cuando se rompe, salen al plasma y se determina se envia esta prueba en sospecha a un problema de alcoholismo. 12. FOSFATASA ACIDA (ACP = acid phosfate) Enzima que Hidroliza esteres de fosfato inorganico produce un alcohol y un fosfato Ph optimo: 5 se encuentra en ciertos organos cmo el higado, bazo, globulos rojos, glndula prosttica (que contibuye con 1/3 a 1/2 de la concentracion de esta enzima en la sangre de los varones sanos) Se usa para ver si el paciente tiene algun problema con la prostata (FOSFATASA ACIDA PROSTATICA) Hay otra prueba q no es una enzima.. Es una serina proteasa .. Se hace a hombres para determinar problemas prostaticos: es la PSA (antigeno especifico de prostata) 13. FOSFATASA ALCALINA (ALP = alcaline phosfate) Actua sobre esteres fosfatos inorganicos.. Lo unico que cambia comparandola con la acida es el Ph optimo al q actua Ph optimo 10 Hay 5 isoenzimas: ALP heptica ALP Osea ALP Placentaria ALP Intestinal ALP Renal La que vamos a encontrar principalmente en el suero son: hepatica, osea y placentaria tienen mayor interes clinico) ALP se aumenta en problemas obstructivos del higado (ictericia obstructiva) Por ejemplo:

una mujer puede tener aumentada la ALP a expensas de la Placentaria o nios en crecimiento pueden tener aumentada la osea por una actividad osteoblastica (durante el crecimiento) 14. AMILASA Es una enzima HIDROLASA Se sintetiza en el pancreas y aparato gastrointestinal Actua sobre el glucogeno para que produsca glucosa o sobre los alimentos (almidon) Se usa para ver PANCREATITIS aguda (se usa preferiblemente esta en el determinacion por que es mucho mas sencillo el procedimiento) Tiene una isoenzima (pero no hay q saberla ahora) 15. LIPASA Es una enzima HIDROLASA actua sobre TRIGLICERIDOS es una enzima pancreatica se encuentra aumentada en PANCREATITIS (aumenta mucho mas drasticamente que la amilasa) 16. COLINESTERASA Actua sobre la ACETILCOLINA la hidrolisa en acetato y colina. Es importante porque permite que la fibra muscular se recupere entre uno y otro momento de excitacin y haya relajacin TIPO 1 verdadera o Acetil colinesterasa (o eritrocitaria) Se encuentra en glbulos rojos, materia gris de cerebro y en el bazo TIPO 2 o srica o Pseudo. Colinesterasa Se encuentra Hgado, pncreas, suero, etc. AMBAS (1 y 2) SON INHIBIDAS POR INSECTICIDAS / PLAGUICIDAS por organofosforados. La primera q se inhibe es la srica, luego la eritrocitaria La eritrocitaria indica el tiempo de exposicin al plaguicida Estas exposiciones tienen una serie de secuelas, enfermedades, impotencia sexual, anomalas en hijos de madres expuestas (de ah la importancia de su monitoreo).