Determinacin de Disminucin de Vitamina C en Bebidas Comerciales, mediante HPLC (cromatografa lquida de alta eficacia), Columnas ZORBAX Eclipse XDB-C8

Nota de Aplicacin Alimentos

Introduccin

Autor
Ing. Mnica Andrade S. Laboratorio Anlisis Industrial. Universidad de las Amricas. Granados y Jos Queri. Ecuador.

El Instituto Nacional de Estadstica y Censos (INEC) indica que el 36.9 % de los establecimientos del Ecuador se dedican a alimentos y bebidas. En Febrero de 2004, el consumo per cpita fue de 25 litros (EL UNIVERSO, 2004). Segn Euromonitor International, se estima que para el ao 2014 Amrica Latina superar el consumo de bebidas (Jugos, refrescos saborizados, entre otras) a Amrica del Norte. Los diferentes aditivos para una bebida artificial o natural enriquecida con vitaminas tendern a elevarse. La vitamina C (cido ascrbico) es uno de los principales compuestos de las bebidas comerciales. Contribuye a la cicatrizacin, absorcin intestinal del hierro y favorece a la formacin de anticuerpos para nuestro sistema inmunolgico. De acuerdo a estudios realizados para vitamina C, se establece que el producto de la oxidacin es el cido monodehydro-L ascorbico, (Wiley J., 2010). Existen cuatro productos de Disminucin de vitamina C: furfural, cido 2-furoici, 3 hidroxi y 2 pirona (Jian-Ping Yuan y Feng Chen, 1998). Se comprob que en productos comerciales existe una disminucin en la concentracin de vitamina C al someterlos a condiciones de temperatura (calor); el oxgeno provoca la oxidacin acelerada de la vitamina (Husein M,. 2012). En la presente investigacin, se realiza un estudio sobre la disminucin de concentracin de vitamina C en cinco bebidas comerciales de la ciudad de Quito, mediante cromatografa lquida de alta resolucin en funcin del tiempo tomando en cuenta el tipo de empaque y las condiciones de almacenamiento.

1. Experimental Todos los reactivos usados fueron de grado analtico. Metanol Grado HPLC, cumple con las especificaciones ACS filtrado en 0.2 micras, Agua PA 1 filtrada en 0.2 micras, Agua cida pH 2.5 filtrada en 0.2 micras, vitamina C 99.5% pureza. 2. Soluciones y Estndares Inicilamente se elabor una solucin concentrada de 500mgL con Vitamina C. Las diluciones se prepararon hasta 25mgL. 3. Equipo y Materiales El anlisis se realiz en el equipo Agilent 1260 Series HPLC. Conformado por una bomba cuaternaria con detector de fluorescencia. La separcin de picos se logra mediante la columna ZORBAX Eclipse XDB-C8 (4.6 x 50mm, 3.5 micron). Los datos del anlisis son detectados por el Software Chem Station Edition.

Para la deteccin ptima de la biomolcula se estableci una metodologa presentada en la Tabla 1.

4. Parmetros de Mtodo

Tabla 1 Condiciones de Anlisis y separacin.

Columna

Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C8 (4.6 x 50mm, 3.5 micron) Flujo: 0.8mL/min Temperatura: 40C Injeccin: 20L Fase mvil: A: 70% Agua cida B: 30% Metanol. Gradiente: TIEMPO %Metanol %Agua cida 0.00 30 70 0.50 40 60 1.00 50 50 1.50 60 40 Deteccin 254nm 360nm Tiempo 6 minutos Post time: 1 minuto.

Reactivo con grado de pureza aceptable.

5. Linealidad, Lmite de Deteccin y Lmite de Cuantificacin Se construy una curva de cuantificacin para evaluar las concentraciones de vitamina C (Figura 2). Se determinaron los lmites de deteccin, cuantificacin (lneas azules) y linealidad (verde) entre 150 mg L y 300 mg L.

Figura 1: Lmites de deteccin y cuantificacin de diferentes concentraciones de vitamina C.

6. Resultados estndar

cromatogrficos

producto

Establecidos los parmetros en la Tabla 1, se realiza el anlisis en el equipo de cromatografa lquida. En la Figura 2, se presenta el cromatograma para vitamina C. Ntese claramente que la resolucin del pico es ptima (R>1.5).

Figura 2: Cromatograma para vitamina C

La Figura 3 presenta el cromatograma por arreglo d diodos para vitamina C. La usencia de ruidos e impurezas es clara y se puede apreciar la forma del pico.

Figura 3 Cromatograma por arreglo de diodos para vitamina C

7. Seleccin de muestras Las muestras de bebidas fueron obtenidas en una tienda comercial, se analizaron 5 muestras en total con distintos envases y concentraciones de vitamina C detalladas en la Tabla 2.

Tabla 2 Caractersticas de bebidas comerciales seleccionadas.

PRODUCTO

TIPO DE PRODUCTO

FECHA DE ELABORACIN

FECHA DE EXPIRACIN

CONTENIDO NETO PRODUCTO

DECLARACIN VITAMINA C, % VALOR DIARIO

TIPO DE ENVASE

1 2 3 4

Refrescante natural Bebida artificial Pulpa natural Pulpa natural Refresco Saborizado

09/03/2013 24/02/2013 12/12/2012 21/03/2013

09/09/2013 25/05/2013 12/12/2013 17/10/2013

300ml 500ml 250ml 250 ml

56% 30% 30% 72%

Cristal PET polietilen tereftalato Tetra pack Tetra pack PEAD polietileno de alta densidad

16/03/2013

15/05/2013

250 ml

100%

8. Extraccin El proceso de extraccin de muestra se especifica en la Figura 4. Se toma 20 mL de bebida comercial y se filtra en papel de celulosa de 125 mm. Luego, la muestra se diluye en una solucin 30% metanol (99% pureza) y 70% agua pH 2.5, en una proporcin 1:100 (muestra, fase mvil). Posteriormente, se filtra al vaco con una membrana de celulosa de 2 m. Esta solucin filtrada est lista para inyectarse en el equipo. El volumen de inyeccin es de 20 L.

Figura 4 Mtodo de extraccin de muestras.

9. Experimental En el anlisis se realizaron dos metodologas:

Tabla 3 Condiciones de almacenamiento muestras - fase mvil.

CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO - BEBIDA EN DILUCION FASE MOVIL.

PRODUCTO

A. DEGRADACION EN FASE MVIL: Tomar una muestra de bebida y diluir en fase mvil (70% Agua pH 2.5, 30% metanol). Proporcin 1:100, en un baln aforado. Almacenar el producto en el baln a condiciones detalladas en Tabla 3.

TIPO DE PRODUCTO Refrescante natural

TIPO DE ENVASE ALMACENADO Cristal

DILUCION 70% Agua cida pH 2,5 - 30% Metanol Grado HPLC. 70% Agua cida pH 2,5 - 30% Metanol Grado HPLC. 70% Agua cida pH 2,5 - 30% Metanol Grado HPLC. 70% Agua cida pH 2,5 - 30% Metanol Grado HPLC. 70% Agua cida pH 2,5 - 30% Metanol Grado HPLC.

FILTRADO

LUMINOSIDAD

HUMEDAD

TEMPERATURA

MUESTRA 1

2m

natural

44%

21C

MUESTRA 2

Bebida artificial

Cristal

2m

natural

44%

21C

MUESTRA 3

Pulpa natural

Cristal

2m

natural

44%

21C

MUESTRA 4

Pulpa natural

Cristal

2m

natural

44%

21C

B. DEGRADACION EN ENVASE COMERCIAL: Tomar una muestra del envase cada da y diluir en fase mvil (70% Agua pH 2.5, 30% metanol). El envase debe estar almacenado en las condiciones detalladas en la Tabla 4.

MUESTRA 5

Refresco Saborizado

Cristal

2m

natural

44%

21C

Tabla 4 Condiciones de almacenamiento para bebidas comerciales.

CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO - BEBIDAS COMERCIALES PRODUCTO MUESTRA 1 MUESTRA 2 MUESTRA 3 MUESTRA 4 MUESTRA 5 TIPO DE PRODUCTO Refrescante natural Bebida artificial Pulpa natural Pulpa natural Refresco Saborizado TIPO DE ENVASE Cristal PET - polietilen tereftalato Tetra pack Tetra pack PEAD - polietileno de alta densidad LUMINOSIDAD natural natural natural natural natural HUMEDAD 44% 44% 44% 44% 44% TEMPERATURA 21C 21C 21C 21C 21C

10. Anlisis Establecidos los diferentes parmetros se realiz el anlisis en el cromatgrafo. La Figura 6 presenta el cromatograma obtenido de cido ascrbico (vitamina C) presente en una bebida comercial, tomando una muestra diaria directamente del envase. La Figura 7 indica el cromatograma para vitamina C en bebida comercial. Muestra que fue diluida en fase mvil y almacenada. Ntese la resolucin de los cromatogramas y la ausencia de ruidos.

Figura 5 Cromatograma para cido ascrbico (vitamina C) en bebida comercial - muestra del envase.

Figura 6 Cromatograma para bebida comercial diluida en fase mvil y almacenada.

11. Resultado experimental Disminucin en fase mvil En la Figura 7 se presenta las concentraciones (ppm) de vitamina C obtenidas en relacin al tiempo de anlisis. El da cero (0), corresponde a la fecha de fabricacin del producto y los dems das que se hicieron los anlisis. Como se observa en cada bebida comercial la disminucin de la concentracin de cido ascrbico se vio afectada al almacenar una muestra diluida en fase mvil. Es por esta razn, que bajo ningn motivo se debe almacenar una muestra. Pues dara como resultado falsos positivos de acuerdo a la concentracin de un elemento en el producto.

Figura 7 Variabilidad de concentraciones de vitamina C en Almacenamiento de fase Mvil.

 Disminucin en envase comercial Los cinco productos comerciales sometidos a condiciones normales presentaron una disminucin de acuerdo a la concentracin de vitamina C. En la Figura 8 se presenta este hecho. Correspondiente a la concentraciones (ppm) de vitamina C obtenidas en relacin al tiempo de anlisis. El da cero (0), pertenece a la fecha de fabricacin del producto y los dems das que se hicieron los anlisis.

Figura 8 Disminucin de la concentracin de vitamina C en bebidas comerciales, expresado en concentracin (ppm).

Para determinar resultados certeros, se ha realizado un cuadro resumen. (Figura 9). El mtodo de cromatografa liquida de alta resolucin fue efectivo para establecer las concentraciones. Como se observa, el producto 1 refrescante natural y el producto 5 refresco saborizado, fueron los que presentaron mayor disminucin de la vitamina. Se debe tomar en cuenta que ambos empaques son trasparentes. Entonces se determina que el cido es susceptible a luminosidad (calor). La bebida artificial (producto 2), el da 45 present una disminucin del 61%. El empaque es un polietileno treftalato y el tiempo de vida til es de 120 das promedio. Por ende se constituye que este embalaje no garantiza la estabilidad de la vitamina en tal periodo. Los envases tetra pack de los productos 3 y 4, son de diferentes formas y cantidad de lminas de acuerdo al tiempo de vida til. En comparacin, se determina que el producto 4 es el de mayor preservacin de la vitamina C por ser un envase obscuro y evitar el contacto directo del producto con el ambiente.

Figura 9 Disminucin de la concentracin de vitamina C en bebidas comerciales, expresado en porcentaje.

Discusin Los resultados obtenidos en la curva de calibracin con un coeficiente de determinacin de 0.99997 nos permiten tener una alta precisin en las mediciones. Para la cuantificacin es importante determinar cules son los lmites de deteccin. El anlisis espectral mediante el detector ultravioleta con arreglo de diodos tambin nos permite determinar los niveles de pureza del anlisis. Segn los resultados obtenidos, se comprob que el almacenamiento de una muestra de vitamina C (99.5% pureza) mantenida en fase mvil presenta una disminucin en su concentracin. Esto significa que para el anlisis de vitamina C mediante cromatografa lquida es pertinente preparar una muestra el mismo da del anlisis y no reutilizarla. Mediante la investigacin se dedujo que la vitamina C al ser hidrosoluble es susceptible de cambios por la exposicin de luz (calor), por consiguiente los fabricantes de bebidas que declaran contenido de esta vitamina no garantizan la cantidad estipulada en la etiqueta para el tiempo de vida til de la bebida. El envase comercial tetra-pack asegura la estabilidad de la vitamina C, pues el producto no est en contacto directo a la luz. Al momento de comprar bebidas que declaran contenido de vitamina C el consumidor debe asegurarse que el producto tenga una fecha de fabricacin lo ms ajustada a la fecha actual. En conclusin, es importante incentivar el consumo de productos naturales propios que nos brinda nuestro planeta. Las frutas y hortalizas ricas en contenido de vitamina C, seran nuestra prioridad, puesto que el cido ascrbico en las bebidas comerciales tiende a disminuir en funcin del tiempo.

REFERENCIA Ciancaglini P. Using a classical method of vitamina C quantification as a tool discussion of its vole in the body. Biochem. Mol. Biol. Edu. 29:110114,2001. Harris DC. Analisis qumico cuantitativo. Editorial Revert, 2001./Borsook, H. (1933). Oxidation-Reduction potencial of Ascorbic Acid (Vitamina C). Recuperado el 22 de Mayo de 2013 de http://authors.library.caltech.edu/4851/1/BORpnas33.pdf./ Ecuador con un consumo per cpita de 25 litros. El Universo, Quito, Ecuador Recuperado el 22 de Mayo de 2013 de http://www.eluniverso.com/2004/02/01/0001/9/2DF9CCD5B8BF4EBD A37BD9234A397397. html./ Instituto Nacional de Estadsticas y Censos. (2012). Infoeconoma. Anlisis Sectoriales. Recuperado el 22 de Mayo de 2013 de http://www.inec.gob.ec/inec/revistas/infoe.pdf. Kirk-Ohmer. (2012). Ascorbic Acid, Recuperado el 22 de Mayo de 2013 de http://es.scribd.com/doc/3 0136986/Ascorbic-Acid. Departamento de Salud. (2010). rea de Prevencin y nutricin, Recuperado el 22 de Mayo de 2013 de http://www.dgadp.uady.mx/salud/articulos/n18_15042010/La.Vitami naC.como.Antioxidante.muchas.cosas.mas.pdf. Jian-Ping Yuan and Feng Chen. (1998). Degradation of Ascorbic Acid in Aqueous Solution. Recuperado el 23 de Mayo de 2013 de http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jf9805404. /Hussein, M. (2012). Analysis of Vitamin C in Comerciial Fruit Juice Sample. Recuperado el 23 de Mayo 2013 de http://www.slideshare.net/mizah92/analysisvitamin-c-in-commercial-fruit-juice.

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