Objetivos: Realizar una preparacin adecuada de los medios de cultivos a utilizar en la prctica de laboratorio.

rio. Aislar e identificar de forma correcta al microorganismo utilizado. Realizar de forma adecuada y correcta la preparacin de reactivos para la extraccin del DNA plasmidico. Obtener de forma correcta el material gentico del microorganismo, evitando posibles contaminaciones en la muestra.

LA BACTERIA. E. coli es una de las especies bacterianas ms minuciosamente estudiadas, y no solamente por sus capacidades patognicas, sino tambin como sustrato y modelo de investigaciones metablicas, genticas, poblacionales y de diversa ndole (Neidhardt, 1999). Forma parte de la familia Enterobacteriaceae (Ewing, 1985). Ella est integrada por bacilos Gram negativos no esporulados, mviles con flagelos peritricos o inmviles, aerobios-anaerobios facultativos, capaces de crecer en agar MacConkey y en medios simples con o sin agregado de NaCl, fermentadores y oxidativos en medios con glucosa u otros carbohidratos, catalasa positivos, oxidasa negativos, reductores de nitratos a nitritos, y poseedores de una proporcin G+C de 39 a 59% en su DNA. Se trata de bacterias de rpido crecimiento y amplia distribucin en el suelo, el agua, vegetales y gran variedad de animales. En conjunto, la importancia de las enterobacterias en patologa humana puede cuantificarse constatando que constituyen el 50% aproximadamente de todos los aislamientos clnicamente significativos en los laboratorios microbiolgicos, y hasta el 80% de todos los bacilos Gram negativos identificados. Integran tambin esta familia otros gneros que se consideran en otros captulos por su asociacin con infecciones intestinales, como son Salmonella, Shigella y Yersinia, E. coli es la especie tipo del gnero Escherichia. Incluye grmenes generalmente mviles, que producen cido y gas a partir de la glucosa, la arabinosa, y habitualmente de la lactosa y otros azcares. Producen reaccin positiva de rojo de metilo, y negativa de Vogues-Proskauer. Son inhibidos por KCN e incapaces de crecer en medio con citrato como nica fuente de carbono y energa, pero s en caldo acetato. Se clasifican en ms de 170 serogrupos O segn las caractersticas antignicas de su LPS, y en serotipos por la combinacin de antgenos O y H flagelares. Otros antgenos presentes en distintas cepas (capsulares, fimbriales y otros) han sido empleados para su clasificacin o identificacin. E. coli coloniza el tracto gastrointestinal a las pocas horas de vida del nio, y establece con el husped una relacin estable de mutuo beneficio (Drasar y Hill, 1974). Como integrante de la flora normal del hombre y de muchos animales, se lo considera un germen indicador de contaminacin fecal cuando est presente en el ambiente, agua y alimentos, junto con otros similares agrupados bajo la denominacin de "bacterias coliformes". Estas son enterobacterias que pertenecen al gnero Escherichia y a otros relacionados como Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter o Serratia, y que tienen en comn la capacidad de fermentar la lactosa en un lapso no mayor de 48 horas, con produccin de cido y gas. Son grmenes de gran ubicuidad y capacidad de proliferacin, y a la vez de fcil cultivo e identificacin, y por lo tanto muy tiles como indicadores de contaminacin, pero no son enteropatgenos como grupo (como tampoco lo es E.coli), y por lo tanto su presencia en alimentos, ambiente o pacientes no

certifica la etiologa de una infeccin intestinal o un brote de ETA. Es necesario hilar ms fino. E. coli puede ser causa de enfermedad endgena en pacientes debilitados o en situacin de alteracin de la pared intestinal (peritonitis, sepsis, etc.), pero las infecciones entricas provocadas por este germen no son causadas por las cepas que habitan normalmente el intestino, sino por lneas especialmente patgenas en esta localizacin (Nataro y Kaper, 1998, Tabla 2), que se transmiten por va fecaloral de persona a persona o a travs del agua y alimentos, y que pasaremos a describir. Medios de cultivo Para disear un medio de cultivo se debe tener en cuenta no slo los nutrientes requeridos por el microorganismo que se desea estudiar, sino tambin las condiciones fsicas que le permitan crecer, los cuales son: Nutrientes: La cantidad y naturaleza de los nutrientes en un medio de cultivo viene determinada por el rendimiento de un producto determinado, adems de los requerimientos nutricionales del microorganismo. pH: Un microorganismo puede alterarse o alterar el pH del medio de cultivo como resultado de las sustancias producidas por el propio microorganismo. Estos cambios pueden llegar a inhibir el crecimiento del microorganismo. Estos cambios se pueden prevenir controlando el pH mediante sistemas tampn, el ms utilizado en microbiologa es la combinacin de KH2PO4 y K2HPO4. Necesidades de gases: los principales gases que afectan al desarrollo microbiano son el O2 y CO2. Las bacterias presentan una respuesta amplia y variable al O2 libre clasificndose en 4 grupos: Aerobias: bacterias que se desarrollan en presencia de O2 libre. Anaerobias: bacterias que se desarrollan en ausencia de O2 libre. Anaerobias facultativas: bacterias que se desarrollan en presencia o ausencia de O2 libre. Microerobias: bacterias que crecen en presencia de pequeas cantidades de O2 libre.

Suministro de luz: Los organismos fotosintticos debern ser expuestos a una fuente de iluminacin, la cul no debe plantear problemas de variacin de temperatura, por lo que suelen usarse lmparas fluorescentes con un desprendimiento mnimo de calor.

Control de temperatura: El desarrollo de las bacterias depende de reacciones qumicas y la velocidad con que se efectan, las cuales estn influidas por la temperatura, por lo cul la temperatura puede, en parte, determinar el crecimiento de los microorganismos en estudio. Cada especie microbiana posee una temperatura ptima de crecimiento clasificndose segn esto en:

Psicrfilas: capaces de desarrollarse a 0 C o menos. Su temperatura ptima es alrededor de los 15 C. o Mesfilas: crecen mejor entre 25 y 40 C. o Termfilas: crecen mejor entre 45 y 60 C.
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Grado de humedad

Presin osmtica: generalmente se trabaja en condiciones de isofona (300 miliosmoles), aunque existen bacterias que pueden crecer en concentraciones hipotnicas e hipertnicas.

Esterilidad

Proteccin: El medio de cultivo debe estar protegido de la contaminacin microbiana ambiental. Ahora se desea definir el Agar-Agar para mejor comprensin de lo que viene a continuacin. Agar-Agar Sustancia mucilaginosa que se extrae de algunas algas rojas o Rodofceas, frecuentes en el Ocano Atlntico, Pacfico e ndico. Es una sustancia amorfa. Se emplea como medio de cultivo en bacteriologa, como apresto de sedas, como sustituto de la gelatina, etc. La forma seca del Agar-Agar se conoce de mediados del siglo XVIII, cuando un japons descubri, accidentalmente, la manera de purificarlo y secarlo. Fue llevado de China a Europa y trado a Amrica a mediados del siglo XIX, para utilizarse, principalmente, como substituto de la gelatina en la confeccin de postres gelatinosos. Qumicamente, el Agar-Agar es una mezcla compleja de sales de polisacridos, fundamentalmente, galactsidos. Las grandes molculas que lo constituyen determinan sus cualidades sobresalientes, como coloides y espesantes, que lo han hecho hasta ahora insustituible. Adems de los polisacridos, el Agar-Agar contiene numerosos cationes asociados, tales como sodio, potasio, calcio, magnesio, etc. De los cuales no esta, claramente, establecida su influencia sobre las propiedades de este producto. Referente a las propiedades y contenidos del Agar-Agar, bsicamente, dependen de la materia prima empleada, procedencia geogrfica, poca de cosecha y madurez del alga. A continuacin, se caracterizarn los tipos de medios de cultivo segn su estado y composicin. Estado Medios slidos: Su proporcin de Agar es siempre por encima del 15%. Medios semislidos: Son medios intermedios entre los medios lquidos y slidos, su proporcin de Agar suele ser suele ser inferior al 5%, pero siempre suele presentar cierta cantidad que le proporcione una consistencia semislida. o Medios lquidos o caldos: No contiene Agar y su composicin (adems de agua) suele contener al menos una fuente de carbono, sales minerales, y a veces segn las caractersticas de medio, factores de crecimiento, vitaminas, peptonas, aminocidos, entre otros.
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Composicin

Medios sintticos o qumicamente definidos: Llevan fuentes de carbono, nitrgeno, sales que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca, etc.), otros elementos como estimuladores de crecimiento pero siempre a concentraciones conocidas. o Medios complejos o de composicin indefinida: Estos medios llevan ingredientes como extracto de levadura, peptona, infusin de cerebro, extracto de carne, etc. que contienen nutrientes en abundancia pero sin saber con exactitud la composicin cualitativa ni cuantitativa de estos nutrientes. o Medios de enriquecimiento: Son medios complejos, normalmente, con aditivos adicionales para favorecer el crecimiento de determinados microorganismos (particularmente hetertrofos exigentes). Tales como: adiccin de sangre, suero o extractos de tejidos de animales y plantas. o Medios selectivos: Son aquellos que favorecen por su diseo el crecimiento especfico de un microorganismo particular o grupo de microorganismos. Es de gran utilidad para el aislamiento de microorganismos a partir de una poblacin microbiana mixta. Ejemplo: CO2 como fuente de carbono es selectivo para auttrofos, adicionando cristal violeta se inhibe el crecimiento de los Gram (+), utilizando maltosa como nica fuente de carbono slo crecern los que usen maltosa. o Medios diferenciales: Son aquellos destinados a facilitar la discriminacin de microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios. Ejemplo: Agar sangre diferencia hemolticos de no hemolticos; McConkey diferencia lactosa (+) de lactosa (-). o Medios de mantenimiento: Suelen ser distintos a los de crecimiento ptimo ya que el crecimiento rpido y prolfico suele ocasionar la muerte rpida de las clulas. Por ejemplo: al aadir glucosa y utilizarla los microorganismos producen cidos, acidificndose el medio por lo que es preferible no utilizar glucosa en los medios de mantenimiento.
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Aislamiento Aislar: Es separar un tipo de microorganismo a partir de una poblacin mixta. En habitad naturales, raramente encontramos a los microorganismos en cultivo puro Aislamiento directo: Se logra directamente a partir de una muestra cuando el o los microorganismos estn en una proporcin adecuada., se realiza por estras (agotamiento) con o sin dilucin previa de la muestra (suelo, alimentos), en medio slido Aislamiento por enriquecimiento: Cuando el microorganismo que se desea aislar e identificar se encuentra en baja proporcin en la muestra, se incluye una primera etapa que consiste en sembrar la muestra en medio lquido. Luego de varios pasajes se asla por el mtodo de estras. Extraccin del ADN plsmico: Los plsmidos son usados a menudo para purificar una secuencia especfica, debido a que ellos pueden ser fcilmente purificados del resto del genoma. Para su uso como vectores y como clonadores moleculares, a menudo los plsmidos necesitan ser aislados. Hay muchos mtodos de aislar ADN plasmdico de una bacteria, los arquetipos de los cuales son el miniprep y el maxiprep. El miniprep se suele usar desde una perspectiva

analtica. El resultado es una cantidad de ADN plasmdico (10-30g), el cual es suficiente para anlisis usando digestin restrictiva, para secuenciacin o para algunas tcnicas de ingeniera gentica. En el maxiprep, se cultivan volmenes mucho ms grandes de bacterias en suspensin. Esencialmente este es un escalado de la preparacin mini-prep, el cual es seguido por una purificacin adicional. Esto resulta en una cantidad relativamente grande (0,5 -1 mg) de ADN plsmido muy puro. En los ltimos tiempos muchos kits comerciales han sido creados para realizar la extraccin plasmdica a varias escalas, pureza y niveles de automatizacin. El ADN plsmido puede aparecer en uno de cinco conformaciones, las cuales (para un tamao dado) corren a diferentes velocidades en un gel durante electroforesis. Las conformaciones se muestran abajo en orden de movilidad electrofortica (velocidad para un voltaje dado), del ms lento al ms rpido: Mellado abierto circular: el ADN tiene un solo corte filamentario. Lineal: ADN tiene terminales libres, ya sea porque los filamentos fueron cortados o porque el ADN era linear in vivo. Usted puede modelar este como un cordn que no se ha conectado as mismo. circular relajado: ADN que interacta completamente con ambos filamentos sin cortar, pero que ha sido enzimticamente relajado. Usted puede modelar este dejando un cordn relajado y luego conectndolo a s mismo. superespiral desnaturalizado: ADN como el ADN superespiral o superenrollado (ver ms abajo), pero que tiene regiones sin unir que lo hacen ligeramente menos compacto; esto resulta de una excesiva alcalinidad durante la preparacin del plsmido. ADN superespiral: Es un ADN totalmente intacto con los filamentos sin cortar, y con forma de remolino, resultando en una forma compacta. La tasa de migracin de pequeos fragmentos lineales es directamente proporcional al voltaje aplicado (en el caso de voltajes bajos). En el caso de altos voltajes, grandes fragmentos migran continuamente a diferentes tasas. Por lo tanto, la resolucin del gel decrece con el incremento del voltaje. A un bajo voltaje determinado, la migracin de un pequeo fragmento lineal de ADN est en funcin de su longitud. Fragmentos lineales largos (de 20kb) migran a cierta tasa sin importar la longitud. Esto es debido a que las molculas reptan desde el centro de la molcula siguiendo el sentido de la matriz de gel. La digestin restrictiva se usa frecuentemente para analizar fragmentos purificados de plsmidos. Estas enzimas rompen especficamente el ADN en ciertas secuencias cortas. Bibliografias: http://webcache.googleusercontent.com/search? q=cache:ZZYzI1WU68gJ:www.higiene.edu.uy/biolcel/metabolismo_ fisiologia.ppt+desarrollo+de+la+e.coli+en+medio+liquido&cd=2&hl =es&ct=clnk&gl=b http://html.rincondelvago.com/agar-agar_1.html http://bvs.sld.cu/revistas/mie/vol6_1_07/mie07107.htm

http://docs.google.com/viewer? a=v&q=cache:1PJQ_nU7t2QJ:www.bvsops.org.uy/pdf/coli.pdf+aisla miento+e+identificacion+de+e.coli.hrml http://es.wikipedia.org/wiki/Pl%C3%A1smido