Sunteți pe pagina 1din 190

MINISTERUL EDUCAIEI I CERCETRII PROIECTUL PENTRU NVMNTUL RURAL

BIOLOGIE
Elemente de genetic i microbiologie

Ileana STOICA

2005

2005

Ministerul Educaiei i Cercetrii Proiectul pentru nvmntul Rural Nici o parte a acestei lucrri nu poate fi reprodus fr acordul scris al Ministerului Educaiei i Cercetrii

ISBN 973-0-04266-7

Cuprins

CUPRINS
CUPRINS INTRODUCERE Unitatea de nvare 1 - GENETICA CLASIC
Cuprins Obiectivele Unitii de nvare 1 1.1 Istoricul cercetrilor de genetic 1.2 Legile Mendeliene ale ereditii
1.2.1 Noiuni de baz n genetica clasic 1.2.2 Prima lege a ereditii 1.2.3 A doua lege a lui Mendel 1.2.4 A treia lege a lui Mendel 1.2.5 Variaii de la modelul de dominan recesivitate 1.2.6 Serii polialelice 1.2.7 Caractere poligenice

I V 1
1 1 2 4 5 6 7 8 8 9 10 11 11 12 13 14 16 18 18

1.3 Teoria cromozomial a ereditii


1.3.1 Musculia-de-oet 1.3.2 Tezele teoriei cromozomiale a ereditii 1.3.3 Determinismul cromozomial al sexelor

1.4 Definirea genei 1.5 Lucrare de verificare 1 1.6 Rspunsuri la testele de autoevaluare - Unitatea de nvare 1 1.7 Bibliografie recomandat

Unitatea de nvare 2 - STRUCTURA ACIZILOR NUCLEICI


Cuprins Obiectivele Unitii de nvare 2 2.1 Introducere 2.2 Structura primar a acizilor nucleici 2.3 Structura secundar a acizilor nucleici 2.4 ADN elicea vieii 2.5 Suprarsucirea moleculelor de ADN 2.6 Acizii ribonucleici 2.7 Lucrare de verificare 2 2.8 Rspunsuri la testele de autoevaluare - Unitatea de nvare 2 2.9 Bibliografie recomandat

19
19 19 20 21 23 25 28 28 31 33 33

Unitatea de nvare 3 - CROMOZOMUL LA ORGANISME PRO- I


EUCARIOTE

34
34 34 35 35 35 36 36 38 39 39 40 i

Cuprins Obiectivele Unitii de nvare 3 3.1 Cromozomul bacterian


3.1.1 Dimensiune 3.1.2 Modelul Pettijohn 3.1.3 Configuraii ADN n cromozomul bacterian 3.1.4 Compoziia n nucleotide 3.1.5 Proteine asociate cu cromozomul bacterian 3.1.6 Secvene ADN repetate 3.1.6.1 Secvene repetate necodificatoare 3.1.6.2. Secvene repetate codificatoare
Proiectul pentru nvmntul Rural

Cuprins

3.1.7 Numrul de copii genice 3.1.8 Densitatea informaiei n cromozomul bacterian 3.1.9 Redundana genelor i a produselor genetice
3.1.10 Situsuri de inserie fagic n cromozomul bacterian 3.1.11 Localizarea genelor nrudite fiziologic

3.2 Plasmide bacteriene


3.2.1 Principalele categorii de gene 3.2.2 Clasificarea plasmidelor

3.3 Structura cromozomului la eucariote


3.3.1 Clase de secvene ADN la eucariote 3.3.2 Proteine cromozomale 3.3.3 Nivelele de organizare ale cromatinei

3.4 Lucrare de verificare 3 3.5 Rspunsuri la testele de autoevaluare - Unitatea de nvare 3 3.6 Bibliografie recomandat

41 42 42 43 44 44 45 46 49 50 50 51 53 54 54

Unitatea de nvare 4 - FUNCIILE MATERIALULUI GENETIC


Cuprins Obiectivele Unitii de nvare 4 4.1 Replicarea ADN
4.1.1 Principalele etape ale replicrii ADN 4.1.2 Enzimologia replicrii 4.1.2.1 Complexul primozom 4.1.2.2 Topoizomerazele 4.1.2.3 ADN polimeraze 4.1.3 Replicarea plasmidelor bacteriene 4.1.3.1 Replicarea plasmidelor lineare 4.1.3.2 Replicarea plasmidelor circulare 4.1.3.2.1 Mecanismul theta 4.1.3.2.2 Mecanismul strand-displacement 4.1.3.2.3 Mecanismul rolling-circle 4.1.3.3 Mecanisme de control al replicrii plasmidiale

55
55 55 56 56 60 60 61 63 65 65 66 66 67 68 70 72 72 74 75 75 75 76 78 79 79 80 80 82 82 84 84

4.2 Transcrierea genetic


4.2.1 Definiii i principii 4.2.2 Enzime 4.2.3 Transcrierea la procariote 4.2.3.1 Promotori 4.2.3.2 Terminatori 4.2.3.3 ARN polimeraza de la procariote 4.2.3.4 Fazele transcrierii genetice la procariote 4.2.4 Transcrierea la eucariote 4.2.4.1 ARN polimerazele de la eucariote 4.2.4.2 Promotorul la eucariote 4.2.4.3 Complexul de pre-iniiere 4.3.4.4 Factorii de elongare

4.3 Lucrare de verificare 4 4.4 Rspunsuri la testele de autoevaluare - Unitatea de nvare 4 4.5 Bibliografie recomandat

Unitatea de nvare 5 - INTRODUCERE N MICROBIOLOGIE


Cuprins Obiectivele Unitii de nvare 5 5.1 Istoricul i obiectivele microbiologiei
5.1.1. Istoricul microbiologiei

85
85 85 86 86

ii

Proiectul pentru nvmntul Rural

Cuprins

5.1.2.Clasificarea microorganismelor 5.1.3.Obiectivele i importana microbiologiei 5.1.4 Rezumatul capitolului 5.1

5.2 Structura celulei procariote


5.2.1. Mrime i form 5.2.2. Organizarea general a celulei procariote 5.2.3. Membranele celulei procariote 5.2.4. Citoplasma 5.2.5. Nucleoidul 5.2.6. Peretele celular 5.2.7. Componentele externe ale peretelui celular 5.2.8. Chemotaxia 5.2.9. Endosporul bacterian 5.2.10 Rezumatul capitolului 5.2

5.3. Celulele procariote versus celulele eucariote


5.3.1. Caracteristicile generale ale celulei eucariote 5.3.2. Comparaie ntre celulele procariote i eucariote 5.3.3. Rezumatul capitolului 5.3

5.4. Lucrare de verificare 5 5.5. Rspunsuri i comentarii la testele de evaluare Unitatea de nvare 5 5.6 Bibliografie recomandat

87 90 92 92 92 93 95 97 99 100 104 107 109 111 112 112 113 115 116 118 118

Unitatea de nvare 6 - NUTRIIA I CRETEREA MICROORGANISMELOR


Cuprins Obiectivele Unitii de nvare 6 6.1 Nutriie microbian
6.1.1 Principalii nutrieni necesari microorganismelor 6.1.2 Necesarul de carbon, hidrogen i oxigen 6.1.3 Necesarul de azot, fosfor i sulf 6.1.4 Factori de cretere 6.1.5 Preluarea nutrienilor de ctre celule 6.1.6 Medii de cultur 6.1.7 Rezumatul capitolului 6.1

119
119 119 120 120 121 124 124 125 127 129 130 130 132 133 134 134 135 136 138 139 139 140 140 141 141 142 144 146 iii

6.2 Creterea microbian


6.2.1 Curba de cretere 6.2.2 Estimarea creterii 6.2.3 Culturi continue 6.2.4 Influena factorilor de mediu asupra creterii 6.2.4.1 Presiunea osmotic 6.2.4.2 pH 6.2.4.3 Temperatura 6.2.4.4 Oxigenul 6.2.4.5 Presiunea 6.2.5 Rezumatul capitolului 6.2

6.3. Controlul microorganismelor prin intermediul agenilor fizici i chimici


6.3.1. Definirea principalilor termeni folosii 6.3.2. Moartea microorganismelor 6.3.3. Condiii pe care trebuie s le ndeplineasc un agent antimicrobian 6.3.4. Metode fizice folosite pentru controlul microorganismelor 6.3.5. Ageni chimici utilizai pentru controlul microorganismelor 6.3.6 Rezumatul capitolului 6.3
Proiectul pentru nvmntul Rural

Cuprins

6.4 Rspunsuri i comentarii la testele de evaluare Unitatea de nvare 6 6.5 Bibliografie recomandat

147 147

Unitatea de nvare 7 - BIODIVERSITATEA MICROORGANISMELOR


Cuprins Obiectivele Unitii de nvare 7 7.1 Bacterii
7.1.1 Taxonomia bacterian. Definiii. Generaliti 7.1.2 Conceptul de specie n lumea bacterian 7.1.3 Sisteme de clasificare ale bacteriilor utilizate n prezent 7.1.3.1. Sistemul de clasificare bazat pe analiza ARNr 16S 7.1.3.2. Clasificarea dup Bergeys Manual 7.1.4 Bacteriile Gram negative de interes general, medical i industrial 7.1.5 Bacteriile Gram pozitive, altele dect Actynomycetele 7.1.6 Bacterii Gram pozitive cu un coninut ridicat n G+C: Actinomycetes i genurile nrudite 7.1.7 Alte bacterii Gram negative i cianobacteriile 7.1.8 Rezumatul capitolului 7.1

148
148 148 149 149 150 153 153 154 155 157 160 162 165 165 165 166 167 167 169 169 171 172 174 174

7.2 Fungi
7.2.1. Importana fungilor 7.2.2. Caractere generale ale fungilor 7.2.3. Principalele grupe de fungi 7.2.3.1. Diviziunea Zygomycota 7.2.3.2. Diviziunea Ascomycota 7.2.3.3. Diviziunea Deuteromycetes (Fungi imperfecti) 7.2.4 Rezumatul capitolului 7.2

7.3 Lucrare de verificare 6 7.4 Rspunsuri i comentarii la testele de evaluare Unitatea de nvare 7 7.5 Bibliografie recomandat

6. BIBLIOGRAFIE SELECTIV

175

iv

Proiectul pentru nvmntul Rural

Introducere

INTRODUCERE
Dragi cursani, n ultimul deceniu, aproape zilnic, ziarele i canalele de televiziune prezint tiri legate fie de diverse descoperiri genetice, fie de microorganisme patogene sau cu capaciti deosebite. Modulul Elemente de Genetic i Microbiologie v introduce n studiul geneticii i al microbiologiei, domenii de mare actualitate, att n tiin, ct i n viaa de zi cu zi. Noutatea coninutului acestui modul l face util tuturor celor care i desvresc pregtirea n domeniul biologiei. Se adreseaz n principal cadrelor didactice din mediul rural care sunt calificate n alte domenii, dar urmeaz cursuri de formare n biologie, dar este la fel de util i cadrelor didactice din mediul rural, cu diplom universitar n domeniul biologie. Poate fi utilizat, de asemenea de orice cursant la nvmntul la distan, sau de cei interesai n explicarea i aprofundarea unor aspecte legate de procese genetice de baz sau de microorganisme. Modulul este astfel structurat nct s v permit acumularea treptat a noiunilor care v permit, la final, s definii n termeni corespunztori structura i organizarea materialului genetic i principalele aspecte legate de microorganisme. Cursul deschide ns i posibiliti aplicative n genetic medical, criminalistic, epidemiologia bacteriilor patogene, dar i n bioremedierea (cu ajutorul microorganismelor) unor ecosisteme poluate. Modulul este alctuit din 7 uniti de nvare, aranjate ntr-o succesiune logic, corespunztoare obiectivelor educaionale pe care ni le-am propus, respectiv: cunoaterea aspectelor de baz ale geneticii clasice; nelegerea structurii acizilor nucleici; cunoaterea organizrii materialului organisme pro- i eucariote; genetic la

nelegerea proceselor de replicare i, respectiv, de transcriere a informaiei genetice; nsuirea informaiilor microorganisme; de baz legate de

nelegerea fenomenelor biologice ce stau la baza nutriiei i creterii microorganismelor; cunoaterea aspectelor legate de biodiversitate a microorganismelor ;

Proiectul pentru nvmntul Rural

Introducere

formarea i dezvoltarea abilitii de a transfera cunotinele despre procese genetice i despre microorganisme n domenii cu aplicabilitate direct (diagnostic genetic pre- i postnatal, criminalistic, epidemiologie bacterian, biodegradare de substane poluante). Unitile de nvare au n medie ntre 20 i 30 de pagini i cuprind pe lng coninutul tiinific: cuprinsul fiecrui capitol al unitii de nvare; o scurt prezentare a ceea ce urmrete s transmit fiecare dintre capitolele componente (n caset); un numr rezonabil de teste de autoevaluare un rezumat al fiecrui capitol, care sintetizeaz coninutul tiinific al unitii de nvare, lucrarea de verificare aferent fiecreia dintre cele 7 uniti de nvare, rspunsuri i comentarii la testele de autoevaluare, bibliografia care se recomand a fi parcurs pentru aprofundarea cunotinelor. De asemenea, sunt inserate din loc n loc casete cu texte ajuttoare, care, fie c explic anumii termeni utilizai n text, fie c detaliaz unele coninuturi, chiar dac acestea nu vor face obiectul evalurilor. La finalul crii se gsete o list selectiv cu bibliografia care a stat la baza conceperii acestui modul. Voi prezenta n continuare, pe scurt, coninutul fiecrei uniti de nvare, precum i obiectivele specifice, care corespund competenelor specifice ce se urmresc a fi formate. Astfel, Unitatea 1, prezint n primul rnd, un scurt istoric al cercetrilor de genetic. Sunt apoi detaliate noiunile eseniale de genetic clasic, cu prezentarea pe larg a legilor Mendeliene ale ereditii. n continuare sunt prezentate tezele teoriei cromozomiale a ereditii i determinismul genetic al sexelor.

Obiective specifice pentru Unitatea 1

s explicai legile mendeliene ale ereditii; s definii noiuni ca gene alele, genotip, fenotip, homozigot, heterozigot, polialelie, poligenie; s explicai teoria cromozomial a ereditii; s deosebii fenomenul de linkage de cel de crossingover; s nelegei determinismul cromozomial al sexelor.

vi

Proiectul pentru nvmntul Rural

Introducere

Unitatea 2 v introduce n genetic molecular, prezentnd noiunile de baz ale compoziiei chimice, structurii primare, secundare i teriare a acizilor nucleici, noiuni ce permit explicare ulterioar, n Unitatea III, a organizrii materialului genetic. Competenele specifice pentru aceast unitate sunt: s cunoatei componentele chimice de baz ale acizilor nucleici; s nelegei structura mono- i dublucatenar a acizilor nucleici; s nelegei motivele pentru care ADN este considerat elicea vieii; s nelegei modul n care moleculele de ADN sufer suprarsuciri locale; s cunoatei noiunile eseniale legate de structura acizilor ribonucleici.

Obiective specifice pentru Unitatea 2

Unitatea 3 prezint structura i organizarea materialului genetic la organisme pro- i eucariote, evideniindu-se asemnri i deosebiri, aspecte importante pentru nelegere Unitii IV. s nelegei structura cromozomului bacterian; s nelegei rolul proteinelor asociate cu ADN n structura cromozomilor la pro- i eucariote; s nelegei tipurile i rolul secvenelor de ADN repetate; s nelegei noiunile eseniale legate de plasmidele bacteriene s nelegei sistemul de organizare a materialului genetic n cadrul cromozomilor la eucariote.

Obiective specifice pentru Unitatea 3

n Unitate 4 de nvare, se parcurg principalele noiuni i etape ale proceselor de replicare i de transcriere genetic, comparativ la pro- i eucariote.

s nelegei principalele etape ale replicrii moleculelor de ADN; s nelegei rolul diverselor proteine n procesul de replicare ADN; s nelegei rolul i importana secvenelor de origine a replicrii ADN; s nelegei mecanismele de replicare a plasmidelor i de control al acestor procese s nelegei mecanismele de exprimare a genelor prin transcriere genetic

Obiective specifice pentru Unitatea 4

Proiectul pentru nvmntul Rural

vii

Introducere

n Unitatea 5 sunt prezentate noiunile eseniale legate de morfologia, structura i clasificarea principalelor grupe de microorganisme. Unitatea urmrete formarea urmtoarelor competene specifice:

Obiective specifice pentru Unitatea 5

s explici importana microbiologiei pentru societatea uman; s enumeri i s caracterizezi componentele celulei procariote; s analizezi relaia dintre particularitile diferitelor componente ale celulei eucariote i rolul pe care l ndeplinesc; s identifici principalele deosebiri dintre celula procariot i cea eucariot.

Unitatea 6 detaliaz aspecte legate de procesele biologice ce stau la baza nutriiei i creterii microorganismelor. Unitatea urmrete formarea urmtoarelor competene specifice:

Obiective specifice pentru Unitatea 6

s identifici i s caracterizezi principalele clase nutriionale de microorganisme; s explici i s exemplifici importana mediilor de cultur n izolarea i identificarea microorganismelor; s clasifici microorganismele dup tolerana fa de diferii factori de mediu; s argumentezi importana controlului microorganismelor

n final, Unitatea 7 noiuni generale de taxonomie bacterian, punndu-se accent pe importana datelor de nivel molecular n clasificarea i identificarea microorganismelor. Obiective specifice pentru Unitatea 7

s defineti noiunile de taxonomie i specie bacterian; s argumentezi superioritatea utilizrii taxonomiei moleculare n clasificarea bacteriilor; s caracterizezi principalele grupe de bacterii i fungi; s corelezi diferitele implicaii practice ale microorganismelor cu taxonii corespunztori.

viii

Proiectul pentru nvmntul Rural

Introducere

CUM SE FACE EVALUAREA CUNOTINELOR?


Evaluarea cuprinde dou modaliti distincte: o evaluare pe parcurs prin intermediul lucrrilor de verificare de la finalul fiecrei uniti de nvare i o evaluare final, realizat fa n fa cu examinatorul. Ponderea celor dou tipuri de evaluri este: 60% evaluarea pe parcurs i 40% evaluarea final. Un loc aparte l ocup testele de autoevaluare, care sunt instrumente simple, la ndemna oricrui cursant pentru a-i verifica cunotinele i pentru a se pregti n vederea lucrrilor de verificare i a evalurii finale. Testele de autoevaluare: sunt inserate n text, n chenar, find notate TA 1.1 etc, prima cifr reprezentnd numrul unitii de nvare; sunt n general alctuite din 1-2 exerciii, iar frecvena cu care apar depinde foarte mult de dificultatea coninutului tiinific parcurs; se regsesc sub form de teste ce solicit alegerea unui rspuns corect din mai multe variante de rspuns, completarea unor spaii libere, explicarea n cteva fraze a unor noiuni etc; fiecare test are alocat un spaiu corespunztor ca dimensiune pentru notarea rspunsului; am optat pentru teste de autoevaluare de nivel mediu, care s corespund posibilitilor de nvare a majoritii cursanilor; rezolvarea corect a acestor teste constituie garania obinerii unor rezultate satisfctoare la evaluarea final; la sfritul fiecrei uniti de nvare exist varianta corect de rspuns pentru fiecare test n parte. Lucrrile de verificare: reprezint baza evalurii finale; sunt situate la sfritul unitilor de nvare, n acest modul existnd 6 asemenea lucrri; se bazeaz pe aceleai tipuri de ntrebri ca i testele de autoevaluare, dar unele lucrri de autoevaluare conin i cerina de a ntocmi un scurt eseu pe o tem dat; fiecare lucrare de verificare cuprinde exerciii al cror punctaj nsumeaz 90 de puncte, 10 puncte fiind din oficiu; punctajul aferent fiecrui item se regsete n lucrarea de verificare; lucrrile de verificare se vor transmite tutorelui la datele stabilite de acesta, de preferin n format electronic, iar notarea i comentariile pe marginea lor, precum i comunicarea rezultatelor se va face n maximum dou sptmni din momentul primirii lucrrii; dup primirea tuturor celor 6 lucrri de verificare se va face o medie a punctajului obinut, medie care apoi va reprezenta 50% din nota final.

Proiectul pentru nvmntul Rural

ix

Genetica clasic

Unitatea de nvare 1

GENETICA CLASIC

Cuprins:
Cuprins Obiectivele Unitii de nvare 1 1.1 Istoricul cercetrilor de genetic 1.2 Legile Mendeliene ale ereditii 1.2.1 Noiuni de baz n genetica clasic 1.2.2 Prima lege a ereditii 1.2.3 A doua lege a lui Mendel 1.2.4 A treia lege a lui Mendel 1.2.5 Variaii de la modelul de dominan recesivitate 1.2.6 Serii polialelice 1.2.7 Caractere poligenice 1.3 Teoria cromozomial a ereditii 1.3.1 Musculia-de-oet 1.3.2 Tezele teoriei cromozomiale a ereditii 1.3.3 Determinismul cromozomial al sexelor 1.4 Definirea genei 1.5 Lucrare de verificare 1 1.6 Rspunsuri la testele de autoevaluare - Unitatea de nvare 1 1.7 Bibliografie recomandat 1 1 2 4 5 6 7 8 8 9 10 11 11 12 13 14 16 18 18

Obiectivele Unitii de nvare 1 s explicai legile mendeliene ale ereditii; s definii noiuni ca gene alele, genotip, fenotip, homozigot, heterozigot, polialelie, poligenie; s explicai teoria cromozomial a ereditii; s deosebii fenomenul de linkage de cel de crossingover; s nelegei determinismul cromozomial al sexelor.

Proiectul pentru nvmntul Rural

Genetica clasic

1.1 Istoricul cercetrilor de genetic

Capitolul prezint principalele etape parcurse de cercetrile de genetic.

Genetica este tiina care studiaz structura i funciile genelor i transmiterea lor la descendeni. nceputurile geneticii se nscriu cu 4000 de ani n urm, prin studiile realizate n Sumer i Egipt, concretizate printr-o selecie primitiv a caracterelor pe baz de fenotipuri avantajoase pentru amelioratori. Genetica modern a debutat la mijlocul secolului al XIX-lea cu studiile lui Gregor Mendel care a analizat transmiterea caracterelor la Pisum sativum (mazrea) i a stabilit c anumite caractere pot fi transmise la descendeni realiznd o corelaie ntre caractere i factorii ereditari. Astfel a nceput genetica formal genetica transmiterii caracterelor. Cunoscut ca printele geneticii moderne, Gregor Mendel (1822-1884) s-a nscut n 1822 ntr-o familie de rani din Heizendorf (localitatea fcea parte din Austria la vremea respectiv; astzi ns, localitatea se numete Hynice i face parte din Republica Ceh). La vrsta de 21 de ani intr n Mnstirea Augustinian din Brnn (astzi Brno) unde ulterior devine clugr. A urmat cursuri de matematic, tiin, filozofie la Universitatea din Viena. n grdina mnstirii din Brno, Mendel a realizat timp de zece ani experimente de ncruciri ntre diverse soiuri de mazre, urmrind transmiterea a apte perechi de caractere ereditare la descendeni. Interpretnd rezultatele, Mendel a elaborat principiile ereditii cunoscute astzi sub denumirea de Legile lui Mendel. ia publicat cea mai important lucrare despre ereditate n 1866, dar de-abia n 1900 cunoscutul botanist olandez Hugo de Vries a apreciat munca i activitatea lui Mendel. ntreaga semnificaie a fost realizat de-abia n anii 1920-1930, prin efervescena experimental a altui mare genetician, Thomas Hunt Morgan, care a elaborat teoria cromozomal a ereditii i a denumit acei factori ereditari gene. Morgan este cel care a fundamentat citogenetica, tiin ce studiaz structura i numrul cromozomilor, precum i comportamentul lor n timpul diviziunii celulare (mitoz i meioz). Thomas Hunt Morgan (1866-1945) s-a nscut n Kentucky, SUA i a fost profesor de zoologie experimental la Universitatea Columbia ntre 1904 i 1928. mpreun cu doctoranzii si (A.H.Sturtevant, C.B.Bridges i H.J.Muller), Morgan a realizat experimente i analize citologice pe musculia-de-oet (Drosophila melanogaster) demonstrnd faptul c cromozomii se comport foarte asemntor cu ceea ce Mendel denumea factori ereditari. Toate rezultatele l-au condus pe Thomas Morgan la elaborarea Teoriei cromozomiale a ereditii i la publicarea lucrrii Mecanismele Ereditii Mendeliene (1915), lucrare ce a avut un rol foarte important n dezvoltarea geneticii moderne.
Proiectul pentru nvmntul Rural

Gregor Johann Mendel

Thomas Hunt Morgan

Genetica clasic

Experimentele ulterioare realizate de Morgan au demonstrat existena i comportamentul genelor, rezultate publicate sub titlul Teoria Genei (1926). Pentru ntreaga sa activitate tiinific, Thomas Morgan primete n 1933 Premiul Nobel pentru fiziologie i medicin. Genetica molecular debuteaz cu studiile lui Griffith (1928) care a urmrit procesul de virulen la pneumococi (bacterii ce provoac pneumonie la om i mamifere). Griffith a constatat c pneumococi neviruleni devin infecioi n prezena unor pneumococi viruleni dar omori anterior prin tratament termic. A concluzionat c modificarea se realizeaz prin aciunea unui agent transformat. Natura acestui agent ns a fost descoperit mai trziu, n 1944, de ctre Avery, Mac Leod i McCarty, fiind vorba de o macromolecul de ADN d.c. Acizii nucleici au fost iniial descoperii n nucleii leucocitelor umane, dar fr s fie identificat funcia lor. Analiza chimic realizat n prima decad a secolului trecut a stabilit existena a 2 clase importante de acizi nucleici, i anume ADN i ARN. Pn n prezent, cea mai important descoperire din domeniul geneticii a fost elucidarea structurii ADN, macromolecul dublu catenar helical, de ctre James Watson i Francis Crick n 1953. n prezent, ADN este denumit macromolecul informaional, coninnd informaia genetic codificat n structura sa. Etapa urmtoare n dezvoltarea geneticii este reprezentat de apariia geneticii moleculare care a beneficiat pe studiile pe microorganisme, iniial pe bacterii, iar cobaiul a fost Escherichia coli. Acest microorganism prezint avantaje majore pentru studiile de genetic: o generaie se obine n cteva minute, toate caracterele se exprim (datorit faptului c este haploid, adic deine un singur set de gene/ cromozomi), populaia reprezint o clon (toi indivizii fiind identici din punct de vedere genetic, iar variabilitatea intervine doar n urma unor procese mutagene).
Escherichia coli

Streptococcus pneumoniae

O alt etap care a revoluionat genetica molecular este reprezentat de momentul iniierii tehnologiei ADN recombinant n 1970, tehnologie ce a permis realizarea unor cercetri fundamentale referitoare la. structura i funciile genelor i a unor cercetri aplicative ce au condus la sinteza unor substane biologic active, inclusiv a unor compui de interes biomedical. Tot anul 1970 este anul n care Temin i Baltimore au descoperit retrovirusurile i reverstranscrierea. Anul 1975 este asociat cu hibridizarea molecular de tip Southern, Northern i Western blotting, fapt ce a permis seturi de analize moleculare a structurii fine a genelor. Anul 1977 este corelat cu secvenierea acizilor nucleici, Maxam, Gilbert i Sanger, precum i cu identificarea genelor mozaicate de la organismele eucariote. 3

Proiectul pentru nvmntul Rural

Genetica clasic

Perioada urmtoare a geneticii moleculare este cea a anilor 1980 1985, cnd au fost obinute primele organisme transgenice, organisme obinute prin introducerea de gene heterologe (gene obinute de la alte organisme) n embrioni timpurii aflai n stare de blastul. Etapa urmtoare corespunde anului 1975, an n care Kary Mullis a pus la punct tehnica PCR (Polymerase Chain Reaction) de amplificare enzimatic in vitro a unei secvene de ADN, tehnic esenial n studierea i secvenierea genelor pentru c permite obinerea unui numr mare de copii dintr-o anumit secven de nucleotide ntr-un timp foarte scurt. n anul 1996, cercettorii de la Institutul Roslin din Edinburg, Marea Britanie au reuit clonarea unui organism mamalian pornind de la celule somatice adulte. De atunci i pn n prezent s-a mai reuit clonarea unor diverse specii de mamifere. Teste de autoevaluare TA 1.1 Cum sunt denumite astzi cele mai importante descoperiri ale lui Gregor Mendel ? Rspuns: ............................................................................................................. TA 1.2 Ce teorie a elaborat Thomas Morgan ? Rspuns: ............................................................................................................. TA 1.3 Care este cea mai important descoperire n domeniul geneticii, pn n prezent ? Rspuns: ............................................................................................................. ............................................................................................................. .............................................................................................................

1.2 Legile Mendeliene ale ereditii

Capitolul explic cele trei legi mendeliene ale ereditii i noiunile de baz din genetica clasic.

La mijlocul secolului XIX Gregor Johann Mendel a efectuat o serie de experimente pe plante de mazre, n grdina mnstirii din Brno. El a ales mazrea de grdin (Pisum sativum), n primul rnd pentru c aceast plant se poate i autofertiliza datorit faptului c pe o aceeai tulpin exist i flori femele i flori mascule.

Proiectul pentru nvmntul Rural

Genetica clasic

Figura 1.1 Cele apte caractere fenotipice analizate de Gregor Mendel la Pisum sativum (dup Singer, 1978 )

Mendel a ncruciat diverse soiuri de mazre, urmrind n descenden apte caractere (Figura 1.1), dintre care cele mai cunoscute sunt forma i, respectiv, culoarea bobului. Pentru fiecare din cele dou caractere, Mendel a constatat c pot exista dou variante: Caracter forma bobului culoarea bobului Variante neted zbrcit galben verde

n cursul ncrucirilor pe care le-a realizat, Mendel a notat: P sau F0 generaia parental, pur din punct de vedere genetic F1 prima generaie, obinut din ncruciarea dintre 2 linii parentale pure F2 a doua generaie, obinut prin autofecundarea indivizilor din prima generaie 1.2.1 Noiuni de baz n genetica clasic Din experimentele efectuate de Gregor Mendel, au reieit urmtoarele noiuni ce sunt n bun parte valabile i astzi : gene alele (denumite de Mendel factori ereditari) sunt variante ale unei gene, variante ce codific pentru un acelai caracter i care sunt localizate n loci omologi ntr-un organism diploid, un caracter este determinat de o pereche de gene alele; acestea pot s fie identice una cu cealalt, caz n care organismul poart denumirea de homozigot pentru acea gen, sau pot sa fie diferite una de cealalt, caz n care organismul se numete heterozigot ntr-o pereche de gene alele prezente ntr-un organism, de cele mai multe ori, nu se exprim ambele gene, ci doar una dintre ele; gena care se exprim este denumit ca fiind dominant fa de cealalt, care este denumit recesiv ca urmare, organismele heterozigote prezint acelai fenotip cu organismele homozigote dominante
Proiectul pentru nvmntul Rural

Genetica clasic

perechile de gene alele prezente ntr-un organism se despart n interiorul gameilor, acetia avnd doar cte una din gene din fiecare pereche loci omologi reprezint locaii situate la acelai nivel pe cromozomi omologi, locaii n care se gsesc gene alele linie pur din punct de vedere genetic care este homozigot pentru o serie de caractere genotipul reprezint totalitatea genelor deinute de un organism fenotipul reprezint totalitatea caracterelor artate (prezentate) de un organism
Mendel a mai notat : A - gen dominant a gen recesiv AA organism cu genotip homozigot dominant; un asemenea organism exprim fenotipul genei A aa - organism cu genotip homozigot recesiv; un asemenea organism exprim fenotipul genei a Aa organism cu genotip heterozigot; un asemenea organism exprim fenotipul genei A

1.2.2 Prima lege a ereditii Legile mendeliene descriu transmiterea caracterelor prin intermediul factorilor ereditari. Prima lege a lui Mendel este intitulat Legea puritii gameilor i statueaz faptul c gameii sunt puri din punct de vedere genetic, adic nu conin dect unul din cei 2 factori ereditari pereche. Aceast lege mai este denumit i monohibridism, ntruct descrie ncruciarea ntre organisme ce difer ntre ele doar printr-un singur caracter, situaie n care descendena este uniform fenotipic i se aseamn cu unul din parentali. Pentru evidenierea acestei legi, Mendel a ncruciat 2 linii pure de mazre: una cu bob neted (pe care a notat-o AA) i una cu bob zbrcit (aa). Dac se ncrucieaz 2 organisme homozigote pentru un caracter (AA x aa), organisme ce difer ntre ele printr-un singur caracter, n prima generaie (F1) rezult numai organisme care din punct de vedere genotipic sunt heterozigote, iar din punct de vedere fenotipic prezint fenotipul genei dominante (n cazul de fa A adic bob neted. Prin autofertilizarea organismelor obinute n aceast prim generaie, se obin n generaia a doua (F2) organisme ce difer ntre ele att genotipic ct i fenotipic: - homozigote dominante (AA) - homozigote recesive (aa) - heterozigote (Aa) n urma interpretrilor statistice, s-a constatat c genotipurile i fenotipurile segreg dup anumite reguli statistice: - cele 3 genotipuri posibile respect anumite proporii: 1AA : 2Aa : 1aa; - cele 2 fenotipuri posibile respect anumite proporii: 3 fenotipul genei dominante : 1 fenotipul genei recesive (Figurile 1.2 i 1.3). 6
Proiectul pentru nvmntul Rural

Genetica clasic

Figura 1.2 Prezentarea schematizat a monohibridrii prin ncruciarea la Pisum sativum ntre plante cu bob galben (caracter dominant codificat de gena A) i plante cu bob verde (caracter recesiv codificat de gena a).

Figura 1.3 Schema segregrii genotipice i fenotipice, de la generaia parental pn la generaia a treia, n cazul unei singure perechi de caractere.

1.2.3 A doua lege a lui Mendel A doua lege a lui Mendel se mai numete i dihibridism i presupune ncruciarea a 2 organisme ce difer ntre ele doar prin 2 caractere. Aceast lege mai poart numele i de Legea segregrii independente a caracterelor i statueaz faptul c fiecare pereche de caractere se transmite la descendeni n mod independent de alte perechi de caractere. n experimentele sale Mendel a luat n studiu plante de mazre cu bob neted i galben (caractere dominante) i plante cu bob zbrcit i verde (caractere recesive). n prima generaie (F1) s-au obinut plante hibride care fenotipic exprimau caracterele dominante (bob neted i galben). n urma autofertilizrii plantelor din prima generaie, n a doua generaie s-a obinut o segregare fenotipic de 9:3:3:1 (tabelul din figura 1.4).

Proiectul pentru nvmntul Rural

Genetica clasic

Figura 1.4 Reprezentarea schematizat a segregrii caracterelor n a doua generaie (F2) prin dihibridism.
gamei femeli gamei masculi

AB AABB AABb AaBB AaBb

Ab AABb AAbb AaBb Aabb

aB AaBB AaBb aaBB aaBb

ab AaBb Aabb aaBb aabb

AB Ab aB ab

1.2.4 A treia lege a lui Mendel Cea de a treia lege a lui Mendel este cunoscut i sub denumirea de Legea reasocierii independente. Aceast lege are, de fapt, ca suport citologic, procesul de recombinare independent a perechilor de cromozomi omologi n timpul meiozei proces cunoscut i sub denumirea de recombinare genetic intercromozomial. 1.2.5 Variaii de la modelul de dominan recesivitate Au fost identificate o serie de abateri de la legile mendeliene, ce prezint un pattern de segregare diferit de cele amintite mai sus. a) Un exemplu este dominana incomplet, caz n care hibrizii nu prezint fenotipul dominant, ci un fenotip intermediar. Astfel, la planta barba-mpratului (Mirabilis jalapa), hibrizii nu prezint culoarea roie caracteristic caracterului dominant, ci culoarea roz intermediar. n acest caz, raportul de segregare fenotipic nu este 3:1 ci 1:2:1 (Figura 1.5).

Figura 1.5 Prezentarea schematizat a monohibridrii prin ncruciarea la Mirabilis jalapa ntre plante cu flori roii (caracter dominant codificat de gena A) i plante cu flori albe (caracter recesiv codificat de gena a).

b) O alt abatere este codominana, care este cel mai evident n cazul grupelor de snge de la om din sistemul ABO. Sistemul ABO presupune existena unor anticorpi fa de polizaharidele celulare A sau B. Un anticorp este o protein ce are capacitatea de a lega un antigen (molecul strin de corp) i a o inactiva. Inactivarea este nsoit de formarea unui precipitat. Sngele de tip A conine hematii pe a cror suprafa se gsesc antigene de tip A, iar n plasm conine anticorpi anti-B. Sngele de 8
Proiectul pentru nvmntul Rural

Genetica clasic

tip B conine hematii pe a cror suprafa se gsesc antigene B, iar n plasm conine anticorpi anti-A. In cazul grupei sanguine AB, hematiile conin pe suprafaa lor ambele antigene, manifestndu-se astfel fenomenul de codominan. Totodat, n plasm nu exist nici un fel de anticorpi. n cazul grupei 0, nu exist antigene pe suprafaa hematiilor, dar n plasm exist ambii anticorpi. In final, s-a stabilit c sistemul cuprinde 3 gene, LA, LB i l. Genele LA i LB sunt codominante una fa de cealalt i fiecare dintre ele este dominant fa de gena l (tabelul din figura 1.6).
Figura 1.6 Genotipurile posibile la grupele de snge n sistemul AB0.

Fenotip (Grupa de snge) A B AB 0

Genotip posibil LALA sau LAl LBLB sau LBl LALB ll

Antigenele AB0 de pe suprafaa hematiilor sunt glicoproteine ce se formeaz de la un precursor polipeptidic la care se adaug, n funcie de grupa sanguin, diverse lanuri polizaharidice. Glicolizarea este realizat de o enzim diferit la grupele La i Lb. n cazul grupei 0, alela recesiv l codific pentru o enzim inactiv care determin ca antigenul s fie format din miezul polipeptidic i fucoz. Pentru grupa A transferaza A catalizeaz legarea la fucoz a N-acetilglucozaminei, iar pentru grupa galactoza. 1.2.6 Serii polialelice Cercetri ulterioare experimentelor lui Mendel au artat c dei la nivelul unui singur individ exist o singur pereche de loci omologi i, ca atare, o singur pereche de gene alele, la nivelul unei populaii de indivizi pot exista mai multe gene alele, ce constituie o serie polialelic. Simplificat, genele dintr-o serie polialelic pot fi notate astfel: a1, a2, a3, a4, a5, ......, an. Un individ conine doar 2 gene din seria polialelic, de exemplu: a1/a3 sau a1/a5 sau a2/a2 sau a4/a4 etc. Astfel, unii indivizi sunt homozigoi pentru o anumit gen (a1/a1; a2/a2 etc), iar alii sunt heterozigoi (a1/a2 sau a2/a3 etc). Noiunea de dominan/ recesivitate a fost redefinit ca relaia dintre 2 gene alele prezente n acelai individ. Astfel, este posibil ca gena a1 s fie dominant fa de gena a2 i, ca urmare, heterozigotul a1/a2 s prezinte fenotip a1. Pe de alt parte ns, este posibil ca aceeai gen a1 s fie recesiv fa de a3 i, deci, heterozigotul a1/a3 s aib fenotip a3. Cu alte cuvinte, n multe serii polialelice nici una dintre gene nu este dominant fa de toate celelalte. Proiectul pentru nvmntul Rural 9

Genetica clasic

1.2.7 Caractere poligenice Cercetrile au continuat i au evideniat faptul c unele caractere sunt influenate de mai multe gene ne-alele. Cu alte cuvinte, exist caractere ce sunt determinate de combinaii de gene de tipul [a2/a5; b3/b4], fiecare din cele dou perechi de gene alele aparinnd la serii polialelice diferite: a1, ...., an i b1, ...., bn. Fenomenul poart numele de poligenie, iar caracterul respectiv este determinat poligenic.

Teste de autoevaluare TA 1.4 Urmrind Figura1.2, facei schema monohibridrii la Pisum sativum ntre plante cu bob neted (caracter dominant) i plante cu bob zbrcit (caracter recesiv) :

TA 1.5 Dac o mam are grupa de snge A, iar copilul su are grupa B, atunci ce grupe de snge poate avea tatl ? Facei schema. Rspuns: .............................................................................................................

10

Proiectul pentru nvmntul Rural

Genetica clasic

1.3 Teoria cromozomial a ereditii

Capitolul explic procesele genetice ce stau la baza teoriei cromozomiale a ereditii.

Geneticianul american Thomas Hunt Morgan i echipa sa au elaborat ntre 1911 i 1919 Teoria cromozomial a ereditii, teorie ce se bazeaz pe comportamentul cromozomilor n mitoz i meioz. Pentru toate contribuiile sale n domeniul geneticii, Morgan a primit n 1933 Premiul Nobel.

Figura 1.7 Musculi- de- oet depunnd un ou (dup Encarta Encyclopedia, 2004).

Thomas Hunt Morgan Biologul i geneticianul american Thomas Hunt Morgan s-a nscut n 1866 n Lexington, Kentucky, USA. Morgan a studiat embriologia la Universitatea Johns Hopkins unde i-a luat i doctoratul n 1891. ntre 1904 i 1928 a fost profesor de zoologie experimental la Universitatea Columbia. La nceput a criticat teoriile lui Mendel, dup care a realizat serii ntregi de experimente i analize citologice pe musculia-de-oet. Astfel, Morgan i studenii si A.H. Sturtevant, C. Blackman Bridges i H.J. Muller au artat faptul c cromozomii se comport foarte asemntor cu factorii ereditari ai lui Mendel. Morgan i colaboratorii si au publicat dou lucrri importante - The Mechanism of Mendelian Heredity (Mecanismul Ereditii Mendeliene, 1915) i Theory of the Gene (Teoria Genei, 1926) care au influenat major etapele urmtoare n dezvoltarea geneticii moderne. n 1933 Thomas Morgan a primit Premiul Nobel pentru fiziologie i medicin.

1.3.1 Musculia-de-oet Musculia-de-oet (Figura 1.7), cu denumirea tiinific de Drosophila melanogaster, din punct de vedere tiinific face parte din Ordinul Diptera, Familia Drosophilidae. Este cunoscut oamenilor pentru c apare la oet (de unde i denumirea) sau la fructe fermentate. Adulii au dimensiuni mici (3-4 mm), cu corp maron sau negru, cu ochi de obicei de culoare roie. Grupuri ntregi de cercettori (dintre care cel mai cunoscut a fost grupul condus de Thomas Morgan) au ales musculia-de-oet pentru cercetri citologice i genetice din urmtoarele motive: se cresc foarte uor i ieftin, pe medii de cultur cu compoziie simpl (ap, zahr, agar- agar, drojdie- de- bere) au un ciclu de via foarte scurt, de numai 10 12 zile la temperatura de 24oC; ca urmare, o nou generaie poate fi obinut n aproximativ o sptmn; Drosophila este un dipter cu morfogenez complet, adic traverseaz toate cele 3 stadii larvare:

adult

ou

larv I

larv II

larv III

pup

adult
11

Proiectul pentru nvmntul Rural

Genetica clasic

sunt foarte prolifice: un cuplu poate produce pn la 500 de descendeni aceast specie prezint o variabilitate genetic foarte mare, chiar n populaii naturale fiind prezente un numr mare de mutaii are o garnitur cromozomial simpl, format doar din 8 cromozomi, grupai n 4 perechi (Figura 1.8):

perechea I sunt heterozomi, XX la femel i XY la mascul perechea II sunt autozomi, metacentrici perechea III sunt autozomi, submetacentrici perechea IV sunt autozomi, subtelocentrici

Figura 1.8 Cromozomii la musculia- de- oet.

1.3.2 Tezele teoriei cromozomiale a ereditii Prima tez a teoriei cromozomiale a ereditii statueaz faptul c genele sunt plasate linear n cromozomi, fiecare gen ocupnd o anumit poziie denumit locus (cu pluralul loci). A doua tez a teoriei cromozomiale statueaz faptul c genele plasate pe acelai cromozom se transmit nlnuit (mpreun, n bloc) la descendeni. Morgan a denumit acest fenomen linkage i, deci, genele de pe acelai cromozom se transmit linkat. La baza fenomenului de linkage st faptul c n timpul diviziunii celulare (fie mitoz, fie meioz) cromozomii se comport ca entiti de sine stttoare; n transmiterea lor de la celula parental la celulele fiice, cromozomii i pstreaz individualitatea i integritatea structural. Astfel, genele plasate pe acelai cromozom se transmit n bloc la celulele fiice, n contrast cu genele plasate pe cromozomi diferii. A treia tez a teoriei cromozomiale s-a bazat pe observaia comportamentului cromozomilor n timpul meiozei. Astfel, n decursul profazei I a meiozei cromozomii omologi se apropie foarte mult unul de altul realiznd aa-numita sinaps cromozomial. Mai mult chiar, ntr-o asemenea structur (denumit bivalent), cromozomii omologi schimb ntre ei fragmente cromatidice echivalente. Fenomenul a fost denumit crossing-over (mai este numit i recombinare genetic intra-cromozomial) i are efect invers fa de linkage producnd netransmiterea nlnuit a anumitor gene plasate pe acelai cromozom. Cercetri ulterioare au concluzionat c fenomenul de crossing-over reprezint unul dintre cele mai importante mecanisme de variabilitate genetic la organisme eucariote, deci la organisme ce prezint sexualitate. Pe de alt parte, frecvena evenimentelor de crossing-over este direct proporional cu lungimea cromozomului; cu alte cuvinte, probabilitatea ca 2 gene plasate pe acelai cromozom s nu se transmit nlnuit crete cu distana dintre ele. Faptul c genele sunt plasate pe cromozom a fost de Morgan nc din 1910 prin studii pe Drosophila melanogaster, care a constatat c n populaiile de tip slbatic (cu ochi roii) apreau 12
Proiectul pentru nvmntul Rural

Genetica clasic

frecvent masculi cu ochi albi. Gena pentru culoarea ochilor (w+) este plasat pe cromozomul X, iar gena pentru ochi albi este recesiv (w). La musculia de oet, sexele sunt determinate cromozomial, pe un model cu femele XX i masculi XY. Ca urmare, o mutaie la nivelul acestor gene localizate pe cromozomul X se exprim ca i cum organismul ar fi haploid. Genele plasate pe cromozomul X i care, deci, se transmit o dat cu acesta, sunt X-linkate (fenomenul de X-linkage). 1.3.3 Determinismul cromozomial al sexelor La organismele eucariote dezvoltate grupurile de gene de control al dezvoltrii sexuale se gsesc grupate pe anumii cromozomi ce au fost denumii cromozomi de sex sau heterozomi. n marea majoritate a cazurilor, aceti cromozomi au fost notai cu literele X i, respectiv, Y. Ceilali cromozomi din garnitur au fost denumii autozomi (notai cu litera A). La Drosophila, dar i la mamifere (inclusiv la om), femela reprezint sexul homogametic avnd, pe lng autozomi, doi heterozomi e acelai fel, notai XX. Garnitura cromozomial a unei femele poate fi scris astfel: 2A + XX. Denumirea de sex homogametic se datoreaz faptului c, prin meioz, femela formeaz gamei ce pot conine doar un singur tip de heterozomi, respectiv tipul X. Masculul este sexul heterogametic i conine ca heterozomi cte un cromozom din fiecare tip. Garnitura sa este: 2A + XY. Din punct de vedere al heterozomilor, masculul formeaz dou tipuri de gamei: unii conin cromozomul X, alii Y. Datorit faptului c acest tip de determinism cromozomial al sexelor a fost descris prima oar la musculia-de-oet, a fost denumit determinism tip Drosophila (Figura 1.9).

Figura 1.9 Reprezentarea schematizat al tipului Drosophila de determinism cromozomial al sexelor.

n afar de diptere i de mamifere, acest tip de determinism a mai fost identificat i la o serie de specii de plante. Alte cercetri au evideniat, n cadrul dipterelor, existena unui subtip, denumit subtipul Protenor (greier- de- cmp) de la numele speciei la care a fost descris prima oar. n acest caz, femela are tot 2 cromozomi de sex similari (notai tot XX) i este sexul homogametic. Masculul ns nu are 2 heterozomi (XY), ci doar unul singur (X) i este sexul heterogametic. Pe de alt parte ns, n ansamblu, masculul are un cromozom mai puin dect femela. Proiectul pentru nvmntul Rural 13

Genetica clasic

Exist i specii la care masculul este sexul homogametic (2A + XX), iar femela este sexul heterogametic (2A + XY - tipul Abraxas sau pasre sau 2A + X0 - subtipul fluture).

Teste de autoevaluare TA 1.6 Marcai varianta cea mai apropiat de noiunea de linkage: a) celul b) nlnuire c) disociere d) mitoz TA 1.7 Marcai varianta cea mai apropiat de noiunea de crossing-over: a) mitoz b) traversare c) citodifereniere d) recombinare TA 1.8 Listai cele 4 tipuri importante de determinism cromozomial al sexelor : Rspuns: ............................................................................................................. ............................................................................................................. .............................................................................................................

1.4 Definirea genei


Gena este unitatea fundamental a ereditii reprezentnd un segment de ADN. Funcia genelor a fost stabilit dup 1945, cnd a fost iniiat ipoteza c o gen codific pentru o anumit enzim, fiecare etap catabolic fiind catalizat de o anumit enzim codificat de o anumit gen. n consecin, o mutaie la nivelul unei gene blocheaz activitatea enzimei i, implicit, calea metabolic corespunztoare. Ulterior s- a stabilit c, de fapt, o protein poate fi format din mai multe polipeptide i, deci, o gen codific pentru un lan polipeptidic. Faptul c o gen codific o anumit polipeptid a fost demonstrat de diverse date experimentale, dintre care amintim cele ale lui Beadle i Efphrussi 1950, care au demonstrat c producerea pigmentaiei de tip slbatic (crmiziu) la drosofile se realizeaz n mai multe etape. Blocajul ]n diverse etape apariia unor mutante cu culori diferite ale ochilor. Pentru formarea pigmentului de tip slbatic, triptofanul este convertit n pigmentul xantomatin (pigment maro) ntr-o serie de reacii : Concepia clasic despre gen considera c gena este indivizibil i c determin un anumit fenotip, fiind cea mai mic unitate de mutaie i recombinare. n concepia modern, gena este divizibil, cea mai mic unitate de mutaie i recombinare fiind perechea de nucleotide, denumit muton i, respectiv, recon. Pentru stabilirea structurii fine a genei s-au realizat iniial experimente pe bacteriofagul T4 de ctre Seymour Benzer (1955-1962). Bentzer a adaptat la fagul T4 testul de complementaie, utilizat anterior la organismele superioare. 14
Proiectul pentru nvmntul Rural

Genetica clasic

Complementaia genetic reprezint interaciunea dintre 2 seturi de gene care permite celulei sau virusului s manifeste o anumit funcie dei fiecare set de gene poart o mutaie la nivelul unei gene eseniale. Testul de complementaie (testul cis- trans, test de alelism) stabilete dac 2 mutaii aparin la 2 gene diferite sau sunt intragenice. Gena n testul cis- trans poart numele de cistron, acesta fiind o unitate de funcie, o regiune cromozomal ce codific un produs celular specific i este format dintr-o multitudine de locusuri potenial mutabile, ntre care se poate realiza recombinare genetic.

Triptofan Blocaj vermillon (rou foarte aprins) Formilkinurenin Blocaj cinnabar (rou aprins) Hidroxinurenin

Xantomatin (maro)

Proiectul pentru nvmntul Rural

15

Genetica clasic

1.5 LUCRARE DE VERIFICARE 1


I. ncercuii litera corespunztoare variantei corecte de rspuns: 1. Genele alele sunt : a) gene suprapuse localizate pe acelai cromozom b) gene complementare localizate pe cromozomi omologi c) gene ce codific pentru acelai caracter, localizate pe cromozomi omologi d) gene ce codific pentru caractere diferite, localizate pe cromozomi omologi 2. Gena dominant este : a) gena care se exprim dintr-o pereche de gene alele b) gena care nu se exprim dintr-o pereche de gene alele c) gena dominant fa de heterozomi d) gena dominant fa de autozomi 3. Gena recesiv este : a) gena care se exprim dintr-o pereche de gene alele b) gena care nu se exprim dintr-o pereche de gene alele c) gena recesiv fa de autozomi d) gena recesiv fa de heterozomi 4. Homozigot este : a) un organism homogametic b) un organism heterogametic c) un organism ce prezint aceeai gen n dublu exemplar n loci omologi d) un organism ce prezint dou gene diferite n loci omologi 5. Heterozigot este : a) un organism homogametic b) un organism heterogametic c) un organism ce prezint aceeai gen n dublu exemplar n loci omologi d) un organism ce prezint dou gene diferite n loci omologi 6. Noiunea de genotip se apropie cel mai mult de : a) generare b) un numr de genoflexiuni c) un numr de gene d) tipuri de genuri 7. Noiunea de fenotip se apropie cel mai mult de : a) fenetic b) frenologie c) un numr de caractere d) un numr de gene 8. Pisum sativum este : a) piroc b) mazre c) pisanie d) pirog

16

Proiectul pentru nvmntul Rural

Genetica clasic

9. Polialelia este : a) situaia n care un caracter este determinat de mai multe gene alele b) situaia n care un caracter este determinat de mai multe gene nealele c) situaia n care un caracter este determinat de mai muli cromozomi aleli d) situaia n care un caracter este determinat de mai muli heterozomi 10. Poligenia este : a) situaia n care un caracter este determinat de mai multe gene nealele b) situaia n care un caracter este determinat de mai multe gene alele c) situaia n care un caracter este determinat de mai muli cromozomi omologi d) situaia n care un caracter este determinat de mai muli cromozomi neomologi Total: 10 puncte (cte 1 punct pentru fiecare item) II. Completai spaiile goale cu noiunile corespunztoare: La specia Mirabilis jalapa se manifest fenomenul numit ..............................................., iar grupele de snge din sistemul AB0 la specia uman se caracterizeaz prin fenomenul ......................................................... Thomas H.Morgan a experimentat pe specia ....................................................... La aceast specie femela perechea de heterozomi se noteaz .......... , iar la mascul se noteaz .......... Total: 10 puncte (cte 2 puncte pentru fiecare noiune) III. Rspundei pe scurt (1-2 fraze) la urmtoarele ntrebri: 1) 2) 3) 4) 5) 6) Exprimai prima lege a lui Mendel. Exprimai cea de-a doua lege a lui Mendel. Care este diferena ntre polialelie i poligenie ? Definii noiunile de linkage i crossing-over. Care este diferena ntre autozomi i heterozomi ? Care este, din punct de vedere al heterozomilor, diferena ntre o femel de mamifer i una de fluture ? Total: 30 puncte (cte 5 puncte pentru fiecare noiune) IV. Reprezentai diagramatic ierarhizarea pe criterii organizatorice a lumii vii. 1) Facei schema de dihibridism la Pisum sativum ntre plante cu bob neted i galben (genotip NNGG) cu plante cu bob zbrcit i verde (nngg). 2) femeie cu grupa de snge B nate un copil cu grupa de snge 0. Femeia nu tie care din cei 2 brbai, Ionel sau Vasile, este tatl copilului. n urma analizelor se constat c Ionel are grupa A, iar Vasile are grupa AB. Care dintre cei doi poate fi tatl copilului ? Facei schema. Total: 10 puncte (cte 5 puncte pentru fiecare schem) V. Realizai pe maximum 2 pagini un eseu cu tema: Importana legilor mendeliene i a teoriei cromozomiale a ereditii pentru dezvoltarea cercetrilor de biologie. Se puncteaz structurarea eseului, claritatea argumentelor, folosirea limbajului adecvat. Total: 30 puncte (cte 10 puncte pentru fiecare cerin) Total general: 90 puncte + 10 puncte din oficiu= 100 puncte
Proiectul pentru nvmntul Rural

17

Genetica clasic

1.6 RSPUNSURI LA TESTELE DE AUTOEVALUARE Unitatea de nvare 1


TA1.1 Legile lui Mendel. TA1.2 Teoria cromozomial a ereditii. TA1.3 Descoperirea structurii ADN. TA1.4 Schema este similar celei din Figura 1.2 TA1.5 Tatl poate avea grupa de snge B (cu oricare din genotipurile posibile LBLB sau LBl) sau grupa AB (cu genotipul LALB). TA1.6 b TA1.7 d TA1.8 vezi subcap. Determinismul genetic al sexelor.

1.7 BIBLIOGRAFIE RECOMANDAT


1. Cornea C.P., 1998, Elemente de Inginerie Genetic, Editura ALL, Bucureti. 2. Covic M., tefnescu D., Sandovici I., 2004, Genetic medical, Editura Polirom. 3. Gavril L., 2003, Genomica Un tratat despre genom, de la virusuri la om, vol.I i vol.II, Editura Enciclopedic, Bucureti. 4. Raicu P., Stoian V., 1991, Genetica dezvoltrii la eucariote, Editura Academiei Romne. 5. Vassu T., Stoica I., Cstuak O., Muat F., 2001, Genetica microorganismelor i Inginerie genetic microbian. Note de curs i Tehnici de laborator. Editura Petrion, Bucureti.

18

Proiectul pentru nvmntul Rural

Structura acizilor nucleici

Unitatea de nvare 2

STRUCTURA ACIZILOR NUCLEICI

Cuprins:
Cuprins Obiectivele Unitii de nvare 2 2.1 Introducere 2.2 Structura primar a acizilor nucleici 2.3 Structura secundar a acizilor nucleici 2.4 ADN elicea vieii 2.5 Suprarsucirea moleculelor de ADN 2.6 Acizii ribonucleici 2.7 Lucrare de verificare 2 2.8 Rspunsuri la testele de autoevaluare - Unitatea de nvare 2 2.9 Bibliografie recomandat 19 19 20 21 23 25 28 28 31 33 33

Obiectivele Unitii de nvare 2 s cunoatei componentele chimice de baz ale acizilor nucleici; s nelegei structura mono- i dublucatenar a acizilor nucleici; s nelegei motivele pentru care ADN este considerat elicea vieii; s nelegei modul n care moleculele de ADN sufer suprarsuciri locale; s cunoatei noiunile eseniale legate de structura acizilor ribonucleici.

Proiectul pentru nvmntul Rural

19

Structura acizilor nucleici

2.1 Introducere

Capitolul prezint principalele noiuni legate de ADN ca molecul informaional.

Trsturile (caracterele) ereditare se caracterizeaz prin capacitatea de a se transmite de la o generaie la cealalt. Caracterele ereditare sunt determinate de factorii genetici, iar totalitatea acestora alctuiesc genotipul unui organism. n timpul vieii oricrui organism genotipul acestuia funcioneaz (adic se exprim), iar din interaciunea genotipului cu mediul rezult manifestarea vizibil, denumit fenotip. Toate funciile unui organism, fie el unicelular, fie pluricelular, sunt ndeplinite cu ajutorul materialului genetic. Genetica este tiina care studiaz caracterele ereditare ale organismelor, structura i funcionarea acestora, modul n care se transmit la descendeni. Datorit dezvoltrii tehnicilor de studiu n ultimii douzeci de ani, n prezent genetica este reprezentat de un complex ntreg de tiine, de la citogenetic clasic, pn la inginerie genetic. Setul complet de informaie genetic dintr-un organism poart numele de genom. Cercetrile desfurate pe ntindere de aproape un secol au demonstrat c toate organismele descrise pe Terra pn n prezent au genom format din acizi nucleici. Mai mult dect att, la toate organismele, att cele procariote, ct i cele eucariote, au genomul format din ADN. Se poate deci spune c molecula ADN reprezint materialul genetic aproape universal pe Pmnt. O excepie notabil o reprezint anumite virusuri, la care materialul genetic este reprezentat de molecule ARN. Viaa - flux continuu de informaie Dintr-un anumit punct de vedere, viaa ar putea fi definit i ca un flux continuu de informaie. Astfel, materialul genetic conine informaie pentru : formarea tuturor structurilor unei celule pentru diferenierea unor diverse tipuri de celule i esuturi pentru desfurarea tuturor reaciilor biochimice i, n final, fiziologice multiplicarea celulelor i pentru nmulirea organismelor pentru moartea celular i chiar i pentru moartea unui organism ntreg

Teste de autoevaluare. TA2.1 ncercuii litera corespunztoare variantei celei mai apropiate de domeniul de studiu al geneticii? a) studiul mainilor; b) studiul climei; c) studiul caracterelor ereditare;

20

Proiectul pentru nvmntul Rural

Structura acizilor nucleici

2.2 Structura primar a acizilor nucleici

Capitolul prezint principalii constitueni chimici ai acizilor nucleici.

Acizii nucleici reprezint molecule foarte complexe, produse att de organisme vii (celule), ct i de virusuri. Denumirea de acizi nucleici se datoreaz faptului c prima oar au fost izolate din nuclei de celule. Cercetri ulterioare au dovedit ns faptul c anumite tipuri de acizi nucleici nu se gsesc n nucleu, ci n citoplasm. n ansamblu, acizii nucleici ndeplinesc dou funcii biologice majore: - transmit informaia ereditar de la o generaie la alta - conin informaie pentru producerea de proteine specifice Exist dou categorii majore de acizi nucleici : acid deoxiribonucleic (pe scurt, ADN) i acid ribonucleic (pe scurt, ARN). O molecula de acid nucleic este format din uniti de baz, numite nucleotide, legate ntre ele prin legturi chimice de tip covalent (legturi fosfodiesterice). Fiecare nucleotid este alctuit din 3 categorii de molecule, i ele legate ntre ele (Figurile 2.2 i 2.3) : baz azotat pentoz (un zahar format din 5 atomi de carbon) un rest de radical fosforic Att n structura ADN, ct i n ARN, exist 4 tipuri majore de baze azotate : adenin, timin, citozin, guanin - n ADN adenin, uracil, citozin, guanin - n ARN Adenina i guanina sunt baze azotate derivate din structura purinei i, ca atare, mai sunt numite i baze purinice (sau, simplu purine). Timina, citozina i uracilul sunt derivate din structura pirimidinei baze pirimidinice/ pirimidine (Figura 2.2). n mod curent, cele 5 baze azotate se prescurteaz A, T, C, G i, respectiv, U. Pentoza este, fie riboz n ARN, fie deoxiriboz n ADN (Figura 2.4)

Formarea nucleotidelor Baz azotat + pentoz = nucleosid de ex. A + pentoz = adenosina nucleosid + radical fosforic = nucleotid de ex. adenosin + radical fosforic = acid adenilic

Proiectul pentru nvmntul Rural

21

Structura acizilor nucleici

Figura 2.1 Clasificarea nucleosidelor i a nucleotidelor.

Denumirea nucleosidelor i a nucleotidelor


Baze azotate Purine Adenin (A) Nucleoside n ARN n ADN Nucleosid mono-, di-, trifosfai (n ARN) Deoxinucleosid mono-, di-, trifosfai (n ADN) Nucleotide n ARN n ADN adenosina deoxiadenosin AMP, ADP, ATP Guanin (G) guanosin deoxiguanosin GMP, GDP, GTP Pirimidine Citozin (C) citidin deoxicitidina CMP, CDP, CTP Uracil (U) Timin (U) uridin deoxitimidin UMP, UDP, UTP

dAMP dADP dATP acid adenilic acid deoxiadenilic

dGMP dGDP dGTP acid guanosilic acid deoxiguanosilic

dCMP dCDP dCTP acid citidilic acid deoxicitidilic

dTMP dTDP dTTP acid uridilic acid deoxitimidilic

Figura 2.2 Toate nucleotidele au acelai plan general de structur. (a) Structura chimic a riboadenozin 5-monofosfatului (AMP), nucleotid prezent n moleculele ARN. (b) Structura chimic a celor 2 zaharuri prezente n moleculele de acizi nucleici: riboza n ARN i 2deoxiriboza n ADN.

22

Proiectul pentru nvmntul Rural

Structura acizilor nucleici

Figura 2.3 Structura chimic a principalelor baze azotate din acizii nucleici. Azotul din poziia 9 (N9) al purinelor i azotul 1 (N1) al pirimidinelor se leag la carbonul din poziia 1 (C1) al unei molecule de riboz sau deoxiriboz.

Teste de autoevaluare ncercuii litera corespunztoare variantei corecte de rspuns TA2.2 Care sunt principalele tipuri de acizi nucleici ? a) ADN; b) ADN i ARN; c) ARN TA2.3 Care sunt componentele chimice ale unei nucleotide ? a) baze azotate; b) acizi nucleici; c) pentoze; d) baze azotate, pentoze i radicali fosforici

2.3 Structura secundar a acizilor nucleici

Capitolul prezint noiunile eseniale privind structurile secundare ale acizilor nucleici.

Nucleotidele se leag ntre ele prin legturi fosfodiesterice ce se formeaz ntre o pentoz a unui nucleotid i radicalul fosforic al nucleotidului urmtor. Asemenea lanuri de nucleotide poart numele de catene polinucleotidice i reprezint structura primar a unui acid nucleic. Astfel de molecule sunt, deci, monocatenare (prescurtat m.c.) Mai toate tipurile de acizi ribonucleici (ARN) sunt formate dintr-o singur caten polinucleotidic, n timp ce majoritatea moleculelor de ADN sunt alctuite din dou catene polinucleotidice, avnd astfel i o structur secundar. Asemenea molecule sunt dublucatenare (prescurtat d.c.).
Proiectul pentru nvmntul Rural

23

Structura acizilor nucleici

Formarea unor molecule de acizi nucleici dublucatenare respect o serie de legi chimice, ce poart numele cercettorului care le-a descris prima oar Chargaff (vezi caseta cu Legile lui Chargaff). Legile lui Chargaff 1. cele 2 catene polinucleotidice sunt complementare una fa de cealalt
Aceasta nseamn c unei adenine de pe una din catene i corespunde o timin pe cealalt caten, de care se leag prin 2 legturi de hidrogen (A = T); se spune, deci, c adenina este complementar cu timina. n mod similar, guanina este complementar cu citozina, de care se leag prin 3 legturi de hidrogen (G C). Se deduce c legturile de hidrogen permise sunt: A = T i G C n moleculele de acizi nucleici dublucatenare dar formate dintr-o caten ADN i o caten ARN (asemenea molecule hibrid se formeaz de obicei n procesul de transcriere genetic), adeninelor din catena ADN le corespund n catena ARN molecule de uracil. i n acest caz se fromeaz tot 2 legturi de hidrogen: A = U.

2. ntr-o molecul de acid nucleic d.c. purinele sunt n raport echimolar cu pirimidinele
Aceast regul este, de fapt, o consecin a primei legi. Astfel, dac oricrei A de pe una din catene i corespunde o T pe cealalt caten i oricrei G i corespunde o C, atunci numrul moleculelor de adenin este egal cu numrul celor de timin, adic A = T i, respectiv, G = C De aici, prin adunarea celor dou ecuaii, se deduce: A + G = T + C Deci, numrul purinelor dintr-o molecul de acid nucleic d.c. este egal cu numrul pirimidinelor. Altfel spus, cele dou tipuri de molecule se afl n raport echimolar.

3. cele dou catene polinucleotidice dintr-o molecul de acid nucleic d.c. sunt antiparalele
O caten polinucleotidic are dou capete: la un capt se afl carbonul din poziia 5 (C5) al unei pentoze, iar la cellalt capt se afl carbonul din poziia 3 (C3) al unei alte pentoze. n interiorul unei celule o asemenea caten polinucleotidic este sintetizat chiar n aceast direcie: 5 3. Cele 2 catene polinucleotidice ale unei molecule d.c. sunt n orientri inverse una fa de cealalt: capul 5 al fiecreia corespunde cu capul 3 al celeilalte. Cele 2 catene sunt antiparalele.

Figura 2.4 Reprezentare schematic a unei poriuni dintr-o molecul de ADN

24

Proiectul pentru nvmntul Rural

Structura acizilor nucleici

Figura 2.5 Dou reprezentri ale dublului helix ADN. (a) Dublu-helix ADN de form B. Scheletul glucido-fosforic (n gri i marcat cu linii roii) se afl la exteriorul helixului. Bazele azotate se afl la interior. Sunt marcate curbura major i cea minor a helixului. (b) Structura schematizat a unui ADN dublu-helix. Cele dou schelete glucido-fosforice (n verde nchis i deschis) sunt n orientare invers: 5 3, fa de 3 - 5. Bazele azotate de pe cele dou catene sunt prezentate n albastru i rou.

2.4 ADN - elicea vieii

Capitolul prezint detaliile de structur secundar i teriar a acizilor nucleici.

Datorit formei spaiale a nucleotidelor cele 2 catene polinucleotidice dintr-o molecul d.c. se dispun spaial una fa de cealalt ntr-o form de elice (dublu helix), nvrtindu-se una n jurul celeilalte i amndou n jurul unui ax central. Aceast dispunere formeaz structura teriar a unei molecule de acid nucleic d.c. n arhitectura unei asemenea molecule, la exterior se gsesc cele 2 schelete glucido-fosforice ale catenelor, iar spre interior sunt bazele azotate. Perioada modern a biologiei moleculare a nceput n 1953, cnd James Watson, Francis Crick i Maurice Wilkins au propus modelul de structur dublu-helical a ADN. Toate cercetrile ulterioare au demonstrat corectitudinea acestui model (Figurile 2.4 i 2.5). Un dublu-helix de acid nucleic prezint o serie de parametri fizici, denumii parametri helicali (vezi caseta cu parametri helicali).

Proiectul pentru nvmntul Rural

25

Structura acizilor nucleici

Parametri helicali n = numrul de nucleotide per tur de spir (de elice) h = distana dintre perechile de nucleotide adiacente P = pasul elicei i este distana traversat de-a lungul axei helixului de un tur complet de spir (adic de o rotaie de 360o). P poate fi exprimat n raport cu numrul de nucleotide dintr-un tur (n) i cu distana dintre 2 nucleotide n procesul de rotaie (h) t = unghiul de rsucire sau de rotaie a perechile de baze azotate; acestea nu sunt perfect perpendiculare pe axa helixului (sau, altfel spus, dou perechi de baze adiacente nu sunt coplanare), ci sunt nclinate cu un unghi de rsucire t care, de obicei, este 34,6o. Aceste este de fapt cauza pentru care cele dou catene se rsucesc una n jurul celeilalte, formnd o structur de dublu-helix. Valorile acestor parametri pot varia ntre anumite limite i determin mai multe forme topologice ale moleculei de ADN d.c. Forma B reprezint conformaia cel mai des ntlnit n celule. Are un diametru de aproximativ 20 Angstrom (), iar distanele dintre perechile de baze este de aproximativ 3,4 . n aceast conformaie exist o medie de 10,4 baze azotate per tur de spir, iar unghiul de rotaie dintre 2 baze adiacente este de +34,6. Forma A se ntlnete n celule n regiunile dublucatenare ale moleculelor de ARN i n dublu-helixurile hibride ADN ARN ce se formeaz n procesele de transcriere genetic. Are un diametru de aproximativ 23 , 11 baze per tur de spir i un unghi de +34,7. Forma Z este mai subire (un diametru de 18 ), 12 baze per tur i un unghi de -30 ntre ele. Datorit acestui lucru, formele A i B sunt denumite de dreapta, iar forma Z este de stnga.

Figura 2.6 Reprezentarea schematic a celor 2 forme principale de ADN d.c.

Figura 2.7 Denaturarea i renaturarea moleculelor de ADN dublu-catenare.

26

Proiectul pentru nvmntul Rural

Structura acizilor nucleici

Figura 2.8 Variaia absorbanei n denaturarea termic a ADN. (a) Denaturarea (topirea) moleculelor de ADN d.c. poate fi monitorizat prin variaia absorbanei n lumin ultraviolet 260 nm: pe msur ce ADN denatureaz, absorbana crete pn aproape de dublu. Temperatura la care jumtate din molecule sunt denaturate poart numele de temperatur de topire (Tm). (b) Valoarea Tm depinde de coninutul n guanin i citozin a moleculelor de ADN d.c.: cu ct procentul molar de guanin citozin (%molGC) este mai mare, cu att este mai mare i valoarea Tm.

Teste de autoevaluare ncercuii litera corespunztoare variantei corecte de rspuns TA2.4 Care este direcia de sintez a unei catene de acid nucleic ? a) 3 5; b) 5 3; c) 3 3; d) 5 5 TA2.5 Ce se ntmpl cu o molecul de ADN d.c. dac este nclzit la 100oC? ..................................................................................................... ..................................................................................................... TA2.6 Listai legile lui Chargaff : ..................................................................................................... ..................................................................................................... ..................................................................................................... ..................................................................................................... .....................................................................................................

Moleculele de ADN d.c. pot fi lineare sau circulare (Figurile 2.9 i 2.10). Astfel, cromozomii la organismele eucariote, dar i o serie de plasmide, sunt alctuite din molecule de ADN d.c. linear. Cromozomul bacterian, precum i o serie de plasmide bacteriene, sunt alctuite din molecule de ADN d.c. circular.
Proiectul pentru nvmntul Rural

27

Structura acizilor nucleici

Figura 2.9 Molecul de ADN d.c. linear.

Figura 2.10 Molecul de ADN d.c. circular.

2.5 Suprarsucirea moleculelor de ADN

Sunt prezentate modelele de suprarsucire a acizilor nucleici.

Moleculele de ADN se gsesc n celule ntr-o stare de suprarsucire. Astfel, prin convenie internaional, se numesc suprarsuciri negative cele ce sunt n direcie invers fa de orientarea bazelor din B-ADN. Cu alte cuvinte, o molecul ADN ce prezint suprarsuciri negative, are un grad mai mare de relaxare. Suprarsucirile n aceeai direcie cu cele naturale dintr-o molecul B-ADN se numesc suprarsuciri pozitive i produc o nfurare mai mare a moleculei de ADN. Este important de reinut faptul c gradul de rsucire a moleculelor de ADN influeneaz esenial o serie de procese celulare: - n comparaie cu cromozomii eucariotelor, cromozomul bacterian este mult mai mic; cu toate acestea, aceast molecul de ADN ce reprezint cromozomul bacterian nu ar ncpea n celula bacterian dac nu ar fi suprarsucit i mpachetat - diverse procese, ca replicare, transcriere, recombinare precum i repararea moleculelor de ADN, presupun dersucirea local a moleculelor de ADN

2.6 Acizii ribonucleici

Capitolul prezint principale privind acizilor ribonucleici.

noiuni structura

Pe de o parte, acizii ribonucleici reprezint materialul genetic al anumitor tipuri de virusuri (numite virusuri ARN). Pe de alt parte, n celule, moleculele de ARN ndeplinesc diverse funcii metabolice, dintre care cele mai importante sunt legate de traducerea informaiei genetice din secven de nucleotide n secven de aminoacizi, adic n sinteza de proteine. 28

Proiectul pentru nvmntul Rural

Structura acizilor nucleici

Din punct de vedere chimic, exist trei diferene majore ntre acizii ribonucleici i ADN: - zaharul din ARN (riboza) conine o grupare hidroxil n plus fa de deoxiriboz (prezent n ADN); - n majoritatea moleculelor de ARN timina din ADN este nlocuit cu uracil; - n cele mai multe cazuri, moleculele de ARN sunt formate dintr-o singur caten polinucleotidic, spre deosebire de majoritatea moleculelor de ADN, care sunt dublu-catenare; chiar i moleculele de ARN monocatenare pot forma structuri secundare i teriare (Figura 2.11); - unele molecule de ARN (n mod special, ARNt) mai conin i o serie de baze azotate modificate, de exemplu pseudouridina, dihidrouridina, riboziltimina, inozina. Cele mai importante tipuri de acizi ribonucleici dintr-o celul sunt ARN mesager, ARN de transfer i ARN ribozomal.

ARN mesager (ARNm)

este o molecul intermediar ce reprezint o copie a uneia din cele 2 catene ale unei gene ce codific pentru o protein

ARN de transfer (ARNt)

este un intermediar n sinteza proteic; fiecare molecul de ARNt are o zon de 3 nucleotide numit anticodon, iar pe de alt parte, la unul din capete se leag de un anumit aminoacid

ARN ribozomal (ARNr)

este un component major al ribozomilor, intervenind tot n sinteza de proteine

Moleculele de ARN au un rol central n exprimarea genelor. Iniial, aceste molecule au fost descrise ca intermediar n sinteza proteic; ulterior ns, s-a constatat c exist multe clase de ARN ce ndeplinesc roluri complexe n diverse etape ale exprimrii genelor. Implicarea moleculelor de ARN n foarte multe funcii celulare i, n mod special n expresia genic, reprezint unul din argumentele majore n sprijinul teoriei conform creia, n fazele iniiale ale apariiei i evoluiei sistemelor biologice, ARN ar fi reprezentat componenta activ n meninerea i expresia informaiei genetice, i nu moleculele de ADN, care probabil au aprut mult mai trziu; se vorbete deci, de o aa-zis lume ARN.

Proiectul pentru nvmntul Rural

29

Structura acizilor nucleici

Figura 2.11 Structuri secundare (a) i teriare (b) n moleculele de ARN; aceste structuri se formeaz pe baza existenei unor zone cu complementaritate intracatenar. (dup Lodish,2000)

Reine ! Toate moleculele de ARN dintr-o celul iau natere printrun proces numit transcriere genetic. Molecula rezultat poart numele de transcript primar i este ulterior procesat, n funcie de gena care a fost transcris, pentru a deveni ARNm, ARNt sau ARNr.

Teste de autoevaluare ncercuii litera corespunztoare variantei corecte rspuns TA2.7 Moleculele de ADN d.c. pot fi : a) lineare; b) circulare; c) sferice; d) lineare sau circulare TA2.8 Moleculele de ARN conin: a) A+T+U+G; b) A+U+G+T; c) A+U+C+G

de

TA2.9 Listai cele mai importante tipuri de ARN celular : ..................................................................................................... ..................................................................................................... .....................................................................................................

30

Proiectul pentru nvmntul Rural

Structura acizilor nucleici

2.7 LUCRARE DE VERIFICARE 2 I. ncercuii litera corespunztoare variantei corecte de rspuns: 1. Genotipul este : a) ansamblu de tipuri; b) ansamblu de genuri c) ansamblu de gene 2. Fenotipul este : a) totalitatea caracterelor unui organism b) totalitatea genelor unui organism c) totalitatea fenotipurilor unui organism 3. Zaharul din structura ADN este : a) riboza b) maltoza c) deoxiriboza 4. Zaharul din structura ARN este : a) riboza b) arabinoza c) fructoza 5. Bazele azotate din structura ADN sunt : a) adenin + adenozin + guanidintrifosfat + citidin b) adenin + citidin + timidintrifosfat + uracil c) adenin + timin + guanin + citozin 6. Bazele azotate din structura ARN sunt : a) adenin + citidin + uridiltrifosfat b) adenin + guanina + uracil + citozin c) adenin + uracil + guanidintrifosfat 7. Nucleotidele sunt formate din : a) baz azotat + pentoz + radical fosforic b) nucleosid + pentoz + radical fosforic c) nucleosidtrifosfat + pentoz + radical fosforic 8. Legturile de hidrogen dintr-o molecul de ADN d.c. sunt : a) A = G i T C b) G = C i A U c) A =T i G C 9. Care este cea mai ntlnit conformaie e ADN d.c. n celule ? a) forma A b) forma B c) forma Z

Proiectul pentru nvmntul Rural

31

Structura acizilor nucleici

10. Cele mai importante tipuri de ARN celular sunt : a) ARN mesager + ARN viral b) ARN de transfer + ARN mesager c) ARN de transfer + ARN mesager + ARN ribozomal Total: 20 puncte (cte 2 puncte pentru fiecare item) II. Completai spaiile goale cu noiunile corespunztoare: ntr-o molecul de ADN d.c. numrul de adenine este egal cu cel de ..........................., iar numrul de guanine este egal cu cel de .................................... Cele dou catene .................................... dintr-o molecul de acid nucleic dublucatenar sunt

Atunci cnd este nclzit la peste 95oC, o molecul de ADN dublucatenar devine ...................................... prin ruperea legturilor ............................. Total: 10 puncte (cte 2 puncte pentru fiecare noiune) III. Rspundei pe scurt (1-2 fraze) la urmtoarele ntrebri: 1) Ce este structura primar i, respectiv, structura secundar, a ADN ? 2) Cte tipuri de legturi exist ntre nucleotidele dintr-o molecul de ADN d.c. ? 3) Listai legile lui Chargaff privind structura ADN. 4) Completai catena complementar lips a unei molecule de ADN d.c.: ATTGCAACGG .................................. 5) Completai catena ARN sintetizat prin citirea urmtoarei catene ADN : TGGCATAACTT ..................................... 6) Care sunt principalii parametri helicali ai unei molecule ADN ? 7) Care sunt diferenele ntre forma A i forma B ale unei molecule ADN ? 8) Care sunt diferenele structurale ntre ADN i ARN ? Total: 40 puncte (cte 5 puncte pentru fiecare noiune) IV. Realizai pe maximum 2 pagini un eseu cu tema: ADN este elicea vieii. Se puncteaz structurarea eseului, claritatea argumentelor, folosirea limbajului adecvat. Total: 30 puncte (cte 10 puncte pentru fiecare cerin) Total general: 90 puncte + 10 puncte din oficiu= 100 puncte

32

Proiectul pentru nvmntul Rural

Structura acizilor nucleici

2.8 RSPUNSURI LA TESTELE DE AUTOEVALUARE Unitatea de nvare 2


TA2.1 c TA2.2 b TA2.3 d TA2.4 b TA2.5 legturile de hidrogen dintre cele 2 catene se desfac, formndu-se 2 molecule ADN m.c. TA2.6 vezi caseta cu Legile lui Chargaff TA2.7 d TA2.8 c TA2.9 ARNm, ARNt, ARNr

2.9 BIBLIOGRAFIE RECOMANDAT


1. Cornea C.P., 1998, Elemente de Inginerie Genetic, Editura ALL, Bucureti. 2. Raicu P., Stoian V., 1991, Genetica dezvoltrii la eucariote, Editura Academiei Romne.

Proiectul pentru nvmntul Rural

33

Cromozomul la organisme pro- i eucariote

Unitatea de nvare 3

CROMOZOMUL LA ORGANISME PRO- I EUCARIOTE

Cuprins:
Cuprins Obiectivele Unitii de nvare 3 3.1 Cromozomul bacterian 3.1.1 Dimensiune 3.1.2 Modelul Pettijohn 3.1.3 Configuraii ADN n cromozomul bacterian 3.1.4 Compoziia n nucleotide 3.1.5 Proteine asociate cu cromozomul bacterian 3.1.6 Secvene ADN repetate 3.1.6.1 Secvene repetate necodificatoare 3.1.6.2. Secvene repetate codificatoare 3.1.7 Numrul de copii genice 3.1.8 Densitatea informaiei n cromozomul bacterian 3.1.9 Redundana genelor i a produselor genetice 3.1.10 Situsuri de inserie fagic n cromozomul bacterian 3.1.11 Localizarea genelor nrudite fiziologic 3.2 Plasmide bacteriene 3.2.1 Principalele categorii de gene 3.2.2 Clasificarea plasmidelor 3.3 Structura cromzomului la eucariote 3.3.1 Clase de secvene ADN la eucariote 3.3.2 Proteine cromozomale 3.3.3 Nivelele de organizare ale cromatinei 3.4 Lucrare de verificare 3 3.5 Rspunsuri la testele de autoevaluare - Unitatea de nvare 3 3.6 Bibliografie recomandat 34 34 35 35 35 36 36 38 39 39 40 41 42 43 43 44 45 45 47 49 50 50 51 53 54 54

Obiectivele Unitii de nvare 3 s nelegei structura cromozomului bacterian; s nelegei rolul proteinelor asociate cu ADN n structura cromozomilor la pro- i eucariote; s nelegei tipurile i rolul secvenelor de ADN repetate; s nelegei noiunile eseniale legate de plasmidele bacteriene s nelegei sistemul de organizare a materialului genetic n cadrul cromozomilor la eucariote.

34

Proiectul pentru nvmntul Rural

Cromozomul la organisme pro- i eucariote

3.1 Cromozomul bacterian


3.1.1 Dimensiune

Capitolul prezint principalele noiuni legate de structura i organizarea cromozomului bacterian.

Imensa majoritate a bacteriilor dein ca material genetic esenial o molecul ADN dublu catenar circular covalent nchis, suprarsucit negativ i mpachetat. Dei complexarea cu proteine i mpachetarea nu este identic cu cea din cromozomii de tip eucariot, totui aceast molecul este denumit tot cromozom sau nucleoid. Cromozomul bacterian este ataat la membrana plasmatic a celulei bacteriene n aproximativ 20 de puncte, dar o funcie deosebit o are punctul de ataare de lng regiunea de origine a replicrii acestei molecule de ADN (ori C). Cei mai mici cromozomi de tip procariot msoar mai puin de 1 Mpb i se ntlnesc mai ales la bacteriile fr perete celular (bacteriile din genurile Mycoplasma, Ureaplasma au cromozomi cu dimensiuni cuprinse ntre 600 i 800 kpb). La cealalt extrem se afl bacteriile din genurile Myxococcus i Calothrix, care au cromozomi foarte mari (aproximativ 12-13000 kpb). Escherichia coli are un cromozom de dimensiune intermediar: 4700 kpb.

Figura 3.1 Modelul Pettijohn de structur a nucleoidului din bacteria Escherichia coli. ntre 40 i 50 de bucle suprarsucite radiaz dintr-un miez proteic (dup Brown, 2002).

3.1.2 Modelul Pettijohn n general, molecula ADN ce formeaz cromozomul bacterian este de aproximativ 1000 de ori mai lung dect celula bacterian. Aceast molecul este complexat cu proteine, suprarsucit i mpachetat formnd o structur conform cu modelul elaborat de Pettijohn n 1974 (Figura 3.1). Conform acestui model, prin asocierea ADN cu proteine i cu ARN (de regul, ARN nascent) se formeaz aproximativ 50 de domenii topologice, semi-independente (denumite i bucle), per genom de E.coli. Fiecare domeniu (bucl) este suprarsucit separat de celelalte domenii i poate fi relaxat Proiectul pentru nvmntul Rural 35

Cromozomul la organisme pro- i eucariote

independent de celelalte prin introducerea unei rupturi monocatenare. Gradul de suprarsucire negativ este dat de balana dintre activitatea a doua enzime - ADN giraza i ADN topoizomeraza I amndou reglnd densitatea helical a moleculelor de ADN. ADN giraza crete numrul de spire per kilopereche de baze azotate (suprarsucete molecula de ADN), iar ADN topoizomeraza I scade numrul de spire. 3.1.3 Configuraii ADN n cromozomul bacterian Principalul tip de structur secundar a ADN ce formeaz cromozomul bacterian este forma B de dreapta, dar aceast configuraie nu se gsete uniform de-a lungul ntregului cromozom bacterian. Alte configuraii, prezente pe distane scurte, sunt ADN-Z (n dublu helix de stnga), structuri cruciforme (n regiunile cu secvene invers repetate) i regiuni triplu-catenare (n zone extrem de bogate n purine sau pirimidine). Este de reamintit faptul c, n general, expresia genic este afectat nu numai de secvena primar a ADN (succesiunea de nucleotide), ci i de structura secundar i teriar a acestuia. 3.1.4 Compoziia n nucleotide n majoritatea cazurilor, compoziia global n nucleotide a unei molecule de ADN se exprim prin procentul molar de guanin + citozin (%mol GC), restul pn la 100% fiind, evident, reprezentat de adenin + timin (datorit criteriului de complementaritate ntre cele dou catene ADN, respectiv ntre bazele purinice i cele pirimidinice). Compoziia n nucleotide a cromozomului bacterian variaz n limite foarte largi: 25 %mol GC la Mycoplasma capricolum i 75 %mol GC la Micrococcus luteus.

CASETA 3.1 Procentul molar de guanin citozin n cromozomul bacterian


Procentul molar de guanin + citozin este corelat i cu compoziia n codoni a genomului. Aceasta variaz n sensul preferinei pentru 1-2 codoni dintr-un grup de codoni sinonimi. Se constat astfel c la Mycoplasma capricolum este favorizat prezenta A/T n poziia 3-a a codonilor sinonimi. S-a mai constatat c n cromozomul bacterian exist i o serie de gene a cror activitate poate afecta compoziia total n nucleotide a unei molecule de ADN. Astfel, la E.coli au fost descrise dou gene (mut T i mut Y) care afecteaz frecvena transversiilor A-T / C-G i, respectiv, C-G / A-T. Echilibrul ntre exprimarea acestor dou gene afecteaz compoziia global n nucleotide a moleculei de ADN ce reprezint cromozomul de E.coli. O alt problem o reprezint contextul de citire a unui anumit codon, n spe, configuraia codonilor adiaceni. Numrul teoretic posibil de codoni (sens) adiaceni este foarte mare (612 = 3721), dar, examinnd 237 de gene de la E.coli s-a constatat c perechile de codoni adiaceni nu sunt distribuite randomizat, ci anumite perechi de codoni sunt mai abundente dect altele. S-a dedus astfel c, compoziia n nucleotide a unui codon este corelat i cu compoziia codonilor adiaceni, corelat probabil cu procesele de ataare la situsurile A (Aminoacil) i P (Peptidil) ale ribozomilor. Se pare deci, c aparatul de traducere a informaiei genetice ar fi putut s determine evoluia unor anumite trsturi ale matriei genetice.

36

Proiectul pentru nvmntul Rural

Cromozomul la organisme pro- i eucariote

Figura 3.2 Organizarea genomului la cteva specii de procariote. Denumirea speciei Escherichia coli K-12 Vibrio cholerae El Molecule ADN 1 molecul circular 2 molecule circulare 1 cromozom 1 megaplasmid Deinococcus radiodurans R1 4 molecule circulare Cromozom 1 Cromozom 2 Megaplasmid Plasmid Borrelia burgdorferi B31 7 8 molecule circulare 11 molecule lineare Cromozom linear Plasmid circular cp9 Plasmid circular cp26 Plasmid circular cp32 Plasmid linear lp17 Plasmid linear lp25 Plasmid linear lp28-1 Plasmid linear lp28-2 Plasmid linear lp28-3 Plasmid linear lp28-4 Plasmid linear lp36 Plasmid linear lp38 Plasmid linear lp54 Plasmid linear lp56 0.911 0.009 0.026 0.032 0.017 0.024 0.027 0.030 0.029 0.027 0.037 0.039 0.054 0.056 853 12 29 necunoscut 25 32 32 34 41 43 54 52 76 necunoscut 2.649 0.412 0.177 0.046 2633 369 145 40 2.961 1.073 2770 1115 Dimensiune (Mb) 4.639 Numrul de gene 4397

Teste de autoevaluare ncercuii litera corespunztoare variantei corecte TA3.1 Conform modelului Pettijohn, cromozomul bacterian este alctuit din : a ADN polimeraz i 5 bucle ADN; b) ARN polimeraz i 10 bucle ADN; c) miez proteic i 50 bucle ADN TA3.2 Compoziia n nucleotide a cromozomului bacterian, exprimat prin procentul molar de guanin + citozin, este cuprins ntre : a)25% i 75%; b) 15% i 85%; c) 10% i 90%
Proiectul pentru nvmntul Rural

37

Cromozomul la organisme pro- i eucariote

3.1.5 Proteine asociate cu cromozomul bacterian n afar de ARN polimeraza, care datorit ratei nalte de transcriere la procariote, rmne asociat cvasi-permanent cu moleculele de ADN, cromozomul bacterian este asociat cu o serie de proteine bazice, similare cu histonele de la organismele eucariote, denumite proteine histone-like. La E.coli au fost descrise 9 specii moleculare de proteine bazice, cu greutate moleculare ntre 9 i 28 kd, care se ataeaz la ADN ntr-o manier situs-nespecific i care au funcii similare cu histonele de la organismele eucariote. Dintre cele 9 specii moleculare proteice, cea mai important este o protein denumit HU (HelixUnwinding= desfacerea dubului helix). Din complexarea moleculelor HU cu ADN cromozomal bacterian se formeaz structuri similare cu nucleozomii de la eucariote, denumite structuri nucleosom-like (chiar i n condiii n vitro), n care sunt cuprinse circa 200 pb/ nucleozom. Structurile nucleosom-like nu sunt statice, ci se afl ntr-un echilibru dinamic. Studii mai ample au demonstrat faptul c proteina HU nu este o simpl protein structural a arhitecturii cromozomului bacterian, ci are rol foarte important n diverse procese din celula bacterian n mod special n procese ce implic interaciuni ADN-proteine, situaie n care moleculele HU favorizeaz ataarea altor proteine la ADN. Dei proteinele histone-like au fost studiate extensiv la E.coli, totui au fost identificate proteine cu funcii omoloage i la alte genuri i specii bacteriene. Pe de alt parte, s-a constatat c o serie de microorganisme din grupul Archaea prezint proteine histone-like cu structur intermediar ntre cele de la Bacteria i histonele de la Eukarya.

CASETA 3.2 Proteina HU este cea mai important protein histone-like de la E.coli
au fost descrise proteine tip HU la toate bacteriile studiate ca i histonele de la organismele eucariote, proteina HU se ataeaz la molecule de ADN d.c. indiferent de secvena de nucleotide, deci situs - nespecific are un caracter bazic i o greutate molecular de 9,7 kd funcioneaz ca dimer un monomer este format din 2 polipeptide, denumite HU- i HU- i codificate de gene diferite: hup A i, respectiv, hup B. are proprieti fizice i compoziie total n aminoacizi similar cu histonele de la eucariote, dar secvena de aminoacizi este diferit de acestea. ca i histonele de la eucariote, proteina HU are un grad nalt de conservare n lumea bacterian exist aproximativ 25000 de molecule HU per genom de E.coli, dar aceste molecule nu sunt dispuse uniform de-a lungul cromozomului bacterian, ci sunt mai dense la periferia nucleoidului (n zonele extrem de active transcripional)

38

Proiectul pentru nvmntul Rural

Cromozomul la organisme pro- i eucariote

Caseta 3.3 Proteina IHF


Alte proteine histone-like de la E.coli sunt proteina H (similar cu histona H2A de la eucariote), proteina H1, proteina H-NS, proteina IHF. Proteina IHF (Integration Host Factor, g.m.=20 kd) 9 a fost descoperit n studiile privind integrarea genomului fagului n cromozomul de E. coli ; ulterior, s-a constatat c aceast protein intervine i ntr-o serie de alte procese din celula bacterian 9 este format din 2 subuniti codificate de genele him A i him B. 9 spre deosebire de alte proteine histone-like, moleculele de IHF se ataeaz la ADN ntr-o manier situs-specific (adic doar la anumite secvene de nucleotide) 9 moleculele de IHF nu sunt necesare pentru recombinarea bacterian omoloag, dar par s intervin n fenomene de recombinare neomoloag, specializat, cum sunt de altfel, procesele de transpoziie i de conjugare bacterian

Teste de autoevaluare ncercuii litera corespunztoare variantei corecte TA3.3 Proteinele histone-like de la bacterii : a) au caracter acid; b) au caracter acid i se ataeaz la ADN situs-specific; c) au caracter bazic i se ataeaz la ADN situs-nespecific 3.1.6 Secvene ADN repetate n cromozomul bacterian au fost identificate secvene ADN repetate, dintre care unele nu codific proteine/ ARN (secvene repetate necodificatoare), iar altele codific o serie de proteine sau specii moleculare de ARN (ARNr, ARNt) secvene repetate codificatoare. 3.1.6.1 Secvene repetate necodificatoare = ADN repetitiv Acestea sunt reprezentate de secvene scurte ce apar de regul n afara ORF-urilor (Open Reading Frames). Marea majoritate a acestor secvene servesc ca situsuri de interaciune ADN-proteine (inclusiv n procese de recombinare, inversie, excizie, transpoziie) i ca situsuri modificate ce identific catena matri n timpul replicrii semiconservative a cromozomului bacterian. Dintre cele mai cunoscute asemenea secvene sunt secvenele REP, Chi, Dam. Secvene REP (Repeated Extragenic Palindromes) Sunt formate din palindroame repetate, majoritatea aflate n regiuni extragenice. O secven REP conine o secven consensus de 38 bp. Grupuri (denumite clusteri) de 2-4 secvene REP separate ntre ele prin 20 pb formeaz un element REP (REPE = REP Element). La E.coli i Salmonella typhimurium exist 100-200 structuri REPE (reprezentnd deci, aproximativ 0.5% din cromozomul bacterian), localizate nsa diferit. La secvenele REP se leag molecule de protein HU i de ADN giraz, aceste secvene avnd deci rol n mpachetarea nucleoidului. Tot la aceste secvene se leag i ADN polimeraza intervenind n procese de replicare i reparare ADN.
Proiectul pentru nvmntul Rural

39

Cromozomul la organisme pro- i eucariote

Situsuri Chi Un situs Chi are o lungime de 8 pb: 5 GCTGGTGG 3 Datorit faptului c reprezint situsul de recunoatere i tiere a moleculelor ADN de ctre endonucleaza RecBCD, secvenele Chi stimuleaz recombinarea omoloag mediat de RecA i RecBCD. S-a mai constatat c efectul recombinativ al situsului Chi este polar: stimuleaz recombinarea la captul 5 al lui Chi, i nu la 3. Situsuri Chi au fost identificate att pe cromozom, ct i pe unele plasmide de la E.coli. Mai mult chiar, s-a constatat c secvenele Chi reprezint situsuri de stimulare a recombinrii genetice la toi membrii familiei Enterobacteriaceae. n contrast, la Pseudomonadaceae, complexul enzimatic RecBCD nu acioneaz la situsuri Chi. In cromozomul de E.coli au fost identificate aproximativ 950 de situsuri Chi, ce par s fie distribuite relativ uniform (1 situs Chi la 5 kbp), cu excepia zonei adiacente regiunii oriC, unde exist un cluster de 22 de situsuri Chi. Situsuri Dam sunt formate din 4 bp (5 GATC 3) i reprezint situsurile de metilare a adeninei (adenina este metilat la poziia N6). Cromozomul de E.coli conine foarte multe situsuri Dam (peste 18.000) care, dac ar fi dispuse randomizat ar exist 1 situs Dam/250 bp. i n acest caz s- a constatat un numr foarte mare de situsuri Dam n, i n jurul, regiunii oriC: n cele 245 bp ce definesc oriC la E.coli exist 8 situsuri Dam, iar n cele 350 bp ce flancheaz oriC exist nc 12 situsuri Dam. 3.1.6.2 Secvene repetate codificatoare Asemenea secvene au dimensiuni mult mai mari dect cele necodificatoare. operoni rrn exist la toate bacteriile i cuprind secvene ce codific pentru molecule de ARN ribozomal (ARNr). La cele mai multe dintre speciile bacteriene, linkage-ul (ordinea) n cadrul unui operon rrn este 16S 23S 5S. E.coli i S.typhimurium au cte 7 loci (operoni) rrn, localizai n poziii echivalente. Cei 7 operoni sunt notai rrnA.rrnG, fiecare cuprinznd secvene 16S-23S-5S cotranscrise ntr-o molecul ARN de 30S. Numrul operonilor rrn variaz de la un gen/ specie bacterian la alta: Bacillus subtilis are 10 operoni rrn, Mycobacterium sp. are 1-2 operoni rrn. Chiar n cadrul aceleiai tulpini bacteriene, locii rrn pot diferi ntre ei n ceea ce privete prezena/ absena genelor pentru ARNt n regiunile spacer dintre genele ARNr. Astfel, toi cei 7 operoni rrn de la E.coli au 1-2 gene pentru ARNt ntre secvenele pentru 16 i 23S, i 0-2 gene ARNt dup 5S. Distribuia locilor rrn pe cromozom variaz la diverse specii bacteriene: la E.coli, majoritatea locilor rrn sunt localizai n jumtatea cromozomal ce are n centru regiunea oriC; la B.subtilis, locii rrn sunt grupai ntr-o zon ce reprezint 30% din cromozom.

40

Proiectul pentru nvmntul Rural

Cromozomul la organisme pro- i eucariote

genele pentru ARNt Cromozomul de E.coli conine 41 de gene/ operoni pentru ARNt distribuii n tot cromozomul. Unii din aceti operoni codific pentru o molecul de ARNt, alii pentru mai multe molecule de ARNt, iar alii au i secvene ce codific diverse proteine. secvene rhs (rearrangement hot-spots) sunt capabile s genereze duplicaii genice prin procese de crossing-over inegal ntre secvene repetate. La E.coli K-12 au fost identificate 4 secvene rhs, notate rhs A, B, C i D. Fiecare din aceste 4 secvene au dimensiuni ntre 8 i 9 kbp i sunt compuse dintr-o regiune core (miez) (cu secven conservat de aproximativ 3700 bp) i din segmente flancatoare. Prin exprimarea regiunilor core ale secvenelor rhs A, B i C sunt sintetizate 2 proteine cu funcie deocamdat necunoscut. n contrast cu E.coli K-12, la E.coli B i E.coli C, precum i la S.typhimurium, nu au fost descrise secvene rhs. Teste de autoevaluare ncercuii litera corespunztoare variantei corecte TA3.4 Secvenele repetate necodificatoare din cromozomul bacterian sunt : a) secvene REP b) situsuri Chi c) situsuri Dam d) toate de mai sus TA3.5 Cele mai cunoscute secvene repetate codificatoare din cromozomul bacterian codific pentru : a) ADN polimeraze; b) ARN polimeraze; c) ARNr i ARNt 3.1.7 Numrul de copii genice La bacterii, n afar de genele sau operonii aflai n copii multiple, numrul de copii ale unei gene cromozomale poate varia n funcie de urmtorii factori: 1. poziia genei pe cromozom, de-a lungul unui gradient pornind de la oriC spre regiunea ter. n timpul replicrii cromozomului bacterian, n funcie de poziia lor pe cromozom, unele gene sunt deja replicate, n timp ce altele nc nu. Astfel, unele gene se gsesc ntr-un numr mai mare de copii dect altele. 2. copii ale unei gene cromozomale pot exist i pe plasmide. n aceast situaie se folosete termenul de meroploidie parial, care se refer la o ploidie parial ce afecteaz anumite gene, fr s existe multiplii de cromozomi ntregi (este cazul genelor prezente i pe cromozom i pe un plasmid). 3. ntr-o celula bacterian pot exist mai multe copii ale ntregului cromozom. La anumite specii bacteriene exist mai multe copii cromozomale n aceeai celul: Desulfovibrio vulgaris (4 copii), D.gigas (17 copii), Azotobacter chroococcum (20-25 de copii), A.vinelandii (40-80 de copii cromozomale). Este de subliniat faptul c la majoritatea speciilor bacteriene cu copii cromozomale multiple exist procese de inactivare cromozomal ce asigur funcionarea unui singur cromozom i inactivarea celorlali.
Proiectul pentru nvmntul Rural

41

Cromozomul la organisme pro- i eucariote

3.1.8 Densitatea informaiei n cromozomul bacterian Densitatea informaiei biochimice, adic numrul de reacii biochimice catalizate per kb de material genetic, este un parametru extrem de variabil n genomul bacterian, n primul rnd datorit faptului c nu ntotdeauna genele au o relaie 1-la-1 cu reaciile biochimice. n mod uzual, este valabil relaia 1 gen => 1 polipeptid => 1 reacie biochimic. Exist ns i foarte multe excepii, de exemplu: - enzime formate din mai multe lanuri polipeptidice: de exemplu, enzima succinat dehidrogenaza este format din 4 polipeptide codificate de 4 gene diferite sdh A, B, C i D. n acest caz, relaia este 4 gene =>1 reacie biochimic; - enzime polifuncionale, ce catalizeaz mai multe reacii biochimice: de exemplu, complexul enzimatic FAD ce oxideaz acizii grai este format din 2 polipeptide codificate de 2 gene diferite fadA i fadB. Acest complex enzimatic catalizeaz 5 reacii biochimice (din care 4 sunt catalizate de FadA). n acest caz, relaia este 1 gen => 4 reacii biochimice. CASETA 3.4 Gene suprapuse
n cadrul genomului bacterian variaz i densitatea de citire a informaiei genetice prin transcriere. Astfel, dei marea majoritate a genelor bacteriene sunt contigue, totui cromozomul bacterian cuprinde i gene cu diverse grade de suprapunere: - gene cu promotor plasat n regiunea terminal a genei upstream: trpA-trpB, ilvA-ilvD - gene cu promotor plasat n interiorul genei upstream: mioA-mioD - gene cu grad ridicat de suprapunere: 1. gene suprapuse total, codificate pe cele 2 catene ale ADN; de exemplu, locusul CysE (codific serin-acetil-transferaza), ce este implicat n biosinteza cisteinei, are 2 ORF (cys X i cys E) codificate pe cele 2 catene ale locusului CysE. 2. secvene codificatoare ce sunt folosite de mai multe ori, pornind transcrierea din poziii diferite; de exemplu, locusul McrB (codific proteine implicate n restricia ADN la 5metil-citozin) conine 3 ORF-uri pe aceeai caten ADN, pornind din 3 situsuri diferite de iniiere a transcrierii. Traducerea celor 3 transcripte duce la formarea a 3 proteine (de 51, 53 i, respectiv, 54 kdal) cu secven carboxi-terminal identic, dar diferit n regiunea aminoterminal. 3. gene suprapuse total, cu molecule transcript identice, dar traduse diferit prin procese de frameshift translaional: de exemplu, gena trpR care codific 2 proteine i gena dnaX, care codific 2 subuniti ale ADN polimerazei III. Asemenea gene cu grad ridicat de suprapunere sunt foarte bogate n informaie genetic (unele au chiar informaie dubl). Multe din ele (de exemplu, genele mcrB i dnaX) nu sunt tipice pentru cromozomul de E.coli, n ceea ce privete procentul molar de guanin + citozin. Astfel, gena mcrB are 48% mol GC, iar gena dnaX are 58 % mol GC, n timp ce cromozomul de E.coli are, n total, 51-51.5 % mol GC. S-a emis ipoteza c asemenea gene care prezint un procent molar de guanin + citozin extrem de diferit fa de media cromozomal, ar fi fost achiziionate de E.coli din alte genomuri, prin procese de transfer de material genetic pe orizontal (transformare, conjugare, transducie).

42

Proiectul pentru nvmntul Rural

Cromozomul la organisme pro- i eucariote

3.1.9 Redundana genelor i a produselor genetice Pentru foarte multe funcii celulare, exist cte 2 gene, ca i cum programul genetic al acestor bacterii ar avea sisteme de backup (copii de siguran). Aceast redundan ar putea fi considerat ca fiind o densitate redus a informaiei genetice. Cu toate acestea, cel puin n unele cazuri, aceast informaie este reglat diferit i folosit n scopuri metabolice diferite. n cromozomul de E.coli exist 58 de perechi (de cte 2 gene) sau clusteri (mai mult de 2 gene), ce codific 125 de produse genice. Din acestea, n 56 de perechi/ clusteri reaciile catalizate sunt identice. n cazul anumitor grupuri genice, reglajul exprimrii lor este diferit, de exemplu: - genele aroF, aroG i aroH codific, toate trei, o aceeai enzim: 3-deoxi-D-arabino-heptulosonat7 fosfat-sintetaza (DAHPaza). Enzima codificat de aroF este sensibil la concentraia de tirozin, cea codificat de aroG este sensibil la concentraia de fenil-alanin, iar cea codificat de aroH este sensibil la concentraia de triptofan; - genele glpA i glpD codific amndou glicerol-3-fosfatdehidrogenaza. Enzima codificat de glpA este sintetizat i folosit n condiii de anaerobioz, iar cea codificat de glpD n condiii de aerobioz. Unele din aceste gene pereche au secven similar una cu cealalt (i proteinele corespunztoare au secven similar n aminoacizi) i este probabil c au aprut prin procese de duplicaie genic, urmat de o oarecare divergen funcional. Altele ns, dei enzimele desfoar aceeai funcie, totui au secven diferit (att ca proteine, ct i genele corespunztoare). Este posibil ca asemenea gene s fi aprut fie prin evoluie convergent, fie prin transfer lateral de la ali repliconi bacterieni (aceast ultim situaie poate fi identificat prin determinarea procentului molar de guanin + citozin). 3.1.10 Situsuri de inserie fagic n cromozomul bacterian Muli bacteriofagi i inser genomul n cromozomul bacterian, fie prin transpoziie n poziii randomizate n cromozom (bacteriofagul Mu), fie prin recombinare situs-specific numai n anumite poziii (fagii lambdoizi ce constituie fagii nrudii cu fagul ). Situsurile cromozomale n care fagul lambda (i fagii lambdoizi) i inser genomul, sunt denumite situsuri attB (attachment on bacteria) i corespund unor situsuri attP (attachment on phage) pe genomul fagic. Fagul lambda necesit un situs attB de minimum 21 bp, din care 15 sunt identice cu 15 bp din attP (234 bp). Lambda are un situs preferat attB n cromozomul de E.coli K-12 (dar i situsuri secundare) ce e situat intergenic. Ali fagi lambdoizi (21, e14, P22) se insereaz n situsuri attB cu localizare intragenic. Pe cromozomul de E.coli K12 au fost cartate situsurile pentru 15 fagi lambdoizi i s-a constatat c ele sunt grupate ntre poziiile 6 min i 44 min. Aceast organizare a situsurilor n care se insereaz genomul fagilor lambdoizi reprezint nc un argument n favoarea ipotezei conform creia cromozomul de E.coli (i nu numai) ar avea o origine
Proiectul pentru nvmntul Rural

43

Cromozomul la organisme pro- i eucariote

himeric, unul din segmente derivnd dintr-o gazd ancestral a fagilor lambdoizi. Pe de alt parte, s-a constatat c foarte multe elemente genetice cu caracter mobil se inser n genele pentru ARNt, fapt pentru care s-a sugerat c acestea ar fi reprezentat situsurile folosite de fagii ancestrali. 3.1.11 Localizarea cromozomal a genelor nrudite fiziologic n cromozomul de E.coli, majoritatea genelor (operonilor) par s fie distribuii randomizat (indiferent de nrudirea lor fiziologic), cu excepia celor implicai n catabolismul glucozei ce par s fie dispui n 4 zone echidistante pe harta circular a cromozomului. Aceast randomizare a dispunerii operonilor a fost verificat i prin rearanjamente cromozomale induse experimental caz n care operonii au continuat s funcioneze normal. Totui, n treimea cromozomal ce are n centru regiunea ter (ca, de altfel, i n regiunea oriC), poziia operonilor pare s fie destul de fix, orice rearanjament deranjnd total funcionarea acestora. Orice aranjament nerandomizat al genelor duce la ipoteza c poziia genelor ar putea afecta funcionarea lor, deducndu-se astfel o organizare mai nalt dect operonul sau reglonul. La cele mai bine studiate specii de Pseudomonas (P.aeruginosa, P.putida) s-a constatat c genele cu funcii housekeeping (gene implicate n metabolismul central al oricrei celule, precum i n metabolismul anabolic) sunt grupate n jumtate din harta circular a cromozomului. n acelai timp, genele implicate n metabolismul catabolic par s fie dispuse randomizat n cealalt jumtate a cromozomului bacterian. Acest mod de dispunere a genelor ar putea reflecta istoria construciei cromozomului din pri separate: genele pentru metabolismul esenial ar fi existat probabil n acel genom ancestral mai mic, care a fost ulterior mrit la actuala dimensiune prin fuziune cu un alt element genetic sau prin transfer de material genetic (transformare, conjugare, transducie). n general, s-a constatat c la foarte multe bacterii clusterii genici din jurul regiunilor oriC i ter sunt foarte similari ntre taxoni bacterienei foarte ndeprtai filogenetic, fapt ce susine ipoteza c iniierea i terminarea replicrii cromozomului bacterian sunt procese extrem de vechi i sunt coordonate prin mecanisme similare la marea majoritate a bacteriilor. Teste de autoevaluare ncercuii litera corespunztoare variantei corecte TA3.6 Genele suprapuse sunt : a) gene cu mai multe nucleotide; b) gene cu mai multe ORF-uri; c) gene cu mai puine nucleotide

44

Proiectul pentru nvmntul Rural

Cromozomul la organisme pro- i eucariote

3.2 Plasmide bacteriene

Capitolul prezint noiunile eseniale legate de plasmidele bacteriene.

n prezent, plasmidele sunt definite ca fiind repliconi neeseniali, capabili s se replice fizic independent de cromozom i transmii n form extracromozomal, pe vertical (de la o generaie de indivizi la alta) sau pe orizontal (de la un individ la altul n cadrul aceleiai generaii). n general, plasmidele reprezint un fenomen al lumii procariote. Cu toate acestea, au fost descrise structuri genetice plasmidiale i la unele grupuri de eucariote inferioare (drojdii, fungi, mucegaiuri) i chiar i la eucariote superioare (plasmidele din mitocondrii i cloroplaste la unele celule vegetale). Exist cercettori care ncadreaz plasmidele n categoria organismelor acelulare. n contrast cu aceast teorie, ali cercettori consider plasmidele ca nefiind organisme, ci alturi de virusuri, transposoni i secvene de inserie, ar aparine unor specii moleculare speciale, de elemente genetice mobile (ADN accesoriu) (P. Sykora 1992).

Figura 3.3. Reprezentare schematizat a nucleoidului i a plasmidelor bacteriene.

3.2.1 Principalele categorii de gene codificate de plasmide Fiind repliconi fizic independeni, toate plasmidele poart gene implicate n propria replicare, stabilitate i partiie. n afar de acestea, majoritatea genelor codificate de plasmide confer caractere adaptative, avantajoase gazdelor bacteriene. Cele mai frecvente categorii de gene purtate de plasmide sunt : - gene de rezisten la antibiotice
Plasmidele de rezisten au fost descoperite n Japonia n anii 50 la izolate clinice de Shigella dysenteriae i s-a constatat c aceste gene nu erau plasate pe cromozomul bacterian. Au fost denumite factori R. Folosirea abuziv i/ sau incorect a antibioticelor au determinat, pe de o parte, rspndirea n populaiile de bacterii patogene a determinanilor de antibiorezisten, iar pe de alt parte, dezvoltarea unor mecanisme de antibiorezisten extrem de eficiente. n ceea ce privete originea genelor de antibiorezisten, au fost emise 2 ipoteze majore: a-genele de antibiorezisten existente n prezent n foarte multe bacterii patogene ar avea originea n gene similare prezente n bacteriile ce produc antibiotice (i care, de regul, sunt bacterii din sol); n aceast situaie se presupune c ar fi avut loc
Proiectul pentru nvmntul Rural

45

Cromozomul la organisme pro- i eucariote

evenimente de transfer de gene pe orizontal ntre bacterii din sol i bacterii patogene; b-genele de antibiorezisten ar fi evoluat din gene house-keeping (de exemplu: proteinele ce efluxeaz tetraciclina ar putea s fi evoluat din proteinele de transport al nutrienilor).

- gene de toleran la metale grele (ioni mercurici, derivai organomercurici, nichel, cobalt, plumb, cadmiu, bismut, antimoniu, zinc, argint) - gene de rezisten la ageni intercalai, radiaii UV, radiaii X, bacteriofagi, bacteriocine - gene ce codific factori de patogenitate i de virulen - gene ce codific bacteriocine - gene ce codific antibiotice - gene implicate n metabolismul opinelor (plasmidele Ti de la Agrobacterium) - gene ce codific capaciti metabolice deosebite, de exemplu folosirea unor substane xenobiotice ca surs unic de carbon i energie la specii de Pseudomonas - gene fixatoare de azot (genele nif de la Rhizobium i Bradirhizobium) - gene ce codific enzime proteolitice, amilolitice etc - gene ce codific transferul plasmidelor pe orizontal prin proces de conjugare bacterian (regiunea tra)
Caractere eseniale/neese niale

Deci, n afar de genele implicate n propria replicare, stabilitate i partiie, plasmidele mai pot purta i gene ce codific caractere unele eseniale, altele neeseniale pentru bacteria gazd. Caracterele eseniale reprezint ci metabolice centrale ale celulei bacteriene, plasmidele purttoare fiind prezente la marea majoritate a izolatelor naturale ale unor tulpini bacteriene (de exemplu, unele plasmide mari de la Agrobacterium tumefaciens, Rhizobium leguminosarum). Unele caractere neeseniale confer avantaje selective gazdelor purttoare, permind supravieuirea acestora n anumite condiii de mediu. n aceast categorie intr genele plasmidiale ce codific rezistena la antibiotice i tolerana la metale grele (asemenea gene sunt prezente la multe tulpini de bacterii patogene). n absena antibioticelor sau a metalelor grele ca factori de presiune selectiv, procesele de replicare, meninere i partiie a plasmidelor reprezint un efort metabolic suplimentar pentru celulele bacteriene. Ca urmare, n doar cteva pasaje, aceste plasmide sunt eliminate din populaia bacterian prin subreplicare. Ele se menin doar ntr-o proporie sczuta a populaiei bacteriene, fapt ce ar putea fi considerat o economie metabolic la nivelul ntregii populaii bacteriene. Exist ns i aa-numite plasmide criptice, care nu par s ofere gazdei nici un caracter avantajos. Interesant este faptul c, dei pot fi ncadrate n categoria selfish DNA (ADN egoist), totui i aceste plasmide sunt meninute ntr-o anumit proporie din populaiile bacteriene. n ansamblu, genomul bacterian se caracterizeaz printr-o intens circulaie pe orizontal a genelor, ntre diveri indivizi bacterieni (H.Tschape 1994). Aceast circulaie se desfoar prin trei procese centrale - conjugare, transformare i transducie dintre care, plasmidele sunt implicate n primele dou.

46

Proiectul pentru nvmntul Rural

Cromozomul la organisme pro- i eucariote

Acest flux continuu de gene pare s fie o caracteristic definitorie a lumii bacteriene i s fi contribuit esenial la extrema versatilitate metabolic a bacteriilor n aproape toate mediile naturale. 3.2.2 Clasificarea plasmidelor Plasmidele pot fi clasificate funcie de diverse criterii : a) criteriul autotransferabilitii. Autotransferabilitatea reprezint capacitatea unui element genetic (n spe, un plasmid) de a se autotransfera de la un individ bacterian la altul. De regul, genele implicate n autotransferabilitate sunt grupate ntr-un operon (denumit operon tra), iar elementul genetic purttor este denumit conjugon. Conform acestui criteriu exist 3 clase de plasmide : 1) plasmide conjugative sunt plasmidele care prezint ntreg operonul tra i sunt autotransferabile, putnd genera proces de conjugare bacterian; 2) plasmide non-conjugative sunt plasmidele ce nu prezint operonul tra, nu sunt autotransferabile (nu pot genera conjugare bacterian) i nici mobilizabile; 3) plasmide mobilizabile sunt plasmidele ce nu prezint operonul tra (i, ca atare, nu sunt autotransferabile), dar au gene mob care le permit mobilizarea n evenimente de conjugare iniiate de alte plasmide ce sunt conjugative. b) criteriul structurii moleculare. Marea majoritate a plasmidelor sunt formate din ADN dublu catenar. Mai mult dect att, din punct de vedere al structurii moleculare, exista dou clase de plasmide : 1) plasmide circulare. Plasmidele circulare sunt alctuite din ADN d.c. circular, iar forma in vivo pare sa fie CCC (circular covalently closed); foarte rar i temporar se ntlnete forma CO (circular open), n care una din cele dou catene nu este continu avnd o legtur fosfodieric lips. Tot in vivo se mai ntlnesc i concatemeri (oligo/ multimeri). 2) plasmide lineare. Asemenea plasmide sunt alctuite din ADN d.c. linear (L). Au fost descrise dou tipuri de plasmide lineare : 1. Plasmide lineare cu telomere hairpin (telomere n ac-de-pr). Acestea sunt ntlnite cu precdere la plasmidele lineare de la Borrelia (Figura 3.3). Spirochetele din genul Borrelia au structur genomic linear: toate speciile de Borrelia examinate au un cromozom linear de 950-1000 kb i mai multe plasmide lineare cu dimensiuni cuprinse ntre 5 i 200 kb (unele au i plasmide CCC). Toate plasmidele lineare de la Borrelia descrise pn n prezent au telomere de tip hairpin. Telomerele hairpin se caracterizeaz prin palindroame terminale bogate n A/T, la capete existnd o continuitate n legtura de tip covalent ntre cele 2 catene. Asemenea structuri (ADN d.c. L cu telomere de tip hairpin) mai exist i la ADNmt de la reprezentanii genului Pichia, la poxvirusuri i la plasmidele lineare din mitocondriile de fungi. 2. Plasmide cu telomere invertroni Asemenea telomere sunt ntlnite la plasmidele lineare de la genul Streptomyces plasmide cu dimensiune cuprins ntre 9 i 600 kbp. Ca i cele hairpin, telomerele invertroni prezint i ele palindroame terminale bogate n A/T. Diferena const ns n faptul c nu exist legtur covalent ntre capetele celor 2
Proiectul pentru nvmntul Rural

47

Cromozomul la organisme pro- i eucariote

catene, i, ca urmare, capetele 5 i 3 sunt libere. La capul 5 al fiecrei catene este ataat covalent o molecul proteic denumit proteina TP (Telomeric Protein) (Figura 3.3). Asemenea structuri ADN, cu palindroame terminale bogate n A/T i cu proteina TP ataat covalent la capul 5 au fost definite de K.Sakaguchi (1990) ca fiind elemente genetice mobile cu replicare autonom i denumite INVERTRONI, similare funcional cu transposonii. Telomerele invertroni sunt caracteristice repliconilor lineari de la eucariote, n mod special la plasmidele lineare din mitocondriile de fungi i plante i din citoplasma de fungi. a)

b)

Figura 3.4 Structura telomerelor hairpin la Borrelia (a) i invertroni la Streptomyces (b) (dup H.Hinnebusch, 1992). palindroame terminale, bogate n A-T = la capul 5 al fiecrei catene exist o protein ataat covalent

c) criteriul incompatibilitii plasmidiale De-a lungul anilor, conceptul de incompatibilitate plasmidial a ridicat foarte multe probleme. Actualmente, acest concept este definit ca fiind incapacitatea a dou sau mai multe plasmide de a se menine i propaga stabil n aceeai linie celular. Plasmidele din acelai grup de incompatibilitate ce conin origini de replicare similare (deci, au acelai replicon-type), nu sunt motenite stabil n descenden i segreg una de cealalt. Cel mai probabil acest proces se datoreaz unei competiii moleculare ntre plasmide cu acelai replicon-type pentru aceleai proteine implicate n replicarea respectivelor plasmide proteine codificate cromozomal. La Enterobacteriaceae au fost descrise peste 30 de grupuri de incompatibilitate plasmidial. Un tip de incompatibilitate s-ar baza pe competiia ntre secvenele repetate RS (la care se ataeaz proteina RepA), dintre diferite plasmide existente n celula bacterian. Bazndu-se pe tipul de replicon a fost imaginat o metod nou de identificare plasmidial folosind o colecie de sonde rep (Sykora P. 1992). Procesul de gene-flow n lumea bacterian ar putea avea un rol important n evoluia bacteriilor. Cu toate acestea, procesele de transfer de material genetic pe orizontal nu par s afecteze stabilitatea speciilor taxonomice bacteriene. Din acest punct de vedere, plasmidele se gsesc intr-o situaie total diferit: gene-flowul ntre plasmide nenrudite pare s fie att de ridicat i de rspndit, nct nu se poate alctui o identificare taxonomic a plasmidelor doar pe baza unei liste a caracterelor pe care le codific. Se pare c biologia plasmidelor nu implic mecanisme de izolare taxonomic asemntoare cu speciile de plante i animale. n contrast, n lumea plasmidelor se observ un fenomen total diferit: izolarea plasmidelor individuale sau foarte asemntoare. Acest fenomen este cunoscut ca fenomenul de incompatibilitate plasmidial. 48
Proiectul pentru nvmntul Rural

Cromozomul la organisme pro- i eucariote

Teste de autoevaluare TA3.7 Listai cel puin 5 tipuri de gene existente pe plasmide : a) ....................; b) ............................; c) ..............................; d) ....................... e) ............................ TA3.8 Plasmidele conjugative sunt : a) plasmide lineare; b) plasmidele ADN d.c.; c) plasmidele autotransferabile TA3.9 Plasmidele mobilizabile au : a) gene de rezisten; b) gene mob; c) gene tra TA3.10 Precizai principalele diferene ntre plasmidele cu telomere hairpin i cele cu telomere invertroni. .......................................................................................................... .......................................................................................................... .......................................................................................................... ..........................................................................................................

3.3 Structura eucariote

cromozomului

la

Capitolul prezint aspectele eseniale ale structurii cromozomilor de la eucariote.

Materialul genetic este reprezentat dintr-un genom nuclear i un genom extranuclear (reprezentat din genomul mitocondrial i, n cazul celulelor vegetale, i din genom cloroplastic). Genomul nuclear cuprinde un set de molecule lineare de ADN, fiecare reprezentnd un cromozom. Fr excepie, toate eucariotele au cel puin 2 cromozomi care ntotdeauna sunt lineari. Singura variaie care se nregistreaz este cea referitoare la numrul de cromozomi, care ns nu este corelat cu caracteristicile biologice sau cu poziia evolutiv a organismului respectiv. Astfel, la Saccharomyces cerevisiae (drojdia de bere - un eucariot unicelular, inferior) numrul haploid de cromozomi este 16, de 4 ori mai mare dect la musc (Musca domestica). De asemenea, numrul de cromozomi nu este corelat nici cu dimensiunea genomului; de exemplu, la salamandr genomul este de 30 ori mai mare dect la om, dar are jumtate din numrul haploid de cromozomi de la om. Cromozomii eucarioi sunt separai de citoplasm prin membrana nuclear i, ca urmare, transcrierea i traducerea sunt separate n timp i spaiu una de cealalt; n contrast, la procariote, cele dou procese se desfoar aproximativ simultan. Nucleul este format din 4 componente: nucleolem, carioplasm, cromonemata (singular, cromonema) i nucleol. Cromonemata este o substan cromatic despiralizat n interfaz i condensat n mitoz. Din aceast substan se difereniaz cromozomii. Nucleolul este o substructur nuclear cu rol n biogeneza ribozomilor. n aceast zon a nucleului are loc sinteza de ARN ribozomal prin transcrierea genelor corespunztoare.
Proiectul pentru nvmntul Rural

49

Cromozomul la organisme pro- i eucariote

La eucariote ADN este complexat cu o clas de proteine specializate, cu caracter bazic, denumite histone. Acest complex poart numele de cromatin (denumirea are la baz tinctorialitatea fa decolorani bazici). Cromatina se prezint sub 2 stri: - eucromatina cromatin decondensat n interfaz i condesat n timpul diviziunii celulare se aplic la nceputul fazei S a interfazei - heterocromatina condensat permanent i se replic la sfritul fazei S. Heterocromatina se clasific n: heterocromatin constitutiv este caracteristic zonelor centromerice i telomerice heterocromatin facultativ - este caracteristic unuia din cromozomii X la femelele de mamifer i constituie cromatina sexual; apare datorit necesitii compensaiei de doz a genelor eseniale prezente pe cromozomul X heterocromatin de citodifereniere apare prin inactivarea selectiv a unor gene n timpul proceselor de citodifereniere Eucromatina este caracteristic genelor active transcripional, n timp ce heterocromatina are rol preponderent reglator i structural. 3.3.1 Clase de secvene ADN la eucariote 1. secvene unice, o copie per genom haploid, corespunztoare genelor codificatoare pentru lanuri polipeptidice, excepie fcnd genele ce codific histone, care se gsesc n cteva sute de copii per genom haploid (este necesar o sintez rapid ntr-un timp scurt corespunztoare perioadei S de replicare a ADN). 2. secvene moderat repetitive: sunt intr-un numr de 102 103 copii per genom haploid i codific pentru ARN ribozomal, ARN de transfer i pentru histone. 3. secvene nalt repetitive: ajung pn la 106 copii per genom haploid n general, eucariotele conin mult mai mult ADN dect procariotele. O celul de om conine de peste 1000 de ori mai mult ADN dect o celul de Escherichia coli. Astfel, ADN-ul dintr-o celul de om, aflat n stare decondensat atinge o lungime de 4 cm i nu poate ncpea ntr-un nucleu (de diametru 5 m) dect n form condensat. Forma cromozomilor dintr-o celul eucariot se modific n timpul ciclului celular. 3.3.2 Proteinele cromozomale Principalele proteine ce complexeaz ADN-ul au greutate molecular mic, o cantitate mare de aminoacizi cu caracter bazic i se numesc histone. Au fost descrise 5 clase de histone: H1 H2A, H2B, H3 i H4. Histona H1 este alctuit din 3 domenii structurale distincte: - un capt amino-terminal cu 39 aminoacizi bazici 50
Proiectul pentru nvmntul Rural

Cromozomul la organisme pro- i eucariote

- o regiune globular central cu un diametru de 2,8 nm, cu aminoacizi cu caracter acid; interacioneaz cu alt protein-terminal ce conine 40% lizin (cu puternic caracter bazic) i are afinitate de interaciune cu molecula de ADN. Histonele H2A i H2B au cantitate mai redus de lizin. H2A are leucin, iar H2B are serin i prolin. Au doar 2 domenii, dintre care unul interacioneaz cu ADN. Histonele H3 i H4 sunt bogate n arginin i, n mod similar cu H2A i H2B, au tot doar 2 domenii funcionale. n general, histonele prezint o structur nalt conservat n lumea vie. Cea mai heterogen este histona H1, acest parametru scznd de la H1 ctre H4. Genele pentru histone sunt organizate n uniti repetitive dispuse n tandem. De exemplu, la D.melanogaster unitatea repetitiv este format din genele pentru: H1 H3 H4 H2A H2B

Figura 3.5 Organizarea genelor pentru histone la D.melanogaster. regiuni reglatoare ale genelor (situsuri hipersensibile la nucleaz)

3.3.3 Nivelele de organizare ale cromatinei Elementul structural de baz al cromatinei este nucleozomul care este format dintr-un octamer histonic central i o histon de legtur (linker). Nucleozomul are 145 perechi de baze corespunztoare la aproximativ 2 ture de spir suprarsucite negativ n jurul miezului histonic. Miezul histonic prezint domeniul hidrofob carboxi-terminal de interaciune cu celelalte proteine spre partea central, iar domeniul amino-terminal se gsete la suprafaa de interaciune cu ADN. ntre 2 nucleozomi adiaceni se interpune ADN linker de 60 perechi de baze i este complexat cu histona H1. Cromatina extins apare ca un irag de mrgele cu un diametru de 11 nm. Prin intermediul histonei H1 implicat n superspiralizare interacioneaz 6 10 nucleozomi pentru a forma solenoidul de 30 nm. Acesta este unitate de baz a condensrii materialului genetic n interfaz. Forma superioar de condensare este reprezentat de cromozomii metafazici, perioada n care materialul genetic atinge un nivel maxim de condensare de 1400 nm. Procesul de condensare a cromatinei este realizat prin ataarea ei la o clas de proteine denumite proteine scaffold (proteine de eafodaj). Ataarea se realizeaz cu formarea unor bucle (domenii) care au fiecare 100 kpb, comparabile cu cele de la cromozomul bacterian.
Proiectul pentru nvmntul Rural

51

Cromozomul la organisme pro- i eucariote

Figura 3.6 Reprezentarea schematizat a structurii nucleozomilor (dup Strachan, 1999).

n organizarea materialului genetic nuclear la organisme eucariote intervin i proteine non-histonice. Acestea se submpart n mai multe clase: enzime ale metabolismului ADN: ADN polimeraze, ADN ligaze, ADN topoizomeraze, terminal-ADN-nucleotidil-transferaze enzime ale metabolismului ARN: ARN polimeraze, poliA polimeraze, enzime de splicing, RNaze enzime ce modific histonele: protein-kinaze, metilaze, acetilaze, esteraze, proteaze proteine structurale: proteinele fusului de diviziune, proteinele matricei nucleare, proteinele scaffold, proteinele particulelor RNP (RiboNucleoProtein) proteinele HMG (High Mobility Group) ce intervin n modificarea structurii cromatinei n vederea funcionrii genelor n replicare i transcriere: o HMG 1 i HMG 2 proteine omoloage cu g.m. 29 kd; o HMG 14 i HMG 17 - proteine omoloage cu g.m. 10-12 kd Proteinele HMG nlocuiesc histona H1 determinnd, alturi de topoizomeraze, relaxarea helixului ADN n iniierea transcrierii genelor.

Teste de autoevaluare ncercuii litera corespunztoare variantei corecte TA 3.11 Care este, teoretic, numrul minim posibil de cromozomi ntr-o celul diploid dintr-un organism eucariot ? a) 1 b) 2 c) 3 d) 4 e) 6 TA 3.12 Marcai varianta cea mai apropiat de noiunea de histone : a) glucide b) lipide c) proteine bazice d) proteine acide

52

Proiectul pentru nvmntul Rural

Cromozomul la organisme pro- i eucariote

3.4 LUCRARE DE VERIFICARE 3

I. ncercuii litera corespunztoare variantei corecte de rspuns: 1. Proteinele histone-like sunt: a) asociate cu cromozomul bacterian b) asociate cu membrana citoplasmatic c) asociate cu peretele celular 2. Proteina HU este codificat de genele: a) hup D b) hup A i hup B c) hup A, B i C 3. Proteina IHF intervine n: a) replicarea cromozomului bacterian b) transcrierea genelor plasmidiale c) recombinare genetic neomoloag 4. Elementele REP sunt formate din: a) 2-4 secvene REP b) 6-8 secvene REP c) 8-10 secvene REP 5. La situsurile Chi acioneaz urmtoarea enzim: a) endonucleaza Eco RI b) endonucleaza Hind III c) endonucleaza RecBCD 6. La situsurile Dam se metileaz: a) guanina b) adenina c) citozina 7. Operonii rrn codific pentru: a) ARN ribozomal b) ARN mesager c) ARN mitocondrial 8. Succinat dehidrogenaza, codificat de 4 gene, determin: a) 3 reacii biochimice b) 2 reacii biochimice c) 1 reacie biochimic 9. Plasmidele conjugative: a) sunt autotransferabile b) sunt mobilizabile c) nu au operon tra

Proiectul pentru nvmntul Rural

53

Cromozomul la organisme pro- i eucariote

10. La eucariote, eucromatina este caracteristic: a) genelor centromerice b) genelor inactive transcripional c) genelor active transcripional Total: 20 puncte (cte 2 puncte pentru fiecare item) II. Completai spaiile goale cu noiunile corespunztoare: Din asocierea histonelor cu ADN rezult structuri numite ................................., iar din asocierea proteinelor histone-like cu ADN rezult structuri numite .............................. n genomul bacterian exist gene contigue, dar i gene .................................. Plasmidele lineare pot avea telomere ................................ sau telomere ............................. Total: 10 puncte (cte 2 puncte pentru fiecare noiune) III. Rspundei pe scurt (1-2 fraze) la urmtoarele probleme: 1. 2. 3. 4. 5. Ce tipuri de gene pot fi plasate pe plasmide ? Clasificai plasmidele n funcie de structur i de autotransferabilitate. Definii eucromatina i cele 3 tipuri de heterocromatin. Care sunt clasele de histone i ce rol au ele n structura cromatinei ? Descriei structura unui nucleozom. Total: 30 puncte (cte 6 puncte pentru fiecare noiune)

IV. Realizai pe maximum 2 pagini un eseu n care s comparai genomul procariotelor cu cel al eucariotelor. Se puncteaz structurarea eseului, claritatea argumentelor, folosirea limbajului adecvat. Total: 30 puncte (cte 10 puncte pentru fiecare cerin) Total general: 90 puncte + 10 puncte din oficiu= 100 puncte

3.5 RSPUNSURI LA TESTELE DE AUTOEVALUARE Unitatea de nvare 1


TA 3.1 TA 3.2 TA 3.3 TA 3.4 TA 3.5 TA 3.6 c a c d c b TA 3.7 vezi subcapitolul 3.1.2 TA 3.8 c TA 3.9 b TA 3.10 vezi subcapitolul 3.2.2 TA 3.11 b TA 3.12 c

3.6 BIBLIOGRAFIE RECOMANDAT


1. Raicu P., Stoian V., 1991, Genetica dezvoltrii la eucariote, Editura Academiei Romne. 2. Vassu T., Stoica I., Cstuak O., Muat F., 2001, Genetica microorganismelor i Inginerie genetic microbian. Note de curs i Tehnici de laborator. Editura Petrion, Bucureti.

54

Proiectul pentru nvmntul Rural

Funciile materialului genetic

Unitatea de nvare 4 FUNCIILE MATERIALULUI GENETIC

Cuprins:
Cuprins Obiectivele Unitii de nvare 4 4.1 Replicarea ADN 4.1.1 Principalele etape ale replicrii ADN 4.1.2 Enzimologia replicrii 4.1.2.1 Complexul primozom 4.1.2.2 Topoizomerazele 4.1.2.3 ADN polimeraze 4.1.3 Replicarea plasmidelor bacteriene 4.1.3.1 Replicarea plasmidelor lineare 4.1.3.2 Replicarea plasmidelor circulare 4.1.3.2.1 Mecanismul theta 4.1.3.2.2 Mecanismul strand-displacement 4.1.3.2.3 Mecanismul rolling-circle 4.1.3.3 Mecanisme de control al replicrii plasmidiale 4.2 Transcrierea genetic 4.2.1 Definiii i principii 4.2.2 Enzime 4.2.3 Transcrierea la procariote 4.2.3.1 Promotori 4.2.3.2 Terminatori 4.2.3.3 ARN polimeraza de la procariote 4.2.3.4 Fazele transcrierii genetice la procariote 4.2.4 Transcrierea la eucariote 4.2.4.1 ARN polimerazele de la eucariote 4.2.4.2 Promotorul la eucariote 4.2.4.3 Complexul de pre-iniiere 4.3.4.4 Factorii de elongare 4.3 Lucrare de verificare 4 4.4 Rspunsuri la testele de autoevaluare - Unitatea de nvare 4 4.5 Bibliografie recomandat 55 55 56 56 60 60 61 63 65 65 66 66 67 68 70 72 72 74 75 75 75 76 78 79 79 80 80 82 82 84 84

Obiectivele Unitii de nvare 4 s nelegei principalele etape ale replicrii moleculelor de ADN; s nelegei rolul diverselor proteine n procesul de replicare ADN; s nelegei rolul i importana secvenelor de origine a replicrii ADN; s nelegei mecanismele de replicare a plasmidelor i de control al acestor procese s nelegei mecanismele de exprimare a genelor prin transcriere genetic

Proiectul pentru nvmntul Rural

55

Funciile materialului genetic

4.1 Replicarea ADN


Replicarea ADN reprezint transmiterea fidel a informaiei genetice la celulele fiice, n urma diviziunii celulare. Replicarea este una dintre cele dou funcii eseniale ale materialului genetic. Mai mult dect att, replicarea ADN este procesul de baz al continuitii vieii pe Pmnt. 4.1.1 Principalele etape ale replicrii ADN Ca i alte procese din biologia molecular, i procesul de replicare se desfoar n 3 etape iniierea, elongarea i terminarea : Iniierea implic recunoaterea regiunii de pe o molecul ADN unde va ncepe procesul de replicare Elongarea cuprinde evenimentele ce se desfoar la o bifurcaie de replicare, unde catenele parentale sunt copiate n catene fiice Terminarea este o etap destul de puin cunoscut i se desfoar atunci cnd molecula parental a fost complet replicat Etapele chimice ale replicrii ADN Din punct de vedere chimic, replicarea ADN presupune urmtoarele etape principale: desfacerea iniial a dublului helix ntr-o zon denumit regiune de origine a replicrii sinteza unor fragmente de ARN m.c. scurt ce ofer captul 3-OH liber pentru sinteza primelor legturi fosfo-diesterice; aceste fragmente poart numele de primeri i sunt sintetizate de ARN polimeraze speciale denumite primaze n bucla de ADN desfcut procesul de replicare se va desfura n ambele direcii, formndu-se deci 2 bifurcaii de replicare n faa fiecrei bifurcaii de replicare dublul helix va fi desfcut prin intervenia topoizomerazelor (care dersucesc dublul helix) i a helicazelor (care desfac legturile de hidrogen dintre cele 2 catene); astfel, bucla de replicare se va lrgi n fiecare din cele 2 capete fiecare din cele 2 catene ale helixului parental va servi drept matri pentru sinteza unei catene noi sinteza catenelor noi se realizeaz de ctre enzime numite ADN polimeraze, pe baz de complementaritate cu catena veche folosit ca matri; nucleotidele sunt legate ntre ele prin formarea de legturi fosfo-diesterice; alungirea catenei noi se realizeaz n direcie 5 3 datorit faptul c ADN polimerazele nu pot sintetiza o caten nou dect n direcie 5 3, la fiecare bifurcaie de replicare, sinteza celor 2 catene noi are loc oarecum diferit una din catenele noi este sintetizat continuu, pornind de la un singur primer: aceast caten este denumit catena conductoare (leading) (Figura 4.1) cealalt caten este sintetizat discontinuu, pe msur ce dublul helix parental este desfcut n continuare; aceast caten este denumit caten ntrziat (lagging) i este format din multe fragmente distincte, denumite fragmente Okazaki (de la numele celui care le-a descris prima oar) de aproximativ 100 nucleotide; fiecare asemenea fragment este iniiat de la un primer
Proiectul pentru nvmntul Rural

56

Funciile materialului genetic

ntr-o faz mai avansat a replicrii primerii sunt ndeprtai att din structura catenei conductoare, ct i din cea ntrziat, dup care golurile sunt umplute tot de o ADN polimeraz aceste fragmente sunt apoi unite ntre ele prin refacerea legturilor fosfo-diesterice de ctre o ADN ligaz n timpul procesului de replicare monocatenele ADN (att cele vechi, ct i cele nou sintetizate) sunt stabilizate i protejate de aciunea nucleazelor, de ctre o clas special de proteine numite proteine Ssb (Single Stranded Binding) terminarea replicrii unei molecule de ADN difer ntre moleculele circulare i cele lineare la moleculele circulare, ntlnite n majoritatea cazurilor la cromozomul bacterian i la plasmide, cele 2 bifurcaii de replicare se ntlnesc ntr-o regiune denumit ter. la moleculele ADN lineare din cromozomii de la eucariote, capetele acestora (telomerele) sunt replicate printr-un mecanism diferit, iar fragmentele sunt apoi unite de ADN ligaze Teste de autoevaluare TA 4.1 Care sunt principalele etape ale replicrii ADN? 1. ......................... 2. ....................... 3. ........................... ncercuii litera corespunztoare variantei corecte TA 4.2 n replicare, primerii sunt molecule de : a) proteine b) ARN c)ADN TA 4.3 ntr-o bucl de replicare, numrul de bifurcaii este de : a) 1 b) 2 c) 3 TA 4.4 n replicare catenele noi sunt sintetizate n direcie : a) 3- 5 b) 3 3 c) 5 5 d)5 3 TA 4.5 n replicare, sinteza catenelor noi este realizat de : a) ARN polimeraze b) ADN topoizomeraze c) ADN polimeraze

Figura 4.1 Reprezentarea schematizat a unei bifurcaii de replicare.


Proiectul pentru nvmntul Rural

57

Funciile materialului genetic

Complementaritatea dintre bazele azotate de pe cele 2 catene ale moleculei de ADN determin o structur perfect adaptat funciei de replicare, fiecare dintre cele 2 catene servind drept matri pentru sinteza unei catene complementare. n majoritatea cazurilor, replicarea se realizeaz pe model semiconservativ, macromoleculele de ADN fiice fiind formate dintr-o caten veche i una nou (Figura 4.2).

Figura 4.2 Principalele trei modele de replicare a moleculelor ADN.

repliconi

La majoritatea organismelor (chiar i la genomuri virale) replicarea ADN se desfoar bidirecional, ceea ce presupune formarea a dou bifurcaii de replicare ce avanseaz de la secvena de origine a replicrii (denumit secven oriC pentru cromozomul bacterian) ctre regiunea de terminare a replicrii (denumit secvena ter n cromozomul bacterian). Dei procesul de replicare a moleculelor de ADN se desfoar enzimatic n mod similar la toate organismele, att la cele procariote, ct i la cele eucariote, totui exist suficiente diferene ntre cele 2 tipuri principale de organisme. Astfel, cromozomul bacterian este un replicon unic, adic are o singur secven de origine a replicrii. n contrast, cromozomii de la eucariote sunt fiecare dintre ei structuri multirepliconice (au mai multe regiuni de origine a replicrii ADN) (Figurile 4.3 i 4.4).

58

Proiectul pentru nvmntul Rural

Funciile materialului genetic

Figura 4.3 Replicarea bidirecional a unui cromozom bacterian (A) i a unui cromozom de tip eucariot (B)

Figura 4.4 Reprezentarea schematic a replicrii cromozomului bacterian.

Mai mult chiar, apar diferene i datorate structurii teriare. Cromozomul bacterian are o structur circular i, ca urmare, cele 2 bifurcaii de replicare se ntlnesc la nivelul secvenei ter (Figura 4.5). Cromozomul de tip eucariot are o structur linear, iar capetele lui (denumite telomere) se replic diferit de restul cromozomului.

Figura 4.5. Imaginea de microscopie electronic i reprezentarea schematizat a unei molecule circulare de ADN n timpul replicrii.

Teste de autoevaluare ncercuii litera corespunztoare variantei corecte TA 4.6 n replicare, catenele nou sintetizate ................................. fa de catenele vechi : a) alele b) complementare c) omoloage TA 4.7 Cromozomul bacterian este un replicon : a) unic b) bivalent c) trivalent
Proiectul pentru nvmntul Rural

sunt

59

Funciile materialului genetic

4.1.2 Enzimologia replicrii cromozomului bacterian Cercetrile asupra procesului de replicare a moleculei ADN precum i asupra enzimelor implicate au debutat pe cromozomul de Escherichia coli i, ca urmare, majoritatea datelor experimentale provin de la bacterii (Figura 4.6). 4.1.2.1 Complexul primozom Complexul primozom este format dintr-o serie de proteine ce determin iniierea replicrii ADN. Cele mai importante proteine sunt: primaza: la bacterii este denumit DnaG i este codificat de gena dnaG; aceast enzim sintetizeaz scurte fragmente de ARN ce au funcie de primeri, adic ofer capul 3-OH liber pentru polimerizare. proteinele de iniiere: n, n, n, DnaA, DnaB, DnaC i DnaT Iniierea replicrii presupune detaarea secvenei oriC de membrana plasmatic, dup ce, n prealabil, a fost atins o anumit mas celular (denumit mas de iniiere) i n urma acumulrii unei cantiti substaniale de fosfolipide acide pe faa intern a membranei plasmatice. Secvena oriC din cromozomul de E.coli are 245 bp i prezint 2 regiuni importante: - o regiune cu 4 cutii dnaA (sunt formate din cte 9 bp, denumite 9-meri) la care se va ataa proteina DnaA - o regiune cu 3 cutii de tip 13-meri, bogate n adenin-timin, la care se vor ataa complexe proteice DnaB-DnaC Zece pn la 12 molecule de DnaA se leag la cutiile dnaA, determinnd buclarea moleculei de ADN i, ca atare, desfacerea dublului helix n cutiile dnaB. Zonele monocatenare aprute se complexeaz cu proteina DnaB (cu funcie de helicaz), adus de proteina DnaC. Ulterior, primaza (DnaG) ncepe aici sinteza moleculelor de ARN primeri (Figura 4.7). Teste de autoevaluare. TA 4.8 Listai proteinele complexului primozom : .................................................................................................................. .................................................................................................................... ....................................................................................................................

Figura 4.6 Reprezentarea schematic a unei bifurcaii de replicare.

60

Proiectul pentru nvmntul Rural

Funciile materialului genetic

Figura 4.7 Originea replicrii n cromozomul de E. coli.

Figura 4.8 Structura regiunii de origine a replicrii la drojdia de bere (Saccharomyces cerevisiae).
(A) Structura secvenei ARS1, o secven ARS tipic de la S.cerevisiae, cu poziionarea secvenelor funcionale A, B1, B2 i B3. (B) Desfacerea dublului helix are loc n regiunea B2 prin ataarea proteinei ABF1 la regiunea B3. Proteinele complexului de origine a replicrii sunt ataate permanent la regiunile A i B1.

n procesul de replicare a ADN, n diverse etape, apar zone monocatenare ce sunt stabilizate (i aprate) fa de aciunea nucleazelor prin ataare de proteine de tip Ssb (Single Stranded Binding proteine ce se ataeaz la monocatene ADN). 4.1.2.2 Topoizomerazele Superspiralizarea cromozomului bacterian impune intervenia unor enzime care s realizeze relaxarea dublului helix ADN. Aceste enzime se numesc topoizomeraze i acioneaz asupra topoizomerilor ADN (Figura 4.9). Topoizomerii sunt molecule ADN cu structur primar i secundar identic i care difer n structura teriar. Dou molecule ADN d.c. ce au aceeai secven de nucleotide dar numr diferit de nlnuiri i suprarsuciri sunt topoizomere datorit diferenelor de natur topologic.
Proiectul pentru nvmntul Rural

61

Funciile materialului genetic

La bacterii, ca de altfel i la eucariote, exist 2 clase de topoizomeraze cu mecanisme diferite de aciune (Figura 4.9) : topoizomeraze tip I induc rupturi monocatenare (i tranzitorii) n ADN topoizomeraze tip II induc rupturi bicatenare n ADN (Figura 4.10) La bacterii, topoizomeraza de tip I cea mai bine caracterizat este TopA de la E.coli, care relaxeaz suprarsuciri negative nalt rsucite. Topoizomerazele de tip II, n absena ATP, au rolul de a relaxa macromolecula ADN ca i TopA, n timp ce n prezena ATP induc suprarsuciri negative n moleculele circular covalent nchise (CCC) relaxate. Cea mai cunoscut enzim din aceast clas este ADN giraza, care poate introduce aproximativ 100 de suprarsuciri negative per minut.

Figura 4.9 Desfacerea dublului helix ntr-o bifurcaie de replicare, prin aciunea topoizomerazelor.

Figura 4.10 Modul de aciune al ADN topoizomerazelor de tip I i II. (A) Topoizomerazele de tip I realizeaz ruperi monocatenare, conduc catena intact prin aceast rupere, refcnd apoi legtura fosfo-diesteric. (B) Topoizomerazele de tip II taie ambele catene dintr-un dublu helix; prin acest spaiu este trecut un alt fragment al dublului helix, iar apoi se refac cele 2 legturi fosfo-diesterice.

62

Proiectul pentru nvmntul Rural

Funciile materialului genetic

Figura 4.11 Rolul secvenelor terminator i al proteinelor Tus n replicarea cromozomului la E.coli.

Teste de autoevaluare ncercuii litera corespunztoare variantei corecte TA 4.9 Topoizomerazele sunt enzime care : a) modific gradul de spiralizare a ADN b) degradeaz moleculele de ADN c) degradeaz cromozomii TA 4.10 Proteina care desface legturile de hidrogen dintre cele 2 catene ADN este : a) o histon b) o topoizomeraz c) o helicaz 4.1.2.3 ADN polimeraze Procesul de replicare propriu-zis a ADN este realizat de un complex de enzime denumite ADN polimeraze. Cea mai important activitate enzimatic desfurat de o asemenea enzim este formarea de legturi fosfo-diesterice ntre nucleotide adiacente, cu creterea lanului n direcie 5 3. Toate ADN polimerazele descrise pn n prezent polimerizeaz n direcie 5 3 i nu pot realiza acest proces dect pornind de la capul 3OH liber al unei nucleotide. De obicei, acest cap este oferit de un scurt fragment monocatenar de ARN denumit primer. La bacterii au fost descrise 3 tipuri de ADN polimeraze ce coexist n aceeai celul : Proiectul pentru nvmntul Rural 63

Funciile materialului genetic

ADN polimeraza I (ADN pol I) este codificat de gena polA i are o g.m. de aprox 100 Md. n celula de E.coli exist circa 400 molecule de ADN pol I care are o vitez de polimerizare de 667 nucleotide / min. n afar de activitatea de polimerizare, aceast enzim poate desfura i activitate de exonucleaz (adic de desfacere de legturi fosfo-diesterice i eliminare de nucleotide dintro caten). Astfel, ADN pol I are un domeniu polipeptidic ce realizeaz activitate exonucleazic n direcie 3 5 , activitate foarte important ce i asigur enzimei i posibilitatea de a i corecta singur eventualele erori de ncorporare a unor nucleotide mperecheate greit. Aceast funcie este denumit citire corect (proof-reading). Totodat, ADN pol I poate desfura i activitate exonucleazic n direcie 5 3, activitate ce i permite ndeprtarea primerilor ARN. ADN polimeraza II (ADN pol II) este codificat de gena polB. i aceast enzim poate avea i activitate exonucleazic 5 3. ADN polimeraza III (ADN pol III) este principala replicaz a cromozomului bacterian i reprezint un adevrat complex enzimatic format din cel puin 10 subuniti funcionale (Tabelul din Figura 4.12). Teste de autoevaluare ncercuii litera corespunztoare variantei corecte TA 4.11 Ce tipuri de activiti enzimatice poate desfura ADN polimeraza I de la bacterii ? a) polimeraz 5 3 b) polimeraz, exonucleaz 3 5 i exonucleaz 5 - 3 c) polimeraz i exonucleaz 3 5

Figura 4.12 Subunitile ADN polimerazei III de la procariote.

Denumirea subunitii

Masa molecular 130 27 10 71 47 35 33 15 12 40

Gena pol C (dnaC) dnaQ holE dnaXZ dnaXZ holA holB holC holD dnaN

Funcii
ADN pol Exo 5 3 Exo 3 5 structural Dimerizarea miezului enzimei ATPaze

Subansamblu Miezul enzimei


64

complexul complexul favorizeaz transferul sub. la matria ADN

Leag miezul enzimei la ADN i l recicleaz

complexul

Proiectul pentru nvmntul Rural

Funciile materialului genetic

Holoenzima ADN pol III acioneaz ca dimer, fiecare din cei 2 monomeri realiznd sinteza pe una din cele 2 catene. O excepie o reprezint complexul care acioneaz doar pe catena ntrziat.

Figura 4.13 Reprezentarea schematizat a interveniei subunitilor ADN polimerazei la eucariote.

4.1.3 Replicarea plasmidelor bacteriene


Indiferent dac confer bacteriei gazd caractere eseniale sau neeseniale, toate plasmidele au n structura lor o regiune foarte important pentru replicarea i meninerea stabil a plasmidului respectiv n populaia bacterian. n prezent se consider c aceast regiune esenial ar conine: a) secvene de origine a replicrii plasmidiale, denumite convenional oriV (fata de oriC - originea replicrii cromozomului bacterian); o secven oriV trebuie s ndeplineasc urmatoarele condiii: - regiunea ADN minimal, cu activitate n cis, ce poate susine replicarea plasmidial - regiunea ADN n care cele 2 catene se despart pentru a iniia procesul de replicare - nucleotidul/nucleotidele la care ncepe sinteza catenei leading b) multe plasmide codific o protein implicat n iniierea replicrii plasmidiale, denumita proteina de tip Rep c) gene implicate n controlul replicrii plasmidiale 4.1.3.1 Replicarea plasmidelor lineare (ADN d.c. linear) n ceea ce privete replicarea plasmidelor lineare, aceasta se desfoar prin mecanisme diferite funcie de tipul de telomere. a) plasmide cu telomere hairpin Datorit capetelor legate covalent, ADN polimeraza poate trece peste ele continund replicarea printr-un intermediar replicativ concatemeric. Asemenea plasmide ar putea reprezenta un caz special de plasmide circulare monocatenare, n care jumtate din cerc este complementar cu cealalt jumtate.
Proiectul pentru nvmntul Rural

65

Funciile materialului genetic

b) plasmide cu telomere invertroni Se replic printr-un mecanism de replicare ADN primat de proteine, n cazul de fa proteina TP (Telomeric Protein). n cazul unor asemenea plasmide, telomerele reprezint originea replicrii i sunt recunoscute de proteine de iniiere care desfac dublul helix ADN. Plasmidele cu telomere invertroni sunt replicate de o ADN polimeraz ce seamn mai mult cu ADN polimeraza de la eucariote, dect cu ADN polimerazele de la procariote. Ultima nucleotid de la capul 5 al fiecrei din cele 2 catene (nucleotida la care este ataat covalent proteina TP), este o adenin (A). Separat de molecula plasmidial, se formeaz complexe din alt monomer TP i alt molecul de adenin. Cei 2 monomeri TP (unul ataat la o adenin, iar cellalt ataat la adenina din telomera plasmidial) se atrag i are loc procesul de dimerizare, iar ntre A i primul nucleotid (T) de pe catena complementar se formeaz legturi de hidrogen. Totodat, acest al doilea A ofer capul 3 liber pentru primarea polimerizrii (Figura 4.14).

Figura 4.14 Replicarea plasmidelor lineare cu telomere invertroni. 4.1.3.2 Replicarea plasmidelor circulare. Au fost descrise 3 mecanisme generale de replicare a plasmidelor circulare . 4.1.3.2.1 Mecanismul THETA Acest mecanism prezint asemnri foarte mari cu procesul de replicare a cromozomului bacterian. Ca i n cazul acestuia, acest mecanism poart numele de theta datorit faptului c intermediarii de replicare sunt molecule cu forma literei greceti theta. Mecanismul theta de replicare se ntlnete cu precdere la plasmidele de la bacteriile Gram-negative, dar i la unele plasmide de la Grampozitive (streptococ, enterococ, unii lactococi). 66
Proiectul pentru nvmntul Rural

Funciile materialului genetic

Replicarea acestor plasmide necesit o protein iniiator, codificat plasmidial i denumit proteina Rep, iar procesul pornete de la o regiune denumita oriV, ce are organizare similar cu oriC din cromozomul bacterian. ntreg procesul de replicare de tip theta depinde de mai multe clase de proteine, din care ns doar proteinele de tip Rep sunt codificate plasmidial, celelalte sunt codificate cromozomal i sunt aceleai proteine ce intervin i n replicarea cromozomului bacterian. O excepie o reprezint plasmidul Col E1, care se replic printr-un mecanism de tip theta, dar nu necesit prezena unei proteine iniiator de tip Rep. ori V La plasmidele ce se replic prin mecanism theta, regiunea oriV cuprinde: 4-5 secvene ADN n repetiie direct i denumite iteroni, la care se ataeaz proteina Rep (iteronii exist i n cazul celorlalte dou mecanisme de replicare plasmidial), o regiune bogat n A/T, unde este iniiat desfacerea dublului helix, cutii dnaA, la care se ataeaz proteina DnaA. Proteinele Rep sunt proteine de tip leucine-zipper cu un domeniu HTH (-helix-turnhelix) i se ataeaz la ADN intr-o manier situs-specific, i anume la secvenele iteroni. Ataarea se realizeaz astfel nct moleculele Rep sunt aliniate pe aceeai fa a moleculei ADN. Procesul de replicare a plasmidelor prin mecanism theta se Etape desfoar n urmatoarele etape : a) n prima etap are loc ataarea proteinelor Rep la secvenele iteroni; acest lucru determin o curbare a moleculei ADN n aceast zon, fapt ce faciliteaz etapa urmtoare; b) ataarea proteinelor DnaA la cutiile dnaA; la rndul ei, aceast etap o faciliteaz pe urmtoarea; c) ataarea complexului proteic DnaB-DnaC la regiunea din oriV bogat n A/T; DnaB este o helicaz i desface dublul helix n aceast zon; d) are loc sinteza unui ARN primer de ctre o ARN polimeraz codificat de o gen cromozomal; e) ncepe procesul de polimerizare desfurat, la majoritatea plasmidelor din aceast clas, de ctre ADN polimeraza III (excepie face plasmidul Col E1, care este replicat prin mecanism theta, dar de ctre ADN polimeraza I); f) sinteza celor 2 catene (leading i lagging) este cuplat i se desfoar cvasi-simultan; g) sinteza se desfoar n majoritatea cazurilor unidirecional, spre deosebire de replicarea cromozomului bacterian care la marea majoritate a speciilor bacteriene se desfoar bidirecional. Dintre cele mai cunoscute plasmide ce se replic prin mecanism theta, amintim pSC101, P1, RK2, RP4, R6K, R1, CColE2, ColE3. 4.1.3.2.2 Mecanismul STRAND-DISPLACEMENT (SD) Denumirea provine din termenul strand-displacement ori V (dislocarea catenei) i se refer la faptul c n timpul procesului de replicare are loc dislocarea uneia din cele 2 catene ADN. Acest mecanism se ntlnete mai ales la plasmidele promiscue din grupul de incompatibilitate IncQ. La aceste plasmide regiunea oriV este
Proiectul pentru nvmntul Rural

67

Funciile materialului genetic

Etape

alctuit din 3 secvene ADN de tip iteroni, 1 regiune bogat n G/C (174 bp), 1 regiune bogat n A/T (31 bp) Procesul de replicare ADN de tip strand-displacement nu depinde de proteine ale celulei gazd (codificate cromozomal, cum ar fi DnaA, DnaB, DnaC), ci de trei proteine codificate plasmidial: RepA este o helicaz ce intra n dublul helix ADN n regiunea bogat n A/T i faciliteaz dislocarea catenei parentale nereplicate sub forma buclei D (forma literei D); RepB este o primaz care sintetizeaz un primer ARN necesar iniierii polimerizrii ADN; RepC este o protein iniiator care se ataeaz la secvenele iteroni din oriV. Replicarea pornete de la dou origini (ssiA i ssiB) simetrice i adiacente, ce funcioneaz n forma monocatenar i sunt situate pe cele 2 catene. Procesul de replicare ncepe cnd aceste 2 origini sunt expuse monocatenar. Procesul de replicare SD se desfoar n urmtoarele etape: 1. monomeri ai proteinei RepC se ataeaz la secvene iteroni din oriV; 2. proteina RepA (helicaza) se ataeaz la regiunea din oriV bogat n A/T, determinnd desfacerea dublului helix; 3. proteina RepB (primaza) se ataeaz la bucla A/T i sintetizeaz un primer ARN; 4. ncepe procesul de polimerizare ADN; 5. helicaza RepA faciliteaz dislocarea catenei parentale nereplicate sub forma unei bucle D. Produsele intermediare ale unui proces de replicare SD sunt: - o molecul ADN circular d.c. - o molecul ADN circular m.c. pe aceasta va fi iniiat un nou proces de replicare care va conduce la formarea catenei complementare, i deci, a formei dublucatenare a plasmidului. n cazul unui asemenea mecanism de replicare sinteza celor dou catene noi ale moleculei de ADN nu este cuplat i simultan.

4.1.3.2.3 Mecanismul ROLLING-CIRCLE (RC) Denumirea provine din faptul c n timpul procesului, molecula de ADN are forma unui cerc rotativ. Acest mecanism de replicare este ntlnit la plasmide din multe bacterii Gram-pozitive, de exemplu plasmidul pT181 (de la Staphylococcus), pUB110 i pC194 (de la Bacillus subtilis). Ca i n cazul mecanismului SD, replicarea de tip RC depinde de o protein iniiator codificat plasmidial (proteina Rep) i de o serie de proteine codificate pe cromozomul bacterian. Plasmidele ce se replic prin mecanism RC au doua secvene ori V ori situate distanat una de alta: dso (double-stranded origin), de la care este iniiat replicarea primei catene noi (catena leading); dso are 2 regiuni: regiunea bind, la care are loc ataarea proteinei iniiator Rep i regiunea nick, n care proteina Rep produce ruptura monocatenar iniial sso (single-stranded origin), de la care este iniiat sinteza celei de-a doua catene noi (catena lagging) 68
Proiectul pentru nvmntul Rural

Funciile materialului genetic

Etape

n procesul de replicare RC se parcurg urmtoarele etape: - proteina Rep se ataeaz la regiunea bind a secvenei dso; - proteina Rep taie o legtur fosfodiesteric (ruptur monocatenar) i rmne ataat la capul 5 Tyr-fosfodiesteric; capul 3 va servi ca primer pentru sinteza catenei leading; - n procesul de sintez a catenei leading intervin o serie de proteine codificate pe cromozomul bacterian: helicaza, Ssb, ADN polimeraza III; - replicarea catenei leading continu mai mult de o rund complet depind regiunea dso; - pentru terminarea replicrii catenei leading are loc o reacie de transfer de caten: prin monomerul liber, proteina Rep atac regiunea dso a catenei vechi, taie o legtur fosfodiesteric i reface alta, rezultnd o molecul circular d.c. care a eliberat i un dimer de Rep inactiv i, respectiv, o molecul circular m.c. pe care, de la sso, este sintetizat un primer i apoi o caten noua Deci, i n cazul acestui mecanism sinteza celor dou catene ADN noi nu este cuplat. Intr-un asemenea proces proteina Rep are un rol mai complex dect ntr-o replicare SD : - se ataeaz la dso, avnd rol n iniierea replicrii; - taie o legtur fosfodiesteric, producnd nick-ul iniial; - la terminarea sintezei primei catene noi, Rep taie i reface legturi fosfodiesterice Datorit activitii sale catalitice, proteina Rep de la plasmidele ce se replic printr-un mecanism RC este similar cu topoizomerazele din clasa I. n general, plasmidele ce se replic prin RC au o alctuire modular, cel mai important modul fiind LIC (Leading strand Initiation and Control region) care este format din dso, gena rep i elemente de control al replicrii plasmidei. Pe baza structurii LIC au fost definite 4 familii de plasmide ce se replic prin mecanism RC, familii ce au drept reprezentani urmatoarele plasmide: pT181, pC194, pMV158, pSN2. Alte module importante n aceste plasmide sunt: 1-2 sso, 1 mob, 1 gen de antibiorezisten.

Teste de autoevaluare. ncercuii litera corespunztoare variantei corecte TA 4.12 Mecanismul theta i datoreaz numele de la: a) plasmidele de la bacteriile Gram-negative b) intermediarul de forma literei c) proteina Rep TA 4.13 Mecanismul SD i datoreaz numele de la : a) una din catenele parentale este dislocat b) una din catenele fiice este dislocat c) unul din cromozomii omologi este dislocat TA 4.14 n replicarea plasmidelor prin mecanismul RC, sinteza celor 2 catene noi este : a) cuplat b) necuplat c) simultan
Proiectul pentru nvmntul Rural

69

Funciile materialului genetic

4.1.3.3 Mecanisme de control al replicrii ADN plasmidial Replicarea acestor plasmide se desfoar unidirecional i este realizat de ADN polimeraza I i nu de ADN pol III care replic cromozomul bacterian. Procesul de replicare ncepe cu sinteza unui ARN primer (=ARN II), ce este transcris ncepnd de la un situs localizat la 555 pb n amonte fa de oriV . Iniial, acest transcript este separat de ADN, ca n cazul unei transcrieri obinuite. Pe msur ce ARN polimeraza se apropie de oriV, transcriptul ncepe s rmn hibridizat cu matria ADN; cauza probabil: ARN II conine 6 G consecutive situate la circa 265 nucleotide n amonte fa de oriV; aceste 6 G interacioneaz probabil cu 6 C consecutive din ADN matri, ce se gsesc la cca 20 nucleotide n amonte fa de oriV. Apoi hibridul este tiat de RNaza H, iar capul 3 al ARN va fi elongat de ADN pol I. O modalitate de control negativ al replicrii plasmidelor din familia Col E1 este prin formarea unui al doilea ARN (=ARN I), care are funcie de ARN antisens, conine 108 nucleotide i este transcris de la -445 fa de oriV, dar n direcie opus, de pe cealalt caten ADN. Prin legarea lui ARN I (antisens) de ARN II (primer) este alterat conformaia secundar a acestuia din urm, astfel nct ARN primer nu mai poate hibridiza cu oriV. Acest ARN antisens este transcris constitutiv, dar este instabil, iar legarea lui la ARN II este mediat de o protein numit Rop (codificat de gena rop). Aplicarea unui inhibitor al sintezei proteice (de exemplu, cloramfenicolul) blocheaz sinteza proteinei Rop, rezultatul fiind o cretere a frecvenei de iniiere a replicrii plasmidelor Col E1. Acest lucru se bazeaz pe faptul c n citoplasma bacterian exist suficiente molecule de ADN pol I (cca 300), chiar dac este blocat proteosinteza. Prima citare a lui pSC101 n literatura de specialitate a fost n 1973 - Cohen care a folosit-o ca vector n experimente de clonare. Ulterior ns, aceast plasmid a fost identificat ca plasmid natural la Salmonella i Escherichia coli. Ea prezint un numr mediu de copii (6-7) per echivalent cromozomal i are o gen de rezisten la tetraciclin. ntreaga plasmid (9263 pb) a fost complet secveniat. Regiunea replicativ a acestei plasmide are 3 zone majore: (1) regiunea par - foarte important pentru stabilitate i afecteaz i numrul de copii; (2) regiunea ori - de la care pornete replicarea unidirecional i care conine majoritatea situsurilor necesare pentru replicare i pentru incompatibilitate; (3) gena repA - care este o gen specific plasmidial i codific o protein de replicare. pSC101, mpreun cu fagul P1 i cu o serie de alte plasmide (F, R6K), aparine unei clase de repliconi a cror replicare nu este realizat de ADN polimeraza I. Aceti repliconi codific o protein autoreglat (RepA) esenial pentru replicare i poseda copii repetate direct ale unei secvene ce este specific pentru fiecare
Proiectul pentru nvmntul Rural

Plasmidele din familia Col E1

pSC101

70

Funciile materialului genetic

plasmid i la care se ataeaz proteina RepA. RepA se ataeaz la cele 3 secvene RS din regiunea ori , participnd la iniierea replicrii.

Figura 4.15 Controlul replicrii la plasmidul Col E1.

Meninerea stabil a lui pSC101 n celula bacterian presupune intervenia a mai multor clase de proteine: DnaA (esenial i n iniierea replicrii cromozomului bacterian), IHF (Integration Host Factor, protein histone-like implicat n reglarea unei serii de procese celulare), DnaB, DnaC, DnaG (primaza), componente ale holoenzimei ADN polimeraza III. Regiunea ori din plasmidul pSC101 conine situsuri multiple de legare pentru proteine eseniale n replicarea plasmidial: - un situs de ataare a proteinei DnaA - 2 secvene repetate, formate din cte 13 pb (13-mer), omoloage cu secvenele din oriC i la care se ataeaz complexul DnaB-DnaC - o regiune bogat n A/T - ntre regiunea A i regiunea T se gsete situsul pentru IHF - un cluster de 3 secvene repetate direct RS1 (24 pb), RS2 (18 pb), RS3 (24 pb) la care se ataeaz proteina RepA - ARN polimeraza se ataeaz la un promotor localizat n i ntre aceste 3 secvene RS (promotorul pentru ARN-Y) Procesul de transcriere n regiunea oriV i implicat n iniierea replicrii este un fenomen extrem de frecvent n lumea bacterian, att pentru replicarea cromozomului, ct i a unor plasmide. n cazul
Proiectul pentru nvmntul Rural

71

Funciile materialului genetic

lui pSC101, printr-un asemenea proces de transcriere la origine, este sintetizat ARN-Y care ncepe din mijlocul lui RS2. Acest proces nu se afl sub controlul proteinei RepA, iar rolul moleculei ARN-Y pare s fie acela de a facilita deschiderea dublului helix ADN n regiunea ori. Regiunea par nu este esenial pentru replicare (plasmidele par se replic), dar este esenial pentru stabilitatea plasmidelor n celula bacterian, probabil prin situsul pentru giraza. Legarea simultan a proteinelor Rep A, IHF, Dna A, DnaB-Dna C este favorizat de curbarea ADN determinat de legarea IHF (curbeaz dublul helix ADN cu150o la situsul de ataare), i determin formarea REPLISOMULUI. Reglarea numrului de copii plasmidiale la pSC101 i, probabil, i la alte plasmide i sisteme similare, nu este produsul unui singur mecanism de reglare, ci este o rezultant a unui set de interaciuni moleculare (ADN-proteine, ADN-ADN, proteine-proteine), fiecare dintre ele contribuind la replicarea, stabilitatea i partiia eficient a plasmidului.

Figura 4.16 Structura regiunii replicative la plasmidul pSC101.

4.2 Transcrierea genetic


4.2.1 Definiie i principii Transcrierea genetic reprezint procesul de sintez, catalizat enzimatic, a moleculelor de ARN, ca urmare a citirii informaiei codificate n molecule ADN. Procesul se desfoar pe baza legilor de complementaritate chimic dintre cele 2 catene ale unei molecule de acid nucleic dublu catenar i conduce la formarea de legturi fosfo-diesterice ntre ribonucleotide. Prin transcriere genetic se sintetizeaz toate tipurile de molecule ARN proprii celulelor, att la organisme procariote, ct i la eucariote, i anume: ARN mesager (ARNm), ARN ribozomal (ARNr), ARN de transfer (ARNt), ARN heterogen nuclear (ARNhn). Molecula ARN rezultat prin transcriere, nainte de orice alt procesare, poart numele de transcript primar. Procesul de transcriere a unei poriuni din ADN (denumit gen) presupune deci sinteza unei copii a informaiei genetice, copie care din punct de vedere chimic este o molecula de acid nucleic monocatenar, i anume ARN.
Proiectul pentru nvmntul Rural

72

Funciile materialului genetic

Transcrierea ncepe n anumite zone din molecula ADN, zone numite promotori. Acetia au anumite secvene de nucleotide care i fac uor de recunoscut de ctre ARN polimeraze (enzimele ce sintetizeaz molecule de ARN). n zona promotorilor dublul helix ADN este desfcut de ctre ARN polimeraze, formndu-se o aanumit bucl de transcriere. n interiorul acesteia, ARN polimeraza sintetizeaz o molecul de ARN, copiind informaia genetic de pe una din catenele ADN pe care o folosete ca matri. Primul nucleotid de pe catena ADN matri care este citit i cruia i corespunde un prim nucleotid n catena ARN, este numerotat convenional cu +1 i denumit startpoint (punct de pornire a transcrierii). Urmtoarele nucleotide din matria ADN sunt numerotate +2, +3, +4 etc. Fa de poziia nucleotidului +1, se definesc 2 zone n matria ADN : - zona amonte (upstream), n care nucleotidele sunt numerotate cu semnul minus (-1, -2, -3 etc) - zona aval (downstream), n care nucleotidele sunt numerotate cu semnul plus (+2, +3, +4 etc) Procesul de transcriere pornit de la promotori continu pn n anumite zone din ADN, cu anumite secvene, zone denumite terminatori. n aceste zone, ADN polimeraza se desprinde de pe molecula de ADN, bucla de transcriere format n dublul helix ADN se nchide, iar transcriptul ARN este eliberat.

Teste de autoevaluare TA 15. Definii : promotori .................................................................................................. bucl de transcriere ................................................................................. terminatori ................................................................................................ O zon din ADN cuprins ntre un promotor i un terminator poart numele de unitate de transcriere. Din cele 2 catene ale moleculei de ADN, catena care este folosit ca matri pentru sinteza unui transcript ARN este complementar cu aceasta i este numit caten antisens. Catena ne-matri este denumit caten codificatoare sau caten sens. Admind c o gen reprezint o zon din ADN (sau mai exact, secvena de nucleotide de pe una din catenele ADN dintr-o anumit zon) ce codific un polipeptid (sau o molecul de ARNr, ARNt ARNhn), o unitate de transcriere poate include : - o singur gen, caz n care se numete transcriere monocistronic - sau mai multe gene, caz n care se numete transcriere policistronic Dei exist i destule excepii, n general, transcrierea monocistronic este caracteristic organismelor eucariote, iar cea policistronic procariotelor (Figura 4.16)
Proiectul pentru nvmntul Rural

73

Funciile materialului genetic

Figura 4.17 Reprezentarea schematizat a unui proces de transcriere monocistronic i, respectiv, policistronic.

Teste de autoevaluare TA 16. Definii : unitate de transcriere ........................................................................... caten sens .......................................................................................... caten antisens ....................................................................................

4.2.2 Enzime

Procesul de transcriere genetic este catalizat de o clas special de enzime numite ARN polimeraze. La organismele procariote exist cte o singur specie molecular de ARN polimeraz per celul, aceasta realiznd sinteza tuturor tipurilor de ARN din celul. La eucariote, majoritatea celulelor dein cte 3 specii moleculare de ARN polimeraze, fiecare dintre ele sintetiznd anumite specii de ARN. Teste de autoevaluare ncercuii varianta corect TA 17. Procesul de transcriere genetic este catalizat de: a) ADN polimeraze b) amilaze c) ARN polimeraze d) amino-transferaze

74

Proiectul pentru nvmntul Rural

Funciile materialului genetic

4.2.3 Transcrierea la procariote


4.2.3.1 Promotori Promotorii reprezint secvene din structura ADN, aflate n amonte fa de o gen, la care se ataeaz n mod situs-specific (n funcie de secvena de nucleotide) ARN polimeraza. Un promotor de la procariote prezint 4 regiuni importante din punct de vedere funcional : - o secven hexameric (adic format din 6 perechi de baze) n jurul poziiei -35; este denumit generic hexamerul -35 - o secven hexameric n jurul poziiei -10, denumit generic hexamerul -10 - o regiune spaiatoare ntre cei 2 hexameri (ADN spacer) - o regiune situat ntre poziiile -40 i -60, bogat n A i T, denumit elementul UP (Upstream = amonte) Cei 2 hexameri i elementul UP au secven de nucleotide nalt conservat, secvenele consensus fiind 5-TTGACA-3 pentru hexamerul -35 i, respectiv, 5-TATAAT-3 pentru hexamerul -10 (Figura 4.18). Cu ct secvenele de nucleotide din cei 2 hexameri sunt mai apropiate de cele de mai sus, cu att tria promotorului respectiv este mai mare, adic cu att ARN polimeraza se va ataa mai strns i cu att gena respectiv va fi transcris cu o rat mai ridicat. Cei 2 hexameri din promotori sunt recunoscui de subunitatea a ARN polimerazei, iar la elementul UP se ataeaz subunitatea -CTD a acestei enzime.

Figura 4.18 Structura promotorilor la procariote.

4.2.3.2 Terminatori

Transcrierea genetic continu de la promotori pn la terminatori. Acetia reprezint regiuni din molecula ADN ce prezint o anumit secven de nucleotide : - 2 copii ale unei secvene poli-GC n repetiie invers; aceast regiune prezint complementaritate intracatenar i determin formarea n transcriptul ARN a unei structuri n ac-de-pr (hairpin) ce mpiedic avansarea ARN polimerazei - o regiune format din 4 10 adenine (ce corespunde pe transcript cu 4 10 resturi de uracil) care reprezint semnalul propriu-zis de terminare a transcrierii Dei regiunile terminator sunt identificate pe molecula ADN, terminarea transcrierii este de fapt realizat de catena ARN (Figura 4.19). 75

Proiectul pentru nvmntul Rural

Funciile materialului genetic

Pn n prezent au fost identificate 2 clase de terminatori la procariote : - terminatori Rho independeni : sunt regiuni de tip terminator n care cele 2 secvene poli-GC prezint complementaritate intracatenar perfect, realiznd o structur n ac-de-pr stabil - terminatori Rho dependeni : sunt regiuni terminator n care cele 2 poli-GC nu prezint complementaritate intracatenar perfect; n acest caz structura n ac-de-pr este stabilizat de ctre o protein numit proteina Rho (de la litera greceasc Rho - ) care alunec pe molecula ARN pn la acul-de-pr i l stabilizeaz.

Figura 4.19 Structura terminatorilor la procariote.

Teste de autoevaluare TA 18. Refacei n schema de mai jos structura unui promotor de la procariote :

4.2.3.3 ARN polimeraza de la procariote

Aceast enzim este una dintre cele mai mari proteine din celula bacterian, avnd o greutatea de 480 kd, un diametru de aproximativ 100 Angstromi i fiind vizibil i la microscopul electronic. O celul de E.coli conine n medie 7000 de molecule de ARN polimeraz. Holoenzima este format din 4 tipuri de subuniti: , b, b i . Subunitatea este dimerizat, formula general a enzimei fiind 2 .
Proiectul pentru nvmntul Rural

76

Funciile materialului genetic

Subunitatea este codificat de gena rpoA i este dimerizat. Ea are un prim rol n asamblarea tuturor subunitilor enzimei, proces ce se desfoar n ordinea: 2 2- 2-- 2--. Fiecare monomer de este format din 3 regiuni: CTD reprezint domeniul carboxi-terminal al subunitii i se ataeaz direct la ADN, recunoscnd secvena UP din structura promotorilor. NTD reprezint domeniul amino-terminal al subunitii ; nu se ataeaz direct la ADN, ci la subunitatea - linker polipeptidic ce are o structur flexibil i face legtura dintre cele 2 domenii terminale Subunitatea este codificat de gena rpoB i realizeaz formarea propriu-zis a legturilor fosfo-diesterice ntre ribonucleotide, acest proces desfurndu-se ntotdeauna n direcie 5 3. Subunitatea este codificat de gena rpoC i are rol n ataarea iniial, situs-nespecific a ARN polimerazei la molecula de ADN (Figura 4.20). Teste de autoevaluare TA 19. Precizai rolul subunitilor ARN polimerazei de la procariote : Subunitatea .......................................................................................... Subunitatea ............................................................................................ Subunitatea ............................................................................................ Subunitatea ..............................................................................................

Subunitatea

Celula procariot conine mai multe specii moleculare de subunitate , fiecare recunoscnd anumii promotori i, deci, transcriind anumite gene. Astfel, n celula de E.coli, cele mai des ntlnite specii moleculare de sunt: 70 are o g.m. de 70 kd i codificat de gena rpoD; acest recunoate cele 2 secvene consensus TTGACA i TATAAT, fiind folosit de celula bacterian n condiii generale de mediu. Ca urmare, marea majoritate a genelor bacteriene sunt transcrise cu ajutorul acestei subuniti 70. 60 are g.m. 60 kd, este codificat de gena rpoN i este folosit de celul n condiii de privare de azot. 32 are g.m. de 32 kd, este codificat de gena rpoH i este folosit de celul n condiii de oc termic; cu ajutorul acestei subuniti sunt transcrise genele de oc termic. 24 are g.m. 24 kd, nu este cunoscut gena codificatoare i este folosit de celul n condiii de oc termic extrem; se pare c 24 particip la transcrierea unui set de gene ce determin o moarte celular programat, o sinucidere celular (asemntoare proceselor de apoptoz de la celulele eucariote). 77

Proiectul pentru nvmntul Rural

Funciile materialului genetic

Teste de autoevaluare TA 20. Cte tipuri de subunitate are o celul de Escherichia coli i n ce condiii le folosete ? .......................................................................................................... .......................................................................................................... .......................................................................................................... ..........................................................................................................

Figura 4.20 Reprezentarea schematic a atarii ARN polimerazei procariote la promotori.

4.2.3.4 Fazele transcrierii genetice la procariote Ca i alte procese realizate de materialul genetic, transcrierea genetic se desfoar n 3 etape iniierea, elongarea i terminarea transcrierii. Iniierea transcrierii Aceast etap ncepe prin ataarea ARN polimerazei la un promotor, proces ce se desfoar el nsui n mai multe etape: a) etapa de promotor nchis I ARN polimeraza se ataeaz la hexamerul -35 b) etapa de promotor nchis II (promotor curbat) ARN polimeraza se ataeaz apoi i la hexamerul -10; cei 2 hexameri nu sunt ns orientai steric optim fa de situsurile de ataare la ARN polimeraz (i anume la subunitatea s); ca urmare, pentru a se ataa la amndoi hexamerii, enzima trebuie s distorsioneze molecula de ADN; deci, promotorul curbat prezint o tensiune torsional ce va fi eliberat prin deschiderea dublului helix pe o distan de 10 18 pb, ajungndu-se astfel n cea de-a treia etap, cea de c) etapa de promotor deschis; se formeaz astfel bucla de transcriere care depete situsul START (nucleotidul +1 al catenei matri) Se formeaz astfel un complex binar: ADN ARN polimeraz. Iniierea transcrierii continu cu ataarea primului nucleotid, care de obicei la procariote este ATP sau GTP. Complexul devine astfel din binar, ternar: ADN ARN polimeraz ARN. Dup sinteza a aproximativ 8-10 ribonucleotide, subunitatea se desprinde din complex, considerndu-se c acest eveniment ncheie etapa de iniiere a transcrierii.
Proiectul pentru nvmntul Rural

78

Funciile materialului genetic

Elongarea

Aceast etap ncepe dup desprinderea subunitii i este realizat de subunitatea care formeaz legturi fosfo-diesterice ntre ribonucleotide. Catena ARN crete n direcia 5 - 3. Odat cu ARN polimeraza, i bucla de transcriere se deplaseaz pe molecula de ADN, transcriptul rmnnd n hibrid cu matria ADN doar pe o poriune de aproximativ 12 nucleotide. Rata de polimerizare a ARN polimerazei de la E.coli este de circa 30 40 nucleotide per secund. Frecvena erorilor de ncorporare (a ribonucleotidelor greit mperecheate cu cele din catena matri ADN) de ctre aceast enzim este de 1 baz greit per 104 baze ncorporate. Dup ce ARN polimeraza a trecut de promotor, o alt enzim (cu tot cu subunitate ) se poate ataa la acesta i poate ncepe o nou rund de transcriere. Terminarea transcrierii are loc n momentul n care ARN polimeraza ajunge n regiunea unui terminator. Acul-de-pr format n catena transcriptului (vezi figura 4.18) blocheaz avansarea enzimei i o determin s staioneze cteva milisecunde; acest timp este ns suficient pentru ca transcriptul s se desprind din hibridul cu catena ADN matri (desprinderea este facilitat i de faptul c legturile dintre poli-A de pe ADN i poli-U din ARN sunt slabe). Bucla de transcriere se nchide i astfel procesul este ncheiat. Moleculele de ARN transcript pot evolua fie ca ARN mesager, ARN ribozomal, ARN de transfer. Majoritatea moleculelor de ARNm de la procariote sunt monocistronice i sunt alctuite din 3 regiuni mai importante : - regiunea cap (leader), care conine secvena SHINEDALGARNO (5-AGGAGG3) ce este complementar cu un hexamer de la capul 3 al moleculelor de ARNr de 16S - regiunea codificatoare, care ncepe cu codonul start AUG i se termin cu un codon stop - regiunea cozii

Terminarea

4.2.4 Transcrierea la eucariote


4.2.4.1 ARN polimerazele la eucariote n sine, procesul de transcriere la organismele eucariote se desfoar n mod similar cu cel de la procariote. Exist totui o serie de diferene. Astfel, n timp ce la procariote exist o singur specie molecular de ARN polimeraz per celul, la eucariote exist, n majoritatea cazurilor 3 specii moleculare de asemenea enzime. Cele 3 ARN polimeraze de la eucariote sunt nrudite i structural i funcional. Cu toate acestea, cele 3 enzime iniiaz transcrierea de la promotori diferii i transcriu gene diferite : - ARN polimeraza I transcrie n mod special gene ce codific pentru ARN ribozomal - ARN polimeraza II transcrie mai ales gene ce codific ARN mesager
Proiectul pentru nvmntul Rural

79

Funciile materialului genetic

- ARN polimeraza III transcrie mai ales ARN de transfer i o serie de molecule mici de ARN, de exemplu ARN nuclear mic i nucleolar mic Alte diferene importante apar i n ceea ce privete factorii de transcriere. Astfel, dac la procariote iniierea transcrierii necesit doar factorul , la eucariote debutul acestui proces necesit mai multe proteine, denumite generic factori de transcriere generali. n general, structura promotorilor pentru ARN pol I i III este mai simpla dect a promotorilor pentru ARN pol II, dei i aceste 2 enzime necesit factori de transcriere. 4.2.4.2 Promotorul la eucariote Regiunile promotor la eucariote prezint o zon miez care cuprinde un set minimal de secvene necesare iniierii transcrierii de ctre ARN pol II. Un asemenea miez de promotor este de obicei format din 40 de nucleotide ce cuprind de multe ori i situsul START (nucleotidul +1) i este format din : - elementul BRE ce reprezint elementul de recunoatere a factorului de transcriere TFIIB (TFIIB Recognition Element) - cutia TATA la care se ataeaz factorul TBP (TATA Binding Protein); aceast protein reprezint de fapt o subunitate a factorului de transcriere TFIID - regiunea Inr (Iniiator) la care se ataeaz factorul TFIID - regiunea DPE (Downstream Promoter Element = elementul n aval fa de promotor) la care se ataeaz tot TFIID Cei mai muli promotori de la eucariote includ doar 2 sau 3 din aceste regiuni (Figura 4.21). Factorii de transcriere necesari ARN polimerazei II au fost notai TFII (Transcription Factors for RNA polymerase II). La eucariote se formeaz mai nti un complex proteic de preiniiere care se ataeaz la elementul TATA. Succesiunea de evenimente este urmtoarea : - elementul TATA este recunoscut de TFIID; aceast protein este un complex cu mai multe subuniti, dintre care una (TBP) se va lega la cutia TATA. - celelalte subuniti ale complexului TFIID poart numele de proteine TAF (TBP Associated Factors = factori asociai cu TBP) - TBP se leag la cutia TATA; prin legarea sa la cutia TATA, TBP distorsioneaz molecula de ADN n acea regiune determinnd recrutarea i a altor factori de transcriere i a ARN polimerazei - TFIIA i TFIIB se ataeaz la promotor - TFIIF se cupleaz cu ARN polimeraza i mpreun se ataeaz la promotor - TFIIE i TFIIH se ataeaz i ei la ntreg acest complex nucleo-proteic Ca urmare a atarii acestor proteine, dublul helix se deschide n zona promotorului. Spre deosebire de procariote, la eucariote deschiderea dublului helix necesit energie (furnizat prin hidroliza ATP) iar procesul este mediat de activitatea de tip helicaz a factorului TFIIH Sinteza catenei ARN poate acum s nceap.
Proiectul pentru nvmntul Rural

4.2.4.3 Complexul de pre-iniiere

80

Funciile materialului genetic

Figura 4.21 Structura unui promotor la eucariote.

Figura 4.22 Factorii generali de transcriere pentru ARN polimeraza II Factori generali de transcriere Numrul de subuniti

TBP TFIIA TFIIB TFIIE TFIIF TFIIH proteine TAF

1 2 1 2 3 9 11

Caseta 4. ....Rolul celorlalte proteine GTF Proteinele TAF se asociaz cu factorul TBP, mediind ataarea acestuia la cutia TATA. TFIIB se pare c mediaz legtura dintre complexul TBP-TATA i ARN polimeraz. TFIIF modific conformaia steric a ARN polimerazei facilitnd ataarea acesteia la promotor. TFIIE l aduce pe TFIIH i i regleaz activitatea. TFIIH desface legturile de hidrogen dintre cele 2 catene ADN, cu formarea buclei de transcriere. S-a constatat c in vivo iniierea transcrierii la eucariote necesit i alte proteine n afar de cele listate mai sus, inclusiv un aa-numit complex mediator, a crui funcie rmne deocamdat necunoscut.

Teste de autoevaluare TA 21. Ce tipuri de gene transcriu ARN polimerazele de la eucariote ? ARN polimeraza I ................................................................................ ARN polimeraza II .............................................................................. ARN polimeraza III ..............................................................................

Proiectul pentru nvmntul Rural

81

Funciile materialului genetic

4.2.4.4 Factorii de elongare

n aceast etap, ARN polimeraza II se desprinde de marea majoritate a factorilor de iniiere. Locul lor este luat de un set de factori de elongare (TFIIS, TEF). Astfel, TFIIS asigur ncorporarea corect a ribonucleotidelor i corecteaz bazele ncorporate greit (funcie de proofreading). Factorul TEF fosforileaz anumite reziduuri de serin din structura ARN polimerazei II, fapt ce stimuleaz etapa de elongare. Pe de alt parte, n timpul etapei de elongare, ARN polimeraza se asociaz cu o serie de proteine necesare pentru procesarea tipurilor de ARN transcript. - enzime ce adaug la capul 5 al transcriptului un rest de guanin metilat, ceea ce i va conferi transcriptului rezisten la enzime de tip nucleaze i se ataeaz la structura ribozomului - enzime ce produc poliadenilarea captului 3: enzime de tip poli-A polimeraze adaug o coad de pn la 200 de resturi de A la capul 3 al transcriptului; ataarea unei asemenea enzime pare s fie implicat n terminarea transcrierii

4.3 LUCRARE DE VERIFICARE 4


I. ncercuii litera corespunztoare variantei corecte de rspuns: 1. Topoizomerazele: a) replic cromozomul bacterian b) modific gradul de rsucire a ADN c) replic cromozomii la eucariote 2. Primaza este enzima care: a) sintetizeaz fragmente Okazaki b) sintetizeaz ADN c) sintetizeaz primeri 3. Rolul primerilor n replicarea ADN este: a) ofer capul 3-OH pentru polimerizare b) ofer capul 5-OH pentru polimerizare c) ofer capul 5-P pentru polimerizare 4. Fragmentele Okazaki sunt sintetizate: a) pe catena conductoare b) pe catena ntrziat c) pe ambele catene 5. ADN polimeraza III de la bacterii desfoar urmtoarele activiti: a) polimerizare 5-3 b) exonucleaz 5-3 i 3-5 c) toate cele trei activiti 82
Proiectul pentru nvmntul Rural

Funciile materialului genetic

6. Replicarea plasmidelor lineare cu telomere invertroni: a) este primat de proteine b) este primat de ARN c) este primat de glucide 7. n replicarea plasmidelor prin mecanism theta, proteina iniiator este: a) ARN polimeraza b) Proteina Rep c) ADN polimeraza 8. n transcriere, catena ADN matri este denumit: a) caten antisens b) caten sens c) caten consens 9. ARN polimeraza de la procariote conine: a) 2 tipuri de subuniti b) 4 tipuri de subuniti c) 6 tipuri de subuniti 10. ARN polimeraza se ataeaz specific la: a) situsuri Rep b) terminatori c) promotori Total: 20 puncte (cte 2 puncte pentru fiecare item) II. Completai spaiile goale cu noiunile corespunztoare: Terminarea transcrierii la procariote este realizat de ....................., care formeaz structuri de tip .......................... . ARN polimeraza I de la eucariote transcrie gene ce codific pentru .............................., ARN polimeraza II pentru .............................., iar ARN polimeraza III pentru ........................... Total: 10 puncte (cte 2 puncte pentru fiecare noiune) III. Rspundei pe scurt (1-2 fraze) la urmtoarele ntrebri: 1. Care este rolul secvenelor ter i al proteinelor Tus n replicarea cromozomului la Escherichia coli ? 2. Care este rolul factorilor de transcriere n iniierea acestui proces la eucariote ? 3. Corelai, din text i figur, rolul proteinelor active ntr-o bifurcaie de replicare ADN Total: 30 puncte (cte 10 puncte pentru fiecare noiune) IV. Realizai pe maximum 2 pagini un eseu n care s comparai procesul de transcriere, etapele, promotorii i enzimele implicate, la procariote i eucariote, evideniind asemnrile i deosebirile. Se puncteaz structurarea eseului, claritatea argumentelor, folosirea limbajului adecvat. Total: 30 puncte (cte 10 puncte pentru fiecare cerin) Total general: 90 puncte + 10 puncte din oficiu = 100 puncte

Proiectul pentru nvmntul Rural

83

Funciile materialului genetic

4.4 RSPUNSURI LA TESTELE DE AUTOEVALUARE Unitatea de nvare 4


TA 4.1 TA 4.2 TA 4.3 TA 4.4 TA 4.5 TA 4.6 TA 4.7 TA 4.8 iniiere, elongare, terminare b b d c b a primaza, n, n, n, DnaA, DnaB, DnaC, DnaT TA 4.9 a TA 4.10 c TA 4.11 b TA 4.12 b TA 4.13 a TA 4.14 b TA 4.15 vezi subcap. 4.2.1 TA 4.16 vezi subcap. 4.2.1 TA 4.17 c TA 4.18 vezi figura 4.18 TA 4.19 vezi subcap. 4.2.3.3 TA 4.20 vezi subcap. 4.2.3.3 TA 4.21 vezi subcap. 4.2.4.1

4.5 BIBLIOGRAFIE RECOMANDAT


1. Cornea C.P., 1998, Elemente de Inginerie Genetic, Editura ALL, Bucureti. 2. Covic M., tefnescu D., Sandovici I., 2004, Genetic medical, Editura Polirom. 3. Gavril L., 2003, Genomica Un tratat despre genom, de la virusuri la om, vol.I i vol.II, Editura Enciclopedic, Bucureti. 4. Vassu T., Stoica I., Cstuak O., Muat F., 2001, Genetica microorganismelor i Inginerie genetic microbian. Note de curs i Tehnici de laborator. Editura Petrion, Bucureti.

84

Proiectul pentru nvmntul Rural

Introducere n microbiologie

Unitatea de nvare 5

INTRODUCERE N MICROBIOLOGIE

Cuprins:
Cuprins Obiectivele Unitii de nvare 5 5.1 Istoricul i obiectivele microbiologiei 5.1.1. Istoricul microbiologiei 5.1.2.Clasificarea microorganismelor 5.1.3.Scopul i importana microbiologiei 5.1.4 Rezumatul capitolului 5.1 5.2 Structura celulei procariote 5.2.1. Mrime i form 5.2.2. Organizarea general a celulei procariote 5.2.3. Membranele celulei procariote 5.2.4. Citoplasma 5.2.5. Nucleoidul 5.2.6. Peretele celular 5.2.7. Componentele externe ale peretelui celular 5.2.8. Chemotaxia 5.2.9. Endosporul bacterian 5.2.10 Rezumatul capitolului 5.2 5.3. Celulele procariote versus celulele eucariote 5.3.1. Caracteristicile generale ale celulei eucariote 5.3.2. Comparaie ntre celulele procariote i eucariote 5.3.3. Rezumatul capitolului 5.3 5.4. Lucrare de verificare 5 5.5. Rspunsuri i comentarii la testele de evaluare Unitatea de nvare 5 5.6 Bibliografie recomandat 85 85 86 86 87 90 92 92 92 93 95 97 99 100 104 107 109 111 112 112 113 115 116 118 118

Obiectivele Unitii de nvare 5 s explici importana microbiologiei pentru societatea uman; s enumeri i s caracterizezi componentele celulei procariote; s analizezi relaia dintre particularitile diferitelor componente ale celulei eucariote i rolul pe care l ndeplinesc; s identifici principalele deosebiri dintre celula procariot i cea eucariot.

Proiectul pentru nvmntul Rural

85

Introducere n microbiologie

5.1

Istoricul i obiectivele microbiologiei

Acest capitol descrie etapele dezvoltrii microbiologiei ca tiin, precum i relaiile pe care aceasta le are cu medicina i cu alte domenii. Se prezint o trecere n revist a lumii microorganismelor, precum i scopul i relevana microbiologiei n context contemporan.

5.1.1 Istoricul microbiologiei Microbiologia studiaz organisme care, n mod obinuit, nu sunt vizibile cu ochiul liber, deoarece dimensiunile lor sunt extrem de reduse. Din aceast categorie fac parte virusuri, bacterii, alge, fungi i protozoare. Cu toate acestea, unele dintre aceste organisme, respectiv unele alge i unii fungi au dimensiuni mai mari. nainte de descoperirea microorganismelor, savani, precum filozoful grec Lucretius (cca 9855 .Hr.) sau medicul Girolamo Fracastoro (1478-1553), au presupus c unele boli erau cauzate de creaturi invizibile. Primul care a observat i descris microorganismele, folosind un microscop cu o putere de mrire de 50 pn la 300 de ori, a fost Antony van Leeuwenhoek. Descoperirea sa a readus n discuie teoria generaiei spontane, care susinea c organismele vii se pot dezvolta din materie nevie. Unii considerau c microorganismele pot apare spontan, iar organismele mai mari nu. Louis Pasteur (1822-1895) i John Tyndall (1820-1893) au pus capt controversei dintre adepii i criticii teoriei generaiei spontane, dovedind c microorganismele pot crete numai dup inoculare pe medii de cultur. Aceleai medii pstrate sterile nu genereaz apariia microorganismelor. Pornind de la Pasteur, microbiologia utilizeaz, n afar de microscopie de diferite tipuri, o serie tehnici speciale cum sunt tehnicile de sterilizare i mediile de cultur. Diversificarea tehnicilor a permis recunoaterea rolului pe care l joac microorganismele n apariia unor boli (vezi Caseta 1). Caseta 1 Relaia microorganisme - maladii Prima demonstraie direct cu privire la implicarea unui microorganism n producerea unei boli a fost fcut de medicul german Robert Koch (1843-1910). Acesta a injectat oareci sntoi cu material prelevat de la animale bolnave de antrax i a cultivat, n acelai timp, un fragment de splin provenit din aceeai surs i care coninea Bacillus anthracis n ser bovin. Dup ce bacilii au crescut, s-au reprodus i au produs spori au fost injectai la oareci sntoi. n ambele situaii acetia s-au mbolnvit de antrax, dovedind relaia cauzal direct dintre antrax i Bacillus anthracis.

86

Proiectul pentru nvmntul Rural

Introducere n microbiologie

ncepnd din secolul XIX cercettorii s-au preocupat de rolul pe care l au microorganismele n transformrile materiei organice i anorganice. S-a demonstrat implicarea lor n procesele de fermentaie i n circuitele biogeochimice ale carbonului, azotului i sulfului. Secolul XX a dus la diversificarea direciilor de studiu i a tehnicilor de lucru n acest domeniu deosebit de important, microbiologii aducndu-i o important contribuie la dezvoltarea geneticii i biologiei moleculare. Microorganismele au fost intens folosite n cercetri privind codul genetic, sinteza acizilor nucleici i a proteinelor, reglarea exprimrii genelor i controlul activitii enzimatice. De asemenea, descoperirile din domeniul microbiologiei au dus la dezvoltarea tehnologiei ADN recombinant i a ingineriei genetice.

Teste de autoevaluare TA 5.1 Denumii tehnicile care au dovedit incorectitudinea teoriei generaiei spontane. ................................................................................................................. ................................................................................................................. ................................................................................................................. TA 5.2 Enumerai 3 contribuii ale microbiologiei n dezvoltarea biologiei moleculare. ................................................................................................................. ................................................................................................................. .................................................................................................................

5.1.2. Clasificarea microorganismelor Iniial, microorganismele au fost clasificate fie ca plante, fie ca animale. n 1857 Carl von Nageli a propus plasarea bacteriilor i fungilor n regnul Plantae. n 1866, E. Haeckel propune regnul Protista, care include organisme lipsite de nucleu (bacteriile), precum i unele organisme nucleate ca protozoare, alge i fungi. Cu toate acestea, n urmtorii 100 de ani biologii continu s plaseze bacteriile i fungi n regnul Plante. Termenul de procariote a fost introdus n 1937 de E. Chatton, n scopul diferenierii organismelor lipsite de nucleu de celulele nucleate ale plantelor i animalelor. De abia n 1961, R. Stanier va caracteriza procariotele drept celule care posed material nuclear (nucleoplasm) lipsit de membran nuclear. n 1969, Robert H. Whittaker a propus o clasificare ce stipuleaz c procariotele sunt strmoii eucariotelor, altfel spus, eucariotele au evoluat dintr-o celul procariot care s-a dezvoltat n alt celul procariot ca endosimbiont. Relaia endosimbiont este demonstrat de similitudinea dintre celulele procariote i organitele eucariote. 87

Proiectul pentru nvmntul Rural

Introducere n microbiologie

n sistemul de clasificare propus, toate procariotele sunt incluse n regnul Procariota, sau Monera, iar eucariotele sunt cuprinse n celelalte patru regnuri, care se deosebesc de primele prin necesiti nutriionale, pattern-ul de dezvoltare, difereniere tisular i prezena a 9+2 flageli. Regnul Fungi conine organisme eucariote, predominant multinucleate, cu nucleii dispersai ntr-un miceliu cu perete celular septat. Regnul Protista nu este omogen i este greu de definit. Protistele sunt eucariote cu organizare unicelular, fie izolate sau sub form de colonii, lipsite de esut adevrat. Prezint nutriie absorptiv sau fotoautotrof, n aceast categorie intrnd microorganisme cunoscute sub denumirea de alge, protozoare i muli dintre fungi simpli. Acest sistem cu cinci regnuri nu este acceptat de toi microbiologii, micologii incluznd toi fungi n regnul Fungi. O versiune modificat a acestui sistem propus iniial de Robert H.Whittaker este prezentat n Figura 5.1. Includerea bacteriilor n Procariota s-a fcut pe baza observaiilor microscopice, dar noile studii de biologie molecular i biochimie au evideniat existena a dou tipuri de celule procariote: eubacterii i archaebacterii. n 1978 C.R Woese a propus ca toate organismele sa fie clasificate n categorii superioare regnului denumite domenii. Astfel, el mparte lumea vie n trei domenii: Bacteria, Archaea i Eukarya (Figura 5.2). Toate eucariotele (protistele, fungii, plantele i animalele) din sistemul Whittaker trebuie incluse n al treilea domeniu denumit Eucarya. Tabelul din Figura 5.3 prezint principalele caracteristici ale celor trei domenii ale vieii. Archaebacteriile difer de eubacterii printr-o serie de caracteristici, precum lipsa peptidoglicanului din peretele celular, supravieuirea n condiii extreme i prezena unui proces metabolic neobinuit. Archaebacteriile cuprind trei regnuri, cu urmtoarele caracteristici: tipul metanogen, strict anaerob; produc metan (CH4) din dioxid de carbon i hidrogen, extrem halofile care necesit concentraii ridicate de sruri pentru supravieuire i termoacidofile, care cresc normal n condiii de aciditate i temperatur ridicat. Iniial s-a crezut c arheobacteriile sunt cele mai primitive microorganisme, n timp ce eubacteriile sunt nrudite cu eucariotele. Microbiologii studiaz n principal reprezentanii domeniilor Bacteria i Archaebacteria, precum i microorganisme aparinnd domeniului Eukaria, respectiv din regnurile Protista, Fungi i unele specii de alge.

Particularitile arheobacteriilor

88

Proiectul pentru nvmntul Rural

Introducere n microbiologie

Figura 5.1 Cele 5 regnuri ale lumii vii. Acest sistem de clasificare mparte lumea vie n 5 regnuri, unul procariot (Monera, bacteriile) i 4 eucariote (Protista, Fungi, Plantae i Animalia) (dup Campbell, 1993).

Figura 5.2 Arbore filogenetic universal construit prin analize comparative de secvene ARNr 16S (dup Woese, 2000).

Proiectul pentru nvmntul Rural

89

Introducere n microbiologie

Figura 5.3. Compararea celor trei domenii ale vieii

Caracteristica Anvelopa nuclear Organite celulare Peptidoglicani n peretele celular ARN polimeraze Amino-acidul iniiator al sintezei proteice Introni (pri necodificatoare ale genelor) Rspuns la antibiotice Histone asociate cu ADN Cromozom circular Capacitatea de a crete la temperaturi mai mari de 1000C Bacteria Absent Absente Prezent un singur tip formil-metionina Rari inhibarea creterii Absente Prezent Nu

Domeniul Archea absent absente absent cteva tipuri metionina prezeni la unele gene cretere neinhibat prezente prezent la cteva specii

Eukarya prezent prezente absent cteva tipuri metionina prezeni cretere neinhibat prezente absent nu

Teste de autoevaluare TA 5.3 Stabilii dou deosebiri ntre sistemul de clasificare a lui Whittaker i cel al lui Woese? .................................................................................................................... .................................................................................................................... .................................................................................................................... TA 5.4 Enumerai trei caracteristici ale arheobacteriilor. .................................................................................................................... .................................................................................................................... .................................................................................................................... 5.1.3. Scopul i importana microbiologiei Microorganismele sunt foarte diverse, se gsesc pretutindeni i afecteaz societatea uman n nenumrate moduri. Astfel, microbiologia modern este o disciplin vast, cu numeroase specialiti; are mare impact n medicin, agricultur i industria alimentar, ecologie, genetic, biochimie i numeroase alte domenii. Microbiologia are att caracter teoretic, ct i aplicativ. Numeroi microbiologi sunt n principal interesai de biologia microorganismelor i se ocup de un anumit grup; se disting astfel domenii ca virusologia, bacteriologia, algologia, micologia sau protozoologia. Ali cercettori se ocup de aspecte legate de procese funcionale particulare, abordnd citologia microbian, fiziologia microbian, genetica microorganismelor, biologia molecular i 90
Proiectul pentru nvmntul Rural

Introducere n microbiologie

taxonomia molecular. Aspectele aplicative fac obiectul unor domenii ca microbiologia medical sau industrial. Deoarece diferitele domenii sunt interconectate, cercettorii care se ocup de aspectele aplicative trebuie s posede cunotine teoretice temeinice de taxonomie microbian, genetic, imunologie i fiziologie. Multe zone de interes sunt corelate cu sntatea public, care ncearc s controleze rspndirea maladiilor contagioase. De asemenea, n strns legtur cu aceste aspecte se afl i imunologia, care se ocup de modul n care sistemul imunitar protejeaz organismul mpotriva agenilor patogeni, precum i de natura i tratamentul alergiilor i maladiilor autoimune. Imunologia este un domeniu n plin dezvoltare; de exemplu tehnicile de producere i folosire a anticorpilor monoclinali au evoluat foarte rapid. Microbiologia agricol se ocup de impactul microorganismelor n agricultur, att n calitate de ageni patogeni, ct i ca substitueni ai pesticidelor sau pentru creterea fertilitii solului. Ecologia microbian studiaz relaiile dintre microorganisme i habitatul lor, implicarea n circuitele biogeochimice i aspecte legate de poluare. n acest scop, microorganismele sunt, n prezent, foarte utile n bioremediere. Un domeniu cel puin la fel de important ca cele enumerate anterior este microbiologia industrial care utilizeaz anumite abiliti ale microorganismelor pentru producerea de alimente sau ali produi ca: antibiotice, vaccinuri, alcooli, solveni, vitamine, aminoacizi i enzime. Genetica microorganismelor i biologia molecular se focalizeaz pe natura informaiei genetice, pe reglarea dezvoltrii i funcionrii celulelor i a organismelor. Folosirea microorganismelor a fost foarte util pentru nelegerea a numeroase aspecte legate de funcionarea genelor. Cu ajutorul tehnologiei ADN recombinant i al ingineriei genetice, microbiologia se va dezvolta i pe viitor, chiar mai rapid dect pn acum.

Teste de autoevaluare
TA 5.5 Descriei cu cuvintele voastre, n maximum 10 rnduri, implicarea microbiologiei n domeniul sntii publice i n industrie. ..................................................................................................................... ..................................................................................................................... ..................................................................................................................... ..................................................................................................................... ..................................................................................................................... ..................................................................................................................... ..................................................................................................................... ..................................................................................................................... .................................................................................................................... ..................................................................................................................... ..................................................................................................................... ....................................................................................................................
Proiectul pentru nvmntul Rural

91

Introducere n microbiologie

5.1.4 Rezumatul capitolului 5.1 Microbiologia se definete prin mrimea organismelor studiate i prin tehnicile folosite. Antony von Leeuwenhoek a fost primul care a observat microscopic microorganismele. Teoria generaiei spontane a fost dezaprobat de Pasteur, Tyndall i alii. Koch a adus dovada corelaiei dintre microorganisme i anumite maladii. Exist cel puin 5 regnuri n lumea vie. Microbiologii studiaz n principal reprezentanii domeniilor Bacteria i Archeobacteria, precum i microorganisme aparinnd domeniului Eukaria, respectiv din regnurile Protista, Fungi i unele specii de alge. Microbiologia include o mare varietate de domenii care au un mare impact asupra societii. Sunt incluse unele domenii cu caracter aplicativ evident ca domeniul medical, al sntii publice, industrie, alimentaie. Ecologia microorganismelor, fiziologia, biochimia i genetica sunt domenii fundamentale de cercetare n microbiologie.

5.2 Structura celulei procariote


Capitolul prezint n detaliu componentele celulei procariote. n introducere, dup descrierea ctorva aspecte de morfologie, se face o trecere n revist a tuturor constituenilor celulari, n corelaie cu funcia pe care acetia o ndeplinesc. 5.2.1. Mrime i form Dei numeroase bacterii sunt asemntoare din punct de vedere al morfologiei, totui din punct de vedere al mrimii i formei se ntlnete o varietate destul de mare (Figura 5.4). Cele mai frecvent ntlnite forme de microorganisme sunt fie coci fie bacili. Cocii au form sferic i pot exista ca celule individuale, sau asociai n perechi de coci (Diplococcus sp.), n lanuri (Streptococcus sp.), n ciorchini (Staphylococcus sp.), n tetrade (Micrococcus sp.) sau n pachete asemntoare cuburilor (Sarcina sp.). Bacilii sunt asemntori unor bastonae, exemplul tipic fiind Bacillus megaterium. Bacilii difer n ceea ce privete raportul lungime/lime. Unii sunt scuri i lai, semnnd mai degrab cu cocii, din care cauz se numesc cocobacili. Dei numeroi bacili sunt singuri, uneori pot rmne la un loc dup diviziunea celular sub form de perechi sau lanuri. Din categoria bacililor fac parte i vibrionii, care sunt asemntori cu o virgul. Cu toate c cei mai frecveni sunt cocii i bacilii, bacteriile pot avea o varietate mare de forme. Astfel, actinomicetele caracteristice formeaz filamente lungi, multinucleate sau hife, care se pot ramifica alctuind un miceliu. Alte bacterii sunt spiralate, fiind denumite spirili dac sunt rigide sau spirochete dac sunt flexibile. 92
Proiectul pentru nvmntul Rural

Introducere n microbiologie

Mrimea bacteriilor variaz la fel de mult ca i forma. Cele mai mici (de ex. unii membrii ai genului Mycoplasma) au ntre 100 i 200 nm n diametru, aproximativ mrimea celor mai mari virusuri (poxvirusurile). Escherichia coli, care este un bacil, are n medie ntre 1,1 i 1,5 m lungime, n timp ce alte bacterii pot atinge dimensiuni mult mai mari. Unele spirochete ajung uneori la 500 m n lungime, n timp ce cianobacteria Oscillatoria poate avea 7 m n diametru, la fel ca hematiile. Recent a fost descoperit n intestinul unui pete (Acanthurus nigrofuscus) o bacterie gigant (Epulopiscium fishelsoni), de 600 m lungime i 80 m lime. Este evident c unele bacterii depesc ca mrime media celulelor eucariote.

Figura 5.4 Diferite forme de bacterii.

5.2.2. Organizarea general a celulei procariote Celula procariot este destul de complex, fiind format din numeroase structuri ale cror funcii sunt rezumate n tabelul din Figura 5.5. Nu toate componentele sunt ns prezente la absolut toate genurile. Mai mult, exist diferene mari n ceea ce privete structura peretelui celular ntre bacteriile Gram- i Gram+. Cu toate aceste variaii celulele procariote sunt consecvente n privina celor mai importante componente i structura fundamental. Celule procariote sunt ntotdeauna mrginite de un perete celular. La interior, desprit de peretele celular printr-un spaiu periplasmatic se afl membrana plasmatic. Aceast membran poate fi invaginat, formnd o structur membranar intern simpl. Deoarece procariotele nu conin organite interne mrginite de membrane, interiorul celulei pare a fi simplu din punct de vedere morfologic. Materialul genetic este localizat ntr-o zon denumit nucleoid i nu este separat de citoplasma nconjurtoare printr-o membran. n matricea citoplasmatic se gsesc ribozomi i incluziuni celulare (Figura 5.6). Ambele tipuri de bacterii (Gram- i Gram+) pot folosi pentru deplasare flageli. De asemenea, numeroase celule procariote pot fi nconjurate de o capsul sau alt tip de strat situat n exteriorul peretelui celular. Celulele procariote sunt din punct de vedere morfologic mai simple dect celulele eucariote.
Proiectul pentru nvmntul Rural

93

Introducere n microbiologie

Figura 5.5. Funciile componentelor celulei procariote.

Componenta Membrana plasmatic

Vacuolele cu gaz Ribozomii Incluziunile Nucleoidul Spaiul periplasmic Peretele celular Capsule Fimbrii i pili Flageli Endospori

Funcia Barier permeabil selectiv, limit mecanic a celulei, locul unde se desfoar numeroase procese metabolice (respiraie, fotosintez), loc de receptare a semnalelor pentru chemotaxie Asigur plutirea n mediile acvatice Sinteza proteinelor Depozite de carbon, fosfai i alte substane Localizarea materialului genetic (ADN) Conine enzime hidrolitice i proteine de legtur pentru preluare i prelucrarea nutrienilor Determina forma celulei i asigur protecie mpotriva lizei celulare Asigur protecie fa de fagocitoz i aderena la suprafee Ataare la suprafee i n procesele de mperechere Mobilitate Supravieuire n condiii nefavorabile de mediu

Figura 5.6 Celula procariot imagine de ansamblu.

Teste de autoevaluare TA 5.6 Enumerai i descriei principalele forme de celule ntlnite la procariote. ....................................................................................................................... ....................................................................................................................... ....................................................................................................................... TA 5.7 Desenai o celul bacterian i marcai toate structurile importante.

94

Proiectul pentru nvmntul Rural

Introducere n microbiologie

5.2.3. Membranele celulei procariote Membranele sunt o cerin absolut pentru toate organismele vii. Celulele trebuie s interacioneze selectiv cu mediul lor, indiferent dac este vorba despre mediul intern al organismelor pluricelulare sau mediul extern. Celulele trebuie s fie capabile nu numai s achiziioneze nutrieni i s elimine produii de excreie, ci i s menin interiorul ntr-o stare constant, nalt organizat n condiiile mediului extern mereu schimbtor. Membrana plasmatic delimiteaz n egal msur citoplasma celulelor procariote i eucariote, reprezentnd punctul de contact cu exteriorul celulei. Membrana plasmatic Membranele sunt alctuite din proteine i lipide, dei proporia acestora variaz considerabil. Majoritatea proteinelor membranare sunt asimetrice din punct de vedere structural, avnd un capt polar hidrofil i unul nepolar hidrofob, din care cauz fac parte din categoria moleculelor amfipatice. Capetele polare interacioneaz cu apa n timp ce capetele hidrofobe sunt insolubile n ap i au tendina de a se asocia unele cu altele. Aceast proprietate permite lipidelor s formeze un dublu strat, n care capetele hidrofile sunt spre exterior, iar cele hidrofobe orientate spre interior. Majoritatea acestor lipide amfipatice sunt reprezentate de fosfolipide. Membranele celulelor procariote se deosebesc de cele ale celulelor eucariote prin lipsa sterolilor, cum este de exemplu colesterolul. Totui, numeroase membrane bacteriene conin molecule asemntoare sterolilor pentaciclici numite hepanoizi. Membranele a numeroase archeobacterii, spre deosebire de alte membrane bacteriene, sunt formate dintr-un monostrat lipidic. Membranele celulare sunt structuri cu grosime cuprins ntre 5 i 10 nm, fiind vizibile doar la microscopul electronic. Cel mai acceptat model, care s descrie complexitatea structurii membranei celulare este modelul mozaicului fluid a lui S.J. Singer i G. Nicholson. Acest model descrie prezena a dou categorii de proteine membranare: proteine periferice i proteine integrate (transmembranare). Proteinele periferice, reprezint 20-30% din totalul proteinelor membranare, sunt slab conectate cu membrana i pot fi uor ndeprtate. Restul de 70-80% sunt proteine integrate, care traverseaz membrana i din aceast cauz nu pot fi uor ndeprtate (Figura 5.7).

Figura 5.7 Modelul mozaicului fluid.

Se observ dublul strat lipidic, precum i proteinele integrate i cele periferice.


Proiectul pentru nvmntul Rural

95

Introducere n microbiologie

Proteinele integrate sunt la rndul lor molecule amfipatice, cu captul hidrofob n bistratul lipidic, iar cel hidrofil spre exterior. Ades, aceste proteine au ataate spre faa extern a membranei celulare carbohidrai, care se pare joac un rol destul de important. Structura membranei plasmatice este n deplin concordan cu funciile pe care le ndeplinete (vezi Caseta 2). Caseta 2 Funciile membranei plasmatice Membrana plasmatic a celulelor bacteriene ndeplinete nenumrate funcii. Menine integritatea citoplasmei, n special la celulele fr perete celular. Acioneaz ca o barier selectiv permeabil: permite trecerea pasiv a unor molecule sau ioni din interior spre exterior i invers i mpiedic trecerea altora. Unele substane, cum sunt unii nutrieni, excrete sau proteine secretate nu pot traversa membrana plasmatic dect cu ajutorul unui sistem de transport. Membrana plasmatic bacterian este locul n care se desfoar procese metabolice eseniale ca: respiraia, fotosinteza, sinteza lipidelor i a constituienilor peretelui celular. de asemenea, membrana conine molecule receptor speciale care detecteaz i rspund la diferite substane chimice din mediu. Este evident c membrana plasmatic este esenial pentru supravieuirea microorganismelor.

Sistemul intern de membrane Dei citoplasma bacterian nu conine organite membranare complexe cum sunt mitocondriile sau cloroplastele, s-a semnalat prezena ctorva tipuri de structuri membranare. n aceast categorie intr mezozomii (Figura 5.8), care sunt invaginri ale membranei plasmatice de form vezicular, tubular sau lamelar. Se ntlnesc att la bacteriile Gram+, ct i la bateriile Gram-, dei sunt mai evideni la primele. Cu toate c au fost destul de intens studiai, pn n prezent nu se cunoate rolul exact pe care l ndeplinesc mezozomii n celula procariot. Uneori pot fi ntlnii n dreptul peretelui despritor n timpul diviziunii celulare, iar alteori sunt ataai cromozomului bacterian. Astfel, mezozomii pot fi implicai n formarea peretelui celular sau n replicarea cromozomului bacterian i distribuia acestuia la celulele-fiice. De asemenea, pot fi implicai n procese secretorii.

Figura 5.8 Mezozom.

Se observ foarte bine nucleoidul i poziia mezozomului fa de nucleoid i fa de membrana plasmatic 96


Proiectul pentru nvmntul Rural

Introducere n microbiologie

Numeroase bacterii posed sisteme membranare interne diferite de mezozomi. La bacteriile fotosintetizante, cum sunt cianobacteriile i bacteriile purpurii, precum i la bacterii cu activitate respiratorie ridicat se pot ntlni numeroase pliuri ale membranei plasmatice, care iau form sferic sau tubular. Este posibil ca aceste pliuri membranare s ofere o suprafa sporit pentru desfurarea unei activiti metabolice intense. Teste de autoevaluare TA 5.8 ncercuii varianta corect de rspuns: 1. Membranele plasmatice bacteriene sunt formate din: a) lipide i fosfolipide c) proteine, fosfolipide i acizi nucleici b) steroli i proteine d) proteine i lipide n proporii variate. 2. Mezozomii sunt: a) similari mitocondriilor c) nvaginri ale membranei plasmatice b) organite celulare complexe d) caracteristici eucariotelor. TA 5.9 Enumerai trei funcii ale membranei plasmatice de la procariote. ..................................................................................................................... ..................................................................................................................... ..................................................................................................................... ..................................................................................................................... ..................................................................................................................... .....................................................................................................................

5.2.4. Citoplasma n citoplasma procariotelor nu se gsesc organite delimitate de membrane, similar celor de la eucariote. Matricea citoplasmatic este un complex de substane situate ntre membrana plasmatic i nucleoid, fiind format n proporie de 70% din ap. Membrana plasmatic i tot ceea ce se gsete n interiorul ei formeaz protoplastul; aadar, matricea citoplasmatic este parte component a protoplastului.. Incluziunile Matricea citoplasmatic conine o mare varietate de incluziuni organice i anorganice (Figura 5.6). Unele incluziuni, ca de exemplu granulele de polifosfat, de cianoficin i uneori de glicogen, sunt libere n citoplasma. Altele, ns, sunt mrginite de o membran monostratificat de 2,0 pn la 4 nm grosime. Din categoria incluziunilor nchise n membrane unistratificate fac parte granulele de poli--hidroxibutirat, de sulf, de glicogen, carboxizomii i vacuolele cu gaz. Incluziunile organice pot conine fie poli--hidroxibutirat, fie glicogen. ele reprezint rezerve de celulare de carbon, utile ca surs de energie i pentru biosinteze. De obicei, o specie are doar unul dintre aceti polimeri organici, dar la bacteriile purpurii se ntlnesc ambele tipuri de incluziuni.
Proiectul pentru nvmntul Rural

97

Introducere n microbiologie

Cianobacteriile au de asemenea dou tipuri de incluziuni organice: granule de cianoficin i carboxizomi. Granulele de cianoficin sunt formate din lanuri polipeptidice lungi, alctuite n proporii aproximativ egale de arginin i acid aspartic i reprezint depozite suplimentare de azot pentru bacterii. Carboxizomii se ntlnesc nu numai la cianobacterii, dar i la bacteriile nitrificatoare i la tiobacili i folosesc ca loc de depozitare a enzimei ribulozo-1,5difosfat-carboxilaza, enzim implicat n fixarea CO2. Unele dintre cele mai speciale incluziuni, sunt vacuolele cu gaz, prezente la numeroase cianobacterii, bacterii fotosintetizante purpurii i verzi i la alte cteva bacterii acvatice, precum Halobacterium i Thiothrix. Vacuolele cu gaz confer flotabilitate, permind bacteriilor s pluteasc lng sau la suprafaa apei. Vacuolele cu gaz rezult din agregarea a numeroase vezicule cu gaz, ale cror perei nu conin lipide, fiind formai n totalitate dintr-o singur protein, impermeabil pentru ap, dar permeabil pentru gazele atmosferice. Incluziunile anorganice sunt reprezentate de granule de polifosfat i granule de volutin. Ambele tipuri de incluziuni reprezint depozite de fosfat, un component important al acizilor nucleici. n unele celule acioneaz ca surs de energie pentru diferite reacii. Ribozomii Ribozomii sunt particule mici, libere n citoplasm sau slab ataate de membrana plasmatic (Figura 5.6). Au o structur complex, fiind alctuii din ARN (acid ribonucleic) i proteine. Ribozomii reprezint locul sintezei proteice. Ribozomii din matricea citoplasmatic sintetizeaz proteine care vor rmne n interiorul celulei, n timp ce ribozomii din apropierea membranei plasmatice sintetizeaz proteine destinate transportului spre exterior. Ribozomii procariotelor sunt mai mici dect ribozomii eucariotelor. Obinuit sunt denumii ribozomi 70S i au dimensiuni de 14 - 15 nm pe 20 nm, fiind formai din 2 subuniti de 50S i respectiv 30S. S reprezint unitatea Svedberg i msoar coeficientul de sedimentare, adic viteza de sedimentare n timpul centrifugrii. Coeficientul de sedimentare depinde de greutatea molecular, volumul i forma particulei. n general particulele mai mari i mai compacte au valoarea Svedberg mai mare. La eucariote se ntlnesc ribozomi 80S. n ciuda diferenelor, ambele tipuri de ribozomi, att de la procariote, ct i de la eucariote sunt formai din dou subuniti. Chaperonii moleculari Mult timp s-a considerat c proteinele adopt instantaneu structura conformaional final, fie n momentul sintezei, fie imediat dup finalizarea acesteia. Acum este evident c la realizarea conformaiei proteinelor, respectiv la procesul de mpachetare a lanurilor polipeptidice, contribuie nite proteine speciale, care au fost denumite chaperoni moleculari. Procesul a fost bine studiat la Escerichia coli, la care au fost identificai patru chaperoni (DnaK, DnaJ, GroEL i GroES), precum i o protein de stres GrpE. Fiecare dintre aceste molecule intervin n momente precise din cursul mpachetrii lanului polipeptidic n structura caracteristic. 98
Proiectul pentru nvmntul Rural

Introducere n microbiologie

Concentraia chaperonilor crete spectaculos cnd celulele sunt expuse la temperaturi ridicate sau la alte condiii de stres. Din aceast cauz numeroi chaperoni au fost denumii proteine de oc termic (heat-shock proteins) sau proteine de stres. Chaperonii ndeplinesc i alte funcii, cum este cea legat de transportul proteinelor prin membrane.

Teste de autoevaluare TA 5.10 Explicai rolul nveliului proteic al vacuolelor cu gaz. ....................................................................................................................... ....................................................................................................................... ....................................................................................................................... ....................................................................................................................... ....................................................................................................................... TA 5.11 Care dintre urmtoarele incluziuni citoplasmatice reprezint depozite suplimentare de fosfor? a) vacuolele cu gaz c) granulele de volutin b) granulele de cianoficin d) protoplastul. TA 5.12 Completai spaiile libere cu noiunile corespunztoare: Ribozomii sunt eseniali pentru.. Conform coeficientului de sedimentare, ribozomii procariotelor sunt ., iar cei ai eucariotelor . mpachetarea proteinelor n structuri conformaionale caracteristice se face cu ajutorul..

5.2.5. Nucleoidul Cea mai mare deosebire ntre celula procariot i cea eucariot este legat de materialul genetic. Eucariotele posed doi sau mai muli cromozomi, situai ntr-un nucleu delimitat de o membran nuclear. Spre deosebire de acestea, procariotele nu posed nucleu separat de restul citoplasmei printr-o membran nuclear. Cromozomul procariot este aproape ntotdeauna format din ADN dublu-catenar, circular, localizat ntr-o regiune numit nucleoid (Figura 5.6). O celul poate avea mai mult de un nucleoid atunci cnd diviziunea celular are loc dup duplicarea materialului genetic. n celule aflate n plin cretere, nucleoidul prezint prelungiri extinse n matricea citoplasmatic. Este posibil ca aceste prelungiri s conin ADN care este transcris activ n ARN mesager. Nucleoidul poate fi n contact fie cu membrana plasmatic, fie cu mezozomul, aceasta fiind o dovad a implicrii membranelor n repartizarea ADN-ului n celulele fiice. Din punct de vedere chimic, nucleoidul conine ADN (60%), ARN i cantiti mici de proteine. La Escherichia coli cromozomul bacterian are 1400 m, ceea ce nseamn c exist un mecanism eficient de mpachetare pentru a se adapta dimensiunilor nucleoidului. mpachetarea ADN cromozomial se face cu ajutorul proteinelor din nucleoid, care difer de histonele din nucleul celulelor eucariote.
Proiectul pentru nvmntul Rural

99

Introducere n microbiologie

Numeroase bacterii posed, alturi de cromozomul bacterian, i plasmide. Acestea sunt molecule circulare de ADN dublu-catenar, care pot exista i se pot replica independent de cromozom sau se integreaz n el. Plasmidele se pot transmite la descendeni. Ele nu sunt necesare pentru creterea i reproducerea celulei n care se afl, dei pot s conin gene care aduc gazdei un avantaj selectiv. Genele plasmidiale pot fi gene de rezisten la medicamente sau confer o nou caracteristic metabolic i nu n ultimul rnd pot transforma bacteriile n microorganisme patogene.

Teste de autoevaluare TA 5.13 Ce rol ndeplinesc prelungirile citoplasmatice ale nucleoidului. ................................................................................................................. ................................................................................................................. ................................................................................................................. TA 5.14 Care dintre componentele nucleoidului contribuie la mpachetarea cromozomului bacterian? ................................................................................................................. ................................................................................................................. ................................................................................................................. TA 5.15 Ce sunt plasmidele? ................................................................................................................. ................................................................................................................. .................................................................................................................

5.2.6. Peretele celular Peretele celular este una dintre cele mai importante componente ale celulei procariote. Cu excepia micoplasmelor i a ctorva arheobacterii, majoritatea bacteriilor au perete celular puternic, care le confer o anumit form i le protejeaz de liza osmotic (vezi Caseta 3). Peretele celular de la numeroase bacterii patogene are componente care contribuie la patogenitate. De asemenea, peretele celular poate asigura protecie mpotriva substanelor toxice i reprezint locul de aciune al ctorva antibiotice. Dup ce Christian Gram a realizat n anul 1884 tehnica de colorare care i poart numele (coloraia Gram) a devenit evident faptul c bacteriile pot fi mprite n dou grupuri majore, dup rspunsul la procedura Gram. Bacteriile Gram pozitive (Gram+) se coloreaz n violet, iar bacteriile Gram negative (Gram-) se coloreaz n roz sau rou (Figurile 5.9-5.10).

100

Proiectul pentru nvmntul Rural

Introducere n microbiologie

(A)

(B)

Figura 5.9 Culturi bacteriene colorate prin tehnica Gram. (A) Bacterii Gram+; (B) Bacterii Gram-

Figura 5.10 Coloraia Gram. Etapele procedurii de colorarea Gram. Se observ diferenele de culoare ntre cele dou tipuri de celule.

Diferenele structurale dintre aceste dou categorii de bacterii au devenit mai clare numai dup dezvoltarea microscopiei electronice. Peretele celular la bacteriile Gram+ const dintr-un singur strat de 20-80 nm grosime, format din peptidoglican (murein), n timp ce la bacteriile Gram-, structura peretelui celular este mai complex. El este alctuit dintr-un strat de peptidoglican, gros de 1-3 nm, nconjurat la exterior de o membran extern n grosime de 7-8 nm. De multe ori, aceste structuri exterioare membranei plasmatice sunt cunoscute sub denumirea de anvelop, care include nu numai peretele celular, ci i aa-numitele capsule (Figurile 5.11-5.12).
Proiectul pentru nvmntul Rural

101

Introducere n microbiologie

n mod frecvent, la bacteriile Gram-, ntre membrana plasmatic i membrana extern se observ un spaiu, denumit spaiu periplasmatic. Acest spaiu, uneori vizibil i la bacteriile Gram+, poate conine o reea lax de peptidoglican. De asemenea, acest spaiu conine numeroase enzime, implicate n multe procese metabolice i alte procese eseniale pentru celul. Recent descoperitele arheobacterii difer n numeroase privine de bacterii. Dei i ele pot fi Gram+ i Gram-, pereii celulari sunt foarte diferii n ceea ce privete structura i compoziia chimic. Pereii celulari nu conin peptidoglican i sunt alctuii din proteine, glicoproteine i polizaharide.

Figura 5.11 Diagram ce prezint comparativ structura peretelui celular la bacteriile Gram-pozitive i Gram-negative.

Figura 5.12 Structura peretelui celular la bacterii. (A) Bacterii Gram-negative. (B) Bacterii Gram-pozitive. Se observ diferene evidente n ceea ce privete structura peretelui celular la cele dou tipuri de bacterii.

102

Proiectul pentru nvmntul Rural

Introducere n microbiologie

Caseta 3 Peretele celular i protecia osmotic Peretele celular este necesar, n mod obinuit, pentru a proteja bacteria mpotriva destruciei datorate presiunii osmotice. Citoplasma bacterian este mai concentrat dect majoritatea habitatelor microbiene, care sunt hipotone. n timpul osmozei, apa traverseaz membranele plasmatice din soluiile mai diluate spre soluiile mai concentrate. Astfel, apa ptrunde n mod normal n celula bacterian, iar presiunea osmotic atinge 20 de atmosfere. Aceast presiune nu poate fi suportat de membrana plasmatic, care se umfl i este distrus printr-un proces numit liz. Dac habitatele microbiene sunt hipertone (adic sunt mai concentrate dect citoplasma), citoplasma se contract, iar acest fenomen este cunoscut sub denumirea de plasmoliz. Importana peretelui celuar n protecia bacteriilor mpotriva lizei osmotice poate fi demonstrat prin tratament cu lizozim sau penicilin. Lizozimul este o enzim care atac peptidoglicanul, iar penicilina inhib sinteza peptidoglicanului. Dac bacteriile sunt incubate cu penicilin n soluii izotone, bacteriile Gram+ sunt transformate n protoplati care continu s creasc normal, chiar dac le lipsete complet peretele celular. Bacteriile Gram-, dup tratament cu penicilin se transform n sferoplati, deoarece pstreaz unele pri din peretele celular. Protoplatii i sferoplatii sunt osmotic sensibili, iar dac sunt transferai n soluii diluate sunt lizai datorit influxului necontrolat de ap.

Dei majoritatea bacteriilor necesit pentru a supravieui perei celulari intaci, unele bacterii nu au deloc perete celular. De exemplu, micoplasmele nu au perete celular, dar pot totui s supravieuiasc n medii diluate sau terestre, deoarece au o membran plasmatic mai puternic dect n mod normal. Nu se cunoate exact ce determin acest fapt; este posibil ca aceast rezisten la variaii ale presiunii osmotice s se datoreze prezenei unor steroli n membrana plasmatic. Lipsa peretelui celular face ca micoplasmele s fie pleomorfice (adic s aib forme variate). Lipsa peretelui celular se ntlnete i la alte bacterii, denumite forme L, ele fiind parial sau total lipsite de perete celular, n timp prinii sunt fie bacterii Gram+, fie Gram-. Formele L sunt pleomorfice, la fel ca mioplasmele, i continu s se reproduc. Ele apar prin mutaii spontane sau ca urmare a unor tratamente (de exemplu, ca urmare a creterii n medii izotonice sau hipertonice, care conin penicilin). Dac nu mai rmn urme de peptidoglican, bacteriile nu l mai pot resintetiza, pentru c sinteza acestuia este dependent peretele celular preexistent. n aceast situaie formele L devin stabile i pot continua s creasc i s se reproduc, chiar dac tratamentul a ncetat. Alte forme L pot resintetiza peretele celular, dac ndeprtarea lui nu a fost complet. Formele L nu sunt nrudite cu micoplasmele i nu trebuie confundate cu ele.

Proiectul pentru nvmntul Rural

103

Introducere n microbiologie

Teste de autoevaluare TA 5.16 Identificai trei deosebiri n ceea ce privete structura peretelui celular ntre bacteriile Gram+ i bacteriile Gram-. .................................................................................................................... .................................................................................................................... .................................................................................................................... TA 5.17 Crei categorii de bacterii aparin formele L? .................................................................................................................... .................................................................................................................... ....................................................................................................................

5.2.7. Alte structuri externe asociate peretelui celular Bacteriile posed n exteriorul peretelui celular o varietate de structuri cu rol de protecie, implicate n aderare la diverse suprafee sau n mobilitatea celular. Capsule, straturi difuze i straturi S Unele bacterii posed nc un strat exterior peretelui celular. Dac acest strat este bine organizat i greu de ndeprtat este denumit capsul (Figura 5.13). Dac stratul este reprezentat de un material neorganizat este denumit strat difuz. Glicocalixul este o reea extins de polizaharide de la suprafaa bacteriei i care poate acoperi att capsulele, ct i stratul difuz (Figura 5.14). n mod normal, capsulele i straturile difuze sunt formate tot din polizaharide, dar pot fi alctuite i din alte materiale. De exemplu, Bacillus anthracis are capsula format din acid poli-D-glutamic.

Figura 5.13 Cultura bacterian la care se observ capsula.

Dei capsulele nu sunt necesare pentru cretere i reproducere n culturi de laborator, ele confer anumite avantaje bacteriilor n habitatele lor naturale. Ajut acestora s reziste la fagocitoz, aa cum se ntmpl n cazul lui Streptococcus pneumoniae. Dac nu posed capsul, S. pneumoniae este distrus rapid i nu provoac mbolnviri, n timp ce varianta incapsulat este deosebit de patogen. n plus, capsulele conin o mare cantitate ap, protejnd bacteriile de deshidratare. Glicocalixul ajut la ataarea bacteriilor suprafee solide n mediile acvatice, sau de diferite esuturi vegetale sau animale. 104
Proiectul pentru nvmntul Rural

Introducere n microbiologie

Figura 5.14 Glicocalix. Se evideniaz structura intercelular nalt organizat.

Numeroase bacterii Gram+ i Gram- au o structur ordonat, numit strat S, care se ntlnete i la archaebacterii. Stratul S are un aranjament asemntor dalelor de gresie i este alctuit din proteine i glicoproteine. Rolul stratului S este de protecie mpotriva ionilor i a fluctuaiilor de pH, mpotriva stresului osmotic, sau a altor bacterii prdtoare. Folosete, de asemenea, la meninerea rigiditii anvelopei i poate ajuta la aderarea celulelor la suprafee solide. Pili i fimbriile Numeroase bacterii Gram- au nite apendici, scuri, fini, asemntori firului de pr i care nu sunt implicai n locomoie. n mod obinuit sunt denumii fimbrii, dar uneori sunt denumii i pili. Dei pot ajunge la 1000 de fimbrii per celul, datorit dimensiunilor foarte mici nu sunt vizibili dect la microscopul electronic. Sunt alctuite din proteine i au diametru cuprins ntre 3 i 10 nm. Cel puin cteva tipuri de fimbrii particip la ataarea bacteriilor de suprafeele solide (Figura 5.15). Pilii de sex sunt apendici n numr de 1-10 per celul, dar sunt mai mari dect fimbriile (9-10 nm n diametru). Din punct de vedere genetic apariia lor este determinat de factori de sex sau de plasmide conjugative, fiind necesari n mperecherea bacterian. Unele virusuri bacteriene se ataeaz specific la receptori de pe pilii de sex la nceputul ciclului lor reproductiv.

Figura 5. 15 (A) Imagine de microscopie electronic a E. coli n care se disting flagelii lungi i pilii, scuri, subiri i mai rigizi. (B) Se observ un pil de sex lung.

Proiectul pentru nvmntul Rural

105

Introducere n microbiologie

Flagelii i locomoia Majoritatea bacteriilor se deplaseaz cu ajutorul flagelilor, apendici locomotori ce ies n exteriorul membranei plasmatice i a peretelui celular (vezi Caseta 4). Sunt structuri celulare subiri i rigide, cu lungimea cuprins ntre 20 nm pn la 15 sau 20 m. Unele bacterii, denumite monotriche au un singur flagel, care atunci cnd este localizat la un capt se numete flagel polar. Bacteriile amfitriche au cte un flagel la ambele capete, iar cele lofotriche au flageli grupai n snopuri la unul sau la ambele capete ale celulei. Unele bacterii au flagelii rspndii pe toat suprafaa celulei, fiind denumite peritriche. Numrul i poziia flagelilor reprezint un criteriu important n taxonomie (Figura 5.16). Flagelul este format din trei componente: filamentul, corpul bazal i crligul. Filamentul este poriunea cea mai lung, care se ntinde de la suprafaa celulei pn la vrf. Corpul bazal este plasat n interiorul celulei, iar crligul, care este un segment scurt i curbat, leag filamentul de corpul bazal. Filamentul este un cilindru rigid, gol n interior, alctuit dintr-o protein numit flagelin. Crligul i corpul bazal difer de filament. Crligul este uor mai mare n diametru dect filamentul i are n compoziie diferite subuniti proteice. Cea mai complex parte a flagelului este corpul bazal. La E. coli i la majoritatea bacteriilor Gram-negative, corpul bazal este format din patru inele (notate de la exterior spre interior L, P, S i M), conectate la un bastona central. Inelele L i P sunt asociate cu lipopolizaharide i cu straturile de peptidoglican, iar inelul M este n contact cu membrana plasmatic. Bacteriile Gram-pozitive au numai dou inele bazale, unul conectat la membrana plasmatic i altul exterior, ataat probabil la peptidoglican (Figura 5.17).

Figura 5.16 Tipuri de celule dup numrul i poziia flagelilor

Sinteza flagelului este un proces complex, care implic cel puin 20-30 de gene. n afara genelor care codific flagelina, 10 sau mai multe gene codific proteinele din corpul bazal i din crlig. Alte gene sunt implicate n controlul asamblrii i funcionrii flagelului.

106

Proiectul pentru nvmntul Rural

Introducere n microbiologie

Figura 5.17 Structura flagelului la E.coli. n stnga imaginii se observ poziionarea flagelului la nivelul celulei, precum i sensul de rotaie al acestuia.

Studiul regenerrii flagelilor la bacteriile deflagelate a permis nelegerea mecanismului de asamblare a subunitilor de flagelin la nivelul filamentului. Astfel, se pare c aceste subuniti sunt transportate prin spaiul din interiorul filamentului pn la vrful acestuia, unde agreg spontan. Sinteza filamentului flagelar este un exemplu excelent de autoasamblare. Bacteriile au i alte mecanisme prin care se pot deplasa. Astfel, spirochetele se deplaseaz prin micri de flexie sau de rsucire determinate de un filament axial special. Un tip aparte de locomoie se ntlnete la unele cianobacterii, la unele micoplasme i la alte specii de bacterii care se deplaseaz prin trre. Nu au fost, ns, evideniate structuri care s fie asociate cu acest tip de mobilitate. 5.2.8. Chemotaxia Bacteriile se deplaseaz uneori datorit atraciei exercitate de anumite substane, cum sunt unii nutrieni (zaharuri sau aminoacizi) sau datorit respingeri cauzate de substane duntoare, toxice. Deplasarea ctre atractani chimici sau ndeprtarea de substane repelente (respingtoare) se numete chemotaxie, i reprezint un avantaj evident pentru bacterii. Bacteriile rspund la concentraii foarte mici de atractani (n jur de 10-8 M pentru anumite zaharuri), dar detecteaz repelenii doar la concentraii mari. Dac o substan atractant este la un loc cu o substan repelent bacteria va compara semnalele i va rspunde la cea cu concentraia cea mai eficient. Atractanii i repelenii sunt detectai de chemoreceptori, care sunt proteine speciale, care leag substanele chimice i trimit semnale ctre un sistem chemosenzitiv. Proteinele chemoreceptor Proiectul pentru nvmntul Rural 107

Introducere n microbiologie

pot fi localizate n spaiul periplasmic sau n membrana plasmatic. Au fost descoperii pn n prezent n jur de 20 de receptori pentru atractani i aproximativ 10 pentru repeleni. Caseta 4 Micarea flagelilor Flagelul procariot se mic diferit de cel de la eucariote. Filamentul are form de helix rigid, bacteriile deplasndu-se datorit rotaiilor acestui helix. Exist dovezi care arat c flagelul acioneaz ca elicea unei brci cu motor. Bacteriile mutante care au flageli drepi sau regiuni intermediare anormal de lungi nu pot nota. Direcia n care se rotete flagelul determin sensul micrii. Bacteriile monotriche se deplaseaz nainte dac flagelul se rotete n sens opus acelor de ceasornic, iar celula nsi se rotete uor n sens opus. Prin schimbarea direciei de rotaie a flagelului bacteria se oprete i se rostogolete. Bacteriile peritriche se deplaseaz ntr-un mod asemntor. Deoarece bacteriile noat prin rotirea flagelului rigid, s-a presupus c la baz exist un anumit tip de motor. Conform unei ipoteze, flagelul se rotete datorit interaciunii dintre inelul S i inelul M. Exist ns dovezi ce arat c, din punct de vedere funcional, corpul bazal este o structur pasiv, care se rotete ntr-un complex de proteine, delimitate de o membran, asemntor rotorului unui motor electric n centrul unui inel electromagnetic (statorul). Mecanismul exact care determin rotirea corpului bazal este nc neclar. Oricum, flagelul este foarte eficient n deplasarea bacteriilor. Rspunsul chemotactic este foarte complex i implic numeroase proteine. El rezult din combinarea a trei procese: 1) controlul fosforilrii unor proteine citoplasmatice de ctre nivelul atractanilor i repelenilor, 2) rotirea flagelului indus prin fosforilarea altei proteine citoplasmatice i 3) un circuit feed-back reglator care implic inclusiv variaii n ceea ce privete metilarea chemoreceptorului. Teste de autoevaluare TA 5.18 Descriei pe scurt capsula, glicocalixul i stratul S. Ce funcii ndeplinesc? .................................................................................................................... .................................................................................................................... .................................................................................................................... TA 5.19 Prin ce se deosebesc fimbriile de pilii de sex? .................................................................................................................... .................................................................................................................... .................................................................................................................... TA 5.20 Desenai un flagel bacterian i marcai principalele componente.

108

Proiectul pentru nvmntul Rural

Introducere n microbiologie

5.2.9. Endosporul bacterian Unele bacterii Gram-negative pot forma structuri de rezisten, latente, denumite endospori. Endosporii apar n celulele bacteriene aflate n stare vegetativ i sunt caracteristici pentru cteva genuri: Bacillus, Clostridium i Sporosarcina. Aceste structuri sunt deosebit de rezistente la temperaturi ridicate, radiaii ultraviolete, la secet, la aciunea unor detergeni etc. Unii endospori rmn viabili mai mult de 500 de ani, spori de actinomicete fiind recuperai dup 7500 de ani. Datorit rezistenei lor, precum i datorit faptului c unele specii bacteriene care formeaz spori sunt deosebit de patogene, endosporii au o mare importan practic. Din acest motiv, sterilizarea este esenial, att pentru soluii ct i pentru obiecte solide. Endosporii se formeaz n cteva ore, iar asamblarea lor a fost studiat cu foarte mare interes deoarece ofer informaii cu privire la construcia unor structuri biologice complexe. Sporii se formeaz n celule-mam numite uneori sporangii, iar poziia lor n aceste celule difer considerabil de la o specie alta, fiind un criteriu util de identificare a speciilor. Astfel, sporii pot fi localizai central, subterminal sau terminal. Uneori sporii pot fi att de mari nct mresc sporangiul. Structura endosporului este complex. La exterior este nconjurat de un nveli foarte subire, numit exosporium, sub care se gsete alt nveli, mai gros, format din cteva straturi proteice. Acest strat confer sporului rezisten la numeroase substane chimice. Sub acest strat se gsete cortexul, care ocup aproximativ jumtate din volumul sporului i care este alctuit din peptidoglican. Peretele celular al sporului (peretele miezului) nconjoar protoplastul sau miezul (Figura 5.18).

Figura 5.18 Structura endosporului bacterian.

Sporogeneza sau sporulaia (formarea endosporului) ncepe n mod normal atunci cnd, datorit lipsei nutrienilor, nceteaz creterea. Este un proces complex care se desfoar n mai multe etape: 1) formarea unui filament axial de material nuclear, 2) invaginarea membranei celulare i formarea unui sept care va nchide o parte a ADN-ului i, 3) creterea n continuare a membranei celulare care va nveli sporul imatur n cea de a doua membran, 4) formarea cortexului, 5) formarea stratului protector de deasupra cortexului, 6) maturarea endosporului i 7) liza sporangiului i eliberarea sporului. Sporulaia are loc n numai 10 ore (Figura 5.19).
Proiectul pentru nvmntul Rural

109

Introducere n microbiologie

Caseta 5 Rolul endosporului bacterian Nu este nc foarte clar de ce endosporul este att de rezistent la cldur i ali ageni letali. Aproximativ 15% din greutatea uscat a sporului const n acid dipicolinic complexat cu ioni de calciu. Mult timp s-a considerat c acidul dipicolinic este responsabil direct de rezistena la temperaturi ridicate. Dipicolinatul de calciu este posibil s stabilizeze acizii nucleici. Dehidratarea protoplastului pare s fie important n inducerea rezistenei la temperaturi ridicate. Cortexul poate ndeprta osmotic apa din protoplast, protejndu-l astfel de cldur i radiaii. n concluzie, rezistena endosporului la cldur se datoreaz, probabil, ctorva factori: stabilizarea prin intermediul dipicolinatului de calciu a unor componente precum ADN-ul, dehidratarea protoplastului, stabilitii sporite a peretelui celular etc.. n prezent au fost izolate mutante rezistente la cldur crora le lipsea acidul dipicolinic. Transformarea sporului latent ntr-o celul vegetativ activ este de asemenea un proces complex, care are loc n trei etape: 1) activarea, 2) germinarea, 3) creterea extern. Ades endosporii nu germineaz corespunztor, nici n medii bogate n nutrieni, chiar dac au trecut de faza de activare. Activarea este un proces reversibil care pregtete sporii pentru germinare i rezult, de obicei, n urma creterii temperaturii. Activarea este urmat de germinare, care const n umflarea sporului, ruperea sau absorbia nveliurilor sporale, pierderea rezistenei la cldur i la ali factori de stres i creterea activitii metabolice. n ultima etap protoplastul sporului formeaz noi componente, prsete resturile nveliurilor sporale i devine, din nou, o bacterie activ.

Figura 5.19 Sporogeneza. Sunt evideniate etapele sporogenezei, din momentul diviziunii bacteriene i apariiei septului, pn n momentul germinrii i formrii unui nou spor.

110

Proiectul pentru nvmntul Rural

Introducere n microbiologie

Teste de autoevaluare TA 5.21 Ce este chemotaxia i ce sunt chemoreceptorii? .................................................................................................................... .................................................................................................................... .................................................................................................................... TA 5.22 ncercuii litera corespunztoare variantei corecte de rspuns: Endosporii sunt: a) chemoreceptori c) structuri de rezisten b) organite celulare d) incluziuni celulare TA 5.23 Descriei pe scurt structura endosporului bacterian. .................................................................................................................... .................................................................................................................... .................................................................................................................... TA 5.24 Ce contribuie la rezistena sporit a endosporului la temperaturi ridicate? .................................................................................................................... .................................................................................................................... ....................................................................................................................

5.2.10 Rezumatul capitolului 5.2 Bacteriile pot fi sferice (coci), asemntoare unor bastonae (bacili) sau spiralate; pot s nu aib form caracteristic (pleomorfice). Toate bacteriile sunt procariote i sunt mai simple structural dect eucariotele. Membrana plasmatic este alctuit dintr-un dublu-strat lipidic n care sunt integrate proteine. Proteinele periferice sunt mai slab ataate de membrane. Membrana plasmatic se poate nvagina, formnd structuri simple, precum mezozomii. Matricea celular conine incluziuni celulare i ribozomi. Chaperonii moleculari ajut la mpachetarea corespunztoare a proteinelor, protejeaz celulele mpotriva stresului cauzat de unii factori de mediu i ajut la transportul proteinelor. Materialul genetic la procariote este localizat ntr-o zon numit nucleoid i nu este nchis ntr-o membran. Majoritatea bacteriilor au n exteriorul membranei plasmatice un perete celular care le confer o anumit form i le protejeaz de liza osmotic. Peretele celular bacterian este, de obicei, complex i este alctuit din peptidoglican (murein). Bacteriile sunt clasificate n dou categorii: Gram+ i Gram -, pe baza diferenelor n ceea ce privete structura peretelui celular i a rspunsului lor la coloraia Gram. Bacteriile Gram + au pereii celulari formai dintr-un strat gros de peptidoglican, iar bacteriile Gram- au un strat subire de peptidoglican nconjurat de o membran extern complex, care conine lipopolizaharide i alte componente. Peretele celular lipsete la micoplasme i formele L. n exteriorul peretelui celular exist structuri precum: capsule, fimbrii, pili de sex.

Proiectul pentru nvmntul Rural

111

Introducere n microbiologie

Numeroase bacterii sunt mobile, de obicei datorit unor structuri denumite flageli. Speciile bacteriene difer n ceea ce privete numrul i distribuia flagelilor. Filamentul flagelar este un helix rigid care se rotete i mpinge bacteria n ap.

Bacteriile mobile pot rspunde la atractani sau repeleni; acest proces se numete chemotaxie. Unele bacterii supravieuiesc n condiii nefavorabile prin formarea de endospori, structuri latente, rezistente la cldur, deshidratare i la numeroase substane chimice.

5.3.Celulele procariote versus celulele eucariote


Dei bacteriile sunt principalele microorganisme analizate n capitolele de microbiologie ale acestui curs, nu poate fi neglijat importana microorganismelor eucariote. De aceea, vom prezenta pe scurt cteva caracteristici ale celulelor eucariote, precum i o analiz ale principalelor diferene dintre celulele eucariote i procariote. 5.3.1. Caracteristicile generale ale celulei eucariote Bacteriile sunt deosebit de importante n microbiologie. Cu toate acestea, algele eucariote, fungii i protozoarele sunt de asemenea microorganisme i sunt pe larg studiate de ctre microbiologi. Aceste organisme sunt ades foarte complexe i ocup un loc important n ecosistemele din care fac parte. Numeroi fungi i ntr-o oarecare msur unele alge sunt foarte utilizate n microbiologia industrial. De asemenea, numeroase protozoare i muli fungi sunt ageni patogeni ai unor maladii umane. Cea mai evident deosebire dintre celulele eucariote i cele procariote se refer la membrane. Celulele eucariote au membrane care delimiteaz nucleii, precum i membrane care sunt componente importante a numeroase alte organite. Organitele sunt structuri intracelulare care ndeplinesc funcii celulare specifice. Denumirea acestor structuri a rezultat din similaritatea sesizat de biologi ntre relaia organitelor cu celula i a organelor cu organismul. Din punct de vedere structural celula eucariot este mult mai complex dect cea procariot. Aceast complexitate se datoreaz, n primul rnd, utilizrii membranelor n cteva scopuri bine definite. mprirea prin intermediul membranelor a interiorului celulei eucariote face posibil plasarea diferitelor funcii biochimice i fiziologice n compartimente separate, astfel nct acestea se pot desfura simultan n condiii adecvate i sub control independent. Suprafeele membranare mari fac posibil desfurarea unor activiti respiratorii i fotosintetice mai intense, cu att mai mult cu ct aceste procese sunt localizate exclusiv la nivelul membranelor. Sistemul intracitoplasmatic de membrane folosete, de asemenea, ca un sistem de transport al diferitelor substane ntre diferitele locaii celulare. Astfel, aceste sisteme extinse de membrane 112
Proiectul pentru nvmntul Rural

Introducere n microbiologie

sunt necesare n celulele eucariote pentru o reglare adecvat, pentru desfurarea unei intense activiti metabolice i pentru transport. Figura 5.21 reprezint o imagine general a celulei eucariote, comparativ cu cea procariot, n timp ce tabelul din Figura 5.20 prezint pe scurt funciile principalelor organite celulare.
Figura 5. 20 Funciile componentelor celulei eucariote

Componenta Membrana plasmatic

Funcia Barier celular mecanic, permeabil selectiv, cu sisteme de transport transmembranar Mediaz interaciunile intercelulare, aderena la suprafee, secreia Matricea citoplasmatic Mediu pentru alte organite, locul de desfurare a numeroase procese metabolice Microfilamente, filamente Formeaz citoscheletul i au rol n mobilitate intermediare i microtubuli Reticulul endoplasmic Transportul diferitelor substane, sinteza proteinelor i lipidelor Ribozomii Sinteza proteinelor Aparatul Golgi mpachetarea i secretarea diferitelor substane pentru diferite scopuri, formarea lizozomilor Lizozomii Digestie intracelular Mitocondriile Producerea de energie folosind ciclul acizilor tricarboxilici, transportul de electroni, fosforilarea oxidativ i alte ci metabolice Cloroplastele Fotosintez captarea energiei luminoase i formarea carbohidrailor din CO2 i ap Nucleul Depozitarul informaiei genetice, centrul de control al celulei Nucleolul Sinteza ARN-ului ribozomal, formarea ribozomilor Peretele celular ntrirea i asigurarea unei forme celulei Cilii i flageli Mobilitate 5.3.2. Comparaie ntre celulele procariote i eucariote Prin compararea celulelor eucariote i procariote s-a demonstrat c exist numeroase diferene fundamentale ntre ele. Celulele eucariote au nucleul delimitat de membran spre deosebire de celulele procariote la care aceasta lipsete. Bacteriile sunt procariote, n timp ce algele, fungi, protozoarele, plantele superioare i animalele sunt eucariote. Procariotele sunt n mod normal mai mici dect celulele eucariote, adesea avnd mrimea mitocondriilor i cloroplastelor de la eucariote. Prezena nucleului eucariot este cea mai puternic diferen ntre aceste dou tipuri de celule, dar au fost observate i alte deosebiri. Din punct de vedere structural, procariotele sunt mai simple dect eucariotele, deoarece nu au setul complex de organite delimitate de membrane. Aceast simplitate se reflect i la nivel funcional. Procariotele nu au mitoz, meioz, iar organizarea genetic este mai simpl. Numeroase procese eucariotice complexe precum: fagocitoza i pinocitoza, digestia intracelular, micrile ameboidale, curenii citoplasmatici sunt absente la procariote (Figura 5.22).
Proiectul pentru nvmntul Rural

113

Introducere n microbiologie

Figura 5.21 Comparaie intre o celul eucariot i o celul procariot. Observai diferenele n ceea ce privete dimensiunile i structura. Figura 5.22 Comparaie ntre celula procariot i eucariot Caracteristica Procariote
Organizarea materialului genetic Membrana nuclear ADN complexat cu histone Numr de cromozomi Introni n gene Nucleoli Prezena mitozei Recombinare genetic Mitocondrii Cloroplaste Membran plasmatic cu steroli Flageli Absent Nu Unua Rari Abseni Nu Parial, transfer unidirecional de ADN Absente Absente De obicei fr De mrime submicroscopic, formai dintr-o singur fibr Absent Absent De obicei complex din punct de vedere chimic, cu peptidoglican 70S Abseni Abseni sau rari Absent Rudimentar

Eucariote
Prezent Da Mai mult de unu Comuni Prezeni Da Meioz i fuziunea gameilor Prezente Prezente Da De mrime microscopic, mrginii de membran, formai din 20 de microtubuli pe model 9+2 Prezent Prezent Mai simplu din punct de vedere chimic, fr peptidoglican 80S (cu excepia celor din mitocondrii i cloroplaste) Prezeni Prezeni Prezent esuturi i organe

Reticul endoplasmic Aparat Golgi Perete celular Diferene ntre organite mai simple Ribozomi Lizozomi i peroxizomi Microtubuli Citoschelet Difereniere

114

Proiectul pentru nvmntul Rural

Introducere n microbiologie

Cu toate aceste diferene semnificative, ntre cele dou tipuri de celule exist o mare similaritate n ceea ce privete aspectele biochimice. Procariotele i eucariotele sunt formate din constitueni chimici foarte asemntori. Cu doar cteva excepii, codul genetic este acelai la ambele celule, la fel ca i exprimarea genelor. Principiile care stau la baza metabolismului, precum i majoritatea cilor metabolice importante sunt identice. Astfel, n ciuda diferenelor profunde structurale i funcionale dintre procariote i eucariote, la nivel molecular exist o evident unitate, care, de altfel, reprezint esena tuturor proceselor vieii.

Teste de autoevaluare TA 5.25 Ce sunt organitele? .................................................................................................................... .................................................................................................................... TA 5.26 Ce rol ndeplinesc membranele celulare la eucariote? .................................................................................................................... .................................................................................................................... TA 5.27 Denumii organitele celulare caracteristice numai celulei eucariote. .................................................................................................................... .................................................................................................................... TA 5.28 n ce const cea mai important similaritate dintre celulele eucariote i celulele procariote? .................................................................................................................... .................................................................................................................... .................................................................................................................... .................................................................................................................... ....................................................................................................................

5.3.3 Rezumatul capitolului 5.3 Prezena organitelor citoplasmatice complexe, delimitate de membrane i includerea materialului genetic n nuclei cu membran nuclear reprezint principalele deosebiri dintre celulele eucariote i cele procariote. Fiecare organit are o anumit structur, corelat cu funcia pe care o ndeplinete. Cu toate marile diferene dintre eucariote i procariote n ceea ce privete morfologia, la nivel biochimic cele dou tipuri de celule sunt similare.

Proiectul pentru nvmntul Rural

115

Introducere n microbiologie

5.4 LUCRARE DE VERIFICARE 5 I. ncercuii litera corespunztoare variantei corecte de rspuns: 1. Inventarea microscopului : a) a pus capt controversei cu privire la teoria generaiei spontane b) a permis observarea direct a microorganismelor c) a corelat prezena unor microorganisme cu apariia unor maladii d) a dovedit c bacteriile i virusurile sunt microorganisme. 2. Conform cercetrilor de la nivel molecular: a) toate procariotele aparin regnului Procariota b) toate procariotele sunt incluse n regnul Monera c) procariotele aparin la dou domenii: Archaea i Eubacteria d) procariotele fac parte din domeniul Bacteria. 3. Archaeobacteria a) sunt organismele cele mai primitive b) au un singur tip de ARN polimeraza c) se deosebesc de bacterii prin prezena organitelor celulare d) se deosebesc de bacterii prin lipsa peptidoglicanului din structura peretelui celular. 4. Bacteriile a) sunt ntotdeauna asociate n perechi, lanuri sau ciorchini b) au dimensiuni cuprinse ntre 100 i 200 nm c) au o mare varietate de forme i dimensiuni d) sunt uniforme din punct de vedere al formei i dimensiunilor 5. Membrana plasmatic e celulelor procariote a) este monostratificat b) conine proteine periferice i proteine transmembranare c) include steroli, de tipul hepanoizilor d) este lipsit de invaginri. 6. Vacuolele cu gaz a) sunt caracteristice bacteriilor acvatice b) au perei formai dintr-un strat monolipidic c) sunt impermeabile pentru O2 i CO2 d) sunt utilizate ca surs de energie. 7. n biosinteza acizilor nucleici procariotele utilizeaz fosfat stocat n: a) carboxizomi b) granule de polifosfat c) carboxizomi, granule de cianoficin, granule de volutin d) granule de volutin i de polifosfat 116

Proiectul pentru nvmntul Rural

Introducere n microbiologie

8. mpachetarea ADN-ului cromozomial bacterian implic: a) mezozomii b) histone c) proteine asemntoare histonelor d) nucleoidul 9. Spaiul periplasmatic a) este caracteristic bacteriilor Gramb) se ntlnete la toate procariotele c) conine glicoproteine i aminoacizi d) este caracteristic Archaebacteriilor. 10. La aderarea bacteriilor pe suprafee solide particip: a) pilii de sex b) fimbriile i stratul S c) stratul S i spaiul periplasmatic d) peptidoglican. Total: 20 puncte (cte 2 puncte pentru fiecare item) II. Completai spaiile goale cu noiunile corespunztoare: Matricea citoplasmatic conine i ribozomi.. Peretele celular bacterian este complex din punct de vedere chimic, coninnd de obicei.. ..sunt bacterii fr perete celular, la fel ca micoplasmele. ..este o reacie a bacteriilor declanat de apariia n mediu a unor condiii nefavorabile. .bacteriilor se datoreaz flagelilor, alctuii din filament, i corp bazal. Cromozomul bacterian este de obicei Total: 12 puncte (cte 1,5 puncte pentru fiecare noiune) III. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Rspundei pe scurt (1-2 fraze) la urmtoarele ntrebri: Ce funcie se presupune c ndeplinesc mezozomii? Explicai de ce chaperonii moleculari sunt denumii i proteine de oc termic? Ce importan au pentru procariote incluziunile organice? Din ce este alctuit un flagel caracteristic bacteriilor Gram+? Enumerai cel puin trei funcii ndeplinite de peretele celular al procariotele. Explicai rolul capsulelor bacteriene. Ce structuri sunt implicate n rspunsul chemotactic al bacteriilor? Total: 28 puncte (cte 4 puncte pentru fiecare noiune)

IV. Reprezentai diagramatic ierarhizarea celula procariot, punnd n eviden deosebirile existente ntre bacteriile Gram+ i Gram-. Total: 10 puncte V. Realizai n maximum 1-2 pagin un eseu cu tema: Asemnri i deosebiri ntre celulele procariote i eucariote. Se puncteaz structurarea eseului, corectitudinea noiunilor, folosirea limbajului adecvat. Total: 20 puncte (cte 10 puncte pentru fiecare cerin) Total general: 90 puncte + 10 puncte din oficiu= 100 puncte
Proiectul pentru nvmntul Rural

117

Introducere n microbiologie

5.5 RSPUNSURI LA TESTELE DE AUTOEVALUARE Unitatea de nvare 5 TA 5.1 Cultivarea pe medii de cultur i sterilizarea. TA 5.2 Microbiologia a furnizat material optim de cercetare pentru studiul codului genetic, sinteza acizilor nucleici, sinteza proteinelor, reglarea exprimrii genelor. TA 5.3 Sistemul lui Whittaker include 5 regnuri, iar cel al lui Woese 3 domenii. n sistemul lui Woese 4 dintre regnuri (Protista, Plantae, Animalia i Fungi) sunt incluse n Eukarya. TA 5.4 Sunt un domeniu separat, care cuprinde organisme ce populeaz n general medii extreme i care nu posed peptidoglican n peretele celular. A. TA 5.8 1 d, 2 c TA 5.9 Membrana plasmatica menine integritatea celulei bacteriene o anumit form; permite schimburi cu exteriorul; reprezint locul de desfurare a unor procese metabolice. TA 5.10 Impermeabilitate pentru ap, permeabilitate pentru gaze atmosferice. TA 5.11 d TA 5.12 Biosinteza proteinelor; 70S; 80S; chaperoni. 5.6 BIBLIOGRAFIE RECOMANDAT 1. 2. 3. 4. 5. 6. Herlea V., 1998 Microbiologie general, Ed. Univ., Bucureti. Mihescu G., 2000 - Microbiologie general i virologie, Ed. Univ. Bucureti. Zarnea G., 1983 - Tratat de microbiologie general. Vol. I, Edit. Acad. RSR. Zarnea G., 1984 Tratat de microbiologie general. Vol. II, Edit. Acad. RSR. Zarnea G., 1994 Tratat de microbiologie general. Vol. V, Ed. Acad. Romne. Zarnea G., Mihiescu Gr., Velehorschi V., 1992 Principii i tehnici de microbiologie general. I, Bucureti. TA 5.13 Transcrierea activ a ADNm la celulele aflate n cretere. TA 5.14 Proteinele din nucleoid, altele dect histonele EK. TA 5.15 Sunt molecule circulare de ADN dublucatenar, care pot exista independent de cromozom, coninnd gene de rezisten i de patogenitate. TA 5.16 Grosimea peptidoglicanului, membrana extern, spaiul periplasmatic. TA 5.17 Bacteriilor Gram+ i Gram-. TA 5.19 Fimbriile sunt implicate n ataarea bacteriilor de suprafee, iar pilii de sex n procese conjugative. TA 5.22 c TA 5.24 Dipicolinatul de calciu, dehidratarea protoplastului, structura peretelui celular. TA 5.25 Organitele sunt structuri intracelulare, caracteristice celulelor eucariote a cror denumire deriv din similaritatea acestora cu organele componente ale unui organism. TA 5.28 Membrana celular

118

Proiectul pentru nvmntul Rural

Nutriia i creterea microorganismelor

Unitatea de nvare 6

NUTRIIA I CRETEREA MICROORGANISMELOR

Cuprins:
Cuprins Obiectivele Unitii de nvare 6 6.1 Nutriie microbian 6.1.1 Principalii nutrieni necesari microorganismelor 6.1.2 Necesarul de carbon, hidrogen i oxigen 6.1.3 Necesarul de azot, fosfor i sulf 6.1.4 Factori de cretere 6.1.5 Preluarea nutrienilor de ctre celule 6.1.6 Medii de cultur 6.1.7 Rezumatul capitolului 6.1 6.2 Creterea microbian 6.2.1 Curba de cretere 6.2.2 Estimarea creterii 6.2.3 Culturi continue 6.2.4 Influena factorilor de mediu asupra creterii 6.2.4.1 Presiunea osmotic 6.2.4.2 pH 6.2.4.3 Temperatura 6.2.4.4 Oxigenul 6.2.4.5 Presiunea 6.2.5 Rezumatul capitolului 6.2 6.3. Controlul microorganismelor prin intermediul agenilor fizici i chimici 6.3.1. Definirea principalilor termeni folosii 6.3.2. Moartea microorganismelor 6.3.3. Condiii pe care trebuie s le ndeplineasc un agent antimicrobian 6.3.4. Metode fizice folosite pentru controlul microorganismelor 6.3.5. Ageni chimici utilizai pentru controlul microorganismelor 6.3.6 Rezumatul capitolului 6.3 6.4 Rspunsuri i comentarii la testele de evaluare Unitatea de nvare 1 6.5 Bibliografie recomandat 119 119 120 120 121 124 124 125 127 129 130 130 132 133 134 134 135 136 138 139 139 140 140 141 141 142 144 146 147 147

Obiectivele Unitii de nvare 6 s identifici i s caracterizezi principalele clase nutriionale de microorganisme; s explici i s exemplifici importana mediilor de cultur n izolarea i identificarea microorganismelor; s clasifici microorganismele dup tolerana fa de diferii factori de mediu; s argumentezi importana controlului microorganismelor.

Proiectul pentru nvmntul Rural

119

Nutriia i creterea microorganismelor

6.1 Nutriie microbian Pentru obinerea de energie i pentru sinteza constituenilor celulari, organismele au nevoie de un aport de nutrieni. Astfel, nutrienii sunt absolut necesari pentru cretere. Acest capitol descrie necesitile nutritive ale microorganismelor, modul cum acetia sunt procurai, precum i modaliti de cultivare ale microorganismelor. 6.1.1 Principalii nutrieni necesari microorganismelor Analiza compoziiei chimice a celulelor microbiene arat c 95% din substana uscat este alctuit din cteva elemente majore: carbon, oxigen, hidrogen, azot, sulf, fosfor, potasiu, calciu, magneziu i fier. Acestea sunt denumite macroelemente sau macronutrieni, deoarece sunt necesare n cantiti mari. Primele ase (C, O, H, N, S i P) fac parte din compoziia chimic a carbohidrailor, lipidelor, proteinelor i acizilor nucleici. Restul elementelor se gsesc n celule sub form de cationi i joac roluri foarte variate. De exemplu, potasiul (K+) este important pentru activitatea a numeroase enzime, inclusiv a unor enzime implicate n sinteza proteic. Calciul (Ca2+), pe lng alte funcii, contribuie la rezistena la temperaturi ridicate a endosporilor bacterieni. Magneziul (Mg2+) folosete drept cofactor enzimatic, formeaz complexe cu ATP-ul i stabilizeaz ribozomii i membranele celulare. Fierul (Fe2+ i Fe3+) este parte component a citocromilor i cofactor enzimatic. n afar de macroelemente, microorganismele necesit i microelemente cum sunt: mangan, zinc, cobalt, molibden, nichel, cupru. Necesarul microorganismelor fa de aceti nutrieni este foarte redus, aa nct microelementele sunt necesare n cantiti deosebit de mici. n general aceste elemente sunt pri componente ale enzimelor i ajut la catalizarea reaciilor chimice i la meninerea structurii proteinelor. n afar de necesitile privind macro i microelementele enumerate, microorganismele au i necesiti speciale, care reflect particulariti lor morfologice sau particularitile mediului. Diatomeele, spre exemplu, necesit acid silicic pentru a-i construi pereii celulari, foarte bogai n oxid de siliciu. Dei majoritatea bacteriilor nu necesit cantiti sporite de sodiu, cele care triesc n lacuri saline, sau n mri i oceane, depind de prezena unor concentraii mari de ioni de sodiu. Teste de autoevaluare TA 6.1 Care este criteriul de mprire al nutrienilor n micro- i macroelemente? ............................................................................................................ ............................................................................................................ ............................................................................................................ ............................................................................................................ ............................................................................................................

120

Proiectul pentru nvmntul Rural

Nutriia i creterea microorganismelor

6.1.2 Necesarul de carbon, hidrogen i oxigen Necesitile fa de carbon, hidrogen i oxigen sunt ades satisfcute la un loc. Carbonul, care este un component de baz al tuturor moleculelor organice, are ca surse molecule care furnizeaz, n acelai timp, i atomi de oxigen i de hidrogen. Totui, o alt surs important de carbon este dioxidul de carbon (CO2), care nu poate fi folosit i ca surs de hidrogen. Probabil c toate microorganismele pot fixa CO2, pe care l reduc i l ncorporeaz n molecule organice, dar prin definiie doar autotrofele pot folosi CO2 ca unic sau principal surs de carbon. Numeroase microorganisme sunt autotrofe; dintre acestea numeroase sunt fotosintetizante, dar exist i autotrofe care, pentru a obine energie oxideaz molecule anorganice. Reducerea CO2 este un proces consumator de energie. Astfel, numeroase microorganisme nu pot folosi CO2 ca unic surs de carbon i utilizeaz molecule reductoare, mai complexe, pentru a-i suplimenta necesarul de carbon. Organismele care folosesc ca surs de carbon molecule organice se numesc heterotrofe. Multe heterotrofe utilizeaz nutrieni organici att ca surs de carbon, ct i ca surs de energie (Figura 6.1.). Necesarul nutriional al microorganismelor variaz enorm ntre diferitele specii, iar acest necesar se poate modifica n cadrul speciei ca urmare a mutaiilor. Microorganismul care necesit nutrieni conform caracteristicilor speciei din care face parte se numete prototrof. Un microorganism prototrof poate suferi mutaii, astfel nct nu mai poate sintetiza o molecul esenial pentru cretere i reproducere. n aceast situaie va necesita ca nutrient acea molecul sau un compus pe care s-l poat converti n ea. Organismul mutant cruia i lipsete capacitatea de a sintetiza un nutrient esenial i pe care trebuie, astfel, s-l obin din mediul nconjurtor este auxotrof. Multe auxotrofe trebuie s preia din mediu un anumit amino-acid a putea crete. Auxotrofia este o caracteristic foarte util n studiile de genetic microbian (vezi Caseta 6).
Figura 6.1 Surse de carbon, energie i hidrogen/electroni.

Surse de carbon Autotrofe Heterotrofe Surse de energie Fototrofe Chemotrofe Surse de hidrogen sau de electroni Litotrofe Organotrofe

CO2 ca unic sau principal surs de carbon Molecule organice provenind de la alte organisme Lumina Oxidarea compuilor organici sau anorganici Molecule anorganice reduse Molecule organice

Proiectul pentru nvmntul Rural

121

Nutriia i creterea microorganismelor

Caseta 6 Diversitatea microorganismelor n ceea ce privete sursele de carbon Microorganismele au o mare flexibilitate n legtur cu utilizarea diferitelor surse de carbon. Nu exist practic molecule organice naturale care s nu poat fi folosite de unele microorganisme. Actinomicetele pot degrada alcool amilic, parafin i chiar cauciuc. Unele bacterii sunt capabile s foloseasc aproape orice ca surs de carbon; de exemplu bacteria Burkholderia cepacia poate folosi mai mult de 100 de compui cu carbon. Exist ns numeroi compui sintetizai de om (ex. materiale plastice sau DDT), care sunt degradate lent sau deloc. Spre deosebire de speciile de microorganisme care degradeaz aproape orice, unele bacterii catabolizeaz un numr restrns de compui. Bacteriile metilotrofe metabolizeaz numai metan, metanol, monoxid de carbon, acid formic i civa compui nrudii. Parazii din genul Leptospira pot folosi doar acizi grai ca unic surs de carbon i energie. Tipuri nutriionale de microorganisme Pentru cretere toate microorganismele necesit surse de energie, hidrogen i electroni. n funcie de modul n care microorganismele i satisfac aceste necesiti ele pot fi grupate n mai multe clase nutriionale. Exist doar dou surse de energie accesibile organismelor: 1) energia luminoas, captat n timpul fotosintezei i 2) energia rezultat prin oxidarea moleculelor organice sau anorganice. Fototrofele folosesc ca surs de energie lumina, iar chemotrofele obin energia din oxidarea compuilor chimici (organici sau anorganici). Microorganismele au, de asemenea, doar dou surse de atomi de hidrogen i de electroni. Microorganismele litotrofe utilizeaz substane anorganice ca surs de electroni, n timp organotrofele extrag electronii sau hidrogenul din compui organici (Figura 6.1). n ciuda marii diversiti a microorganismelor, ele pot fi clasificate, n funcie de sursele primare de energie, hidrogen i electroni utilizate n patru clase nutriionale (Figura 6.2): 1. Fotolitotrofele autotrofe (ades denumite fotoautotrofe) utilizeaz energia luminoas i CO2 ca surs de carbon. Algele eucariote i cianobacteriile folosesc apa ca donor de electroni i elibereaz oxigen. Bacteriile sulfuroase purpurii i verzi nu pot oxida apa, dar i procur electroni de la donori anorganici ca hidrogenul, hidrogenul sulfurat sau sulf elementar. 2. Heterotrofele chemoorganotrofe (denumite i chemoheterotrofe) folosesc compui organici drept surse de energie, hidrogen, electroni i carbon pentru biosinteze. Ades, acelai nutrient organic satisface toate aceste necesiti. Toate microorganismele patogene sunt heterotrofe. 3. Heterotrofele fotoorganotrofe sunt mult mai puin numeroase, dar sunt importante ecologic, deoarece populeaz medii poluate. Din aceast clas fac parte unele bacterii purpurii i verzi, care folosesc materia organic ca donor de electroni i surs de energie. 122
Proiectul pentru nvmntul Rural

Nutriia i creterea microorganismelor

4. Autotrofele chemolitotrofe oxideaz compui anorganici redui precum fierul, azotul sau sulful pentru a-i procura energie i electroni pentru biosinteze. Sursa de carbon este reprezentat de CO2. Cteva dintre chemolitotrofe pot prelua carbonul care provine din surse organice, fiind aadar heterotrofe. Bacteriile care se bazeaz att pe surse anorganice, ct i pe surse organice se numesc mixotrofe. Ele combin procesele metabolice autotrofe cu cele heterotrofe. Chemolitotrofele contribuie n mare msur la transformrile chimice ale elementelor care au loc continuu n ecosisteme (de exemplu, transformarea amoniacului n nitrat sau transformarea sulfului n sulfat) (vezi Caseta 7).

Caseta 7 Flexibilitatea metabolic bacterian Dei o anumit specie aparine n mod obinuit unei singure clase nutriionale, unele specii au o mare flexibilitate metabolic i i modific cile metabolice ca rspuns la modificarea mediului. De exemplu, numeroase bacterii purpurii nesulfuroase acioneaz ca heterotrofe fotoorganotrofe n absena oxigenului, dar oxideaz molecule organice i funcioneaz chemotrof la concentraii normale de oxigen. Atunci cnd concentraia de oxigen este redus, fotosinteza i metabolismul oxidativ funcioneaz simultan. Aceast flexibilitatea este complex i confer un avantaj, mai ales n mediile n continu transformare.

Figura 6.2. Tipuri nutriionale de microorganisme


Clase nutriionale Surse de energie, hidrogen/electroni i carbon Energie luminoas Donor anorganic de hidrogen/electroni (H/e-) CO2 Energie luminoas Donor organic de H/eCarbon organic (i CO2) Surs anorganic de energie Donor anorganic de hidrogen H/eCO2 Surs organic de energie Donor organic de hidrogen H/eCarbon organic Microorganisme reprezentative Alge Bacterii sulfuroase purpurii i verzi Cianobacterii (bacterii albastre- verzi) Bacterii nesulfuroase purpurii Bacterii nesulfuroase verzi Bacterii sulf-oxidante Bacterii nitrificatoare Hidrogen bacterii Protozoare Fungi Majoritatea bacteriilor nefotosintetizante (inclusiv majoritatea patogenilor)

Fotolitotrofe autotrofe

Fotoorganotrofe heterotrofe

Chemolitotrofe autotrofe

Chemoorganotrofe heterotrofe

Proiectul pentru nvmntul Rural

123

Nutriia i creterea microorganismelor

Teste de autoevaluare TA 6.2 Care sunt principalele surse de carbon? ................................................................................................................. ................................................................................................................. ................................................................................................................. TA 6.3 Microorganismele care folosesc ca unic surs de carbon CO2 se numesc: a) heterotrofe c) prototrofe b) auxotrofe d) autotrofe TA 6.4 Prin ce se deosebesc autotrofele fotolitotrofe de autotrofele chemolitotrofe? ................................................................................................................. ................................................................................................................. ................................................................................................................. ................................................................................................................. ................................................................................................................. .................................................................................................................

6.1.3 Necesarul de azot, fosfor i sulf Pentru a crete microorganismele trebuie s ncorporeze cantiti mari de azot, fosfor i sulf. Dei aceste elemente pot fi obinute din aceiai nutrieni din care se obine i carbonul, microorganismele folosesc, de obicei i surse anorganice. Azotul este necesar pentru sinteza amino-acizilor, purinelor, pirimidinelor, a unor carbohidrai i lipide, a unor cofactori enzimatici, precum i a altor substane. Numeroase microorganisme pot ncorpora amoniacul direct n amino-acizi prin aciunea unor enzime ca glutamat dehidrogenaza i glutamin sintetaza. Multe bacterii (cianobacterii i bacteria simbiont Rhizobium) pot reduce i asimila azotul atmosferic folosind un sistem nitrogenazic. (Nitrogenaza este un sistem enzimatic care catalizeaz fixarea azotului atmosferic.) Fosforul este prezent n acizii nucleici, n fosfolipide, unele nucleotide ca ATP-ul, unele proteine i alte componente celulare. Aproape toate microorganismele folosesc fosfatul anorganic ca surs de fosfor i l ncorporeaz direct. Unele microorganisme (E. coli) preiau activ fosfor din mediul nconjurtor. Concentraiile sczute de fosfor limiteaz creterea microorganismelor n numeroase medii acvatice. Sulful este necesar pentru sinteza unor substane ca aminoacizii cistein i metionin, pentru sinteza unor carbohidrai, a biotinei i tiaminei. Majoritatea microorganismelor folosesc ca surs de sulf sulfatul, pe care l reduc. Cteva,ns, necesit o form redus de sulf, aa cum este cisteina.

124

Proiectul pentru nvmntul Rural

Nutriia i creterea microorganismelor

6.1.4 Factori de cretere Compuii organici absolut necesari deoarece sunt componente celulare eseniale sau precursori ai unor asemenea componente i care nu pot fi sintetizai de organism se numesc factori de cretere. Exist trei clase majore de factori de cretere: 1) amino-acizi, 2) purine i pirimidine i 3) vitamine. Amino-acizii sunt necesari pentru sinteza proteinelor, iar purinele i pirimidinele pentru sinteza acizilor nucleici. Vitaminele sunt molecule organice mici, care n mod obinuit intr aproape n totalitate n alctuirea unor cofactori enzimatici i doar cantiti mici influeneaz creterea. Unele microorganisme au un necesar sporit de vitamine; Enterococcus faecalis necesit pentru cretere opt vitamine diferite. S-au semnalat, de asemenea, i ali factori de cretere, n afar de cei enumerai. Astfel, Haemophilus influenzae necesit hem (din hemoglobin sau din citocromi), iar unele micoplasme necesit steroli. Teste de autoevaluare TA 6.5 ncercuii rspunsurile corecte: 1. Fosforul este necesar pentru sinteza: a) aminoacizilor, nucleotidelor i a tiaminei b) fosfolipidelor c) metioninei, cisteinei, tiaminei i biotinei d) acizilor nucleici, fofolipidelor, ATP-ului i a unor proteine. 2. Principalele clase de factori de cretere sunt: a) proteinele, lipidele i aminoacizii b) aminoacizii, purinele, pirimidinele i vitaminele c) macro- i microelemente d) fosfolipidele i acizii nucleici. 6.1.5 Preluarea nutrienilor de ctre celule Primul pas n utilizarea nutrienilor este preluarea acestora de ctre celula microbian. Mecanismul prin care se realizeaz acest lucru trebuie s fie specific, ceea ce nseamn c substana necesar i nu alta trebuie s fie preluat din mediu. Deoarece microorganismele triesc ades n medii srace n nutrieni, ele trebuie s fie apte s transporte nutrienii din soluii diluate n celule, mpotriva unui gradient de densitate. n final, nutrienii trebuie s traverseze membrana plasmatic, care nu este permeabil pentru numeroase substane. Datorit numrului mare de nutrieni utilizai i a complexitii procesului, microorganismele folosesc cteva mecanisme diferite de transport. Cele mai importante sunt: difuzia, transportul activ i translocaia de grup. Eucariotele nu folosesc ultimul mecanism, dar utilizeaz endocitoza. Difuzia. Cteva substane, printre care glicerolul, pot traversa membrana plasmatic prin difuzie pasiv. Difuzia pasiv este un proces prin care moleculele se deplaseaz dintr-o regiune cu concentraie ridicat ntr-o regiune cu concentraie sczut datorit agitrii termice ntmpltoare. Rata difuziei pasive depinde de gradientul de concentraie dintre exteriorul i interiorul celulei. Pentru a avea loc difuzia pasiv, concentraia extern de nutrieni trebuie s Proiectul pentru nvmntul Rural 125

Nutriia i creterea microorganismelor

fie mare, iar rata prelurii descrete n timp deoarece o parte a nutrienilor preluai nu sunt utilizai imediat. Astfel, difuzia pasiv este un proces ineficient i, de aceea, nu este folosit pe scar larg de ctre microorganisme. Dei glicerolul poate intra n celule prin difuzie pasiv, exist i alt mecanism de transport care opereaz simultan. Prin difuzie pasiv trec prin membrane molecule mici ca: H2O, O2 i CO2. Rata difuziei prin membrane permeabile selective este mult sporit prin folosirea proteinelor cru, numite uneori permeaze, care sunt incluse n membrana plasmatic. Atunci cnd intervin proteinele cru procesul se numete difuzie facilitat. Rata difuziei facilitate crete cu gradientul de concentraie i are loc la concentraii mai sczute ale moleculei care difuzeaz dect n cazul difuziei pasive. Transportul activ. Dei difuzia facilitat poate muta eficient molecule n interiorul celulei, atunci cnd concentraia este mai mare n exterior, aceasta nu poate prelua molecule care se gsesc deja n concentraii mari n interiorul celulei (adic, mpotriva unui gradient de densitate). Microorganismele triesc adesea n habitate caracterizate prin prezenta nutrienilor n concentraii reduse i pentru a supravieui ele trebuie s transporte i s concentreze aceti nutrieni. Deoarece mecanismele difuziei facilitate nu sunt totdeauna adecvate, trebuie folosite alte mecanisme. Transportul activ este transportul unor molecule dizolvate spre concentraii mai mari, adic mpotriva unui gradient de concentraie, folosind un input de energie metabolic. Deoarece transportul activ implic activitatea unor proteine cru, este asemntor difuziei facilitate. Exist o mare specificitate a proteinelor cru fa de molecula transportat. Transportul activ se deosebete, ns de difuzia facilitat prin folosirea energiei metabolice i prin capacitatea de a concentra substane. Inhibitorii metabolismului inhib i transportul activ, dar nu afecteaz difuzia facilitat (cel puin pentru perioade scurte de timp). Proteinele cru sunt localizate n spaiul periplasmatic al bacteriilor Gram negative. Aceste proteine periplasmatice, care sunt implicate i n chemotaxie, se leag de moleculele care urmeaz s fie transportate i interacioneaz apoi cu proteinele de transport membranare pentru a muta moleculele n interiorul celulei. Acest complex pare s aib cteva subuniti i formeaz un por n membran. Sursa de energie este ATP-ul, dei pot fi folosii i ali compui nalt energetici. Prin acest mecanism E. coli transport o mare varietate de glucide (maltoz, galactoz, riboz) i de aminoacizi (histidin, leucin). Transportul cu ajutorul ATP-ului se ntlnete i la bacteriile Gram pozitive, dar mecanismul este mai puin neles. Translocaia de grup. n transportul activ moleculele trec prin membrane fr modificri. Numeroase procariote pot prelua molecule prin translocaie de grup. Acesta reprezint procesul de transport n celul a unei molecule care a fost modificat chimic. Cel mai cunoscut sistem implicat n acest tip de transport este sistemul fosfoenolpiruvatului. El transport n interiorul celulei bacteriene 126
Proiectul pentru nvmntul Rural

Nutriia i creterea microorganismelor

numeroase glucide pe care le fosforileaz folosind fosfoenolpiruvat ca donator de fosfat. PEP + glucid (exterior)

piruvat + glucid-P (interior)

Acest sistem este complex i const din cel puin dou enzime implicate; este larg rspndit la procariote, dar nu se ntlnete la eucariote. Teste de autoevaluare TA 6.6 Prin ce se deosebete difuzia facilitat de transportul activ? ................................................................................................................. ................................................................................................................. ................................................................................................................. TA 6.7 Explicai implicarea proteinelor cru n transportul activ. ................................................................................................................. ................................................................................................................. ................................................................................................................. ................................................................................................................. ................................................................................................................. 6.1.6 Medii de cultur Microbiologia depinde n mare msur de capacitatea de a crete i a pstra microorganismele n laborator. Acest lucru este posibil doar prin utilizarea unor medii de cultur adecvate. Mediile de cultur sunt eseniale pentru izolarea i identificarea microorganismelor (vezi Caseta 8), pentru testarea sensibilitii la antibiotice, pentru analiza apei i a alimentelor, n microbiologia industrial etc. Dei toate microorganismele necesit surse de energie, carbon, azot, fosfor, sulf i diferite minerale, compoziia optim a unui mediu va depinde de specia ce urmeaz a fi cultivat, ntruct necesitile nutriionale variaz foarte mult. Cunotinele despre habitatul normal al microorganismelor sunt ades foarte utile pentru selectarea celui mai adecvat mediu de cultur, deoarece necesitile nutriionale reflect compoziia mediului nconjurtor. n mod obinuit, mediile de cultur sunt utilizate pentru a selecta i crete anumite microorganisme sau pentru a identifica anumite specii. Medii sintetice i medii complexe. Mediile sintetice sunt medii simple, la care se cunosc toate componentele chimice. Astfel, unele microorganisme, n special autotrofele fotolitotrofe (cianobacterii i alge eucariote) pot crete pe medii simple, care conin CO2 ca surs de carbon (adesea adugat sub form de carbonat sau bicarbonat), nitrat sau amoniac ca surs de azot, sulfat, fosfat i nc cteva minerale. Numeroase chemoorganotrofe pot crete foarte bine ntr-un mediu sintetic simplu cu glucoz ca surs de carbon i o sare de amoniu ca surs de azot. Aceste medii sunt larg utilizate n microbiologie, cu att mai mult cu ct, uneori, este deosebit de important s cunoatem ce metabolizeaz un anumit microorganism. Mediile complexe sunt mediile care conin unele ingrediente cu compoziie chimic necunoscut. Asemenea medii sunt foarte utile, ntruct pot fi suficient de bogate i complete nct s satisfac necesitile nutriionale a numeroase tipuri de microorganisme. n plus,
Proiectul pentru nvmntul Rural

127

Nutriia i creterea microorganismelor

mediile complexe sunt necesare cnd nu se cunosc cerinele nutritive ale microorganismelor ce urmeaz s fie cultivate. Mediile complexe conin componente nedefinite ca peptona, extractul de carne, extractul de drojdii etc. Dac este necesar ca un mediu s fie folosit pentru cultivarea pe suprafaa lui a microorganismelor, mediile lichide se pot solidifica prin adugarea de agar. Agarul este un polimer cu sulf format n principal din galactoz i acid glucuronic, fiind extras din alge roii. Tipuri de medii de cultur Mediile de cultur sunt clasificate dup utilizarea lor n: medii uzuale sau medii generale, medii selective i medii difereniale. Mediile uzuale sunt cele care permit creterea a numeroase microorganisme. n aceast categorie intr medii lichide ca bulionul de carne, apa peptonat sau solidificate precum geloza nutritiv. Acestor medii generale li se pot aduga nutrieni speciali (de exemplu snge) pentru a fora creterea unor heterotrofe mai pretenioase, n care caz sunt denumite medii mbogite. Mediile selective favorizeaz creterea anumitor microorganisme. De exemplu, unii colorani precum fuxina bazic i cristal violet favorizeaz creterea bacteriilor Gram- prin inhibarea creterii celor Gram+, fr a afecta negativ microorganismele. Bacteriile pot fi de asemenea selectate prin incubare cu nutrieni pe care i utilizeaz n mod specific. Un mediu care conine numai celuloz ca surs de carbon i energie va fi eficient n izolarea bacteriilor celulozolitice. Posibilitile de selecie ale microorganismelor sunt nenumrate, n prezent fiind folosite foarte multe medii selective. Mediile difereniale sunt medii care deosebesc ntre diferite grupuri de bacterii i permit identificarea microorganismelor pe baza unor caracteristici biologice. Mediul pe baz de snge agarizat, care este att un mediu diferenial ct i un mediu mbogit, face distincia ntre bacteriile hemolitice i nonhemolitice. Bacteriile hemolitice (streptococi sau stafilococi) produc zone clare n jurul coloniilor datorit distrugerii hematiilor. Teste de autoevaluare TA 6.8 Care este deosebirea dintre mediile de cultur sintetice i cele complexe? ................................................................................................................. ................................................................................................................. ................................................................................................................. TA 6.9 Ce sunt mediile mbogite? ................................................................................................................. ................................................................................................................. ................................................................................................................. TA 6.10 Mediile de cultur care conin ca unic surs de carbon celuloza folosesc pentru izolarea: a) bacteriilor Gram+ b) bacteriilor celulozolitice c) bacteriile hemolitice i nonhemolitice d) bacteriilor Gram+ i Gram128
Proiectul pentru nvmntul Rural

Nutriia i creterea microorganismelor

Caseta 8 Izolarea culturilor pure n habitatele naturale microorganismele cresc n mod obinuit n comuniti complexe, formate din populaii aparinnd la mai multe specii. Acest lucru ngreuneaz munca cercettorilor, deoarece un microorganism nu poate fi studiat corespunztor n culturi mixte. Pentru caracterizarea unei specii sunt necesare culturi pure, adic populaii de celule care rezult din multiplicarea unei singure celule. Culturile pure sunt att de importante, nct dezvoltarea acestei tehnici de ctre bacteriologul german Robert Koch a reprezentat un pas de cotitur n dezvoltarea microbiologiei. ntr-un timp relativ scurt au fost izolai numeroi ageni patogeni responsabili pentru apariia multora dintre maladiile bacteriene umane. Se cunosc mai multe tehnici pentru obinerea culturilor pure. O prim etap pentru obinerea unei culturi pure este obinerea coloniilor izolate ale diferitelor specii de microorganisme, care alctuiesc o prob. Pentru aceasta se folosesc cteva tehnici ca: 1) tehnica epuizrii ansei, 2) tehnica diseminrii inocului pe suprafaa mediului i 3) tehnica nsmnrii prin ncorporare. 1) n tehnica epuizrii ansei, pentru recoltarea probei se folosete o ans n care se preleveaz o cantitate minim de prob. Bucla ansei parcurge un traseu lung pe suprafaa mediului solidificat, lsnd n fiecare sector al plcii un numr progresiv mai mic de celule, aa nct crete ansa depunerii unor celule izolate spaial. n timpul incubrii, prin multiplicarea lor rezult colonii izolate. 2) Tehnica diseminrii inoculului pe suprafaa mediului const n etalarea unei mici cantiti de inocul pe suprafaa unei plci cu mediu nutritiv, astfel ca celulele din inocul s fie izolate spaial. 3) Tehnica izolrii prin ncorporare este utilizat pentru microorganismele care necesit o presiune parial a oxigenului mai redus dect cea atmosferic i const n ncorporarea inoculului n mediu nainte de solidificare. Dezvoltarea coloniilor pe suprafaa mediului cu agar permite identificarea bacteriilor, deoarece speciile formeaz colonii de mrime i cu aspect caracteristic. Atunci cnd un amestec de populaii a fost nsmnat corespunztor este posibil s putem identifica colonia dorit n funcie de caracteristicile ei i s o putem folosi pentru a obine culturi pure. 6.1.7 Rezumatul capitolului 6.1 Pentru producerea de energie i pentru biosinteze microorganismele necesit nutrieni. Macronutrienii (C, O, H, N, S, P, K, Mg i Fe) sunt necesari n cantiti mari, iar micronutrienii (Mn, Zn, Co, Mo, Ni, Cu etc.) sunt necesari n cantiti foarte mici. Autotrofele folosesc CO2 ca unic sau principal surs de energie; heterotrofele utilizeaz molecule organice. Microorganismele pot fi clasificate pe baza surselor de electroni i energie. Fototrofele folosesc energia
Proiectul pentru nvmntul Rural

luminoas, iar chemotrofele obin energie din oxidarea compuilor chimici. Azotul, fosforul i sulful pot fi obinui din aceleai molecule organice care folosesc ca surse de carbon, prin ncorporare direct de amoniac i fosfat sau prin reducerea i asimilarea moleculelor organice oxidate, Majoritatea microorganismelor necesit factori de cretere. Dei unii nutrieni pot intra n celule prin difuzie pasiv, de obicei sunt necesare proteine cru. 129

Nutriia i creterea microorganismelor

Difuzia facilitat nu necesit surs de energie; transportul activ folosete energie metabolic i proteine cru pentru a concentra i transporta molecule n interiorul celulei. Bacteriile pot transporta, de asemenea, molecule pe care nti le transform. Acest proces se numete translocaie de grup. Mediile de cultur pot fi alctuite n totalitate din compui chimici (medii sintetice) sau pot conine constitueni,

ca peptona sau extractul de drojdii, a cror compoziie chimic exact nu se cunoate (medii complexe). Dup compoziie i scopul n care se utilizeaz, mediile de cultur sunt: uzuale, mbogite, selective i difereniale. Culturile pure se obin prin izolarea celulelor prin diferite tehnici de cultivare. Microorganismele care cresc pe medii solide formeaz colonii cu morfologie distinct.

6.2. Creterea microbian


Acest capitol se ocup de aspecte privind creterea microorganismelor ntr-un mediu cu aport adecvat de nutrieni. Sunt descrise etapele creterii, precum i modul n care aceasta poate fi msurat. La finalul capitolului este prezentat influena unor factori de mediu asupra creterii microorganismelor. 6.2.1. Curba de cretere Creterea reprezint mrirea coordonat a tuturor constituenilor chimici ai unui microorganism ca rezultat al adugrii de substan nou. Numrul de celule crete atunci cnd microorganismele se reproduc prin nmugurire sau diviziune binar. n cazul diviziunii, celulele i mresc dimensiunile i se divid dnd natere la dou celule-fiice, de dimensiuni aproximativ egale. Este dificil de investigat creterea i reproducerea microorganismelor individuale datorit dimensiunilor lor foarte mici. De aceea, studiul creterii microorganismelor urmrete modificrile numrului total de indivizi dintr-o populaie. Creterea populaiei este analizat prin studierea curbei de cretere a unei culturi microbiene, cultivat ntr-un sistem nchis. Deoarece n timpul incubrii nu mai este adugat mediu de cultur proaspt, concentraia nutrienilor scade, n timp ce concentraia produilor rezultai n urma metabolismului bacterian sau n urma morii unor celule crete. Creterea microorganismelor care se nmulesc prin diviziune binar poate fi reprezentat grafic ca logaritmul numrului de celule versus timpul de incubaie. Curba de cretere rezultat are patru faze: 1) faza de lag, 2) faza de cretere exponenial, 3) faza staionar i 4) faza de declin i moarte celular (Figura 6.3). 1) Faza de lag urmeaz imediat introducerii microorganismelor ntr-un mediu proaspt de cultur i se caracterizeaz prin lipsa creterii numrului sau masei celulare. Dei nu are loc diviziunea celular celulele i sintetizeaz noi constitueni. Faza de lag este necesar naintea nceperii diviziunii celulare din mai multe motive. Celulele pot fi btrne i srace n ATP, cofactori eseniali i 130
Proiectul pentru nvmntul Rural

Nutriia i creterea microorganismelor

ribozomi. Ca urmare, ele trebuie s sintetizeze aceti compui nainte s nceap s creasc. De asemenea, mediul de cultur poate fi diferit fa de mediul n care microorganismele au crescut anterior. n aceast situaie sunt necesare noi enzime, care s permit utilizarea nutrienilor diferii. Faza de lag variaz ca lungime n funcie de starea microorganismelor i de natura mediului de cultur. De exemplu, cnd o cultur tnr, aflat n faza de cretere exponenial este transferat pe un mediu proaspt de cultur, faza de lag poate fi foarte scurt sau chiar absent.

Figura 6.3 Curba ideala de cretere microbiana n cultura

2) Faza de cretere exponenial (de log) este faza n care microorganismele cresc i se divid cu rata maxim posibil n funcie de potenialul lor genetic i natura mediului. Rata de cretere este constant n timpul fazei exponeniale, microorganismele diviznduse i dublndu-i numrul la intervale regulate de timp. Populaia este uniform din punct de vedere al proprietilor chimice i fiziologice. Ca urmare, culturile aflate n aceast faz pot fi folosite n studii biochimice i fiziologice. 3) Faza staionar corespunde momentului n care creterea nceteaz, iar curba devine orizontal. Faza staionar este atins atunci cnd populaia bacterian ajunge la 109 celule per mililitru. Protozoarele i algele nu depesc n culturi valori mai mari de 106 celule per mililitru. Mrimea final a populaiei depinde de cantitatea de nutrieni i de ali factori, ca i de tipul de microorganisme cultivat. n faza staionar numrul de microorganisme viabile rmne constant. Acest lucru se poate datora unui echilibru ntre diviziunea celular i moartea celulelor, sau faptului c, dei populaia nu se mai divide, continu s fie activ metabolic. Populaiile microbiene intr n faza staionar din mai multe motive. Unul dintre factorii cei mai importani este scderea drastic a concentraiei unui nutrient important, care ncetinete iniial creterea. De exemplu, microorganismele aerobe sunt limitate de scderea concentraiei de O2. Alt factor care duce la ncetarea creterii este acumularea de produi toxici n mediu. Numeroase culturi anaerobe sunt afectate de acest factor; streptococii pot produce prin fermentaia zaharurilor cantiti mari de acid lactic, iar mediul devine att de acid nct inhib creterea. Dar streptococii pot intra n faza staionar i prin reducerea cantitii de zaharuri.
Proiectul pentru nvmntul Rural

131

Nutriia i creterea microorganismelor

4) Faza de declin i moarte celular este rezultatul scderii concentraiei de nutrieni i acumulrii de produi reziduali. n aceast faz numrul de celule descrete vizibil. Moartea populaiilor bacteriene, la fel ca i creterea, se produce logaritmic (exponenial), astfel c o anumit proporie de celule moare n fiecare or. Acest model este valabil chiar i cnd numrul de celule rmne constant datorit faptului c dup ce mor celulele nu sufer liza celular. Singurul mod prin care se poate stabili dac o celul bacterian este viabil sau nu este incubarea ei n mediu proaspt de cultur. Teste de autoevaluare TA 6.11 Definii creterea microorganismelor. ................................................................................................................. ................................................................................................................. ................................................................................................................. TA 6.12 Care este modalitatea de studiu a creterii pentru populaiile de microorganisme? ................................................................................................................. ................................................................................................................. TA 6.13 Enumerai fazele curbei de cretere. ................................................................................................................. ................................................................................................................. TA 6.14 Populaiile de microorganisme intr n faza staionar pentru c: a) scade concentraia unui nutrient important b) se acumuleaz cantiti mari de produi reziduali c) numrul celulelor viabile crete d) unele bacterii sufer liz celular. TA 6.15 Ce factori influeneaz rata de cretere n faza exponenial? ................................................................................................................. ................................................................................................................. 6.2.2 Estimarea creterii Datorit importanei practice deosebite, att pentru cercetrile de fiziologia microorganismelor, ct i pentru aplicaiile practice biotehnologice, cunoaterea i aprecierea creterii microorganismelor este esenial. Astfel se explic interesul pentru definirea unor parametri care s caracterizeze acest proces. Pentru estimarea creterii se folosesc urmtorii parametri: timpul de generaie, numrul de celule, masa celular. Timpul de generaie. n timpul fazei exponeniale de cretere fiecare microorganism se divide la intervale constante. Astfel, populaia se va dubla numeric la un interval de timp specific numit timp de generaie. Presupunnd ca ntr-un tub de cultur este inoculat o celul care se divide la fiecare 20 de minute, dup 20 de minute populaia va fi format din 2 celule, dup 40 de minute din 4 celule i tot aa. Deoarece populaia se dubleaz la fiecare generaie, creterea populaiei este totdeauna 2n, unde n este numrul de generaii. Creterea rezultat este exponenial (Figura 6.4). 132
Proiectul pentru nvmntul Rural

Nutriia i creterea microorganismelor

Figura 6.4. Timpul de generaie pentru cteva tipuri de microorganisme


Microorganismul Bacterii Beneckea natriegens Escherichia coli Bacillus subtilis Clostridium botulinum Mycobacterium tuberculosis Anacystis nidulans Anabaena cylindrica Rhodospirillum rubrum Alge Chlorella pyrenoidosa Scenedesmus quadricauda Asterionella formosa Skeletonema costatum Ceratium tripos Euglena gracilis Protozoare Acanthamoeba castellani Paramecium caudatum Tetrahymena geleii Leishmania donovani Giardia lamblia Fungi Saccharomyces cerevisiae Monilinia fructicola Temperatura (0C) 37 40 40 37 37 41 25 25 25 25 20 18 20 25 30 26 24 26 37 30 25 Timpul de generaie (ore) 0,16 0,35 0,43 0,58 12,00 2,0 10,6 4,6-5,3 7,75 5,9 9,6 13,1 82,8 10,9 11-12 10,4 2,4-4,2 10-12 18 2 30

Timpul de generaie variaz n funcie de specia de microorganisme i de condiiile de mediu i este cuprins ntre 10 minute pentru unele bacterii i cteva zile pentru microorganisme eucariote (Figura 2.4). Timpul de generaie n natur este mai scurt dect cel din culturi. Numrul de celule dintr-o populaie se exprim diferit n funcie de mediul de cultur utilizat. Pentru culturile pe medii lichide se exprim ca numrul de celule din populaie raportat la unitatea de volum i poate fi determinat prin numrare n camere speciale de numrare sau cu numrtoare electronice, dac este vorba de microorganisme de talie mare. Pentru culturile pe medii solide, numrul se exprim ca uniti formatoare de colonii, pornind de la faptul c nu putem fi siguri c fiecare colonie aprut rezult dintr-o celul individual. Masa celular se exprim ca miligrame de substan uscat pe mililitru de cultur. De ceea un pas important l reprezint estimarea greutii uscate fie prin cntriri repetate, fie prin msurtori de turbiditate sau prin msurtori indirecte (determinarea concentraiei de azot sau determinarea intensitii unor activiti metabolice).

Proiectul pentru nvmntul Rural

133

Nutriia i creterea microorganismelor

6.2.3 Culturi continue Anumite experimente de laborator sau anumite procese de producie industrial necesit existena unor microorganisme n faza de cretere exponenial. Acest lucru nu se poate realiza timp ndelungat n condiiile obinuite de cultivare ntr-un spaiu nchis, respectiv ntr-un volum fix de mediu nerennoit, n care faza exponenial are un numr limitat de generaii, iar unele condiii de mediu devin limitante. n aceast situaie, prelungirea fazei experimentale se poate realiza numai prin transferuri repetate, n medii optime noi, la intervale scurte de timp. J. Monod i separat Novick i Szilard (1950) au introdus o metod nou, tehnica culturilor continue, imaginnd un dispozitiv numit chemostat, care se bazeaz pe principiul diluiei continue la volum constant. Chemostatul este un sistem de cultivare deschis, n care se adaug continuu mediu de cultur proaspt, cu o rat definit i constant. Volumul total este meninut constant de un dispozitiv care permite recoltarea cu aceeai rat a unei pri din mediul de cultur, care conine microorganisme multiplicate. Mediul de cultur dintr-un chemostat conine un nutrient esenial (de exemplu un amino-acid) care se gsete n concentraie limitat. Datorit prezenei acestui nutrient limitant, rata de cretere este determinat de rata cu care mediul proaspt este introdus n vasul de cultur, iar densitatea final a celulelor depinde de concentraia factorului limitant. Teste de autoevaluare TA 6.16 Explicai de ce timpul de generaie este mai scurt n culturi de laborator dect n natur. ....................................................................................................................... ....................................................................................................................... ..................................................................................................... TA 6.17 Ce este chemostatul? ....................................................................................................................... ....................................................................................................................... ..................................................................................................... 6.2.4. Influena factorilor de mediu asupra creterii Creterea microorganismelor este puternic afectat de natura fizic i chimic a mediului nconjurtor. nelegerea influenei mediului ajut la controlul creterii microorganismelor i la studiul distribuiei ecologice a acestora. 6.2.4.1. Presiunea osmotic Deoarece microorganismele sunt separate de mediul nconjurtor printr-o membran plasmatic permeabil, ele pot fi afectate de modificrile concentraiei osmotice din exterior. Unele microorganisme sunt afectate n mai mic msur de aceste modificri i aparin microorganismelor osmotolerante; acestea pot crete n condiii foarte variate din punct de vedere al presiunii osmotice, respectiv n condiii foarte variate n ceea ce privete concentraia diferitelor substane dizolvate n ap. Totui doar foarte 134
Proiectul pentru nvmntul Rural

Nutriia i creterea microorganismelor

puine microorganisme sunt cu adevrat osmotolerante i de aceea metodele de conservare ale alimentelor prin uscare sau prin adugarea de cantiti mari de sare sau zahr previn alterarea acestora. Totui, numeroi fungi sunt osmotolerani i din aceast cauz pot determina alterarea unor alimente uscate sau conservate. Halofilele sunt microorganisme foarte adaptate la condiii de salinitate; ele necesit pentru cretere concentraii mari de clorur de sodiu (ntre 2,8M i saturaie). De exemplu, genul Halobacterium poate fi izolat din habitate acvatice n care concentraia de sare atinge saturaia. Halobacterium i alte cteva bacterii halofile extreme prezint modificri semnificative n structura proteinelor i ale membranelor. Acest lucru nu se ntlnete la microorganismele osmotolerante, care doar i mresc concentraia mediului intracelular (vezi Caseta 9). Caseta 9 Bacteriile halofile Halofilele sunt arheobacterii, fiind astfel foarte diferite de restul bacteriilor. Aceste halofile, pentru a-i menine hipertonicitatea acumuleaz cantiti enorme de potasiu; concentraia intern de potasiu este cuprins ntre 4 i 7M. Enzimele, ribozomii i proteinele de transport necesit pentru a fi stabile chimic i active funcional nivele mari de potasiu. n plus, membrana plasmatic i peretele celular de la Halobacterium sunt meninute stabile prin intermediul unor concentraii mari de ioni de sodiu. Dac concentraia sodiului descrete foarte mult, peretele celular i membrana plasmatic se dezintegreaz. Bacteriile halofile extreme s-au adaptat cu succes la condiii de mediu care ar mpiedica supravieuirea majoritii microorganismelor. n acest proces, ele au pierdut flexibilitatea ecologic i pot s se dezvolte numai n puine habitate extreme. 6.2.4.2. pH pH-ul este o msur a activitii ionilor de hidrogen dintr-o soluie i poate fi definit ca logaritmul negativ al concentraiei ionilor de hidrogen. pH = - log [H+] = log (1/[H+]) Fiecare specie are un domeniu bine definit al valorilor pH-ului la care creterea se desfoar n condiii optime. Dup preferinele fa de valorile pH-ului, microorganismele pot fi acidofile, neutrofile i alcalofile (bazofile). Acidofilele cresc la valori pH cuprinse ntre 0 i 5, neutrofilele ntre 5,5 i 8,0, iar alcalofilele prefer domeniul 8,5 11,5. n general diferitele grupuri de microorganisme au anumite preferine fa de pH. Astfel, majoritatea bacteriilor i protozoarelor sunt neutrofile, fungi prefer pH-ul acid, cu valori ntre 4 i 6, iar algele, de asemenea, sunt favorizate de valori uor acide. Exist ns numeroase excepii fa de aceste valori generale. De exemplu, bacteria Sulfolobus acidocaldarius i alga Cyanidium caldariusi sunt comune n izvoarele termale acide; ambele cresc foarte bine la pH cuprins ntre 1 i 3 i la temperaturi ridicate. Dei microorganismele pot adesea s creasc n condiii destul de variate de pH, exist ns i limite ale toleranei lor. Variaiile drastice de pH pot distruge membrana plasmatic sau s inhibe
Proiectul pentru nvmntul Rural

135

Nutriia i creterea microorganismelor

activitatea enzimelor i ale proteinelor membranare. Bacteriile mor dac pH-ul intern scade mult sub 5 sau 5,5. Modificrile externe de pH pot de asemenea, s altereze ionizarea moleculelor folosite ca nutrieni i astfel s reduc accesibilitatea lor pentru organism. n ciuda variaiilor valorilor pH-ului din habitatele naturale, la majoritatea microorganismelor pH-ul intern este aproape de neutru. Ades, microorganismele modific pH-ul propriului habitat prin producerea de produi metabolici acizi sau bazici. Microorganismele fermentative produc acizi pornind de la carbohidrai, n timp ce chemolitotrofele ca Thiobacillus oxideaz compui redui cu sulf la acid sulfuric. Alte microorganisme alcalinizeaz mediul prin producerea de amoniac prin degradarea amino-acizilor. Teste de autoevaluare TA 6.18 Ce sunt microorganismele halofile? .................................................................................................................... .................................................................................................................... .................................................................................................................... TA 6.19 Clasificai microorganismele dup preferinele fa de valorile pH-ului. .................................................................................................................... .................................................................................................................... .................................................................................................................... TA 6.20 Cum influeneaz variaiile drastice de pH microorganismele? .................................................................................................................... .................................................................................................................... .................................................................................................................... 6.2.4.3. Temperatura Microorganismele, la fel ca alte organisme, sunt profund afectate de temperatur. Microorganismele sunt cu att mai sensibile cu ct sunt n general unicelulare i de asemenea poikiloterme, adic temperatura lor variaz odat cu cea a mediului extern. Cel mai important factor care determin efectul temperaturii asupra creterii este sensibilitatea reaciilor catalizate de enzime. Temperaturile ridicate produc daune microorganismelor prin denaturarea enzimelor, proteinelor transportoare i a altor proteine. Membranele microbiene sunt de asemenea distruse de cldur. Astfel, dei majoritatea enzimelor funcioneaz mai bine la temperaturi mai mari, microorganismele pot fi afectate ntr-o asemenea msur, nct creterea este inhibat deoarece daunele produse nu pot fi reparate. n domeniul de temperaturi caracteristice microorganismelor, n funcie de influena lor asupra creterii, ntlnim temperatur minim, optim i maxim. Aceste temperaturi se numesc temperaturi cardinale i variaz foarte mult de la un microorganism la altul. Temperatura optim este cuprins n general ntre 00C i 750C, n timp ce creterea microbian poate avea loc la temperaturi cu prinse ntre -200C i peste 1000C. 136

Proiectul pentru nvmntul Rural

Nutriia i creterea microorganismelor

Domeniul temperaturilor de cretere pentru un anumit microorganism se ntinde de obicei pe aproximativ 300C. Unele specii (ca de exemplu Neisseria gonorrhoea) au un domeniu restrns de temperaturi i n aceast situaie se numesc stenoterme, iar cele care au un domeniu larg de temperaturi se numesc euriterme. Tipurile majore de microorganisme difer unele de celelalte prin temperatura maxim de cretere. Limita superioar pentru protozoare este de 50 0C. Unele alge i fungi pot crete i la temperaturi cuprinse ntre 550C i 600C. Bacteriile pot crete i la aproximativ 1000C, iar recent au fost descoperite bacterii care triesc la temperaturi i mai mari. n mod evident, procariotele pot crete la temperaturi mai mari dect eucariotele. S-a sugerat c eucariotele nu sunt capabile s produc membrane ale organitelor stabile i funcionale la temperaturi mai mari de 600C. Dup domeniul de temperatur tolerat, microorganismele se mpart n 5 clase: 1. Psichrofile, care cresc bine la temperaturi ntre 00C i 150C. Temperatura maxim este n jur de 200C. Aceste microorganisme au fost izolate din habitate din Arctica i Antarctica i sunt n majoritate bacterii, dei printre ele se gsesc i alge. 2. Psichrotrofe sau facultativ psichrofile sunt 0 microorganismele care pot crete i la 0 C, dei au temperatura optim cuprins ntre 20 i 300C, iar maxima de 350C. Sunt reprezentate n special de bacterii i fungi i sunt principalii responsabili de alterarea alimentelor. 3. Mezofile, care au temperatura optim ntre 20 i 450C, iar minima la 15-200C. majoritatea microorganismelor se ncadreaz n aceast categorie. 4. Termofile sunt microorganismele care pot crete la temperaturi mai mari de 550C sau mai mult. Creterea minim se nregistreaz n jurul valorii de 450C, iar temperatura optim este cuprins ntre 55 i 650C. Majoritatea sunt bacterii, dar sunt incluse i cteva specii de alge i fungi. 5. Hipertermofilele sunt cteva termofile care pot crete la 0 90 C i mai mult, unele dintre ele avnd temperatura optim la mai mult de 1000C. De obicei, acestea nu pot crete la temperaturi mai mici de 550C.

Proiectul pentru nvmntul Rural

137

Nutriia i creterea microorganismelor

Teste de autoevaluare TA 6.21 Explicai de ce eucariotele nu pot suporta temperaturi la fel de mari ca procariotele. .................................................................................................................. .................................................................................................................. .................................................................................................................. TA 6.22 Enumerai principalele clase de microorganisme n funcie de domeniul de temperaturi tolerat. .................................................................................................................. .................................................................................................................. .................................................................................................................. TA 6.23 De ce sunt considerate microorganismele poikiloterme? .................................................................................................................. .................................................................................................................. ...........................................................................................................................

6.2.4.4. Oxigenul Organismele capabile s triasc n prezena oxigenului atmosferic se numesc aerobe, spre deosebire de cele care cresc n absena lui i care sunt anaerobe. Aproape toate organismele superioare sunt complet dependente de oxigenul atmosferic, fiind astfel obligat aerobe. Oxigenul folosete ca acceptor final de electroni pentru lanul transportor de electroni, n respiraia aerob. n plus eucariotele aerobe folosesc oxigenul pentru sinteza sterolilor i a acizilor grai nesaturai. Facultativele aerobe nu necesit O2 pentru cretere, dar cresc mai bine n prezena acestuia. Anaerobii aerotolerani precum Enterococcus faecalis cresc la fel de bine i n prezena i n absena O2. Spre deosebire de aceste microorganisme, cele strict sau obligat anaerobe (de exemplu, Bacteroides, Fusobacterium, Clostridium pasteurianum, Methanococcus) nu tolereaz deloc O2 i mor n prezena acestuia. Microorganismele aerotolerante i cele strict anaerobe nu pot genera energie prin respiraie i folosesc n acest scop fermentaia i respiraia anaerob. Exist, de asemenea, cteva microorganisme aerobe, aa cum este Campylobacter, numite microaerofile, care sunt afectate de nivelul normal de oxigen atmosferic (20%) i necesit concentraii mai sczute de O2 (2-10%). Toate cele cinci tipuri de organisme au reprezentani printre bacterii i protozoare. Fungii sunt n mod normal aerobe, dar cteva specii (n special dintre drojdii) sunt facultativ anaerobe. Dei microorganismele strict anaerobe nu pot tri n prezena O2 ele au fost descoperite n habitate care par aerobe. n asemenea situaii sunt asociate cu microorganisme facultativ aerobe, care folosesc oxigenul disponibil, fcnd posibil creterea celor strict anaerobe. 138

Proiectul pentru nvmntul Rural

Nutriia i creterea microorganismelor

Aceste relaii diferite cu oxigenul apar datorit ctorva factori, inclusiv inactivarea proteinelor i efectul toxic al unor compui cu oxigen. Enzimele pot fi inactivate cnd anumite grupri sulfhidril sunt oxidate. Un exemplu deosebit este enzima nitrogenaza de la microorganismele fixatoare de azot, care este inhibat n prezena oxigenului. n ceea ce privete unii compui, cum sunt radicalul superoxid, peroxidul sau radicalul hidroxil, acetia sunt extrem de toxici pentru c sunt ageni oxidani foarte puternici i distrug rapid constituenii celulari. Un microorganism trebuie s fie capabil s se protejeze singur mpotriva acestor produi. Numeroase microorganisme posed enzime care ofer protecie mpotriva compuilor toxici cu O2. Aerobii obligai i anaerobii facultativi conin de obicei enzime, superoxid dismutaza i catalaza, care catalizeaz distrugerea radicalului superoxid. Microorganismele aerotolerante nu au catalaz, dar aproape ntotdeauna au superoxid dismutaz. Toate anaerobele stricte nu au aceste enzime sau le au n concentraie foarte sczut, aa nct nu pot tolera prezena oxigenului. 6.2.4.5. Presiunea Majoritatea organismelor i duc viaa pe sol sau la suprafaa apei, aa nct sunt ntotdeauna supuse unei presiuni de 1 atmosfer, nefiind niciodat afectate semnificativ de presiune. Totui, pe fundul mrilor i oceanelor, unde presiunea hidrostatic poate atinge ntre 600 i 1100 de atmosfere, iar temperatura este cuprins ntre 2 i 3 0C, triesc unele specii de bacterii. Numeroase bacterii sunt barotolerante, adic presiunea le afecteaz, dar nu att de mult ca pe bacteriile netolerante. Unele bacterii sunt ns barofile, adic cresc mai bine la presiuni ridicate i n general nu pot fi cultivate la presiuni normale. Deoarece triesc la adncimi mari, acestea sunt importante n reciclarea nutrienilor pe fundul mrilor i oceanelor. Teste de autoevaluare TA 6.24 n ce const efectul negativ al oxigenului asupra unor microorganisme? .................................................................................................................... .................................................................................................................... .................................................................................................................... TA 6.25 De ce se sunt importante microorganismele barotolerante? .................................................................................................................... .................................................................................................................... .................................................................................................................... .................................................................................................................... .................................................................................................................... ....................................................................................................................

Proiectul pentru nvmntul Rural

139

Nutriia i creterea microorganismelor

6.2.5 Rezumatul capitolului 6.2 Creterea reprezint o sporire a constituenilor celulari, care duce la sporirea dimensiunilor celulelor i a numrului acestora. Atunci cnd microorganismele sunt cultivate n sisteme nchise, curba de cretere are, n mod obinuit patru faze: de lag, de cretere exponenial, staionar i de declin i moarte celular. n faza exponenial, numrul celulelor din populaie se dubleaz la intervale constante de timp, numite timp de generaie. Microorganismele pot fi cultivate n sisteme deschise n care continuu sunt furnizai nutrieni, iar reziduurile evacuate. Chemostatul este un sistem deschis de culturi continue, n care populaia microbian este meninut n faza de log. Multe bacterii, alge i fungi sunt hipertone fa de habitat, iar modificrile n ceea ce privete presiunea osmotic a mediului nconjurtor le afecteaz. Cu toate acestea exist i organisme osmotolerante care pot crete n condiii din punct de vedere al presiunii osmotice. Halofilele necesit concentraii mari de clorur de sodiu pentru a supravieui. Fiecare specie are un pH optim pentru cretere, fa de care poate fi clasificat ca fiind acidofil, neutrofil sau bazofil. n plus, microorganismele pot modifica pH-ul mediului n care triesc. Microorganismele au domenii distincte de temperaturi pentru cretere, cu minime, optime i maxime caracteristice. Exist patru clase de microorganisme n funcie de preferinele fa de temperatur: psichrofile, facultativ psichrofile, mezofile i termofile. n funcie de rspunsul fa de prezena oxigenului microorganismele sunt mprite n cel puin 5 clase: obligat aerobe, facultativ anaerobe, aerotolerante anaerobe, strict anaerobe i microaerofile. Oxigenul este toxic datorit apariiei de peroxid i radicali superoxid i hidroxil. Acetia pot fi distrui de ctre enzimele superoxid dismutaz i catalaz. Multe microorganisme de pe fundul mrilor i oceanelor sunt barotolerante, dar unele sunt barofile i necesit presiuni ridicate pentru a supravieui.

6.3. Controlul microorganismelor prin intermediul agenilor fizici i chimici


Controlul i distrugerea microorganismelor are o importan practic excepional. Dei multe microorganisme sunt benefice, unele activiti ale acestora pot avea consecine negative deosebite pentru om. De aceea, este esenial s omorm sau s inhibm creterea unor microorganisme pentru a le minimaliza efectele.

140

Proiectul pentru nvmntul Rural

Nutriia i creterea microorganismelor

6.3.1 Definirea principalilor termeni folosii Din timpuri foarte vechi oamenii au practicat dezinfecia i sterilizarea, chiar dac nu se cunotea nimic despre existena microorganismelor. De exemplu, grecii antici ardeau sulf pentru a afuma cldirile. Nici astzi capacitatea de a distruge microorganismele nu este mai puin important, fiind util n conservarea alimentelor, prevenirea mbolnvirilor i n cercetrile de microbiologie. Terminologia folosit este deosebit de relevant, pentru c termeni ca dezinfectant i antiseptic sunt folosii cu uurin. Capacitatea de a controla creterea microorganismelor pe unele suprafee, cum sunt instrumentele chirurgicale sau vesela este de o importan vital. Uneori, este necesar s eliminm toate microorganismele de pe un anumit obiect, alteori este suficient doar o distrugere parial a acestora. Sterilizarea este procesul prin care toate celulele vii, spori viabili, virusuri i viroizi sunt fie distrui, fie eliminai dintr-un anumit habitat. Un obiect steril este liber n totalitate de microorganisme viabile, spori i ali ageni infecioi. Agenii chimici care determin sterilizarea se numesc sterilizani. Spre deosebire de sterilizare, dezinfecia reprezint omorrea, inhibarea sau ndeprtarea microorganismelor care cauzeaz mbolnviri. Dezinfectanii sunt, de obicei, ageni chimici. Dezinfecia nu sterilizeaz neaprat un obiect, deoarece pot supravieui cteva microorganisme, precum i sporii viabili. Frecvent, este necesar s controlm cu ajutorul agenilor chimici microorganismele care triesc pe esuturi vii . Antisepsia este prevenirea infectrii i se realizeaz prin intermediul antisepticelor. Unii agenii antimicrobieni au aciune germicid, deoarece omoar numeroase organisme patogene i nonpatogene, dar nu au efect asupra endosporilor. n funcie de grupul specific asupra crora acioneaz dezinfectanii sau agenii antiseptici sunt denumii bactericide, fungicide, algicide sau viricide. Alte substane chimice nu ucid, ci doar previn creterea microorganismelor; aa sunt spre exemplu bacteriostaticele sau fungistaticele. 6.3.2 Moartea microorganismelor O populaie microbian nu este omort instantaneu cnd este expus unui agent letal. Moartea populaiei, la fel ca i creterea, este n general exponenial, ceea ce nseamn c reducerea efectivului populaiei se face cu aceeai fracie, la intervale constante de timp. Cnd o populaie a fost puternic redus numeric, rata morii ncetinete datorit faptului c au supravieuit cele mai rezistente tulpini de microorganisme. Pentru a studia eficiena unui agent letal trebuie s putem decide dac microorganismele sunt moarte. Acest lucru nu este foarte uor de stabilit. O bacterie este considerat moart dac, atunci cnd este inoculat ntr-un mediu de cultur adecvat, nu mai crete.
Proiectul pentru nvmntul Rural

141

Nutriia i creterea microorganismelor

6.3.3 Condiii pe care trebuie s le ndeplineasc un agent antimicrobian Distrugerea i inhibarea creterii microorganismelor nu este simpl, deoarece un agent antimicrobian depinde de cel puin 6 factori: 1. Mrimea populaiei. O anumit proporie dintr-o populaie moare n fiecare interval; cu ct populaia este mai numeroas cu att este necesar un interval de timp mai lung pentru a o distruge n totalitate. 2. Compoziia populaiei. Eficiena unui agent antimicrobian variaz n funcie de natura microorganismelor, deoarece acestea difer n ceea ce privete sensibilitatea la aciunea agentului. Endosporii bacterieni sunt mult mai rezisteni dect formele vegetative, iar celulele tinere sunt distruse mai rapid dect cele mature. 3. Concentraia sau intensitatea agentului antimicrobian. Uneori, cu ct un agent chimic este mai concentrat sau un agent fizic mai intens, cu att mai rapid sunt distruse microorganismele. Cu toate acestea, relaia dintre concentraie/intensitate pe de o parte i eficien pe de alt parte nu este liniar. Pentru o scurt perioad de timp creterea concentraiei/intensitii determin o cretere exponenial a eficienei, dup care aceasta rmne staionar sau chiar scade. Uneori, un agent antimicrobian este mai eficient la concentraii reduse. De exemplu etanolul 70% este mai eficient dect cel de 90%. 4. Durata expunerii. Cu ct o populaie este expus un timp mai ndelungat la aciunea unui agent antimicrobian, cu att mai multe microorganisme vor fi distruse. 5. Temperatura. O cretere a temperaturii la care acioneaz un agent chimic poate s-i sporeasc activitatea. Frecvent, o concentraie mai sczut de agent dezinfectant sau sterilizator poate fi folosit eficient la temperatur mai ridicat. 6. Mediul. Populaia asupra creia se acioneaz nu este izolat ci este nconjurat de ali factori de mediu care o pot proteja, sau dimpotriv, pot accentua aciunea de distrugere. De exemplu, deoarece cldura omoar mai rapid la pH acid, fructele i tomatele sunt mai uor pasteurizate dect alimentele neutre, precum laptele. Teste de autoevaluare TA 6.26 Numii trei motive pentru care este important controlul creterii microorganismelor. .................................................................................................................... .................................................................................................................... .................................................................................................................... TA 6.27 Care este diferena ntre sterilizare i dezinfecie? .................................................................................................................... .................................................................................................................... TA 6.28 Definii agenii antiseptici i germicidele. .................................................................................................................... .................................................................................................................... TA 6.29 Enumerai condiiile pe care trebuie s le ndeplineasc un agent antimicrobian pentru a fi eficient. .................................................................................................................... .................................................................................................................... .................................................................................................................... 142
Proiectul pentru nvmntul Rural

Nutriia i creterea microorganismelor

6.3.4. Metode fizice folosite pentru controlul microorganismelor Cei mai folosii ageni fizici pentru controlul creterii microorganismelor sunt: cldura, filtrarea, radiaiile ultraviolete i radiaiile ionizante. Cldura Focul i fierberea apei au fost folosite de pe vremea Greciei antice pentru sterilizare i dezinfecie i se utilizeaz cu succes i astzi, fie c este vorba de cldur umed sau uscat. Cldura umed omoar rapid virusuri, bacterii i fungi. Expunerea 10 minute n ap fiart este suficient pentru a distruge celulele vegetative i sporii eucariotelor. Din pcate, temperatura de fierbere a apei (1000C) nu este suficient pentru a distruge endosporii bacterieni. Fierberea poate fi folosit pentru dezinfectarea apei de but i a unor obiecte care nu sunt distruse de apa fiart. Reinei, fierberea nu sterilizeaz! Cldura umed poate steriliza atunci cnd temperatura depete 1000C. Pentru aceasta este nevoie s se foloseasc aburi sub presiune, condiie realizat ntr-un aparat numit autoclav. Apa este fiart pentru a produce aburi care sunt introdui n camera autoclavului. Aerul prezent iniial n autoclav este forat s ias pn n momentul n care autoclavul se va umple de aburi, apoi se va nchide comunicarea cu exteriorul. Aburii fierbini sunt n continuare introdui n autoclav pn la temperatura i presiunea dorit (de obicei 1210C i 1,5 atmosfere). La aceast temperatur vaporii distrug toate formele vegetative i toi endosporii n aproximativ 1012 minute. Cldura umed degradeaz acizii nucleici i denatureaz enzimele i alte proteine eseniale. De asemenea distruge membranele celulare. Numeroase substane, precum lapte, sunt sterilizate folosind cldur umed. Procesul este denumit pasteurizare, n onoarea celui care a inventat metoda, savantul Louis Pasteur. Uneori, materialele sensibile la temperaturi ridicate pot fi sterilizate folosind cldura umed prin tindalizare. Sterilizarea se face la temperaturi de 90-1000C, timp de 30 de minute, trei zile consecutiv, cu incubare la 370C ntre tratamente. Prima nclzire va distruge toate microorganismele, mai puin endosporii. Majoritatea dintre acetia vor germina n timpul incubrii la 370C i vor fi distrui de a doua autoclavare. Orice spor rmas va fi apoi distrus de a doua incubare i de cel de al treilea tratament. Multe obiecte pot fi sterilizate prin tratament cu cldur uscat. Expunerea se face la 160-1700C pentru 2-3 ore. Moartea microorganismelor apare datorit oxidrii constituenilor celulari i denaturrii proteinelor. Dei cldura uscat este mai puin eficient dect cea umed, aceast metod are cteva avantaje. Nu corodeaz instrumentele i poate fi aplicat uleiurilor, pudrelor i altor materiale de acest tip.

Proiectul pentru nvmntul Rural

143

Nutriia i creterea microorganismelor

Filtrarea Filtrarea este o metod eficient pentru reducerea populaiilor microbiene din soluii sensibile la tratamente termice. Filtrarea nu distruge microorganismele contaminante, ci le ndeprteaz. Filtrarea se face, n prezent, folosind filtre de membran, care sunt filtre circulare, de 1 mm grosime, confecionate din acetat de celuloz, nitrat de celuloz, policarbonat sau alte materiale sintetice. Dei sunt accesibile numeroase tipuri de filtre, cele mai utilizate sunt cele care au mrimea porilor de 0,2 m n diametru. Ele sunt folosite pentru ndeprtarea celulelor vegetative din soluii. Radiaiile Radiaiile ultraviolete (UV) n jur de 260 nm sunt letale pentru microorganisme, dar nu penetreaz eficient sticla, apa i alte substane. Din cauza acestui dezavantaj, sterilizarea UV se folosete numai n anumite situaii specifice i anume: pentru sterilizarea aerului din ncperi, a plafoanelor i a suprafeelor expuse. Radiaiile ionizante sunt exceleni ageni de sterilizare i penetreaz mai profund diferite obiecte. Radiaiile gamma sunt folosite pentru sterilizarea antibioticelor, hormonilor, dispozitivelor din plastic etc. De asemenea, aceste radiaii sunt folosite pentru sterilizarea crnii i a altor alimente. Teste de autoevaluare TA 6.30 Descriei pe scurt modul de funcionare al unui autoclav. .................................................................................................................... .................................................................................................................... .................................................................................................................... TA 6.31 Prin fierbere diferitele materiale sunt: a) autoclavate c) dezinfectate b) sterilizate d) filtrate TA 6.32 Ce efect are filtrarea asupra populaiilor microbiene? .................................................................................................................... .................................................................................................................... .................................................................................................................... TA 6.33 Ce deosebire exist ntre controlul microorganismelor prin intermediul radiaiilor UV i cel prin intermediul radiaiilor ionizante? .................................................................................................................... .................................................................................................................... .................................................................................................................... 6.3.5. Ageni chimici utilizai pentru controlul microorganismelor Dei obiectele sunt uneori dezinfectate folosind ageni fizici, cel mai ades se utilizeaz dezinfectarea chimic. Numeroi factori influeneaz eficiena dezinfectanilor chimici, ca de exemplu: tipurile de microorganisme prezente, concentraia i natura dezinfectantului, durata tratamentului. Folosirea dezinfectantului adecvat este esenial n laboratoare i spitale. 144
Proiectul pentru nvmntul Rural

Nutriia i creterea microorganismelor

n prezent sunt accesibili numeroi dezinfectani, fiecare avnd avantajele i dezavantajele sale. Dezinfectantul ideal trebuie s fie eficient asupra unei game largi de ageni infecioi, care se gsesc n concentraii sczute i n prezena substanelor organice. Dei trebuie s aib aciune toxic asupra microorganismelor, nu trebuie s fie toxic pentru oameni sau s corodeze diferite materiale. Trebuie s poat fi pstrat timp mai ndelungat fr s-i modifice proprietile, s nu aib miros neplcut i s fie solubil n ap i n lipide pentru a putea ptrunde n interiorul microorganismelor. Exist numeroase clase de ageni chimici, dar cel mai adesea sunt folosii: fenolii, alcoolii, halogenii, detergenii i aldehidele. Fenolii Fenolul a fost primul dezinfectant folosit pe scar larg. Astzi fenolul i derivatele sale (crezoli, xilenoli etc.) sunt utilizai ca dezinfectani n laboratoare i spitale. Ei acioneaz prin denaturarea proteinelor i distrugerea membranelor celulare. Prezint unele avantaje ca dezinfectani deoarece sunt tuberculocizi, eficieni n prezena materialelor organice i rmn activi pe suprafee mult timp dup ce au fost aplicai. Dezavantajele sunt legate de mirosul neplcut i de faptul c atac pielea. Alcoolii Alcoolii sunt cei mai utilizai dezinfectani i antiseptici. Sunt bactericizi i fungicizi, dar nu sporicizi; distrug de asemenea nite virusuri. Cei mai cunoscui alcooli folosii ca dezinfectani sunt etanolul i izopropanolul, de obicei n concentraie de 70-80%. Halogenii Dintre halogeni clorul i iodul sunt ageni antimicrobieni importani. Iodul este folosit ca antiseptic al pielii i omoar prin oxidarea constituenilor celulari. n concentraie mare poate omor chiar i unii spori. De obicei se aplic sub form de tinctur de iod, care este un antiseptic eficient, dar care atac pielea. Mai recent, iodul a fost cuplat cu un purttor organic pentru a forma iodofor. Iodoforii sunt solubili n ap, stabili, nu pteaz i elibereaz suficient de lent iodul pentru a nu provoca iritaii. De aceea sunt utilizai n spitale, pentru dezinfectare nainte de operaii chirurgicale. Clorul este un dezinfectant uzual al apei din reeaua potabil. Rezultatul este oxidarea materialului celular i distrugerea celulelor vegetative de bacterii i fungi, dar nu i a sporilor. Moartea majoritii microorganismelor se produce dup aproximativ 30 de minute. Deoarece substanele organice interfer cu aciunea clorului sau a compuilor si, este necesar adugarea lui n exces. Detergenii Detergenii sunt compui organici, de natur amfipatic. Din aceast cauz solubilizeaz reziduurile insolubile i sunt ageni de splare foarte eficieni. Dei i unii detergeni anionici au aciune antimicrobian, detergenii cationici sunt mult mai eficieni. Ei distrug membranele celulare i pot denatura unele proteine, omornd majoritatea bacteriilor, dar nu i sporii acestora.
Proiectul pentru nvmntul Rural

145

Nutriia i creterea microorganismelor

Aldehidele Formaldehida i glutaraldehida sunt molecule reactive care se combin cu proteinele i le inactiveaz. Sunt sporicide i pot fi folosite ca sterilizani chimici. Dezavantajul este c sunt iritante, de aceea sunt utilizate n special la dezinfectarea echipamentelor. Teste de autoevaluare TA 6.34 Explicai de ce majoritatea agenilor chimici sunt dezinfectani nu sterilizani. .................................................................................................................... .................................................................................................................... .................................................................................................................... .................................................................................................................... TA 6.35 Enumerai mecanismele de aciune, avantajele i dezavantajele utilizrii fenolilor, alcoolilor i halogenilor ca ageni antimicrobieni. .................................................................................................................... .................................................................................................................... .................................................................................................................... .................................................................................................................... .................................................................................................................... ....................................................................................................................

6.3.6 Rezumatul capitolului 6.3 Sterilizarea este procesul prin care toate celulele vii, sporii, virusurile sunt fie distruse, fie ndeprtate de pe un obiect, sau dintr-un habitat. Dezinfectarea const n omorrea, inhibarea sau ndeprtarea microorganismelor care cauzeaz mbolnviri, dar nu i a endosporilor,. Moartea microbian este de obicei exponenial. Eficiena unui dezinfectant sau a unui agent sterilizator este influenat de mrimea i compoziia populaiei, concentraia sau intensitatea agentului antimicrobian, durata expunerii, temperatur i natura habitatului. Cldura umed ucide prin degradarea acizilor nucleici, denaturarea enzimelor i a altor proteine i prin distrugerea membranelor nucleare. Vasele de sticl i alte obiecte stabile termic pot fi sterilizate cu ajutorul cldurii uscate la 160- 1700C, timp de 2-3 ore. 146 Microorganismele pot fi eficient ndeprtate prin filtrare pe filtre de membran. Radiaiile UV i cele ionizate pot fi utilizate pentru sterilizarea obiectelor. Agenii chimici acioneaz de obicei ca dezinfectani deoarece nu pot distruge endosporii bacterieni. Eficiena dezinfectrii depinde de concentraie, temperatur i prezena substanelor organice. Fenolii i alcoolii sunt cei mai comuni dezinfectani, care acioneaz prin denaturarea proteinelor i distrugerea membranei celulare. Halogenii omoar prin oxidarea constituenilor celulari. Detergenii cationici sunt ades folosii ca dezinfectani i ageni antiseptici; ei distrug membranele celulare i denatureaz proteinele. Aldehidele pot dezinfecta i chiar steriliza, deoarece omoar sporii.

Proiectul pentru nvmntul Rural

Nutriia i creterea microorganismelor

6.4 RASPUNSURI LA TESTELE DE AUTOEVALUARE Unitatea de nvare 6 TA 6.1 n funcie de cantitatea n care sunt necesari, nu n funcie de rolul pe care l ndeplinesc n celul. TA 6.2 Moleculele organice i CO2. TA 6.3 d TA 6.4 n principal prin sursele de energie. TA 6.5 1-d, 2-b TA 6.6 Transportul activ folosete energie metabolic i n acelai timp capacitatea de concentrare a substanelor. TA 6.7 Proteinele cru sunt localizate n spaiul periplasmatic i se leag de molecule care trebuie transportate i de proteine de transport membranare. Complexul proteic format mut moleculele n celule folosind energia furnizat de complexe macroenergice. TA 6.8 A doua categorie conine ingrediente cu compoziie necunoscut i permite satisfacerea cerinelor nutriionale pentru numeroase tipuri de microorganisme. TA 6.9 Sunt medii uzuale, care conin nutrieni speciali ce favorizeaz creterea unor microorganisme mai pretenioase. TA 6.10 b TA 6.12 Prin modificarea numrului de indivizi dintr-o populaie, datorit dimensiunii foarte reduse. TA 6.14 a TA 6.15 Potenialul genetic al microorganismelor i mediul de cultur. TA 6.16 Mediile de cultur ofer cantiti sporite i accesibile de nutrieni, iar condiiile de cultivare n ansamblu favorizeaz creterea rapid. TA 6.18 Arheobacterii adaptate la condiiile de salinitate. 6.5 BIBLIOGRAFIE RECOMANDAT 1. 2. 3. 4. 5. 6. Herlea V., 1998 Microbiologie general, Ed. Univ., Bucureti. Mihaescu G., 2000 - Microbiologie general i virologie, Ed. Univ. Bucureti. Zarnea G., 1983 - Tratat de microbiologie general. Vol. I, Edit. Acad. RSR. Zarnea G., 1984 Tratat de microbiologie general. Vol. II, Edit. Acad. RSR. Zarnea G., 1994 Tratat de microbiologie general. Vol. V, Ed. Acad. Romne. Zarnea G., Mihiescu Gr., Velehorschi V., 1992 Principii i tehnici de microbiologie general. I, Bucureti. 147 TA 6.20 Prin distrugerea membranei plasmatice, inhibarea enzimelor. De asemenea este redus accesibilitatea nutrienilor prin ionizarea moleculelor. TA 6.21 Probabil, membranele organitelor eucariotelor nu sunt stabile i funcionale la temperaturi mai mari de 600C. TA 6.23 Temperatura lor variaz n funcie de temperatura mediului. TA 6.24 Sunt inactivate unele enzime atunci cnd, spre exemplu, gruparea sulfhidril este oxidat. De asemenea, unii compui precum radicalul superoxid, peroxidaza, radicalii hidroxil sunt ageni oxidani foarte puternici i distrug constituenii celulari. Microorganismele strict anaerobe, precum i cele anaerobe nu posed mecanisme de lupt mpotriva acestor compui. TA 6.25 Prin aciunea lor intervin n circuitele biogeochimice de pe fundul apelor mrilor i oceanelor, reintroducnd n circulaie elemente care altfel ar fi pierdute. TA 6.26 Sntate, controlul alimentelor, cercetare. TA 6.27 Dezinfecia nu omoar neaprat toate microorganismele i sporii viabili. TA 6.31 c TA 6.32 Filtrarea ndeprteaz microorganismele dar nu le distruge. TA 6.33 Radiaiile UV nu pot penetra orice tip de materiale, din care cauz sunt mai puin eficiente. TA 6.34 Agenii chimici nu distrug n general i sporii (nu au aciune sporicid).

Proiectul pentru nvmntul Rural

Biodiversitatea microorganismelor

Unitatea de nvare 7 BIODIVERSITATEA MICROORGANISMELOR

Cuprins:
Cuprins Obiectivele Unitii de nvare 3 7.1 Bacterii 7.1.1 Taxonomia bacterian. Definiii. Generaliti 7.1.2 Conceptul de specie n lumea bacterian 7.1.3 Sisteme de clasificare ale bacteriilor utilizate n prezent 7.1.3.1. Sistemul de clasificare bazat pe analiza ARNr 16S 7.1.3.2. Clasificarea dup Bergeys Manual 7.1.4 Bacteriile Gram negative de interes general, medical i industrial 7.1.5 Bacteriile Gram pozitive, altele dect Actynomycetele 7.1.6 Bacterii Gram pozitive cu un coninut ridicat n G+C: Actinomycetes i genurile nrudite 7.1.7 Alte bacterii Gram negative i cianobacteriile 7.1.8 Rezumatul capitolului 7.1 7.2 Fungi 7.2.1. Importana fungilor 7.2.2. Caractere generale ale fungilor 7.2.3. Principalele grupe de fungi 7.2.3.1. Diviziunea Zygomycota 7.2.3.2. Diviziunea Ascomycota 7.2.3.3. Diviziunea Deuteromycetes (Fungi imperfecti) 7.2.4 Rezumatul capitolului 7.2 7.3 Lucrare de verificare 6 7.4 Rspunsuri i comentarii la testele de evaluare Unitatea de nvare 7 7.5 Bibliografie recomandat 148 148 149 149 150 153 153 154 155 157 160 162 165 165 165 166 167 167 169 169 171 172 174 174

Obiectivele Unitii de nvare 7 s defineti noiunile de taxonomie i specie bacterian; s argumentezi superioritatea utilizrii taxonomiei moleculare n clasificarea bacteriilor; s caracterizezi principalele grupe de bacterii i fungi; s corelezi diferitele implicaii practice ale microorganismelor cu taxonii corespunztori.

148

Proiectul pentru nvmntul Rural

Biodiversitatea microorganismelor

Unul dintre cele mai fascinante i interesante aspecte ale lumii microorganismelor este extraordinara sa diversitate. Aceast unitate ne familiarizeaz cu principiile taxonomiei moleculare i face o trecere n revist a dou dintre cele mai importante tipuri de microorganisme: bacterii i fungi.

7.1 Bacterii
Capitolul enun pe scurt principiile taxonomiei moleculare i conceptul de specie bacterian. Prezint, de asemenea, principalele grupe de bacterii, conform Manualului de sistematic bacterian a lui Bergey.

7.1.1 Taxonomia bacterian. Definiii. Generaliti Taxonomia bacterian este n continu schimbare datorit acumulrii cunotinelor din domeniul biologiei i a aplicrii pe scar larg a prelucrrii electronice a informaiilor, precum i a studiilor moleculare pentru determinarea relaiilor filogenetice dintre microorganisme. Taxonomia, cunoscut i sub denumirea de (bio)sistematic, reprezint tiina clasificrii i reunete de fapt, trei domenii tiinifice: (1) Clasificarea gruparea organismelor n grupe distincte (denumite taxoni) pe baza unor caractere de asemnare. (2) Nomenclatura atribuirea de nume (nomen) taxonilor definii de clasificare. (3) Identificarea poziionarea unui organism necunoscut ntr-una din grupele definite de clasificare i denumite de nomenclatur. Pentru a stabili i defini grupe n cadrul clasificrii microorganismelor, Vandamme (1996) a propus utilizarea aanumitei taxonomii polifazice. n acest scop, taxonii sunt definii pe baza informaiilor obinute de diverse discipline, reunind astfel att date fenotipice (cunoscute ca fcnd parte din taxonomia convenional), ct i date de nivel molecular (taxonomia molecular, chemotaxonomie). La bacterii, taxonomia convenionala se bazeaz pe o serie de trsturi morfologice, structurale, fiziologice i biochimice: forma i mrimea celulei, morfologia coloniilor, ultrastructura celulei, constituenii peretelui celular, motilitate, incluziuni celulare, surse de carbon, azot i energie, produse de fermentaie, domeniul de temperaturi/pH optime, tolerana osmotic, metabolizarea oxigenului, sensibilitatea la o serie de inhibitori metabolici i la antibiotice. Taxonomia molecular se ocup cu studiul variaiilor chimice n organismele vii i folosirea acestor caractere, att pentru clasificarea i identificarea unui organism necunoscut, ct i pentru evidenierea relaiilor filogenetice, evolutive, dintre diverse organisme.
Proiectul pentru nvmntul Rural

149

Biodiversitatea microorganismelor

Multe dintre caracterele fiziologice i biochimice prezint dezavantaje majore: variaz, att calitativ, ct i cantitativ, funcie de condiiile de cultivare. La rndul lor, acestea variaz n mod obiectiv datorit necesitilor nutriionale diferite de la o grup la alta de bacterii. Ca urmare, este dificil de elaborat sisteme standard de analiz a unor asemenea parametri, sisteme care s fie universal valabile pentru toate bacteriile. Pe de alt parte, cercetrile din ultimii 15 ani au demonstrat c, cel puin parte din caracterele morfologice i fiziologice, reprezint adaptri ale populaiilor bacteriene la diverse nie ecologice i nu exprim dect n mic msur gradul de nrudire real dintre diveri taxoni bacterieni. Nu n ultimul rnd este de subliniat faptul c n ultimul deceniu au fost descrise din ce n ce mai multe specii bacteriene ce nu sunt cultivabile. n contrast cu aceste dezavantaje ale taxonomiei convenionale, taxonomia molecular si, n mod particular, acizii nucleici, prezint o serie de avantaje generale: (1) dei cantitatea de ADN per celul poate varia funcie de diveri factori (condiii de cultivare, faz a ciclului celular, numrul de copii ale unui replicon per celul), totui ADN-ul nu variaz din punct de vedere calitativ, adic nu variaz secvena de nucleotide; (2) gradul de nrudire ntre diveri taxoni bacterieni este exprimat cel mai bine la nivel de ADN; (3) n prezent, moleculele ADN pot fi analizate i la microorganisme necultivabile. Teste de autoevaluare TA 7.1 Completai cu cuvintele corespunztoare urmtoarele enunuri: ..este tiina clasificrii i include clasificarea,i identificarea. Taxonomia bacterian. utilizeaz caracteristici morfologice, fiziologice, ecologice i biochimice, n timp ce.. studiaz variaiile la nivelul unor constitueni chimici, n principal la nivelul acizilor. 7.1.2 Conceptul de specie n lumea bacterian Grupul taxonomic de baz n sistematica bacterian modern este specia. Definirea conceptului de specie bacterian a ridicat i nc ridic probleme deosebite. Astfel, de-a lungul anilor conceptul de specie bacterian a suferit o serie de transformri. Astfel, Mayr (1957) oferea o abordare practic uor de folosit n laboratoarele de microbiologie, considernd c speciile bacteriene reprezint entiti statice (ce nu evolueaz) definite prin trsturi fenotipice. Nu se inea seama de faptul c speciile bacteriene sunt compuse din populaii naturale aflate n proces de evoluie molecular. Pe de alt parte, conceptul de specie biologic descris de Mayr se baza pe fenomenul de sexualitate i implica izolarea reproductiv ntre diferitele specii. 150
Proiectul pentru nvmntul Rural

Biodiversitatea microorganismelor

Conceptul lui Mayr este dificil de aplicat la organisme asexuate cum sunt procariotele. La sfritul anilor 50, specia bacterian era definit doar pe criterii morfo-fiziologice. Anii 60 sunt cunoscui ca fiind debutul analizelor de tip molecular. Punerea la punct a unor tehnici fezabile de izolare i purificare a moleculelor de ADN cromozomal i, mai apoi, i a celor de ADN plasmidial, au condus i la primele analize taxonomice pe acizi nucleici. Primul criteriu de taxonomie molecular ce a fost utilizat n sistematica bacterian a fost compoziia total n nucleotide, adic procentul molar de guanin + citozin (%mol GC). Tulpinile bacteriene a cror %mol GC diferea semnificativ erau considerate ca aparinnd la taxoni diferii specii, sau chiar genuri diferite. n prezent, procentul molar de guanin + citozin este un parametru listat n toate manualele internaionale i cerut la orice descriere de specie bacterian nou, rmnnd ns un criteriu negativ, de excludere taxonomic (Figura 7.1).
Figura 7.1 Compoziia n baze azotate la cteva genuri bacteriene (dup Priest, 1994). GEN BACTERIAN %MOL GC GEN BACTERIAN %MOL GC (GRAM-NEGATIVE) (GRAM-POZITIVE) Acetobacter Aeromonas Cytophaga Enterobacter Escherichia Haemophilus Klebsiella Pseudomonas Rhodospirillum 51-65 57-63 29-45 52-60 48-52 37-44 53-58 58-70 60-67 Bacillus Clostridium Corynebacterium Lactobacillus Micrococcus Mycobacterium Staphylococcus Streptococcus Streptomyces 33-64 22-55 51-63 32-52 66-75 62-70 30-37 34-46 69-77

Ca urmare, de la jumtatea anilor 70, n tehnicile de taxonomie molecular i-a fcut apariia metoda hibridizrii ADN : ADN, metod ce exprim gradul de omologie de secven ntre doi cromozomi bacterieni ce aparin la tulpini con-specifice sau din specii diferite. i n acest caz au fost dezvoltate tehnici din ce n ce mai precise i mai rapide (Figura 7.2).

Figura 7.2 Reprezentarea schematizat a hibridizrii ADN: ADN n soluie.


Proiectul pentru nvmntul Rural

151

Biodiversitatea microorganismelor

Esenial este ns faptul c s-a constatat c acest parametru are valoare taxonomic mult mai mare, permind diferenierea speciilor bacteriene. Astfel, i n prezent este nc oficial acceptat de ctre Comitetul Internaional de Sistematic Bacterian, definiia speciei bacteriene ca grup de tulpini bacteriene (inclusiv tulpina tip) ce prezint cel puin 70% omologie de secven ADN. Dezvoltarea tehnicilor de biologie molecular (i, n mod special, a tehnologiei PCR i a tehnicilor de secveniere ADN) n ultimii 20 de ani a culminat cu studiul secvenelor ARNr, mai corect spus, a genelor ce codific aceste molecule. Pe baza analizelor acestor molecule au fost obinute foarte multe informaii utile din punct de vedere taxonomic i filogenetic. Astfel, grupul Archaea (cunoscut anterior ca Archaebacteria) a fost recunoscut ca grup independent, separat de Bacteria (anterior denumit Eubacteria). A existat o perioad cnd s-a crezut c studiul acestor molecule reprezint punctul ultim n taxonomia bacteriilor. Mai mult chiar, pe baza analizei moleculelor ARNr de dimensiune medie au fost propui noi arbori filogenetici universali i, respectiv, de grup. n ceea ce privete ns diferenierea taxonomic a speciilor bacteriene, s-a constatat c moleculele ARNr 16S nu ofer o rezoluie suficient de bun, sau chiar pot conduce la interpretri eronate. S-a concluzionat astfel c cea mai complet surs de informaii taxonomice de nivel molecular este genomul bacterian ca ntreg. n concluzie, conceptul de specie n lumea bacterian reprezint o problem extrem de dezbtut n ultimul deceniu. Este ns necesar acumularea de mult mai multe informaii pentru a putea defini aceste noduri cu existen temporar ntr-un continuum de schimbare i evoluie. Teste de autoevaluare TA 7.2 Explicai de ce nu se poate aplica la bacterii conceptul de specie biologic a lui Mayr. ................................................................................................................. ................................................................................................................. ................................................................................................................. TA 7.3 Enunai trei tehnici moleculare care stau la baza sistematicii bacteriene moderne. ................................................................................................................. ................................................................................................................. ................................................................................................................. TA 7.4 Definii specia bacterian conform Comitetului Internaional de Sistematic Bacterian. ................................................................................................................. ................................................................................................................. .................................................................................................................

152

Proiectul pentru nvmntul Rural

Biodiversitatea microorganismelor

7.1.3 Sisteme de clasificare ale bacteriilor utilizate n prezent 7.1.3.1 Sistemul de clasificare bazat pe analiza ARNr 16S Studiile efectuate pe ARNr 16S au permis ncadrarea eubacteriilor n funcie de relaiile filogentice dintre ele n 11 grupe principale, i anume: 1. Bacterii Gram-pozitive, incluznd i micoplasmele Dup coninutul n baze azotate al ADN, se subdivid n dou grupe principale: Grupa actinomicetelor, cu un coninut ridicat n G+C, cuprinznd genurile Actinomyces, Arthrobacter, Bifidobacterium, Corynebacterium, Micrococcus, Mycobacterium, Nocardia, Propionibacterium i Streptomyces. Grupa cu un coninut sczut n G+C, cuprinznd genurile Bacillus, Clostridium, Enterococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Listeria, micoplasmele, Spiroplasma, Staphilococcus i Streptococcus. Dup toate probabilitile, din aceast grup mai veche au derivat actinomicetele. Micoplasmele ar fi evoluat din clostridii. 2. Proteobacteriile sau bacteriile roii fotosintetizante i nefotosintetizante Aceast diviziune conine majoritatea eubacteriilor Gramnegative. Studiile de secveniere indic faptul c strmoul ancestral a fost o bacterie roie fotosintetizant. Se presupune c multe tulpini i-au pierdut capacitatea de fotosintez cnd s-au adaptat metabolic la nie ecologice noi. Protobacteriile sunt foarte diverse i se divid n cel puin cinci diviziuni. 3. Cianobacterii Bacterii aerobe fotosintetizante. Genurile reprezentative sunt: Anabaena, Calothrix, Fisccherella, Nostoc, Oscillatoria, Scytonema, Synechococcus, Prochloron. 4. Spirochete Sunt bacterii Gram-negative, de form spiralat i cu filament axial distinct. Din aceast categorie fac parte: Borellia, Leptospira, Spirochaeta i Treponema. 5. Grupa plancton Acest grup include bacterii asemntoare cu eubacteria, care prezint perete celular lipsit de peptidoglican i se multiplic prin nmugurire. Planctomyces i Isosphaera. 6. Bacteroides, flavobacteriile i tulpini nrudite Includ: Bacteroides, Cytophaga, Flavobacterium Fusobacterium.
[

7. Chlamydiae Sunt parazii intracelulari cu ciclu unic de dezvoltare i fr peptidoglican. Chlamydia.

Proiectul pentru nvmntul Rural

153

Biodiversitatea microorganismelor

8. Bacteriile sulfuroase verzi (fam. Chlorobiaceae) Bacterii aerobe, fotosintetizante care oxideaz sulfiii i sulful i posed clorozomi. Include genurile: Chlorobium i Pelodictyon. 9. Bacterii verzi nesulfuroase i bacterii nrudite Chloroflexus, Herpetosiphon i Thermomicrobium. 10. Micrococi radiorezisteni i bacterii nrudite Membrii familiei Deinococcaceae sunt coci Gram-pozitivi cu o mare rezisten la radiaii. Bacteriile termofile Gram-negative din genul Thermus sunt total diferite, dei secvenele ARNr indic faptul c sunt nrudite cu Deinococcus. 11. Thermothoga i Thermosipho Aceste eubacterii termofile din sedimente marine geotermale se deosebesc de alte eubacterii, fr s fi fost efectuate, nc, studii exhaustive. 7.1.3.2 Clasificarea dup Bergeys Manual Deoarece, n trecut nu era posibil clasificarea bacteriilor dup relaiile filogenetice dintre ele, sistemul de clasificare prezentat n Bergeys Manual of Systematic Bacteriology i pe care l detaliem i noi, este fenetic i acord o importan deosebit caracteristicilor morfo-fiziologice. Sistemele fenetice clasific microorganismele pe baza similaritii caracterelor fenotipice. Bacteriile sunt incluse n 33 de diviziuni, cu caracteristici uor de determinat, fiecare diviziune purtnd un titlu care corespunde proprietilor acestora i confer, totodat, un nume generic bacteriilor. Caracteristicile folosite se refer la: morfologie i dimensiune, coloraia Gram, modul de obinere a energiei, etc. Grupele bacteriene sunt mprite astfel: Bacterii Gram negative de interes general, medical i industrial; Bacterii Gram pozitive, altele dect actinomicetele; Bacterii Gram-negative cu proprieti distincte, cianobacterii i arhebacterii; Bacterii Gram-pozitive, filamentoase. Dei nu a fost posibil o clasificare satisfctoare a bacteriilor, bazat pe relaii filogenetice, sistemul propus de o noua ediie a Bergeys Manual of Systematic Bacteriology este organizat dup criterii fenotipice i aplicative. R.G. Murray, n articolul teoretic introductiv sugereaz divizarea procariotelor n patru diviziuni i apte clase. Cele patru diviziuni sunt caracterizate dup: 1. prezena sau absena peretelui celular; 2. natura chimic i structura peretelui celular. Noile diviziuni corespund n mare grupelor tradiionale. Gracilicutes (perete celular subire) sunt Gram-negative, Firmicutes (perete celular dur) sunt Gram pozitive, Tenericutes (perete celular moale) sunt micoplasmele, iar arhebacteriile sunt plasate n Mendosicutes (perete celular ntrerupt). n continuare vom prezenta caracteristicile principalelor grupe de bacterii de interes general, didactic i industrial, urmrind clasificarea din Bergeys Manual. 154

Proiectul pentru nvmntul Rural

Biodiversitatea microorganismelor

Teste de autoevaluare TA 7.5 Numii trei grupe de bacterii conform sistemului de clasificare bazat pe analiza ARNr 16S. ....................................................................................................................... ....................................................................................................................... ....................................................................................................................... TA 7.6 Ce st la baza clasificrii din Manualul Bergey? ....................................................................................................................... ....................................................................................................................... .......................................................................................................................

7.1.4 Bacteriile Gram negative de interes general, medical i industrial Volumul 1 din Bergeys Manual clasific bacteriile Gramnegative de interes general, medical i industrial n zece grupe. Prezentm, n continuare cteva dintre aceste grupe de microorganisme. Spirochetele Spirochetele sunt un grup de bacterii Gram-, chemoheterotrofe, deosebindu-se prin structur i mobilitate de alte bacterii. Sunt bacterii lungi ( 0,1-0,3 m/ 5-250m ), de form helical, flexibile. Mobilitatea se realizeaz prin dou filamente axiale (endoflageli) incluse n spaiul dintre membrana extern i cea intern (Figura 7.3). Spirochetele pot fi anaerobe, facultativ anaerobe sau aerobe i includ un numr de bacterii patogene importante. Folosesc drept surs de carbon i energie glucide, aminoacizi, acizi grai i alcooli. Cresc n habitate foarte diverse, n sol dar i n cavitatea bucal la om. Dintre bacteriile patogene este important genul Treponema, care include Treponema pallidum, agentul patogen al sifilisului.

Figura 7.3 Spirocheta Leptospirilla ichterohemorrhagiae,


Proiectul pentru nvmntul Rural

155

Biodiversitatea microorganismelor

care morfologic este tipic pentru acest grup de bacterii.

Bacterii Gram- imobile, curbate Sunt reprezentate de un grup restrns de microorganisme incluse n fam. Spirosomaceae. Sunt rspndite n sol, ap dulce i n habitate marine. Bacili i coci, aerobi, GramAceast grup conine un numr foarte mare de bacili i coci aerobi, Gram-, ncadrai n 21 de genuri i 9 familii, la care se altur 16 genuri neincluse n familii, acestea fiind de interes medical. Caracteristicile generale ale grupului sunt incluse n tabelul din Figura 7.4. Bacteriile facultativ anaerobe, Gram-negative Aceast grup conine 27 de genuri, dintre care 20 sunt incluse n trei familii: Enterobacteriacea,Vibrionaceae i Pasteurellaceae, dintre care prima prezint interes medical, tiinific i industrial. Enterobacteriaceele sunt microorganisme Gram-negative, facultativ anaerobe, sub form de bastonae drepte, cu necesiti nutriionale simple. Dup Bergeys Manual, familia poate fi divizat n dou grupe, n funcie de produii de fermentaie. Majoritatea (genurile Escherichia, Proteus, Salmonella i Shigella), prezint fermentaii mixte cu producere n principal de lactat, acetat, succinat, format (sau H2 i CO2) i etanol. Aceste specii sunt n acelai timppatogene. Datorit rspndirii i importanei enterobacteriilor i n special a tulpinii E. coli, ele reprezint un obiect de studiu n majoritatea laboratoarelor. E. coli, denumit iniial Bacillus coli, a fost izolat de un pediatru, Escherich, n 1884, din fecalele unui pacient bolnav de holer. Ulterior s-a dovedit a fi prezent n mod obinuit n tractul intestinal al oamenilor i al multor vertebrate. Nu se gsete n mod normal n sol i ap. Prezena lui n apa potabil este un indiciu direct al polurii acesteia.
Figura 7.4 Caracteristicile bacililor i cocilor aerobi, Gram-negativi.

FAMILIA
Pseudomonadaceae Azotobacteraceae Rhizobiaceae Methilococaceae

MORFOLOGIA
Bastonae drepte sau curbate Bastonae, celule ovale, flageli peritrichi sau polari Bastonae, flageli polari, subpolari sau peritrichi Bastonae, coci i vibrio; flageli polari sau imobile Forme elipsoidale pn la bastonae; flageli peritrichi, polari sau imobile

% MOL G+C
38-71 52-67,5 57-65 50-64

CARACTERISTICI
Aerobi, cresc pe diferite surse de C Fixeaz N2 Formeaz noduli pe plante leguminoase Folosesc metanul ca surs de C i energie n aerobioza i microfilie Oxideaz etanolul la acid acetic la pH acid sau neutru

REPREZENTANI
Pseudomonas, Xanthomonas Azotobacter, Azomonas Rhizobium Agrobacterium Methilococcus, Methilomonas

Acetobacteraceae

51-65

Acetobacter Gluconobacter

156

Proiectul pentru nvmntul Rural

Biodiversitatea microorganismelor

Bacterii Gram-negative aerobe/facultativ anaerobe cu afiliere taxonomic nesigur Dintre bacteriile Gram-negative aerobe sau facultativ anaerobe cu afiliere taxonomic nesigur fac parte dou grupe de microorganisme cu importan biotehnologic deosebit, i anume: bacteriile acetice i genurile Zymomonas i Chromobacterium. Teste de autoevaluare TA 7.7 ncercuii litera corespunztoare unui gen care include bacterii patogene: a) Zymomonas b) Azotobacter c) Treponema d) Rhyzobium

TA 7.8 Care este importana bacteriilor Gram-, facultativ anaerobe. ....................................................................................................................... ....................................................................................................................... ....................................................................................................................... ....................................................................................................................... ....................................................................................................................... .......................................................................................................................

7.1.5. Bacteriile Gram pozitive, altele dect Actynomycetele Bacteriile Gram-pozitive sunt incluse n diviziunea Firmicutes. Analiza relaiilor filogenetice prin compararea secvenelor ARNr16S demonstreaz faptul c ele pot fi divizate ntr-o grup cu un coninut sczut n G+C i o grup cu un coninut ridicat n G+C sau actinomicete. Coci Gram-pozitivi Aceast grup conine coci chemoheterotrofi, nesporulai, Gram-pozitivi, inclui n dou familii i 15 genuri, care sunt foarte diferite filogenetic. Genurile se caracterizeaz prin aranjamentul celulelor, prezena catalazei i citocromilor, structura peptidoglicanului i coninutul n G+C. Cele mai importante grupe sunt descrise mai jos. Genurile reprezentative sunt Micrococcus i Staphylococcus. Genul Micrococcus conine coci aerobi, catalazo- pozitivi , dispui n principal n perechi, tetrade sau grmezi neregulate, n general imobili. Micrococii sunt adesea de culoare galben-portocaliu sau rou. Sunt rspndii n sol, ap sau pe pielea mamiferelor. Dei se gsesc frecvent pe piele nu sunt patogeni. Membrii genului Staphylococcus sunt coci facultativ anaerobi, imobili, Gram-pozitivi care formeaz frecvent grmezi. Stafilococii se gsesc pe piele, glandele cutanate i mucoasele animalelor cu snge cald, fiind puternic patogeni. Patogenitatea se datoreaz faptului c pot crete n condiii de presiune osmotic ridicat i
Proiectul pentru nvmntul Rural

157

Biodiversitatea microorganismelor

umiditate sczut, fapt care explic parial posibilitatea de a crete i supravieui n secreiile nazale. Infectarea instrumentelor chirurgicale este o problem cu care se confrunt spitalele. Capacitatea de a forma tulpini rezistente la antibiotice precum penicilina constituie, de asemenea, un pericol i pune probleme n tratarea infeciilor stafilococice. S. aureus produce toxina responsabil de sindromul de oc toxic, o infecie sever caracterizat prin temperatur ridicat i vrsturi, provocnd uneori chiar moartea. Genul Streptococcus este un alt reprezentant important al acestei grupe. Cnd cresc n mediu lichid, streptococii se prezint sub form de perechi sau lanuri, nu formeaz endospori i sunt n general imobili. Unele specii sunt anaerobe. Acest gen conine cei mai importani reprezentani patogeni umani, subdivizai n streptococi piogenici i bucali (Figura 7.5). Bacterii nesporulate, Gram pozitive Aceast grup conine apte genuri formate din bastonae regulate, nesporulate, Gram pozitive, mezofile sau chemoheterotrofe i cresc numai pe medii complexe. Cel mai mare gen, Lactobacillus, este format din bacili i uneori cocobacili. Bacteriile produc acid lactic ca metabolit principal al degradrii glucidelor. Toate bacteriile lactice cresc n condiii anaerobe. Bacteriile lactice se subdivid n funcie de produii finali de fermentaie n: Homofermentative, care produc teoretic numai acid lactic, i Heterofermentative, care pe lng acid lactic produc etanol i CO2. Lactobacilii pot fi izolai din produse lactate, unele specii fiind folosite la prepararea produselor fermentate. De exemplu, L. delbrueckii se folosete la prepararea iaurtului, L.acidophilus la producerea laptelui acidulat, alte specii sunt implicate n producerea smntnei i murturilor. Lactobacilii sunt foarte rar patogeni (Figura 7.6).

Figura 7.5 Streptococ ntlnit frecvent la nivelul cilor respiratorii superioare ale omului i care cauzeaz numeroase infecii respiratorii, precum i unele tipuri de pneumonii.

158

Proiectul pentru nvmntul Rural

Biodiversitatea microorganismelor

Figura 7.6 Caracteristicile subgrupelor genului Lactobacillus

CARACTERISTICI Homofermentative Produs principal acid lactic (>85% din glucoz) Nu formeaz gaze din glucoz, prezent aldolaza Cretere la 450C, dar nu la 15 0C, bastonae lungi, glicerol acid teicoic Cretere la 150 C, variabil la 45 0C; bastonae scurte, corineforme, glicerol acid teicoic; produi de fermentaie aerob n prezena O2 Heterofermentative Produce aproximativ 50% acid lactic din glucoz, produce C02 i etanol, lips aldolaz, prezent fosfocetolaza; bastonae lungi i scurte; glicerol, acid teicoic

SPECII

% MOL G+C

L. delbrueckii L.acidiphillus L. casei L. planarum L. curvatus L. fermentum L.brevis L. buchneri L.kefir

49-51 34-37 45-46 45-46 42-44 52-54 44-47 44-47 41-42

Bacterii Gram pozitive, formatoare de endospori Seciunea 13 din Bergeys Manual conine aproape toate bacteriile Gram-pozitive formatoare de endospori. Bacteriile formatoare de endospori sunt larg rspndite n natur, n special n sol, prezena sporilor reprezentnd un avantaj pentru supravieuire n condiii de secet sau privaiuni nutriionale. Dou dintre cele mai studiate i importante genuri sunt Bacillus i Clostridium. Ambele genuri se prezint sub form de bastonae, formeaz endospori, sunt Gram-pozitive, chemoheterotrofe, cu flageli peritrichi sau sunt imobile. Genul Clostridium este anaerob, nu posed catalaz i lan transportor de electroni. Genul Bacillus este aerob sau facultativ anaerob. Aceste genuri sunt foarte importante din punct de vedere practic. Specii din genul Bacillus produc antibiotice ca bacitracina, gramicidina, polimixina. Speciile din genul Clostridium sunt anaerobe, formeaz endospori rezisteni la cldur i sunt responsabile de degradarea alimentelor, chiar a celor din conserve. C. botulinum provoac boala denumit botulinism. Unele clostridii sunt ageni patogeni importani prin producerea de toxine, ca de exemplu C. tetani, care este agentul patogen al tetanosului, iar C. perfringens produce gangrena gazoas i infesteaz alimentele. Teste de autoevaluare TA 7.9 Cum se explic patogenitatea reprezentanilor genului Staphylococcus? ....................................................................................................................... TA 7.10 Sub ce denumire sunt cunoscute bacteriile din genul Lactobacillus? ....................................................................................................................... TA 7.11 Ce categorie de substane produce prin procese fermentative ca metabolit principal acidul lactic? ....................................................................................................................... TA 7.12 Care este importana practic a bacteriilor formatoare de endospori? Exemplificai. ....................................................................................................................... .......................................................................................................................
Proiectul pentru nvmntul Rural

159

Biodiversitatea microorganismelor

7.1.6. Bacterii Gram pozitive cu un coninut ridicat n G+C: Actinomycetes i genurile nrudite Reprezint o grup foarte divers de microorganisme, format din 21 de genuri. Filogenetic, actinomicetele i genurile nrudite formeaz o subdiviziune a bacteriilor Gram pozitive. Dei actinomicetele prezint o variabilitate morfologic foarte mare, ele sunt unitare din punct de vedere filogenetic, majoritatea reprezentanilor avnd un procent molar de G+C cuprins ntre 60-70. Cu toate acestea, genurile din aceast grup se difereniaz greu, trsturile comune fiind restrnse la caractere morfologice: forme de bastonae pn la filamente, coloraia Gram pozitiv, imobile, dei sunt cunoscute tulpini care prezint mobilitate. Actinomicetele Actinomicetele sunt bacterii filamentoase, ramificate, larg rspndite n natur. Pot fi separate n dou grupe, inegale ca mrime: o grup format, n principal, din reprezentani prezeni la om i animale i o a doua grup, cu mult mai mare, prezente n sol, diseminate n mediul nconjurtor. Microorganismele din prima grup se prezint sub forma unei mase filamentoase ramificate (miceliu). Microorganismele din grupa a doua sunt mult mai variate din punct de vedere morfologic. Solul este bogat n tulpini de actinomicete ca Micromonospora, Actinoplanes, Actinomadura i Nocardia, productoare ale unui spectru larg de antibiotice. Tabelul din Figura 7.7 prezint un numr de familii de antibiotice biosintetizate de aceste actinomicete.
Figura 7.7 Antibiotice sintetizate de actinomicete GENURI NUMR DE ANTIBIOTICE
SINTETIZATE

TIPURI DE ANTIBIOTICE SINTETIZATE 4 antracicline; 3 polieteri 5 vancomicine; 4 poliene; 18 peptide 6 antracicline 2 ansamicina 2 aminoglucozide derivai quinolinici tiazolil peptide 36 aminoglucozide; 5 macrolide; 8 peptide; 4 nucleozide derivai de acid aciltetramic 5 ansamicine 2 peptide tip vancomicinp 2 aminoglicozide 5 peptide 3 aminoglicozide; peptide 5 poliene; 4

Actinomadura Actinoplanes Actinosporangium Actinosynnema Ampulariella Chainia Dactylosporangium Kitasatosporia Kitasato Microellobospora Micromonospora Microtetraspora Nocardia Nocardiopsis Pseudonocardia Rhodococcus Saccharomonospora Saccharopolispora Streptoalloteichus Streptosporngium Streptoverticillium Thermoactinomyces Thermomonospora

I6 43 6 7 2 3 3 1 1 1 65 1 15 2 2 2 1 3 2 9 22 1 1

160

Proiectul pentru nvmntul Rural

Biodiversitatea microorganismelor

Este cunoscut faptul c actinomicetele sintetizeaz foarte rar un singur antibiotic, ci mai degrab o serie de actinomicine, unele dintre ele fiind componente majore, altele prezente n cantiti mici. Streptomicetele Streptomicetele sunt printre microorganismele cele mai importante din punct de vedere industrial, n special ca productori de antibiotice i alte substane biologic active. Streptomyces este un gen reprezentat de un numr mare de specii i varieti. n Brergeys Manual sunt incluse peste 500 specii de streptomicete, formnd o grup compact, coninutul molar de G+C fiind cuprins ntre 69 i 73%. Filamentele miceliene au, n general, un diametru de 0,5 pn la 1,0 m i o lungime variabil; adesea, n faza de cretere lipsesc pereii despritori. Creterea are loc apical, fiind nsoit de ramificare, ceea ce face ca n faza vegetativ coloniile s se prezinte ca o estur compact, cutat. Coloniile mature formeaz filamente aeriene denumite sporofori, care dau natere la spori cunoscui i sub numele de conidii. Sporii nu sunt nrudii cu endosporii de Bacillus i Clostridium, ntruct sporii streptomicetelor iau natere prin formarea pereilor transversali ntr-un sporofor multinucleat urmat de separarea direct a celulei individuale n spori. Stadiile de transformare a hifelor aeriene n spori sunt prezentate n Figura 7.8.

Figura 7.8 Formarea conidiilor la streptomicete

O caracteristic de baz a streptomicetelor const n capacitatea de producere a unei game foarte largi de antibiotice (Figura 7.9). Aproximativ 50% din tulpinile genului Streptomyces sau dovedit a fi productoare de antibiotice. Au fost izolate peste 500 de antibiotice diferite dintre care majoritatea au fost caracterizate chimic.

Proiectul pentru nvmntul Rural

161

Biodiversitatea microorganismelor

Figura 7.9 Unele antibiotice comune sintetizate de specii din genul Streptomyces DENUMIRE Streptomicina Spectinomicina Neomicina Tetraciclina Clortetraciclina Eritromicina Clindamicina Nistatina Amphocetin B Cloramfenicol PRODUS DE : S. griseus Streptomyces spp S. fradiae S. aureofaciens S. erythreus S. lincolnensis S. noursei S. nodosus S. venezuelae ACTIV FA DE : Majoritatea bacteriilor Gram-negative M. tuberculosis, N.gonorrhoeae productoare de penicilinaze Spectru larg; utilizat, de regul, n aplicaii locale, datorit toxicitii Spectru larg; bacterii Gram-pozitive i Gramnegative; rickettsii i chlamidiii; Mycoplasma Majoritatea bacteriilor Gram-pozitive; utilizat frecvent n locul penicilinei; Legionella Eficace mpotriva anaerobelor, n special Bacteroides fragilis Fungi, n special infecii cu Candida Fungi Spectru larg; medicament select pentru febra tifoid

Teste de autoevaluare TA 7.13 Pe ce se bazeaz afirmaia: bacteriile cu coninut ridicat G+C sunt greu de identificat? ....................................................................................................................... ....................................................................................................................... ....................................................................................................................... TA 7.14 Explicai larga utilizare a actinomicetelor i a genurilor nrudite. ....................................................................................................................... ....................................................................................................................... 7.1.7. Alte bacterii Gram negative i cianobacteriile Bergeys Manual of Systematic Bacteoriology (volumul 3) se refer la bacterii care se deosebesc dup anumite caracteristici de bacteriile Gram pozitive i Gram negative. Diferenele includ mobilitatea (bacterii care alunec), metabolismul (bacterii fototrofe, chemolitotrofe) i reproducerea sau morfologia (bacterii care nmuguresc, bacterii cu apendici i cu nveli sau teac). n aceast grup mare de microorganisme intr bacteriile anoxigenice fotosintetizante, bacteriile oxigenice fotosintetizante, bacteriile aerobe chemolitotrofe i organismele asociate, bacteriile cu muguri sau apendici, bacterii cu teac, bacteriile cu mobilitate prin alunecare cu/fr organe de fructificare. Caracteristicile unora dintre aceste bacterii sunt prezentate n Figura 7.10. Cianobacteriile Cianobacteriile reprezint un grup mare i diversificat al bacteriilor fotosintetizante. Studiile recente au redus acest numr de la 2000 la 62 de specii incluse n 24 de genuri. Procentul molar al G+C n ADN variaz ntre 35 i 71%. Dei cianobacteriile sunt procariote adevrate, sistemul lor fotosintetic i clorofila a le apropie de eucariote. Ca i algele, cianobacteriile 162
Proiectul pentru nvmntul Rural

Biodiversitatea microorganismelor

folosesc drept pigmeni accesorii ficobiliproteinele. Pigmenii fotosintetici i componentele lanului transportor de electroni sunt localizai n membranele tilacoide i anume n formaiuni speciale denumite ficobilizomi. Acestea conin pigmenii ficobilinici, cu precdere ficocianin, care transfer energia fotosistemului II.
Figura 7.10. Caracteristicile procariotelor fotosintetizante
B.F. BACTERII FOTOSINTETIZANTE ANOXIGENICE TRSTURI VERZI SULFUROASE Principalii pigmeni fotosintetizani Morfologia membranelor fotosintetizante Bacterioclorofila a plus d sau e Sistemul fotosintetizant parial n clorosom independent de membrana plasmatic H2 ; H2S ; S VERZI A NESULFUROASE Bacterioclorofila a i c Clorosomii sunt prezeni cnd bacteriile se dezvolt n condiii anaerobe PURPURII SULFUROASE Bacterioclorofila a i b Sistemul fotosintetizant coninut n membrane sferice sau lamelare legate de membrana citoplasmatic H2 ; H2S ; S NEPURPURII SULFUROASE Bacterioclorofila a i b Sistemul fotosintetizant coninut n membrane sferice sau lamelare legate de membrana citoplasmatic De obicei molecule organice; uneori bacteriile reduc compui cu S sau H2 Extracelular Anoxigenic Oxigenic uneori facultativ anoxige nic Fotolitoa utotrof aerob
OXIGENIC E

CIANOBA CTERII Clorofila a plus ficobilipr oteine Membra nele sunt cptuit e cu ficobiliso mi H2O

Donori de electroni fotosintetici

Donori fotoheterotrofi: glucide, aminoacizi, acizi organici; donori fotoautotrofi H2S; H2 Anoxigenic

Depozit de S Fotosinteza

Extracelular Anoxigenic

Intracelularb Anoxigenic

Tip metabolic

Fotolitoautotrof anaerob obligat

n general fotolitoautotrof; uneori fotoautotrof sau chemoheterotrof (n aerobioza i ntuneric) Mobilitate prin alunecare

Obligat anaerob fotolitoautotrof

Mobilitate

Imobile, unele au vezicule cu gaz

Mobile cu flagel polar, unele au flageli peritrichi

De obicei fotoorganoheter otrof unele facultativ fotolitoautotrof (la ntuneric chemoorganohe -terotrofe) Mobile cu flageli polari sau imobile; unele au vezicule cu gaz

Procent G+C
a b

48-58

53-55

45-70

61-72

Imobile sau mobilitate prin alunecare ; unele au vezicule cu gaz 35-71

Caracteristicile tulpinii Chloroflexus. Cu excepia Ectothiorhodospira.

Proiectul pentru nvmntul Rural

163

Biodiversitatea microorganismelor

Din punct de vedere morfologic, cianobacteriile prezint o mare varietate. Sunt unicelulare, au un diametru de 1-10 m , pot forma colonii diferite ca aspect sau filamente denumite trichoame. Trichomele sunt celule bacteriene dispuse n rnduri pe o suprafa mare, strns legate ntre ele, dei contactul dintre celule este mic. n general, prezint o coloraie albastr- verzuie datorat ficocianinei; unele celule sunt pigmentate n rou sau brun, datorit prezentei ficoeritrinei, un pigment rou. n pofida acestei variaii morfologice, toate cianobacteriile au celule cu structur procariot i un perete celular Gram- tipic. Pentru micarea pe vertical n ap, folosesc veziculele cu gaz; multe dintre formele filamentoase se deplaseaz prin alunecare. Multe cianobacterii formatoare de trichome sau filamente, fixeaz azotul atmosferic prin intermediul unor celule specializate denumite heterociti. n lipsa nitrailor i a srurilor de amoniusursele preferate de azot ale cianobacteriilor- aproximativ 5-10% din celulele trichomei se transform n heterociti. Clasificarea cianobacteriilor rmne n continuare deschis datorit lipsei culturilor pure. Cianobacteriile se pot dezvolta n condiii ambientale extreme, fiind prezente att n ap ct i n sol. Speciile termofile pot s se dezvolte la peste 750C, n izvoare termale neutre i alcaline. Unele forme unicelulare pot crete n roci deertice. n lacurile eutrofe calde, bogate n nutrieni, cianobacteriile de suprafa ca Anacystis i Anabaena produc o pelicul compact, dnd natere fenomenului de nflorire a suprafeei lacurilor. Eliberarea unei mari cantiti de materie organic prin moartea acestor microorganisme stimuleaz creterea bacteriilor chemoheterotrofe, n consecin scade coninutul oxigenului din mediu i survine moartea petilor i a altor vieuitoare din mediul acvatic. Alte cianobacterii, ca de exemplu Oscillatoria sunt att de rezistente la factorii poluani nct prezena acesteia n apele dulci bogate n materii organice reprezint un indicator al polurii apelor.

Teste de autoevaluare TA 7.15 Care este principala deosebire dintre cianobacterii i restul eubacteriilor? ....................................................................................................................... ....................................................................................................................... ....................................................................................................................... TA 7.16 Ce sunt heterocitii i ce rol ndeplinesc? ....................................................................................................................... ....................................................................................................................... ....................................................................................................................... TA 7.17 Ce efecte are nflorirea apelor? ....................................................................................................................... ....................................................................................................................... .......................................................................................................................

164

Proiectul pentru nvmntul Rural

Biodiversitatea microorganismelor

7.1.8 Rezumatul capitolului 7.1 Taxonomia reprezint tiina clasificrii i reunete de fapt, trei domenii tiinifice: clasificarea, nomenclatura i identificarea. Pentru a clasifica microorganismele se utilizeaz taxonomia polifazic i taxonomia molecular. Conceptul de specie n lumea bacterian reprezint o problem extrem de dezbtut n ultimul deceniu. Este ns necesar acumularea de mult mai multe informaii pentru a putea defini aceste noduri cu existen temporar ntr-un continuum de schimbare i evoluie. Studiile efectuate pe ARNr 16S au permis ncadrarea eubacteriilor n funcie de relaiile filogentice dintre ele n 11 grupe principale. Sistemul de clasificare prezentat n Bergeys Manual of Systematic Bacteriology este fenetic i acord o importan deosebit caracteristicilor morfo-fiziologice. Conform acestui sistem bacteriile sunt incluse n 33 de diviziuni, cu caracteristici uor de determinat, fiecare diviziune purtnd un titlu care corespunde proprietilor acestora. Grupele bacteriene sunt mprite astfel: bacterii Gram negative de interes general, medical i industrial; bacterii Gram pozitive, altele dect actinomicetele; bacterii Gram-negative cu proprieti distincte, cianobacterii i arhebacterii; bacterii Gram-pozitive, filamentoase.

7.2. Fungi

Capitolul este doar o introducere n studiul fungilor i urmrete s va familiarizeze cu cteva aspecte legate de diversitatea acestor microorganisme extrem de importante pentru om.

7.2.1. Importana fungilor Fungii prezint un deosebit interes, pe de o parte datorit aplicaiilor biotehnologice, precum i datorit faptului c unii reprezentani sunt cunoscui ca patogeni. n consecin, au fost efectuate cele mai diverse studii, cu scopul de a-i cunoate ct mai bine, att pentru utilizarea lor cu randamente optime n procesele industriale ct i pentru a-i putea combate eficient ca i cauzatori de mbolnviri. Descoperirea antibioticelor i n particular a penicilinei, a revoluionat dup cel de al doilea rzboi mondial terapeutica, permind combaterea unor infecii redutabile, salvnd astfel milioane de viei omeneti . Fungii au fost folosii de ctre om nc din cele mai vechi timpuri, pentru prepararea alimentelor, la ora actual avnd i o sumedenie de alte aplicaii. Astfel: n industria brnzeturilor au rol n nmuierea i aromatizarea pastei (Penicillium roquefortii) sau a pastei presate ( Penicillium camambertii i Geotrichium candidum ); n industria salamurilor, folosirea unui strat alb de Penicillium nalgeovense pe suprafaa acestora previne degradarea lor;
Proiectul pentru nvmntul Rural

165

Biodiversitatea microorganismelor

n producerea unor buturi tradiionale fermentate - spre exemplu buturile alcoolice de tip sake sunt fabricate cu ajutorul fungilor. Hidroliza amidonului din orez care precede fermentaia se realizeaz cu -amilaze biosintetizate de Aspergillus oryzae; n industria chimic, prin intermediul fungilor se produc, prin biosintez: enzime ca: proteaze pectinaze, -amilaze, cu tulpini din genul Aspergillus; acizi organici ca: acid citric, gluconic, cu Aspergillus niger; antibiotice: produse de Penicillium chrysogenum; hormoni, cortizon; biomas, n scopul obinerii unei surse complementare de proteine pentru furajarea animalelor Prin speciile saprofite care se dezvolt pe resturi organice animale i vegetale fungii sunt importani n desfurarea ciclurilor biogeochimice. 7.2.2. Caractere generale ale fungilor Fungii sunt microorganisme eucariote, heterotrofe, saprofite sau parazite, rspndite n ape dulci sau n sol. Printre fungi se gsesc toate formele de tranziie de la organismele unicelulare mobile la multinucleate, cu tal coenocitic sau cu structur complex. Nu formeaz esuturi adevrate. Cu excepia unor fungi care nu au perete celular, peretele lor conine chitin, iar la un grup restrns conine celuloz. Prezint nuclei ataai de membran, mitocondrii, ribozomi 80S i nu conin plasmide. Datorit clasificrii lor iniiale printre plantele fr rdcin, tulpin i frunze (Thalophytes), corpul lor vegetativ a fost numit tal. Cu excepia drojdiilor, talul fungic are aspectul unei mase de filamente (numite hife) ramificate sau nu, mas cunoscut sub denumirea de miceliu. Miceliul este organul de asimilaie al fungului. La aa-numiii fungi inferiori, hifele sunt aseptate (nu posed perei transversali care s individualizeze celulele), iar talul se numete tal coenocitic. La fungii superiori (Ascomycotina, Basidiomycotina i Deuteromycotina), hifele sunt septate (posed perete despritor). Septul este perforat, citoplasma mpreun cu nucleii putnd migra n interiorul miceliului. Fungii au fost distribuii n patru diviziuni principale : Divizia Zygomycota. Divizia Ascomycota Divizia Basidiomycota Divizia Deuteromycota (Fungi imperfeci). Clasificarea convenional a fungilor se bazeaz pe ciclul de via al speciilor i pe morfologia organelor de multiplicare i a sporilor. n prezent accentul se pune studiul caracterele biochimice. Caracteristicile culturale i fiziologice sunt folosite drept criterii definitorii n identificarea speciilor numai la drojdii. Taxonomia molecular este un domeniu care permite identificarea relaiilor filogenetice, ceea ce impune adesea redenumirea unor specii. 166
Proiectul pentru nvmntul Rural

Biodiversitatea microorganismelor

Cu toate acestea, cunoaterea formelor de multiplicare sexuat sau asexuat ale fungilor este necesar pentru o ncadrare corect a taxonilor. Teste de autoevaluare TA 7.18 Definii miceliul. ............................................................................................................... ............................................................................................................... ............................................................................................................... TA 7.19 Enumerai cel puin 3 criterii folosite n clasificarea fungilor. ............................................................................................................... ............................................................................................................... ...............................................................................................................

7.2.3. Principalele grupe de fungi Vom prezenta, n continuare, fungii cei mai importani, att din punct de vedere biotehnologic ct i al degradrii alimentelor, fungi ncadrai n diviziunile Zygomycota, Ascomycota i Deuteromycota (vezi Caseta 10). Caseta 10 Biologia i taxonomia drojdiilor Drojdiile sunt un grup de fungi cu o diversitate filogenetic deosebit, ale cror forme teleomorfe sau stri sexuate sunt prezente la nivelul a dou clase taxonomice majore, Ascomycotina i Basidiomycotina. Speciile anamorfe, care prezint numai nmulire asexuat, au fost iniial grupate n Fungii imperfeci. De asemenea, termenul de drojdie este considerat, n prezent, unul de convenien, aceste organisme, a cror diviziune mitotic (pe cale vegetativ) se realizeaz prin nmugurire sau prin fisiune binar, fiind formele unicelulare ale fungilor filamentoi. Microbiologii au studiat taxonomia drojdiilor de mai bine de un secol, dar nc mai sunt destule de realizat pentru a stabili un sistem de clasificare complet. O identificare corect este absolut necesar pentru tratamentul eficient al infeciilor, pentru nelegerea interaciunii dintre specii n natur i pentru selectarea celor mai potrivite tulpini pentru industria fermentativ i alimentar. Saccaromyces cerevisiae este una dintre cele mai studiate eucariote, fiind considerat organism-model pentru studiile de genetic.

7.2.3.1. Diviziunea Zygomycota Aceast grup prezint un miceliu coenocitic. Unicul perete despritor separ sporangiul i zigosporii de miceliul steril. De obicei, septul apare pe hifele mature ale miceliului. Reproducerea poate fi asexuat i sexuat. Reproducerea asexuat se realizeaz prin sporangiospori (aplanospori) formai n sporangii purtai de sporangiofori (Figura 7.11).

Proiectul pentru nvmntul Rural

167

Biodiversitatea microorganismelor

Unele specii produc clamidospori (celule cu perete gros) (Figura 7.12) sau oidii (celule cu perete subire, rotunde) care pot fi terminali sau intercalai, izolai sau n rnduri. Sporangiosporii, clamidosporii i oidiile germineaz cu formarea unui nou miceliu. Reproducerea sexuat are loc prin fuziunea a dou gametangii multinucleate, rezultnd un zigospor cu perete gros de culoare galben sau brun, adesea acoperit de striuri sau alte formaiuni (Figura 7.13).

Figura 7.11. Sporangioforul la Zygomycetes

Figura 7.12. Clamidospori la Zygomycetes

Figura 7.13. Zigospor la Zygomycetes

Majoritatea membrilor acestei grupe sunt saprofii, iar unii pot inhiba creterea altor fungi i chiar a unor plante sau animale. Unele specii de Rhizopus i Absidia sunt prezente n silozurile de cereale, fructe i alte vegetale, n atmosfer sau compost; pot degrada lemnul, fructele i legumele depozitate. Alte specii, ca cele de Mucor i Rhizopus, joac un rol important n prepararea alimentelor fermentate i n producerea de acizi organici. Unele tulpini din genul Mucor sunt de interes biotehnologic. Se prezint sub form de hife albe sau colorate, variind n nlime de la 1-2 milimetri pn la civa centimetri. 168
Proiectul pentru nvmntul Rural

Biodiversitatea microorganismelor

7.2.3.2. Diviziunea Ascomycota Miceliul vegetativ al ascomicetelor este septat i haploid. Multiplicarea se realizeaz prin asce care adesea se formeaz prin cariogamia a doi nuclei din diferite gametangii (masculin: antheridium, feminin: ascogonium). Ascosporii, n majoritatea cazurilor, sunt n numr de 8 (uneori 2 sau 4) i sunt formai n asce, dup meioz. Statutul teleomorf (faza sexuat a ciclului de via) este adesea nsoit de una sau dou faze de reproducere asexuat, aa-zisul statut anamorf (Figura 7.14). Majoritatea deuteromicetelor (fungii imperfeci) sunt anamorfe n ciclul de via al ascomicetelor. Ascomicetele care aparin ordinului Eurotiales, se caracterizeaz printr-un ascocarp coninnd mai multe asce mici globulare sau subglobulare i ascospori ornamentai.

Figura 7. 14 Ciclul de viata la Eurotiales (Ascomycotina)

7.2.3.3. Diviziunea Deuteromycetes (Fungi imperfecti) Clasa Deuteromycetes cuprinde genuri-tip i specie-tip, la care sunt cunoscute numai formele anamorfe (asexuat sau conidial). Din acest grup fac parte dou genuri cu importan deosebit, genurile Aspergillus i Penicillium. Genul Aspergillus. Reprezentant tipic al deuteromicetelor, reunete specii care se multiplic asexuat prin conidii. Speciile de Aspergillus se deosebesc ntre ele pe baza caracterelor microscopice ale aparatului conidial i a caracterelor de cultur ale coloniilor. Proiectul pentru nvmntul Rural 169

Biodiversitatea microorganismelor

Clasificarea modern impune observaii fcute pe culturi pure de aceeai vrst, crescute n condiii standard de iluminat, temperatur i substrat.
Figura 7.15. Metabolii sintetizai de specii ale genului Aspergillus

SPECIA Aspergillus niger A. terreus A. ustus A. flavipes A. flavus Aspergillus sp.

METABOLII acid citric acid tereic acid ustic flavipina acid aspergilic flavacol aflatoxina B1 acid kojic aspertecina

Metaboliii produi de genul Aspergillus sunt un grup mare de compui chimici de diverse naturi, ale cror funcii n economia celulei nu sunt definite. Tabelul din Figura 7.15. prezint principalele categorii de metabolii cu importan practic deosebit sintetizai de unele specii ale genului Aspergillus, iar tabelul din Figura 7.16. prezint unii metabolii produi de specii ai aceluiai gen utilizai n industria alimentar.
Figura 7.16. Metabolii utilizai n industria alimentar, produi de speciile genului Aspergillus

METABOLII acid citric acid gluconic acid itaconic acid malic acid oxalic acid tartric -amilaza glucoamilaza glucozo-oxidaza, catalaza lactaza naringinaza pectinaza proteaza manitol 170

SPECIA
PRODUCTOARE

SE UTILIZEAZ LA PRODUCEREA rcoritoarelor, brnzeturilor, gemurilor, produselor zaharoase, conservelor, preparatelor congelate prafului de copt, dulciurilor rinilor de mpachetare rcoritoarelor, gemurilor, produselor zaharoase - hidrolizeaz amidonul pn la glucoz buturilor carbogazoase, produselor zaharoase, gelatinei dextrozei, produselor de patiserie, dextrinelor alimentare dextrozei, siropului de dextroz, produselor de patiserie prafului de ou, maionezei, berii, vinurilor produselor lactate - elimin gustul amar al sucului de grapefruit - servete la limpezirea sucurilor de fructe i a vinurilor berii, produselor de patiserie - utilizat ca umidificator
Proiectul pentru nvmntul Rural

A. niger A. niger A. itaconicus, A. terreus Aspergillus sp. A. niger A. niger, A. griseus A. oryzae, A. niger A. awamori, A. niger A. niger A. niger A. niger A. niger A. niger A. candidus

Biodiversitatea microorganismelor

Genul Penicillium. Coloniile de Penicillium se dezvolt rapid pe medii specifice agarizate, formnd o psl deas de conidiofori de culoare verde, uneori de culoare alb. Clasificarea speciilor din genul Penicillium dup caracterele de cultur trebuie completat cu caracteristicile morfologice, cu vitezele de cretere pe diferite medii i la diferite temperaturi, precum i cu determinarea profilului metaboliilor secundari prin cromatografie n strat subire. Penicilina este produs de tulpini de Penicillium chrysogenum. Importana multor specii de Penicillium rezid n metaboliii secundari pe care i produc. Dac lum n considerare numai dou antibiotice, penicilina i grizeofulvina, vom avea o imagine asupra amploarei i importanei industriale a acestora i a altor poteniale aplicaii n industrie. Consecinele descoperirii penicilinelor sunt bine cunoscute. n pofida descoperirii de noi antibiotice, multe cu un spectru larg de aciune asupra germenilor patogeni, penicilinele mpreun cu lactamii rmn produii cei mai importani pentru terapeutic. Teste de autoevaluare TA 7.20 Completai textul urmtor cu noiunile corespunztoare: n faza .a ciclului de via fungal sunt implicate diferite tipuri de spori. Unii dintre acetia, precum ..sunt celule intercalate sau terminale, cu perei subiri. Spre deosebire de miceliul Zygomycetelor, cel al este septat. Din ciclul de via al Deuteromycetelor lipsete faza..

7.2.4 Rezumatul capitolului 7.2 Fungii prezint un deosebit interes, pe de o parte datorit aplicaiilor biotehnologice, precum i datorit faptului c unii reprezentani sunt cunoscui ca patogeni. Fungii sunt microorganisme eucariote, heterotrofe, saprofite sau parazite, rspndite n ape dulci sau n sol. Printre fungi se gsesc toate formele de la organismele unicelulare mobile la multinucleate, cu tal coenocitic sau cu structur complex. Clasificarea convenional a fungilor se bazeaz pe ciclul de via al speciilor i pe morfologia organelor de multiplicare i a sporilor. Fungii au fost distribuii n patru diviziuni principale : Divizia Zygomycota, Divizia Ascomycota, Divizia Basidiomycota, Divizia Deuteromycota (Fungi imperfeci).

Proiectul pentru nvmntul Rural

171

Biodiversitatea microorganismelor

7.3 LUCRARE DE VERIFICARE 6 I. ncercuii litera corespunztoare variantei corecte de rspuns: 1. Microorganismele autotrofe sunt : a) fie fototrofe, fie auxotrofe b) fie fototrofe, fie chemotrofe c) fie fototrofe, fie prototrofe d) fie chemotrofe, fie heterotrofe. 2. Majoritatea bacteriilor nefotosintetizante sunt chemoorganotrofe i folosesc : a) surse anorganice de energie, donor anorganici de hidrogen i carbon organic b) energie luminoas, donori organic de hidrogen i carbon anorganic c) surse anorganic de energie, donori organici de hidrogen, carbon organici d) surse organice de energie, donori organici de hidrogen, carbon organic. 3. Difuzia (pasiv sau facilitat) implic : a) transportul unor molecule de dimensiuni foarte mici b) transportul mpotriva unui gradient de concentraie c) transportul conform unui gradient de concentraie d) utilizarea unor proteine numite integraze. 4. n faza de lag : a) rata de cretere este exponenial b) rata diviziunii crete gradat c) rata de cretere este n scdere d) rata diviziunilor este nul. 5. O populaie format din 100 de bacterii care se divid la fiecare 30 de minute, dup 5 generaii va fi format din : a) 1600 celule b) 1200 celule c) 3200 celule d) 320 celule. 6. Microorganismele care suport variaii mari de temperatur i salinitate crescut sunt : a) stenoterme i halofile b) stenoterme i osmotolerante c) euriterme i halofile d) euriterme i osmotolerante. 7. Avantajul folosirii aldehidelor const n : a) aciunea lor sporicid b) oxidarea constituenilor celulari c) distrugerea membranei celulare d) aciunea lor dezinfectant i antiseptic. 8. Hibridizarea ADN : ADN permite a) stabilirea gradului de omologie ntre 2 cromozomi bacterieni b) stabilirea ordinii nucleotidelor n secvena de ADN c) studiul secvenelor de ARNr d) stabilirea procentului molar de Guanin+Citozin. 172
Proiectul pentru nvmntul Rural

Biodiversitatea microorganismelor

9. Cele mai importante bacterii productoare de antibiotice sunt: a) bacteriile lactice b) streptococii c) deuteromicetele d) stretomicetele i actinomicetele. 10. Ciclul de via al diviziunii Ascomycota include : a) o faz teleomorf i una sexuat b) o singur faz sexuat c) o faz anamorf i una vegetativ d) o faz teleomorf i una asexuat. Total: 20 puncte (cte 2 puncte pentru fiecare item) II. Completai spaiile goale cu noiunile corespunztoare:

Bacteriile pot transporta molecule pe care le transform chimic printr-un proces numit Microorganismele care cresc la temperaturi foarte mari se numesc.. Pentru obinerea celor mai complete informaii cu privire la taxonomia bacterian este necesar analiza complet a ..genomului bacterian. Sistemele de clasificare care folosesc caractere.se numesc sisteme fenetice. Spirochetele sunt bacterii., dintre care unele sunt patogene, n timp ce streptococii, cei mai importani ageni patogeni umani sunt bacterii.. Total: 12 puncte (cte 2 puncte pentru fiecare noiune) III. Rspundei pe scurt (1-2 fraze) la urmtoarele ntrebri: 1. Explicai de ce microorganismele patogene sunt heterotrofe. 2. Ce sunt factorii de cretere ? Exemplificai. 3. Argumentai ineficiena difuziei pasive n preluarea nutrienilor din mediu de ctre procariote. 4. Ce reprezint i la ce folosesc apa peptonat, bulionul de carne i geloza nutritiv ? Dar agarul? 5. Ce deosibire exist ntre cultivarea bacteriilor n sistem nchis i tehnica culturilor continue ? 6. Clasificai microorganismele n funcie de tolerana fa de oxigen. Exemplificai. 7. De ce timpul de generaie este mai scurt n culturi dect n natur ? Total: 28 puncte (cte 4 puncte pentru fiecare noiune) IV. Scriei n dreptul fiecrui enun litera A, dac considerai c enunul este adevrat, sau F, dac considerai c rspunsul este fals.

1. Bacteriile intr n faza staionar de cretere dac populaia atinge 106 celule/ml datorit scderii concentraiei unui nutrient important. 2. Frecvent, pentru culturile lichide numrul se exprim ca uniti formatoare de colonii. 3. Microorganismele care cresc pe suprafee solide tind s formeze colonii cu morfologie distinct i care cresc mai rapid pe margine, unde exist suficieni nutrieni i oxigen. 4. Unele microorganisme strict anaerobe pot fi gsite uneori n habitate aparent aerobe, dei enzimele lor sunt inactivate de prezena oxigenului. 5. Taxonomia molecular permite descrierea speciilor bacteriene necultivabile deoarece utilizeaz drept criteriu secvena de nucleotide din molecula de ADN. Total: 10 puncte (cte 2 puncte pentru fiecare item) V. Realizai n maximum 1-2 pagin un eseu n care s analizai critic afirmaia: n prezent nu exist o definiie unanim acceptat a speciei bacteriene. 173

Proiectul pentru nvmntul Rural

Biodiversitatea microorganismelor

Se puncteaz structurarea eseului, corectitudinea noiunilor, folosirea limbajului adecvat. Total: 20 puncte (cte 10 puncte pentru fiecare cerin) Total general: 90 puncte + 10 puncte din oficiu= 100 puncte 7.4 RASPUNSURI LA TESTELE DE AUTOEVALUARE Unitatea de nvare 7 TA 7.1 Taxonomia este tiina clasificrii i include clasificarea, nomenclatura i identificarea. Taxonomia bacterian convenional utilizeaz caracteristici morfologice, fiziologice, ecologice i biochimice, n timp ce taxonomia molecular studiaz variaiile la nivelul unor constitueni chimici, n principal la nivelul acizilor nucleici. TA 7.2 Nu prezint fenomene de sexualitate asemntoare eucariotelor. TA 7.3 Compoziia total n nucleotide (procentul de GC), hibridizarea ADNN:ADNN. TA 7.4 Specia bacterian este definit ca un grup de tulpini bacteriene ce prezint omologie de secven n procent de cel puin 70%. TA 7.6 Utilizeaz caractere morfologice i fiziologice, fiind un sistem fenetic de clasificare. TA 7.7 Treponema TA 7.8 Au o mare importan industrial datorit fermentaiei mixte cu producere de diferii compui ca: etanol, lactat, acetat. De asemenea sunt importante tiinific, specia E. coli fiind foarte utilizat n cercetare ca specie model. Numeroase specii sunt patogene. TA 7.9 Au rezisten crescut la umiditate i presiune osmotic ridicat, putnd supravieui n secreiile nazale. TA 7.10 Bacterii lactice. TA 7.11 Glucide TA 7.13 Au trsturi morfologice foarte diferite. TA 7.14 Capacitatea de a produce antibiotice i alte substane biologic active. TA 7.15 Procariote cu fotosintez oxigenic. TA 7.16 Sunt celule specializate n fixarea oxigenului atmosferic. TA 7.17 Scad concentraia de oxigen, inducnd moartea petilor i a altor organisme din ap. TA 7.18 Miceliul reprezint talul fungilor format dintr-o mas de hife ramificate sau nu cu rol n asimilaie. TA 7.19 Ciclul de via, morfologia organelor de multiplicare, morfologia sporilor, caractere culturale, fiziologice, biochimice. TA 7.20 n faza anamorf a ciclului de via fungal sunt implicate diferite tipuri de spori. Unii dintre acetia, precum oidiile sunt celule intercalate sau terminale, cu perei subiri. Spre deosebire de miceliul Zygomycetelor, cel al Ascomycetelor este septat. Din ciclul de via al Deuteromycetelor lipsete faza teleomorf.

7.5 BIBLIOGRAFIE RECOMANDATA 1. Herlea V., 1998 Microbiologie general, Ed. Univ., Bucureti. 2. Mihaescu G., 2000 - Microbiologie general i virologie, Ed. Univ. Bucureti. 3. Stoica I., Vassu T., Ssrman E., 2002 Biologia i taxonomia molecular a microorganismelor. Colecia de culturi microbiene. Ed. Arvin Press. 4. Zarnea G., 1983 - Tratat de microbiologie general. Vol. I, Edit. Acad. RSR. 5. Zarnea G., 1984 Tratat de microbiologie general. Vol. II, Edit. Acad. RSR. 6. Zarnea G., 1994 Tratat de microbiologie general. Vol. V, Ed. Acad. Romne. 7. Zarnea G., Mihiescu Gr., Velehorschi V., 1992 Principii i tehnici de microbiologie general. I, Bucureti. 174
Proiectul pentru nvmntul Rural

Bibliografie selectiv

8. BIBLIOGRAFIE SELECTIV (consultat pentru realizarea prezentului manual)


1. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P., 2002, Molecular Biology of the Cell. 4th ed., Garland Publishing House, New York. 2. Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L., 2002, Biochemistry. , W. H. Freeman and Co., New York. 3. Brown T.A., 2002, Genomes. 2nd ed., BIOS Scientific Publishers, Ltd, Oxford, UK. 4. Campbell A.M., 1992, Chromosomal insertion sites for phages and plasmids. Journal of Bacteriology 174(23):7495-7499. 5. Cohen S.N., 1993, Bacterial plasmids: their extraordinary contribution to molecular genetics. Gene 135:67-76. 6. Cooper G.M., 2000, The Cell - A Molecular Approach. 2nd ed., Sinauer Associates, Inc., SUA. 7. Cornea C.P., 1998, Elemente de Inginerie Genetic, Editura ALL, Bucureti. 8. Covic M., tefnescu D., Sandovici I., 2004, Genetic medical, Editura Polirom. 9. Dale J.W., 1998, Molecular Genetics of Bacteria, 3rd Edition.Anonymous Chichester, UK:John Wiley & Sons. 10. Del Solar G., Giraldo R., Ruiz-Echevarria M.J., Espinosa M., Diaz-Orejaz R., 1998, Replication and control of circular bacterial plasmids. Microbiol Molec Biol Rev 62(2):434-464. 11. Embley T.M., Hirt R.P., Williams D.M., 1994, Biodiversity at the molecular level: the domains, kingdoms and phyla of life. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 345(1311):21-33. 12. Espinosa M., del Solar G., Rojo F., Alonso J.C., 1995, Plasmid rolling circle replication and its control. FEMS Microbiol Lett 130:111-120. 13. Freifelder D., 1987, Microbial Genetics. Jones and Bartlett Publishers. Boston, USA. 14. Gavril L., 2003, Genomica Un tratat despre genom, de la virusuri la om, vol.I i vol.II, Editura Enciclopedic, Bucureti. 15. Gilson E., Bachellier S., Perrin S., Perrin D., Grimont P.A.D., Grimont F., Hofnung M., 1990, Palindromic unit highly repetitive DNA sequences exhibit species specificity within Enterobateriaceae.. Researches in Microbiology 141:11031116. 16. Griffiths A.J.F., Miller J.H., Suzuki D.T., Lewontin R.C., Gelbart W.M., 1999, Introduction to Genetic Analysis. 7th ed., W. H. Freeman & Co., New York. 17. Hardy K.G., 1988, Plasmids: A Practical Approach. IRL Pres. Oxford, UK. 18. Herlea V., 1998 Microbiologie general, Ed. Univ., Bucureti. 19. Hinnebusch H., Barbour A.G., 1992, Linear- and circular-plasmid copy numbers in Borrelia burgdorferi. J.Bact. 174(16):5251-5257. 20. Hinnebusch J., Tilly K., 1993, Linear plasmids and chromosomes in bacteria. Molecular Microbiology 10(5):917-922. 21. Hiraga S., 1992, Chromosome and plasmid partition in E.coli. Annu Rev Biochem 61:283-306. 22. Lewin B. , 1997, Genes. 6th ed., Oxford University Press, New York, USA. 23. Lodish H., Berk A., Zipursky S.L., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J.E., 2000, Molecular Cell Biology. 4th ed., W. H. Freeman & Co. Publishing, New York. 24. Manen D., Caro L., 1991, The replication of plasmid pSC101. Molecular Microbiology 5(2):233-237. 25. Margulis L., 1992, Biodiversity: molecular biological domains, symbiosis and kingdom origins. Biosystems 27(1):39-51. 26. Mihaescu G., 2000 - Microbiologie general i virologie, Ed. Univ. Bucureti.
Proiectul pentru nvmntul Rural

175

Bibliografie selectiv

27. Moller-Jensen J., Gerdes K.J.R., 2000, Plasmid and chromosome segregation in prokaryotes. Trends in Microbiology 8(7):313-320. 28. Nester E.W., Evans Roberts C., Nester M., 1995, Microbiologz, A Human Perspective, WCB Publishers, SUA. 29. Pettijohn D.E., 1988, Histone-like proteins and bacterial chromosome structure. Journal of Biological Chemistry 263(26):12793-12796. 30. Pettijohn D.E., 1988, Histone-like proteins and bacterial chromosome structure. Journal of Biological Chemistry 263(26):12793-12796. 31. Prescott L.M., Harlez J.P., Klein D.A., 1996, Microbiologz. Third Edition, WCB Publishers, SUA. 32. Raicu P., Stoian V., 1991, Genetica dezvoltrii la eucariote, Editura Academiei Romne. 33. Russel P.J., 1994, Fundamentals of Genetics, Harper Collins College Publishers, SUA. 34. Sakaguchi K., 1990, Invertrons, a class of structurally and functionally related genetic elements that includes linear DNA plasmids, transposable elements and genomes of adeno-type viruses.. Microbiological Reviews 54(1):66-74. 35. Stoica I., Vassu T., Ssrman E., 2002 Biologia i taxonomia molecular a microorganismelor. Colecia de culturi microbiene. Ed. Arvin Press. 36. Strachan T., Read A.P., 1999, Human Molecular Genetics 2. 2nd ed., BIOS Scientific Publishers, Ltd,Oxford, UK. 37. Summers D.K., 1996, The Biology of Plasmids.Anonymous Anonymous Oxford, UK:Blackwell Science Ltd. 38. Sykora P., 1992, Macroevolution of plamids: a model for plasmid speciation. Journal of Theoretical Biology 159:53-65. 39. Trun N.J., 1998, Architecture of a bacterial chromosome. ASM News 64(5):276-283. 40. Vassu T., Stoica I., Cstuak O., Muat F., 2001, Genetica microorganismelor i Inginerie genetic microbian. Note de curs i Tehnici de laborator. Editura Petrion, Bucureti. 41. Watson J.D., Baker T.A., Bell S.P., Gann A., Levine M., Losick R., 2004, Molecular Biology of the Gene. Fifth Edition, CSHL Press. 42. Weaver R.F., 1999, Molecular Biology, WCB McGraw-Hill Press. 43. Woese C.R., Kandler O., Wheelis M.L. , 1990, Towards a natural system of organisms: proposal for the domains Archaea, Bacteria and Eucarya., Proc Natl Acad Sci USA, 87, pp 4576-4579. 44. Zarnea G., Tratat de Microbiologie Generala. vol I (1983), II (1984) i V (1994), Editura Academiei Romane. 45. Zarnea G., Mihiescu Gr., Velehorschi V., 1992 Principii i tehnici de microbiologie general. I, Bucureti.

176

Proiectul pentru nvmntul Rural