Gua Prctica 9

Micelio de hongos

Produccin de micelio en medio lquido para extraccin de ADN

Guillermo Castellanos, Experto en Investigacin2 Carlos Jara, Ing. Agr. M.Sc., Asociado en Investigacin Gloria Mosquera, Fitopatloga, Ph.D., Lder de Proyecto Fitopatologa de Frijol

Contenido
Generalidades Procedimientos A. Produccin de micelio B. Cosecha del micelio C. Extraccin del ADN del micelio 9-2 9-3 9-3 9-5 9-8

Guas Prcticas de Laboratorio para el Manejo de Patgenos del Frijol

Generalidades
Un punto clave en la extraccin de ADN de buena calidad del micelio de hongos fitopatgenos es el crecimiento ptimo del micelio sobre un medio de cultivo. Se utiliza, generalmente, este tipo de tejido del hongo porque tiene un crecimiento ms homogneo que otros tejidos del hongo. Las esporas, por ejemplo, son ms difciles de procesar que el micelio, porque son estructuras muy rgidas que requieren protocolos de extraccin especiales; adems, pertenecen, por su formacin, a la etapa madura o senescente del crecimiento del hongo. Para lograr un buen crecimiento del micelio de un hongo es necesario aplicar las buenas prcticas microbiolgicas (BPM), entre ellas las siguientes: esterilidad identificacin correcta de las muestras cultivo del hongo en la fase exponencial de crecimiento

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Procedimientos
A. Produccin de micelio
Materiales para el medio lquido
Dextrosa o sucrosa Extracto de levadura Peptona Agua destilada 20 5 5 1 g g g litro

Preparacin
Calentar el litro de agua destilada con los ingredientes para facilitar su mezcla, hasta que la solucin adquiera un color amarillo y se vea cristalina: esta mezcla es el medio lquido. Preparar 20 frascos erlenmeyer de 250 ml (cada uno recibe 50 ml de la mezcla anterior). Tapar cada uno de los frascos erlenmeyer con los siguientes elementos: tapn de algodn, papel de aluminio, papel de envolver y banda de caucho. Llevar los frascos erlenmeyer al autoclave y esterilizarlos.

Una vez preparado el medio lquido, se ejecutan los cuatro pasos del proceso de produccin.

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Pasos del proceso

Se toman los diferentes aislamientos de hongos que sern utilizados para producir micelio, los cuales han crecido previamente en cajas petri que contengan el medio de cultivo adecuado. Se comprueba luego que hayan esporulado y que estn totalmente puros (es decir, libres de otros microorganismos contaminantes). En estos procesos se utilizan pipetas pasteur estriles y todos los procesos se ejecutan en la cmara de flujo laminar. Paso 1 Marcar el frasco erlenmeyer con el nombre del aislamiento que va a crecer en este medio. Proceder luego de la siguiente manera: retirar de los frascos erlenmeyer la banda de caucho, los pedazos de papel de envolver y el tapn de algodn, y colocarlos a un lado evitando que se contaminen, ya que sern reutilizados en el paso siguiente. Paso 2 Tomar con la pipeta 5 ml de medio lquido del frasco erlenmeyer, depositarlo sobre el hongo en crecimiento en una caja petri y raspar su superficie con la pipeta; de este modo se hace una suspensin con el micelio y las esporas del aislamiento.

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Paso 3 Aspirar con la pipeta la suspensin obtenida y colocarla de nuevo en el frasco erlenmeyer de donde se extrajo el medio lquido (paso anterior). Inmediatamente despus tapar el frasco erlenmeyer colocando en l de nuevo el tapn de algodn, los pedazos de papel de envolver y la banda de caucho que se haban reservado. Paso 4 Colocar los frascos erlenmeyer en un agitador a 80 rpm durante 10 das a temperatura ambiente (22 C). Este tiempo es suficiente para que crezca el micelio, que se cosechar ms tarde. Durante la agitacin, el medio debe conservar su estado cristalino. Si se ve turbio, est contaminado; se debe descartar ese aislamiento y repetir todo el proceso.

B. Cosecha del micelio

Materiales
Frascos de vidrio con tapa rosca, que se esterilizan en autoclave Toallas de papel esterilizadas en autoclave Gasa cortada en cuadros de 15 x 15 cm y esterilizada en autoclave Cinta de enmascarar delgada Marcador de punta fina y recipiente de vidrio para desechar el medio de cultivo lquido donde creci el hongo

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Pasos del proceso

Paso 1 Retirar de cada frasco erlenmeyer la banda de caucho, los trozos de papel y el tapn de algodn (Foto 1). Paso 2 Colocar en la boca de cada frasco erlenmeyer un cuadrado de gasa, sujetarlo all con los dedos por sus bordes (puede ayudarse con una varilla de vidrio esterilizada) e inclinar el frasco erlenmeyer sobre un vaso grande para que salga el medio lquido a travs de la gasa (Foto 2). De este modo se filtra el medio y se retiene en la gasa el micelio que creci dentro del frasco erlenmeyer (Foto 3). Paso 3 Retirar la gasa con el micelio de la boca del frasco erlenmeyer y depositarlo sobre dos toallas de papel (Foto 4). Enrollar las toallas sobre el micelio y hacer presin con los dedos para extraerle el remanente de medio de cultivo lquido (Foto 5). Paso 4 Tomar el frasco de vidrio con tapa rosca donde se almacenar el micelio y marcarlo con el nombre del aislamiento usando cinta de enmascarar (Foto 6).

Foto 1

Foto 2

Foto 3

Foto 4

Foto 5

Foto 6

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Paso 5 Depositar el micelio secado con las toallas en el fondo del frasco de vidrio, ya marcado, con la ayuda de una esptula esterilizada pequea (Foto 7). Colocar luego la tapa del frasco (Foto 8) dejando ste a medio cerrar (no enroscar totalmente la tapa). Paso 6 Llevar los frascos que contienen el micelio y que estn an con la tapa floja al liofilizador (ver descripcin en otras guas) y dejarlos all durante 24 horas para que termine de secar el micelio (Foto 9). Pasado ese tiempo de secado, apagar el liofilizador, retirar de l los frascos y ajustar sus tapas. Si no se procede enseguida a extraer el ADN del micelio, los frascos con micelio se almacenarn a 80 C (Foto 10).

Foto 7

Foto 8

Foto 9

Foto 10

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C. Extraccin del ADN del micelio

Materiales (soluciones)
Acetato de amonio 7.5 M PM = 77.08 (CH3 COONH4) Preparacin de 500 ml de solucin: Diluir 289 g de acetato de amonio en 300 ml de agua destilada estril. Cuando el acetato est completamente disuelto, ajustar el volumen de la solucin a 500 ml. Esterilizar la solucin mediante filtros de 0.22 m. Almacenar a temperatura ambiente (RT).

Buffer de extraccin Soluciones stock:

Solucin stock NaCl Tris-HCl, pH 7.5 EDTA, pH 8.0 Compuesto SDSb (2 g)
a. Concentraciones inicial y final (est en los 200 ml, ver abajo). b. SDS = dodecil-sulfato sdico, compuesto tensoactivo aninico.

[Inicial]a 5M 1M 0.5 M

Volumen usado (ml) 20 40 4

[Final]a 0.5 M 0.2 M 10 mM

1%

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Preparacin de 200 ml de buffer: Disolver el SDS (2 g) en 80 ml de agua destilada estril tibia. Adicionar las soluciones stock como indica el cuadro arriba y ajustar el volumen a 200 ml con agua destilada estril. Guardar a temperatura ambiente (RT).

Proteinasa K [10 mg/ml] Referencia: Proteinasa K, Promega Cat# V3021 100 mg Preparacin: Stock 1 [20 mg/ml] Reconstituir 5 ml de una solucin de Tris HCl 50 mM, pH 8.0 y de una de CaCl2 10 mM, as: Tomar 250 l del stock 1 M Tris-HCl pH 7.5 Aadirle 50 l de un stock 1 M CaCl2 Ajustar el volumen a 5 ml

Stock 2 [10 mg/ml] Diluir 5 ml del stock 1 anterior con 5 ml de gricerol al 100%, para obtener una solucin de glicerol al 50%. Alicuotar la solucin anterior en microtubos de 1.5 ml y almacenarlos a 20 C.

La concentracin usual de trabajo de la proteinasa K est entre 50 y 100 g/ml.

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1X TE pH 8.0 Soluciones stock:

Solucin stock Tris-HCl, pH 8.0 EDTA, pH 8.0 [Inicial]a 1M 0.5 M Volumen usado (ml) 5 1 [Final]a 10 mM 1 mM

a. Concentraciones inicial y final (est en los 500 ml, ver abajo).

Preparacin de 500 ml de solucin: Ajustar el volumen (6 ml) hasta 500 ml con agua destilada estril. Esterilizar esta solucin por filtracin (poros de 0.22 m). Tomar alcuotas en microtubos de 1.5 ml y guardarlos a 4 C.

RNAasa A [1 mg/ml] Referencia: RNAasa A Roche 100 mg Preparacin: Stock 1 [10 mg/ml] Resuspender todo el contenido de la enzima en 10 ml de una solucin 10 mM de Tris-HCl, pH 7.5 (100 l de 1 M Tris-HCl) + 15 mM NaCl (37.5 l de 1 M NaCl) Calentar esta suspensin a 100 C durante 15 minutos. Dejar enfriar a temperatura ambiente y tomar alcuotas.

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Stock 2 [1 mg/ml]: Diluir 100 l del stock 1 anterior con 900 l de solucin 10 mM Tris-HCl pH 7.5 + 15 mM NaCl (37.5 l 1 M NaCl). Hacer alcuotas y almacenarlas a 20 C. PM = 121.1

Tris-HCl 1 M Partiendo de Trizma Base:

Preparacin de 1000 ml de solucin: Disolver 121.1 g de Trizma Base en 800 ml de agua destilada. Ajustar el pH al valor deseado adicionando HCl concentrado. Completar a 1 litro con agua destilada y esterilizar en autoclave. Guardar a 4 C.

NaCl 5 M PM = 58.44 Preparacin de 500 ml de solucin: Disolver 146.1 g de NaCl en agua destilada. Esterilizar en autoclave y almacenar a temperatura ambiente.

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EDTA 0.5 M pH 8.0 PM = 372.4 Preparacin de 1000 ml de solucin: Disolver 186.2 g de EDTA en 800 ml de agua destilada; usar un agitador magntico. Ajustar el pH hasta 8.0 con NaOH (~20 g) y completar el volumen a 1000 ml. El EDTA se disuelve bien cuando la solucin alcanza el pH apropiado. Esterilizar en autoclave y guardar a temperatura ambiente.

Acetato de sodio 3 M pH 5.2 PM = 82.03 (anhidro) (CH3COONa) Preparacin de 100 ml de solucin: Disolver 24.61 g de acetato de sodio en 80 ml de agua destilada. Ajustar el pH hasta 5.2 con cido actico glacial y completar el volumen a 100 ml. Esterilizar en autoclave y guardar a temperatura ambiente.

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Proceso de extraccin
La extraccin del ADN del micelio de los hongos fitopatgenos considerados en estas guas comprende los siguientes pasos: 1. Precalentar el buffer de extraccin a 65 C al bao Mara. 2. Adicionar al buffer la Proteinasa K [10 mg/ml] hasta obtener una concentracin final de 30 g/ml. Adicionar, por tanto, 3 l de Proteinasa K por cada ml de buffer, lo que equivale a tomar 2.1 l de Proteinasa K por 700 l de buffer. 3. Macerar el micelio fresco o almacenado (ver protocolo anterior) empleando nitrgeno lquido. Pasar el micelio macerado a tubos eppendorf de 1.5 ml con la ayuda de un pistilo, llenndolos hasta la marca de 100 o 150 l. 4. Adicionar a cada muestra (tubo de 1.5 ml) 700 l del buffer de extraccin con Proteinasa K preparado en el Paso 2. Homogeneizar la mezcla mediante vrtex o mezclador de tubos e incubar al bao Mara a 65 C durante 1 hora, como mnimo. 5. Mezclar por inversin manualmente cada 20 o 30 minutos. 6. Hay dos opciones en este paso: Despus de la incubacin (Paso 4), agregar 0.5 volmenes del acetato de amonio 7.5 M preparado antes, mezclar por inversin del tubo e incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
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Despus de la incubacin (Paso 4), mezclar nuevamente y agregar un volumen igual (700 l) de la solucin de fenol, cloroformo e isoamilalcohol (25:24:1) y mezclar con vrtex. Esta solucin fenlica debe manipularse en cmara extractora evitando inhalar los vapores que desprende.

7. Centrifugar a temperatura ambiente a 12.000 rpm durante 10 minutos. 8. Rescatar el sobrenadante, teniendo cuidado de no tomar la interfase, y pasarlo a un nuevo tubo eppendorf de 1.5 ml. 9. Adicionar 1 volumen igual de una solucin de cloroformo y alcohol isoamlico (24:1) y centrifugar a 12.000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente. La solucin debe estar a temperatura ambiente al momento de usarla y debe manipularse en cmara extractora evitando inhalar los vapores que desprende. 10. Rescatar el sobrenadante y pasarlo a un nuevo tubo eppendorf de 1.5 ml. 11. Paso opcional: Agregar acetato de sodio 3 M de pH 5.2 (1/10 del volumen del sobrenadante) y homogeneizar manualmente por inversin. 12. Agregar isopropanol fro en una relacin 1:1 y homogeneizar suavemente por inversin del tubo manualmente. 13. Incubar a 20 C durante toda la noche.
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14. Centrifugar a 14.000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente y descartar el sobrenadante invirtiendo el tubo, teniendo cuidado de no perder la bolita (pellet) de ADN. 15. Lavar el pellet con 800 l de etanol al 70%, fro y centrifugarlo a 14.000 rpm durante 5 minutos. 16. Descartar el sobrenadante y secar el pellet por inversin del tubo, a temperatura ambiente. 17. Diluir el pellet en el buffer 1X TE ya preparado (usualmente, en 100 l) aadiendo 2 l de RNAasa [1 mg/ml] e incubar a 37 C durante una hora, como mnimo. Recomendacin: Resuspender el pellet durante toda la noche a 4 C con 1X TE, y al da siguiente adicionarle la RNAasa; incubar luego a 37 C. 18. Almacenar el ADN a 20 C.

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