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Chapitre 3 Et Mthodes de dtection
Dr. Nazaire KOUASSI Matre de Recherche CNRA - Cte dIvoire UFHB Biosciences - MASTER I - Biotechnologie et Bioscurit www.uemoa.int www.izf.net
Etat des lieux des OGM
Plan Etat des lieux des OGM Surfaces emblaves et les pays producteurs les espces cultives
Dtection des OGM
Mthodes srologiques Mthodes molculaire (ADN/ARN)
Avantages et risques potentiels des OGM
Avantages potentiels Risques potentiels UFHB Biosciences - MASTER I - Biotechnologie et Bioscurit
Taux dadoption des cultures OGM / cultures conventionnelles (Millions dhectares) en 2008
Soja
Coton
Mas
Colza
Quelques exemples de plantes transgniques obtenues
Culture Caf Caf Coton Coton Papayer Soja Riz Manioc Manioc Mas Mas Arachide Banane
Caractre dintrt Floraison synchrone Rsistant aux insectes Rsistant aux insectes Rsistant aux herbicides Rsistant / maladie virale Rsistant un herbicide Fort taux de Vitamine A Faible contenu en cyanure Rsistant lACMV Rsistant un herbicide rsistant aux insectes Sans aflatoxine Mrissement retard
Institutions CENICAFE (Colombie) CENICAFE (Colombie) Monsanto Monsanto Universit de Hawaii Monsanto IRRI, Institut Suisse Ohio State University Danforth ; IPS / IITA Monsanto Mosanto Texas A&M University Syngenta
- Mthodes srologiques Test ELISA, Test dImmunodiffusion dImmunodiffusion Test par Bandelettes - Mthodes bases sur lADN PCR et RTRT-PCR Real Time PCR (SyBER (SyBER Green, TaqMan TaqMan) )
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Mthodes de dtection des OGM
- Mthodes srologiques Test ELISA, Test dImmunodiffusion dImmunodiffusion Test par Bandelettes
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Comment procder Echantillonnage
Quelque soit ce que nous voulons dtecter, il faut raliser un bon chantillonnage (validit des rsultats) Lchantillon doit donc tre prlev de manire qu'il soit statistiquement reprsentatif de la quantit total des graines. Il doit par exemple comporter un minimum de 3000 graines selon la mthode de travail l'ISTA (International Seed Testing Agency), il doit tre homogne. Le sous-chantillon de l'ensemble de l'chantillon devrait galement tre dtermins correctement (chantillon de travail) . UFHB Biosciences - MASTER I - Biotechnologie et Bioscurit 11
Dtection des OGM : caractrisation phnotypique La caractrisation phnotypique peut tre utilise pour dterminer l'absence ou la prsence d'un caractre particulier. Cette approche peut tre utilise pour tester la prsence ou l'absence de rsistance aux herbicides. Cet examen comprend la germination des semences en prsence de l'herbicide d'intrt (en gnral, on utilise 400 graines) Les contrles, composs de semences avec ou sans le trait recherch doivent tre inclus dans tous les chantillons tests. Ces essais de rsistance lherbicide sont considrs comme prcis et peu coteux.
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Dtection de la protine exprime
Il est possible de dtecter la prsence des protines rsultant de l'introduction d'ADN tranger par des techniques immunologiques (ELISA, Bandelettes, IMD) Cette technique prsente l'avantage de quantifier des OGM (protine exprime) Cependant une transformation simple (chauffage, triturage) dtruit souvent les proprits antigniques de la protine exprime dans la plante transgnique. Par ailleurs, la localisation de la protine dans un organe spcifique peut galement rendre difficile l'utilisation d'une telle technique. UFHB Biosciences - MASTER I - Biotechnologie et Bioscurit 13
Test ELISA : Srologie
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Dpistage des agents pathognes Les tapes du test DAS-ELISA
1. Le "coating" ou dpt danticorps de capture Les puits dune plaque ELISA sont tapisss avec un anticorps de capture capable de se lier spcifiquement lantigne recherch prsent dans le broyats des feuilles ou autres tissus. Lanticorps de capture se fixe aux parois des puits par adsorption aprs une incubation de 2h 37C ou 4C toute la nuit. Lavage des puits pour liminer les anticorps non fixs, 2. Blocage des sites non occups (optionnel) Les puits sont remplis dune solution de PBSt contenant 3% de lait crm ou du 1% BSA (Bovin Srum Albumine). La plaque ELISA est mise incuber 37 C / 1 heure.
Dpistage et limination des parasites
Les tapes du test DAS-ELISA
3. Le dpt dantignes Les organes tester sont broys dans le tampon PBSt puis clarifis par centrifugation. Le SN est dpos dans les puits de la plaque. Si l'antigne recherch est prsent, il va se lier spcifiquement lanticorps de capture aprs une incubation 37C pendant 1 heure. Lavage des puits pour liminer les antignes non fixs
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LES ETAPES DU TEST ELISA
Dpistage et limination des parasites
Les tapes du test DAS-ELISA
4. Le dpt du deuxime anticorps Un deuxime anticorps (anticorps conjugu AP*) capable de se lier l'antigne de capture est ajout dans les puits. Aprs une incubation de 2 h 37C ou une nuit 4C. Les anticorps conjugus non fixs sur lantigne sont limins par rinage. 5. Dpt du substrat En prsence de son substrat (p-NPP) la phosphatase alcaline catalyse une raction qui aboutit la formation d'un produit color dont lintensit sera proportionnelle la concentration de la protine recherche dans le broyat.
LES ETAPES DU TEST ELISA
Dpistage et limination des parasites
Les tapes du test DAS-ELISA
6. lecture de la densit optique ou absorbance La raction sera quantifie par spectrophotomtrie partir d'une lecture des densits optiques une longueur donde de 405 nm de chaque puits laide dun lecteur de plaque ELISA.
Lecteur ELISA (exPrimary EIA)
Plaque de microtitration - ELISA
Un chantillon est dclar positif si sa D.O SP 10%. Le Seuil de Positivit (SP) = 2 x Moy. des tmoins ngatifs
Test de dtection rapide des OGM
Test de Bandelettes Les bandelettes de dtection rapide : kit rapide Flashkit Kits rapides Flashkits (systmes srologiques vendu dans le commerce) (Envirologix) Il sagit de bandelettes de papier-filtre tout comme celles utilises dans les tests de grossesse. Ces bandelettes pralablement imprgnes danticorps spcifiques Par capillarit, lextrait de plante monte le long du papier-filtre et rencontre les anticorps dirigs contre la protine recherche. La prsence dune seule ligne indique le bon fonctionnement de la manipulation atteste de labsence de la protine recherche. 22
Mthodes de dtection des OGM - Mthodes bases sur lADN
PCR et RTRT-PCR Real Time PCR (SyBER (SyBER Green, TaqMan TaqMan) )
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Pourquoi dtecter / identifier
Les acteurs impliqus dans le dveloppement, lutilisation et la rgulation des OGM doivent vrifier la prsence de lOGM (dtection, identification) et le quantifier dans la Semences ou la production des fins de traabilit Dans les varits ou espces compatibles (surveillance du flux de gnes) Dtecter (cribler des semences pour dtecter des OGM) Identifier (type dOGM et les gnes impliqus) Quantifier (dterminer la quantit de chaque OGM)
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Que pouvons nous dtecter dans un OGM
le promoteur qui est le rgulateur de l'activit des gnes le terminateur qui est le signal de terminaison le gne marqueur de slection des cellules transformes le gne dintrt introduit, supprim ou modifi le gne insr (ADN) ou lARNm lARNm issue de la transcription de ce gne
Plasmide Vecteur + Promoteur + GI + NosT = Cassette
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tapes du droulement de la PCR
La dnaturation est ralise environ 95C, pour une dissociation complte des deux brins dADN. Cette tape dure gnralement 0,5 1 minute et permet de dshybrider les brins ADN, de dcrocher les polymrases qui seraient encore lies une matrice et dhomogniser le milieu ractionnel. Lhybridation ou annealing se fait une temprature qui sera dfinie selon la nature des amorces (cette temprature varie de 55 65C). Cette tape dure gnralement 5 60 secondes et permet aux amorces sens (F) et anti-sens (R) de shybrider aux ADN Tm = 2 (A + T) + 4 (G + C) o A, T, G et C sont respectivement le nombre de chacune de ces bases dans lamorce. Calculer les Tm des amorces suivants et leur temprature Dhybridation: F = ATG CGC GAA ACA AGC TTC TTA TC R = ACT TTC TCA TGG ATG CTT CTC
Tm = 2 (?) + 4 (?) = ??
tapes du droulement de la PCR
La polymrisation est ralise environ 72C, temprature permettant lactivit optimale de lADN polymrase thermorsistant qui entre en action. La dure de cette tape dpend normalement de la longueur du fragment amplifier elle dure gnralement 30 120 secondes. A la fin de chaque cycle, les produits sont sous forme d'ADN double brin. Rparation des bouts (extension final) : 5 10 min 72 72 C Le nombre de cycle on peut esprer obtenir avec 30 40 cycles, En effet, chaque cycle de la PCR, les quantits doligonuclotides amorces et de dNTP diminuent ainsi que lenzyme (inactivit) UFHB Biosciences - MASTER I - Biotechnologie et Bioscurit
Etape de dnaturation - Hybridation
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Animation vido PCR
Voir lanimation PCR
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PCR (Polymerase Chain Reaction)
amorce
0 cycle 1 cycle 2
2n
(n = nombre de cycles)
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Machines PCR
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MISE EN PRATIQUE DE LELECTROPHORESE SUR GEL DAGAROSE 1. Coulage du gel.
Agarose (%) . Taille (Pb) 0,75% - 10 000 -15 000 pb 1% 500-10 000 kb 1,25% 300-5000 pb 1,5% 200-4000 pb 2% 100-2500 pb 2,5% 50-1000 pb 2. Chargement du gel avec les chantillons 3. Migration des fragments UFHB Biosciences - MASTER I - Biotechnologie et Bioscurit
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Les limites de la mthode PCR
LADN est suppos rsistant certains traitements chimiques ou thermiques, Cependant la dtection de la prsence dOGM dans les produits alimentaires transforms (exemple : pure de tomates, huile) est hypothtique. En effet, dans ce cas, la probabilit de trouver de lADN transgnique est infime (dgradation partielle) Un autre problme que lon peu rencontrer est la dfinition dun seuil minimal de dtection. En effet, la mthode de PCR est trs sensible et lon peut dceler dinfimes traces dOGM (selon la matrise des oprateurs). UFHB Biosciences - MASTER I - Biotechnologie et Bioscurit
Chromatogramme / squenage
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Squenceur automatique
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La PCR en temps rel ou QQ-PCR
consiste mesurer la quantit dADN polymris chaque cycle grce un marqueur fluorescent (2 mthodes : CYBERGreen et TaqMan PCR) Elle permet par son principe de faire des mesures quantitatives mais elle ncessite des thermocycleurs particuliers. Le nom le plus communment utilis est la Q-PCR ou Q-RT -PCR pour PCR Quantitative (ADN) ou RT -PCR Quantitative (ARN) Comme pour la PCR, la Q-PCR (ex.TaqMan PCR) utilise en plus des deux amorces (sens et antisens) une amorce interne (sonde)
La PCR en temps rel (Real-time PCR) est une technique qui
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PCR quantitative avec une sonde TaqMan Cette mthode repose sur deux principes : - la technologie FRET (fluorescence resonance energy transfer) - lactivit 5-exonuclase de la Taq Pol FAM, VIC FP 3 Reporter TAMRA Quencher 5
5 RP
- Spcificit lamorce pour la PCR - Spcificit de lhybridation de la sonde TaqMan
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La PCR en temps rel : Principe
Lorsque la polymrisation est termine, pour chaque molcule dADN synthtise, un reporteur met une fluorescence. 41
LA PCR EN TEMPS REEL
PCR en temps rel versus PCR en point final
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Raction TaqMan RT-PCR
dilution A 1 10-1 10-2 10-3 10-4
LD 4,5 pg
dilution de lARN (dilution limite) en TaqMan RT-PCR Ech. A (30ng/l) (RNA qty=[S] ng/l x dilution x1.5 l) = LD (limite dtectable)
PCR en temps rel
1. OneStep Real Time PCR
2. Machine QPCR (TaqMan)
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Avantages potentiels des OGM et Risques Potentiels pour la sant et lenvironnement
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Avantages potentiels de la biotechnologie pour les agriculteurs
Moins de pesticides Amlioration des rcoltes grce aux OGM Utilisation efficiente des terres disponibles Amlioration de la valeur nutritionnelle Sant : Diagnostic et traitements des maladies laboration de vaccins & Nutrition animale
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Avantage potentiels des OGM
La biotechnologie agricole amliore les plantes cultives en fournissant et permettant une protection intgre contre les maladies et les insectes. Elle permet dinduire la tolrance aux herbicides, et permet de produire beaucoup aliments de qualits certaines et ceci de faon durable.
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Avantage potentiels des OGM
1. Moins de pesticides La lutte contre les insectes qui ravagent les cultures permet de scuriser les rcoltes, ce qui est depuis toujours une priorit de l'agriculture. La cration de plantes OGM rsistantes aux insectes a pour but de supprimer en partie le recours aux pesticides chimiques. Dans les meilleurs cas, l'utilisation de plantes OGM a permis de consommer de trois cinq fois moins de pesticides UFHB Biosciences - MASTER I - Biotechnologie et Bioscurit
2. Bnfices conomiques et social
Rduction des pertes dues aux maladies et ravageurs (virus, bactries, champignons, insectes, etc.) Rduction de la pnibilit et de la rentabilit du travail (60 km de marche avec un poids de 40 kg pour pulvriser un ha de coton avec les pesticides ( si lon conomie de 3 4 pulvrisations)
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3. Amlioration du rendement
Coton : varit locale sans pulvrisation. Rdt: 735 kg/ha
Coton Bt sans pulvrisation. Rdt: 1102 kg/ha
Coton Bt en essais Fada NGourma (Burkina Faso)
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4. Amlioration de la valeur nutritive
Acides gras, vitamines, sucre, etc. La plante de colza gntiquement modifie pour augmenter la valeur nutritive de lhuile (+ acide olique, - acide linolique) est commercialises. Des modifications de la valeur nutritive ont lieux chez le soja (acide gras) et mas (protine) et le riz (provitamine A et Fer) Le Sorgho biofortifi en Afrique = ABS (teneur en vitamine A et E, fer, lysine, Zinc) Le riz dor (Golden rice, riche en vitamine A) Le gne insr = Beta-carotne (provitamine A) 51
Manioc biofortifi (B6)
Avantages potentiels : 5. Utilisation efficiente des terres disponibles Grce la biotechnologie, les varits de cultures peuvent tre amliores pour produire plus de nourriture dans les zones auparavant non propices aux cultures. Rduction de la pression foncires sur les autres rgions du monde, tels que les forts tropicales, qui sont actuellement surexploites. On peut faire une exploitation la carte (en fonction des stress biotiques ou abiotiques) 6. Sant : Le consommateur souhaite dsormais que laliment contribue amliorer sa sant ou prvenir lapparition de maladies.
Risques potentiels des OGM
Les OGM ne sont autoriss quaprs des sries dvaluations scientifiques rigoureuses et compltes, Cependant la production grande chelle des OGM suscite de multiples interrogations sur la sant publique et sur lenvironnement.
Risques toxicologiques et allergiques Risque de rsistance aux antibiotiques Risques pour lenvironnement : Flux de gnes Rsistance des insectes Impact sur des insectes utiles "non cibls " Modification des pratiques culturales Rduction de la biodiversit UFHB Biosciences - MASTER I - Biotechnologie et Bioscurit
![Biotech Master I - UFHB -BIOSCIENCES CHAP 4 FF [Mode de Compatibilité]](https://imgv2-1-f.scribdassets.com/img/document/225711426/149x198/4878594472/1400802629?v=1)
